Metode optice de analiza

instrumentala

Cursul 11

1
 OBIECTIVE

Prezentarea tipurilor de metode optice

Principiile fundamentale ale metodelor optice

Spectroscopia moleculara UV VIS

Principii generale

Variante de lucru

Determinari calitative

Determinari cantitative

Spectrometrie atomica notiuni fundamentale

2
METODE INSTRUMENTALE DE TIP OPTIC

In functie de natura interactiunii dintre radiatii si

substante:

1. Metode optice de absorbie de energie

Spectrofotometrie molecular - UV, VIS, IR

Spectroscopie atomic

2. Metode optice de emisie de energie

Spectroscopie atomic de emisie domenii diverse de
lungimi de unda

Spectrofotometrie molecular - fluorescenta,
fosforescenta, chemiluminiscenta, difuzia luminii 3
3. Metode de fluorescenta, fosforescenta,
chemiluminiscenta

Metode de difractie

Metode refractometrice

Metode polarimetrice

Metode de difuzie a luminii

Metode combinate
4
METODE INSTRUMENTALE DE TIP OPTIC

in functie de tipul de analit cercetat

Metode optice moleculare

absorbie de energie: Spectrofotometrie (UV, VIS, IR)

emisie de energie - fluorescenta, fosforescenta,
chemiluminiscenta, difuzia sau difractie luminii,
polarimetrie, refractometrie

Metode optice atomice

absorbie de energie Spectroscopie atomic de
absorbtie AAS

emisie de energie Spectroscopie atomic de emisie OES
5
 Principii fundamentale ale spectroscopiei
optice

Se bazeaza pe absorbia sau emisia radiaiilor electromagnetice

de ctre molecule sau atomi

radiaia electromagnetic are:

proprieti de und i de particul
se caracterizeaza prin :
1. lungimea de und cm (micrometri m,
nanometri nm, milimicroni m, angstromi
2. frecvena (nr cicli/sec) - herzi Hz
3. amplitudine A - cm
4. Energie - eV, keV , meV, calorii (cal, kcal), , ergi

.
6
Caracterizarea undelor electromagnetice

Lungimea de und () = wave length

Amplitudine = amplitude

Unde cu frecven nalt = High frequency waves

7
Unde cu frecven joas = Low frequency waves
 Rezultatul determinarii
spectroscopice spectru
spectrul prezinta grafic energia (emis sau absorbit) in
functie de lungimea de unda

Spectrele de absorbie A = f().

8
Rezultatul determinarii spectroscopice spectru

Fiecare substan are un

spectru de absorbie
caracteristic:

ca form general,
ca domeniu spectral,
ca numr de maxime
(picuri)
ca raporturi ntre
intensitile diverselor
picuri

9
10
 Absorbia radiaiei electromagnetice
Notiuni fundamentale

Considerm o radiaie incident monocromatic, Io, care cade pe o

celul coninnd proba (substanta de analizat), celula are lungimea l
cm iar concentraia substanei ce absoarbe lumina este C.

Transmitanta T Absorbanta A
T = I1/I0 A = -ln(T)

11
 LEGILE ABSORBTIEI - Legea Lambert-Beer

I = I0e-kl
k - coeficientul de absorbie
l lungimea cuvei

ln(I0/I) = kl
A = kl
k = const. C

k - coeficient molar de extincie (absorban) notat , pentru C exprimata in [mol/l]

Forma generala a legii Lambert-Beer este:

A = lC 12
 SPECTROMETRIE UV VIS (moleculara)
Caracterizare generala

Spectrofotometrie in domeniul de lungimi de unda

ultraviolet (200-400 nm) si vizibil (400-750 nm)

Aparatele utilizate se numesc spectrofotometre

UV-VIS

Se determina molecule, deci substante

13
 ACTIVITATE INDEPENDENTA

Care din urmatoarele determinari optice aplicate la
controlul alimentelor se desfasoara in domeniul UV si care
in domeniul VIS:

1. Determinarea polifenolilor = 760 nm

2. Determinarea flavonoidelor = 510 nm
3. Determinarea HMF din miere = 284 si 336 nm
4. Determinarea proteinelor (Bradford) = 595 nm
5. Determinarea prolinei = 510 nm
6. Determinarea catalazei (Beers) = 240 nm
7. Determinarea catalazei (Guaiacol) = 570 nm
8. Determinarea peroxidazei = 470 nm
9. Determinarea nitritilor = 520 nm 14
 Aparatura utilizat

Schema bloc pentru un spectrometru de absorbie

toate componentele optice trebuie s fie transparente pentru domeniul

de lungimi de unda ales !!!!

15
Spectrofotometru in UV VIS

Spectrometru FT-IR
16
 Caracterizarea prilor componente
ale aparaturii in spectrometria UV VIS

1. Sursa

Emite semnalul (radiatia)

semnalul emis trebuie s fie o radiaie continu
n domeniul ales;

semnalul trebuie s fie constant
2. Monocromatorul

scop: separarea radiaiei policromatice ntr-una
monocromatic

dispozitiv de tip optic (prisme)

17
 3. Cuvele pentru prob
materiale transparente n domeniul lungimii de und
utilizate;

grosimea trebuie s fie reproductibil, constant,

cunoscut, msurabil.

ultraviolet - cuve din cuar ( 200 nm 400 nm)

vizibil cuve din sticl moale sau Pyrex ( 300 nm
2,5m)

18
4. Detectorii

fotomultiplicatoare, emulsii fotografice,

termocuple, celule fotoconductive,
celule pneumatice i celule fotoelectrice
n funcie de domeniul spectrului.

n domeniul UV vizibil - fotocelule,

celule fotomultiplicatoare, filme
fotografice
19
Pri componente ale spectrofotometrului
de absorbie UV VIS

Diferentieri functionale UV/VIS

20
 Spectrometria de absorbie
n UV-VIS - principii
Principiu general

Unele substane (nemetale, metale, compui ai acestora,
substane organice) au proprietatea de a forma cu reactivi
specifici, n anumite condiii, compui solubili colorai.
Intensitatea de culoare a compusului format, numit
compus colorimetrabil, este direct proporional cu
concentraia sa n anumite limite ale acesteia.

Metoda spectrofotometric molecular se bazeaz pe

determinarea (masurarea, citirea) la un aparat numit
spectrofotometru a absorbanei unei soluii colorate de o
concentraie anume, la o lungime de und specific, n
domeniul ultraviolet (UV) sau vizibil (VIS).
21

Orice determinare spectrofotometric se
caracterizeaz prin urmtoarele aspecte:

reactivul de culoare utilizat, adic reactivul care

determin formarea unui compus colorimetrabil prin
reacie cu specia pe care dorim s o determinm;

lungimea de und la care se face determinarea,

specific pentru fiecare compus i nominalizat n
metod;

dimensiunea cuvei aparatului care se utilizeaz

(drumul optic; de cele mai multe ori este 1 cm).

22
 Spectrometria de absorbie
n UV-VIS

Variante de lucru:
1. Colorimetria (VIS)

2. Fotometria (VIS: lumina incident este

filtrat prin filtre optice, cu spectru larg)

3. Spectrofotometria (UV, VIS: lumina incident

este filtrat prin monocromatoare, domeniul
ngust)
23
 Colorimetria

intensitatea culorii probei se compar vizual,
n lumin alb, cu un set de soluii etalon de
concentratie cunoscuta - prelucrate n condiii
absolut identice cu proba.

n aceast tehnic se pot realiza msurtori,

prin comparaie vizual, n eprubet, la
lumina zilei, rezultnd analize chimice cu
exactiti < dect 1%.
24

este o metod subiectiv i mai puin selectiv

rezultatele depind mult de persoana care execut

analiza deoarece sensibilitatea maxim a ochiului
omenesc atinge maximul pentru domeniul 550-
560nm (domeniul culorii verzi), lucru important
cnd compararea probei cu etalonul se face vizual

Cu ct exist mai multe soluii etalon, pentru

comparaie, cu att metoda este mai exact.

25
Colorimetria

.tropical.com.pl/images/upload/fck/image/test.jpg

26
Culoarea unui compus nu este culoarea absorbita
ci este culoarea care ramane dupa ce se scade
frecventa absorbita din sursa de radiatii

27
ACTIVITATE INDEPENDENTA

Pentru compusii care se determina la
activitatea independenta anterioara
scrieti culoarea compusului
colorimetrabil care se formeaza si caruia
i se determina absorbanta

28
Fotometria i spectrofotometria

msoar instrumental lumina transmis de o soluie

colorat (vizibil) sau incolora (ultraviolet) lucrnd cu o
surs de lumin monocromatic.

Cnd lumina incident este filtrat, prin filtre optice,
avnd un spectru mai larg, avem de a face cu o
fotometrie

cnd domeniul filtrat este mai ngust (utiliznd
monocromatoare) vorbim de spectrofotometrie.

La spectrofotometrie, este posibil fixarea mai precis a

lungimii de und la care se lucreaz.

29

Cu ambele variante se poate chiar trasa un spectru de
absorbie, adic o curb, obinut prin msurarea
semnalului n funcie de lungimea de und a radiaiei
incidente.

n literatura de specialitate uneori se folosete pentru

ambele metode i denumirea de metod colorimetric (sau
chiar spectrocolorimetric), ceea ce uneori poate crea
confuzii.

n domeniul UV, ochiul omenesc nepercepnd lumina, se

utilizeaz doar spectrofotometria.

30
 Determinari calitative in spectroscopia
UV VIS

Se bazeaza pe compararea spectrelor de absorbie ( maximelor)

ale substanelor n domeniul UV-VIS, (200-750nm) cu spectre cunoscute

max maxim de absorbie

X - selectivitatea maximului de absorbie

31
32
 33
http://siphotonics.com/Pages/UV_Vis_Spectroscopy_Software.html
Determinri cantitative n spectroscopie

nlimea curbei i suprafaa ncadrat de curb

reprezint caracteristici cantitative care servesc la
determinarea concentraiei substanelor din probe

Se bazeaza pe legea Lambert-Beer A = lC

Se realizeaza o curba de etalonare pe baza

determinarii absorbantei etalonului la
diferite concentratii cunoscute, la lungimea
de unda corespunzatoare maximului de
absorbtie 34

n dreapta - curba de absorbie la diferite concentraii

n stnga - curba de etalonare avnd un maxim de

absorbie la lungimea de und, max = 610 nm
35
 UV-vis spectra of different concentrations of Rose Bengal.

The molecular structure of Rose Bengal

(4,5,6,7-tetrachloro-2',4',5',7'-
tetraiodofluorescein).

Calibration curve of Rose Bengal.

Equation of line: y = 0.0977x 0.1492
(R2 = 0.996)

36
http://cnx.org/content/m34525/latest/
Spectrul de absorbie al Rodaminei B la diferite
concentraii

37
 Curba de etalonare, nitriti in ape, Griess
y = 4.9051x + 0.0131
2
1.4 R = 0.9966
1.3
1.2
1.1
1
Absorbanta

0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.025 0.05 0.075 0.1 0.125 0.15 0.175 0.2 0.225 0.25

Concentratia, mg/l 38
 Curba etalonare nitriti ape y = 3.6836x - 0.0631
R2 = 0.9839
1.4
1.2
1
0.8
Abs

0.6
0.4
0.2
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4
Conc

Curba etalonare nitriti ape y = 11.248x + 0.1883

R2 = 0.8804
1.4
1.2
1
0.8
abs

0.6
0.4
0.2
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
conc
39
 Determinarea concentratiei pentru
proba necunoscut
NUMAI PENTRU DOMENIUL DE CONCENTRATIE IN CARE ESTE
VALABILA LEGEA LAMBERT-BEER

1. Prin comparaie cu un etalon de concentraie cunoscut

2. Pe baza factorului de panta mediu, Fm

3. Pe baza ecuatiei de regresie aferenta curbei de etalonare,

y=ax + b

40
 1 - Prin comparaie cu un etalon de concentraie
cunoscut (interpolare)

mol - coeficientul de extincie molar pentru soluia de concentraie cunoscut,

respectiv de concentraie necunoscut,

b-grosimea probei din cuv,

c-concentraia cunoscut a probei de referin,

cx- concentraia necunoscut a probei analizat.

Prin mprirea celor dou ecuaii se obine:

Calculul concentraiei pentru proba necunoscut:

41
2 - Pe baza factorului de panta mediu, Fm

factorul de transformare (de pant) F este raportul dintre

concentraiile i absorbanele corespunztoare pentru fiecare
soluie care formeaz scara etalon.
Ci
Fi = -----
Ai

se calculeaz media aritmetic a valorilor obinute Fi, notat cu Fm:
n
Fi
i=1
Fm = ----------
n

unde i are valori de la 1 la maxim n, n funcie de numrul de soluii etalon utilizate

pentru obinerea punctelor prin care se obine curba de etalonare (minim 5
maxim 10, n general).

Concentraia probei necunoscute se determin prin calcul, nmulind

absorbana citit Ax cu Fm.

Cx = Ax Fm
42
Exemplu

43
 ACTIVITATE INDEPENDENTA

Pe ex din tabel veti calcula concentratia probelor necunoscute Cx (1, 2, 3)
prin metoda factorului de panta mediu Fm

44
3 - Pe baza ecuatiei de regresie

Pe baza ecuaiei care descrie curba de etalonare

y = ax +b,

Y absorbanta

X - concentratia

de unde
x = (y- b)/a

se determin concentraia necunoscut cx

cx = (absorbanax b)/a
45
Exemplu
NOTA - R2 este o masura a liniaritatii curbei, deci a respectarii legii Lambert-Beer,
cu atat mai buna cu cat valoarea este mai aproape de 1

46
 ACTIVITATE INDEPENDENTA

Pe ex din tabel veti calcula concentratia probelor necunoscute Cx (1, 2,
3) prin utilizand ecuatia de regresie a curbei de etalonare

47
Spectrometria atomica

Spectroscopia atomic const n

urmatoarele tehnici de uz analitic:

emisia atomic;

absorbia atomic

48

introdus n analiza chimic din anul 1952 de
ctre australianul A. Walsh

se bazeaz pe fenomenul descoperit de germanul

G. R. Kirchhoff (1859) - i anume inversia liniilor
spectrale legea lui Kirchhoff:

Principiul spectrometriei atomice

Fiecare element chimic absoarbe acele radiaii pe
care le poate emite n aceleai condiii, bine
determinate, de temperatur i presiune.

49

Atom invelis electronic stare fundamentala

Dac o radiaie de o anumit lungime de und
acioneaz asupra unui atom aflat n stare
fundamental, atomul poate s absoarb radiaia i
s treac ntr-o stare excitat, un astfel de proces
fiind cunoscut sub denumirea de absorbie
atomic 50

ntruct aceast stare (excitata) este instabil, atomul va
reveni imediat i spontan ctre starea fundamental.

Electronul se va ntoarce n poziia lui iniial, poziia stabil

orbital i va fi emis o cantitate de energie radiant
echivalent cu cea absorbit n procesul de excitare.

Lungimea de und a energiei radiante emise este direct

legat de tranziia electronic care a avut loc si este egala
cu cea a energiei absorbite

Deoarece fiecare element are o structur electronic unic,

lungimea de und a luminii emise este o proprietate unic a
fiecrui element n parte.
51
 Ce se determina prin
spectroscopie atomica?
ATOMI ELEMENTE CHIMICE, METALE

52
Aparatura n absorbia atomic

53

Sursa de radiaii emite un flux luminos de intensitate
constant, prestabilita

Soluia coninnd proba de analizat (sau etalonul, este

transformat ntr-un aerosol fin, n interiorul unei
incinte numite sistem de pulverizare sau pulverizator
(nebulizor).

Aerosolul, amestecat intim cu amestecul de gaze

(oxidant plus carburant) este condus n flacr unde
atomii unui anumit element absorb doar lumina cu
lungimea de und specific elementului respectiv.

Monocromatorul selecteaza radiatia specifica

elementului cercetat

Detectorul (un foto-multiplicator), msoar intensitatea

luminii monocromatice

Inregistrare date computer - 54
 Determinari in AAS
Determinare calitativ

Atomii unui anumit element absorb doar lumina cu
lungimea de und specific elementului respectiv
(emis de surs i trecut prin flacr)

Atomii celorlalte elemente nsoitoare nu absorb

lumina la aceeai lungime de und ci fiecare la alte
valori ale acesteia deci prin selectarea lungimii
de und se pot identifica elementele chimice
55
http://wps.pearsoned.com.au/ibcol/117/30074/7699000.cw/content/index.html
56
Activitate independenta

Care este elementul necunoscut
(unknown) din exemplul de pe slide-ul
anterior?

57
 Determinare cantitativ

Se bazeaza pe Legea Lambert-Beer

Diminuarea intensitatii radiatiei,

exprimat n unitai de absorban, este
proporional cu numrul de atomi ai
elementului de analizat, prezeni n flacra,
deci cu concentratia acestora.

58
Aplicatiile metodelor optice la
controlul alimentelor

59
 CONCLUZII

Metodele optice permit determinari de atomi
si/sau molecule in functie de tehnica folosita si
domeniul spectral (lungimea de unda)

Spectrofotometria moleculara in UV si VIS este

cea mai utilizata tehnica in controlul curent al
alimentelor

Determinarile optice calitative se bazeaza pe a

maximelor si numarul acestor maxime

Determinarile optice cantitative se bazeaza pe

relatia dintre absorbanta si concentratie,
potrivit legii Lambert-Beer
60

Aparatele utilizate Spectrofotometre in care
semnalul optic se converteste in semnal electric
i care are componentele optice transparente la
de lucru

Tehnicile de lucru in spectrofotometria

moleculara sunt: colorimetria, fotometria si
spectrofotometria

Determinarile cantitative se bazeaza pe

operatiunea de etalonare curba de calibrare
prin tehnici de calcul diferite

Spectroscopia atomica emisie si absorbtie

atomica

Aplicatiile metodelor optice in control alimente

se refera la compozitie, substante adaugate si
contaminanti chimici 61
 Test de verificare
1. Care sunt tipurile de metode optice utilizate n controlul
alimentelor?
2. Pe ce principiu fizic general se bazeaz spectroscopia optic?
3. Care sunt mrimile care caracterizeaz o radiaie
electromagnetic?
4. Cum se numete rezultatul unei determinri spectroscopice?
5. Care este domeniul de lungimi de und n care se execut
determinrile spectroscopice n UV/VIS?
6. Definii transmitana/absorbana la o determinare
spectrofotometric.
7. Care este legea fundamental aplicat la determinrile
spectrofotometrice?
8. Definii legea Lambert Beer forma general.
9. Ce se determin (dpdv analitic) atunci cnd se utilizeaz
metode spectrofotometrice n domeniul UV i VIS?
62
10. Care sunt prile componente ale unui spectrofotometru?
11. Care diferene sunt ntre spectrofotometru care face
determinri n domeniul UV fa de cel care face
determinri n domeniul n VIS?
12. Care este principiul general al determinrilor n
spectroscopia de absorbie UV-VIS?
13. Prin ce se caracterizeaz orice determinare
spectrofotometric?
14. Care sunt variantele de lucru n spectrometria de
absorbie n UV-VIS
15. Caracterizai pe scurt colorimetria/Fotometria /
spectrofotometria.
16. Pe ce se bazeaz o determinare calitativ in
spectroscopia UV VIS ?
17. Pe ce se bazeaz o determinare cantitativ in
spectroscopia UV VIS ?
18. Cum se realizeaz curba de etalonare n spectroscopia
UV VIS ?
19. Care sunt metodele utilizate n spectroscopia UV VIS
pentru a se determina concentraia probei necunoscute?
63
20. Cum se calculeaz concentraia probei necunoscute
prin metoda comparaiei cu un etalon de
concentraie cunoscut (interpolare)/ metoda
factorului de panta/ utilizand ecuatia curbei de
etalonare?
21. Care sunt tehnicile de lucru ale spectroscopiei
atomice?
22. Pe ce fenomen fizic se bazeaz spectroscopia
atomic ?
23. Care este principiul de funcionare al spectroscopiei
atomice ?
24. Ce se determin (dpdv analitic) prin spectroscopie
atomic ?
25. Pe ce se bazeaz determinrile calitative n
spectroscopia atomic?
26. Pe ce se bazeaz determinrile cantitative n
spectroscopia atomic?
27. Dati cel putin trei ex de aplicatii ale metodelor
optice in domeniul alimentar
64