Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

3.2. Enzime utilizate n tehnologia ADN recombinant

Enzimele de restricie
Introducere
Sistemele de restricie i modificare (metilare) au fost descoperite n urma analizei interaciilor
bacteriofag-bacterie. ADN-ul fagic eliberat de o anumit tulpin bacterian poate infecta cu succes
bacterii care aparin aceleiai tulpini, deoarece prezint acelai model de modificare ca i ADN-ul
gazdei. n cazul n care fagii meninui pe o anumit tulpin bacterian sunt transferai pe alta, ADN-ul
fagic este atacat de enzimele de restricie ale noii gazde: bacteriofagul este restricionat la o tulpin
bacterian.
Fenomenul de restricie nu este absolut; unii fagi nu sunt restrictai, fie pentru c prezint
mutaii n situsurile recunoscute de sistemele de restricie ale gazdei, fie pentru c dobndesc un
model de modificare similar celui al ADN-ului gazdei.
Principala caracteristic a unui sistem de restricie i modificare const n faptul c o tulpin
bacterian prezint metilaze i endonucleaze care au aceeai specificitate de secvena. Metilaza va
adaug o grupare metil (la un rest de citozin sau adenin) la aceei secvena care este recunoscut
de enzima de restricie. n urma metilrii un situs int devine rezistent la restricie.
La bacterii exist 3 sisteme de metilare, care induc formarea de 6-metiladenin sau 5-
metilcitozin:
1. sistemul hsd, care determin un model specific metilare pe resturi de adenin care identific
bacteria gazd; exist la multe specii de bacterii, n unele cazuri determinnd i metilri pe
resturi de citozin;
2. sistemul dam este implicat n evidenierea catenelor de ADN nou replicate de catenele vechi;
este implicat n controlul replicrii ADN i n marcarea catenelor ADN care sunt subiect pentru
reparare;
3. sistemul dcm este implicat n metilarea citozinei; funciile sale in vivo sunt necunoscute.
Specificitatea de gazd pentru o tulpin bacterian este dat de aciunea specific a acestor
metilaze, care dau un model de modificare al ADN-ului. Modificarea permite unei tulpini bacteriene s
fac distincia ntre ADN-ul propriu i orice ADN strin, nelegnd prin ADN strin orice molecul de
ADN care nu prezint acelai model de metilare. Aceast difereniere face ca orice molecul de ADN
strin (fagic, plasmidial, cromosomal) s fie atacat i clivat de enzimele de restricie. Prin urmare, rolul
sistemelor de restricie i modificare este acela de a proteja ADN-ul propriu de contaminare cu
secvene de alt origine.

Nomenclatura
Descoperirea unui numr foarte mare de enzime de restricie a impus adoptarea unei
nomenclaturi universale. Astfel, se folosete un cod de 3 litere, n format italic, prima litera semnificnd
genul, iar celelalte 2 specia bacterian de la care a fost izolat enzima (spre exemplu, Eco
Escherichia coli); n unele cazuri, o a patra liter (n format normal) indic tulpina bacterian (ex:
EcoR). Dac o anumit tulpin bacterian are mai mult de 1 sistem de restricie-modificare, acestea
se identific prin numere romane : spre exemplu Bgl I si Bgl II.

Tipuri de siteme de restricie/modificare

Endonucleazele de restricie sunt enzime care recunosc secvene de ADN specifice, scurte,
legarea fiind urmat de clivare, fie la situsul de recunoastere, fie la o distan oarecare de acesta, n
funcie de tipul de enzim. Sistemele enzimatice de restricie/modificare (sau restricie/metilare) au
fost mparite n 3 categorii: Tipul I, Tipul II i Tipul III. Tipurile I i III constau n enzime care au att
funcii de restricie ct i funcii de modificare; ambele tipuri recunosc secvene specifice, nemetilate,
de ADN dc; enzimele de tip I cliveaz ADN-ul ntr-o manier randomizat (situs-nespecific), pe cnd
cele de tip III taie la situsuri specifice, dar nu n cadrul secvenei de recunoatere, ci la o distana de
25-27 nucleotide de acesta (ex: EcoP1 codificat de fagul P1). Sistemele de tip II constau n enzime
separate care ndeplinesc funciile de metilare, respectiv, restricie.
Exist i un al 4-lea sistem de restricie/modificare care opereaz n sens invers: conine o
enzim de restricie care recunoate i cliveaz o secvena de ADN metilat. Anumite tulpini de
Steptococcus pneumoniae prezint enzim DpnI care cliveaz secven GATC numai dac aceast
este metilat; aceste tulpini nu prezint o metilaza care s metileze secvenele GATC. Alte tulpini ale
acestei bacterii prezint enzima DpnII, care cliveaz GATC nemetilate, dar aceste tulpini prezint
metilaze specifice, care modific aceast secvent, astfel nct ADN-ul lor este metilat. DpnI poate fi
folosit pentru restricia de substraturi metilate, substraturi pe care enzimele care recunosc aceeai
secvena sunt nactive (Mbo I, Sau3A I). Ambele sisteme vor restricta ADN-ul strin care intr n
tulpina bacterian i prezint un model diferit de metilare; sistemele de restricie care recunosc i
cliveaz ADN metilat sunt rare i probabil mai puin eficiente, deoarece vor degrada doar moleculele
de ADN care prezint un model specific de metilare.

1
 Cap. 3-2 Endonucleaze de restricie

Tip II TipIII TipI

Structura proteica Metilaze i endonucleaze Enzima bifuncional care Enzima bifuncional care
distincte conine 2 subuniti conine 3 subuniti
Situs de recunoastere Secvene de 4-6 pb, Secvene asimetrice de 5-7 Secvene bipartite i
adesea palindromice pb asimetrice
Situs de clivare Acelai sau apropiat de La 24-26 pb n aval faa de Nespecific, la mai mult de
situsul de recunoastere situsul de recunoastere 1000 pb de situsul de
recunoastere
Restricie i metilare Reacii separate Simultane Exclusive
Tab.3.2. Principalele tipuri de sisteme de restricie/modificare

Sisteme de restricie/modificare de tip II

Sistemele de restricie/modificare de tip II sunt cele mai des ntilnite (se ntlnesc la una din 3
tulpini bacteriene) i constau n endonucleaze i metilaze distincte, activitatea ambelor enzime fiind
dependent de ioni de magneziu. Genele pentru endonucleazele i metilazele de tip II sunt adiacente
n cromosomii bacterieni, n toate cazurile studiate pn n prezent. Metilazele sistemului II de
restricie/metilare pot induce formarea de 5-Me-citozin, 4-Me-citozin (mai puin ntlnit) sau 6-Me-
adenina. Enzimele de restricie de tip II au o secvena de recunoatere scurt, de 4-6 nucleotide, n
cele mai multe cazuri palindromic. De exemplu, enzima EcoRI recunoate o secvena
hexanucleotidic:
5-G-A-A-T-T-C-3
3-C-T-T-A-A-G-5
Similar altor endonucleaze de restricie, EcoRI nu taie la nivelul axei de simetrie a secvenei
de recunoatere, ci spre captul 5, ntre G i A, ducnd la formarea de capete 5 coezive:
5-G-3 5-A-A-T-T-C-3
3-C-T-T-A-A-5 3-G-5
n mod similar, multe alte enzime de restricie genereaz fragmente cu capete 5 coezive;
altele (ex: Pst I) genereaz fragmente cu capete 3 coezive, n timp ce alte enzime taie la nivelul axei
de simetrie a secvenei de recunoatere, ducnd la formarea de fragmente cu capete drepte. Spre
exemplu, enzima BalI recunoate secvena
5-T-G-G-C-C-A-3
3-A-C-C-G-G-T-5
i taie la nivelul axei de simetrie ducnd la obtinerea de capete drepte :
5-T-G-G-3 5-C-C-A-3
3-A-C-C-5 3-G-G-T-5
Organizarea structural a enzimelor de restricie de tip II
Enzimele de restricie de tip II au fost i sunt folosite ca sistem model pentru a analiza diverse
aspecte ale interaciilor specifice ADN-proteine i mecanismele hidrolizei legaturilor fosfodiesterice.
Pn n prezent, dei pentru cel putin 60 de enzime de restricie a fost determinat secvena de
aminoacizi, au fost elucidate structurile tridimesionale numai pentru enzimele EcoRV, PvuII, EcoRI,
BamHI, iar mai recent pentru Cfr10I i BglII. Analiza structurii primare a artat, surprinztor, o lips de
similaritate n ceea ce privete secvena de aminoacizi. Totui, n urma analizei structurilor secundare
i tertiare, enzimele de restricie de tip II pot fi mparite n 2 subfamilii, n funcie de tipul de fragmente
de ADN generate dup clivare. Astfel, BamHI, EcoRI i Cfr10I hidrolizeaz secvenele de
recunoatere n zigzag, ducnd la formarea de capete ADN 5 coezive, i sunt structural mai nrudite
ntre ele dect cu EcoRV i PvuII, care cliveaz ADN-ul ducnd la obinerea de capete drepte. BglI, o
endonucleaz care produce capete 3 coezive, este structural mult mai apropiat enzimele EcoRV i
PvuII, dar actualmente nu este considerat ca reprezentant al unei subfamilii diferite.
n ciuda similaritii reduse la nivelul secvenei de aminoacizi, toate endonucleazele de tip II
prezint un centru catalitic similar care const n 5 catene -pliate flancate de 2 -helixuri. n acest
centru catalitic activ, conservat spaial, se regsesc 3 resturi de aminoacizi eseniali n activitatea
catalitic a endonucleazelor. Aceste resturi de aminoacizi sunt reprezentate, n general, de 2 resturi
acide (glutamat sau aspartat) i un rest de lizina (tab.3.3.). Singura excepie o reprezint Bam HI care
conine n situsul activ 3 grupri acide, 2 resturi de glutamat i unul de aspartat.
Pvu II Eco RV Bgl I Eco RI Bam HI Cfr 10I
Asp58 Asp74 Asp116 Asp91 Asp94 Asp134
Glu68 Asp90 Asp142 Glu111 Glu111 Glu204
Lys70 Lys72 Lys144 Lys113 Glu113 Lys190
Tab.3.3. Compoziia n aminoacizi a centrului catalitic activ pentru enzimele
Pvu II, Eco RV, Bgl I, Eco RI, Bam HI si Cfr 10I.

2
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator

Mecanismul de clivare al ADN

Enzimele de restricie de tip II necesit prezena de Mg++ pentru a cliva secvenele de
recunoatere. Deoarece n urma clivrii ADN rezult molecule cu capete 5 fosfat i 3 hidroxil, se
presupune ca legturile fosfodiesterice sunt clivate prin activarea unei molecule de apa i atacul
nucleofilic al acesteia asupra gruprii fosfat. Se consider c ruperea unei legturi fosfodiesterice
necesit 3 componente: o grupare bazic care s activeze molecula de apa nucleofilic; un acid
Lewis, cum ar fi un ion metalic bivalent, necesar pentru a stabiliza sarcinile negative ale fosforului
pentavalent i un acid care va transfera un proton gruprii 3 hidroxil. Toate cele 3 resturi de
aminoacizi din centrul catalitic al unei enzime de restricie de tip II sunt eseniali pentru clivare; mutaii
n oricare din aceste situsuri duc la anularea sau la reducerea drastic a activitii de restricie.
Deoarece situsurile de recunoatere pentru enzimele sistemului II sunt simetrice, pot fi
metilate ambele catene ADN. n aceste condiii, un situs de recunoatere poate fi gsit n stare
complet metilat (cu ambele catene ADN metilate), hemimetilat (doar una dintre catene metilat) sau
nemetilat. Astfel, in vivo, putem ntlni urmtoarele situaii:
- situsurile complet metilate nu sunt supuse aciunilor de restricie sau modificare (metilare);
- situsurile hemimetilate nu sunt recunoscute de enzimele de restricie, dar sunt recunoscute de
metilaze, care determin modificarea catenei nemetilate;
- situsurile nemetilate pot fi inte att pentru restricie ct i pentru metilare; n general, un astfel de
situs este restrictat, fiind foarte rare cazurile n care ADN-ul nemodificat dobindete pattern-ul de
metilare al noii gazde.
Metilazele nu adaug mai multe grupri metil per reacie; dac substratul este reprezentat de ADN
nemetilat, enzima introduce o singur grupare metil, disociaz de pe ADN, fiind necesar o a doua
reacie de asociere la substrat/metilare pentru introducerea celei de-a doua grupri metil. Structural,
metilazele prezinta 2 domenii separate de un an n care este legat ADN-ul; s-a dovedit ca secvena
inta de ADN este denaturat local, restul de baz azotat care urmeaz a fi metilat fiind extras din
dublul helix, este adaugat gruparea metil (n general, donorul de grupari metil este S-adenozil-
metionin), dup care restul de baz azotat este dispus n poziia original.
n unele cazuri, secvenele de recunoatere tetranucleotidice apar n cadrul secvenelor
hexanucleotidice ale altor enzime de restricie. Este cazul enzimelor Mbo I i Sau3A I, care recunosc o
secvena G-A-T-C, n timp ce Bam HI recunoate secvena G-G-A-T-C-C. Deoarece aceste 3 enzime
genereaz acelai tip de capete coezive, fragmentele de ADN obinute prin digestie cu Mbo I sau cu
Sau3A I pot fi clonate ntr-un vector digerat cu Bam HI.
Alte enzime de restricie din cadrul tipului II nu necesit secvene palindromice de
recunoatere (Tipul IIs); aceste enzime vor tia ADN-ul la un numr precis de baze n afara secvenei
de recunoatere. Spre exemplu, Mbo II recunoate secvena 5-G-A-A-G-A-3, i taie la o distan de 8
baze fata de captul 3 al acestei catene, i la 7 baze fa de captul 5 al catenei complementare.
Sisteme de restricie-modificare de Tip I si III
A doua categorie de sisteme de restricie-modificare este reprezentat de tipurile I i III, care
constau n enzime multimerice ce prezint att activitate de restricie ct i activitate de metilare.
Mecanismele de aciune ale acestor enzime sunt diferite unele de altele i de cele ale tipului II, fiind
totodat mai puin ntlnite.
Sisteme de restricie-modificare de tip I
Exista 3 familii de enzime de Tip I, codificate de grupuri de gene nrudite; sistemele Eco B i
Eco K aparin sistemului hsd, sunt primele descoperite, cele mai cunoscute, i reprezint unul dintre
aceste 3 grupuri. O enzim de restricie de tip I const n 3 subuniti diferite (Fig..3.26.). Astfel,
enzima EcoK cuprinde subunitatile R2M2S: subunitatea R este responsabil de restricie, subunitatea
M de metilare iar subunitatea S de recunoterea secvenei int de ADN. n urma recunoasterii
substratului de ctre subunitatea S, legarea enzimei la ADN poate fi urmat fie de metilare fie de
restricie. Activitaile subunitilor R i M sunt exclusive; subunitile M i S pot forma heterodimeri MS,
care exprim funcia de metilare independent de cea de restricie.
Fiecare subunitate este codificat de cte o gena proprie: hsdR, hsdM i hsdS (Fig.3.27.).
+
Mutaii n gena hsdR determin fenotip r m ; ADN-ul nu mai este restricionat, dar este metilat.
- -
Mutaii n hsdS determin un fenotip r m , deoarece complexul enzimatic nu se mai leag la ADN.
Mutaii n hsdM previn att modificarea ct i restricia, ceea ce duce la concluzia c subunitatea M
este cumva implicat n funcionarea subunitii R. Acesta ar putea reprezenta un mecanism de
- +
sigurana, care asigur ca mutantele hsdM s prezinte mai degrab un fenotip r m , dect unul r m
-
care ar fi letal (n absena activitaii metilazei, ar fi restrictat i ADN-ul propriu). Situsurile de
recunoatere pentru EcoB i EcoK sunt structuri bipartite, formate dintr-o secvena specific de 3 pb
separat prin cteva perechi de baze de o secvena specific de 4 pb. Faptul c cele 2 secvene

3
 Cap. 3-2 Endonucleaze de restricie

specifice sunt separate printr-o secven nespecific, sugereaza c ele sunt situate pe aceeai fa a
ADN-ului; secvena nespecific nu este implicat n recunoatere.

hsdR hsdM hsdS Fiecare secven a situsului int este

recunoscut de cte un domeniu distinct al subunitii S.
ADN
Recombinri ntre genele hsdS pot genera noi tipuri de
subuniti de recunoatere care conin o combinaie de
domenii de recunoatere.
Structura situsului de recunoatere este:
ARNm
TGANNNNNNNNTGCT
ACTNNNNNNNNACGA
ARNm transcris de la
al 2-lea start O anumit secvena de ADN este clivat sau
modificat n funcie de starea n care se gasete situsul
int: dac situsul int este complet metilat, enzima se
leag la ADN, dar este eliberat fr reacii ulterioare;
S
dac secvena int este hemimetilat, enzima metileaz
Proteine R M
catena nemetilat, perpetund modelul de metilare al
55kD gazdei; dac situsul int este nemetilat, legarea enzimei
135kD 62kD
duce la clivare. Mutaii care permit enzimei s modifice un
situs nemetilat se gasesc n hsdM, ceea ce sugereaz c
metilaza este raspunztoare de detectarea strii n care
se gsete inta.
Gruprile metil sunt furnizate de S-adenozil-
metionin (SAM), care este convertit n S-adenozil-
Enzima cu functie homocistein n timpul reaciei. n stadiul iniial al reaciei,
de restrictie-modificare SAM acioneaz ca efector allosteric, modificnd
conformaia subunitii S, ceea ce permite legarea
acesteia la ADN. n urma legrii la ADN, enzima
interacioneaza cu ATP, hidroliza acestuia fiind necesar
Complexul cu functie pentru clivare; SAM este eliberat de enzima anterior
de modificare reaciei de restricie (Fig.3.27).
(intilnit numai la EcoB)
Fig.3.26. Structura enzimelor de restrictie de tip I

n cazul enzimelor de tip I, clivarea nu

apare la situsul de recunoastere, ci la Enzima de restrictie
modificare
o distan de circa 1000 pb fa de
S-adenozil-metionina (SAM)
acesta. Cu toate acestea, alegerea
secvenei ce va fi restrictat nu este Forma activata a enzimei
ntru totul ntmpltoare, unele situsuri SAM

fiind clivate preferenial. Reacia de

clivare are loc n 2 etape: mai nti
este clivat una dintre catene ADN, ADN METILAT ADN NEMETILAT
ADN HEMIMETILAT
apoi cealalt caten este clivat n
apropierea primei incizii; clivarea este SAM SAM SAM
urmat de o activitate exonucleazic, ATP +SAH ATP +SAM
nsoit de hidroliza extins a ATP. O
caracteristic interesant a acestor
enzime este aceea c proteina SAM

ramne permanent legat la ADN,

chiar dac clivarea are loc al o
distan de circa 1000 pb de situsul de Enzima se desprinde ADN-ul este complet ADN-ul este clivat la
recunoatere i legare. de pe ADN metilat distanta de situsul de recunoastere

Fig.3.27. Modul de acine al enzimelor de tip I

4
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator

Situs de clivare
Au fost emise 2 ipoteze privind
Situsde legare
relaia dintre situsul de recunoatere i
cel de clivare:
a. enzima se leag la ADN la nivelul
situsului de recunoatere, apoi se
deplaseaz de-a lungul moleculei
ADN pna la nivelul situsului de
rectricie (Fig.3.28.)
b. enzima ramne ataat la nivelul
Enzima se deplaseaza pe ADN secvenei de recunoatere i
[1] determin plierea ADN-ului, prin
interacia cu un alt domeniu de
legare la ADN (Fig.3.28).
Cel de-al doilea model este mai
plauzibil, fiind susinut de date de
microscopie electronic.
ADN-ul este curbat, situsul de clivare
fiind adus in apropierea celui de legare a enzimei [2]

Fig.3.28. Relaia dintre situsul de recunoastere i cel de clizare pentru

enzimele de tip I

Sisteme de restricie-modificare de tip III

Enzimele de restricie i modificare Subunitatea
de tip III sunt mult mai rare, pn n Subunitatea R (108kD)
prezent fiind caracterizate doar 3 astfel de MS (75kD)
sisteme: EcoP1 i EcoP15 codificate de
plasmidele P1 i P15 de la E.coli i Hinf, de
la H. influenzae serotip Rf. Fiecare enzim
este format din 2 tipuri de subuniti:
subunitatea R, responsabil de restricie i
subunitatea SM responsabil pentru
Situs de recunoastere
recunoaterea ADN int i modificare
(Fig.3.29.). Situs de clivare

Fig.3.29. Structura enzimelor de restrictie-modificare de tip III

Activitaile de restricie i modificare sunt exprimate simultan. ntr-o prima etapa, enzima se
leag la ADN, aciune care necesit ATP; n urma legrii, funciile de metilare, respectiv restricie
competiioneaz pentru a reaciona cu ADN-ul. Metilarea va apare la nivelul situsului de recunoatere;
restricia apare la 24-26 pb fa de situsul de recunoatere, probabil pentru c enzima este suficient
de mare pentru a contacta ADN-ul la acest nivel. Restricia const n 2 incizii n trepte, la distana de
2-4pb.
Enzimele sistemului de tip III metileaz resturi de adenin, dar situsurile int pentru P1 i P15
au o caracteristic interesant: pot fi metilate doar pe una din catene. Secvena acestor situsuri este:
AGACC
TCTGG (P1)
CAGCAG
GTCGTC (P15)
n urma replicrii rezult 2 tipuri de situsuri de recunoatere: un situs care prezint restul de
adenin metilat, similar modelului original i un situs nemetilat. Acest din urma situs reprezint o int
att pentru restricie ct i pentru metilare. Ce factori determin ca situsul nemetilat s fie metilat i nu
restrictat? S-a dovedit c exist o diferena n cerinele pentru activitile de metilare respectiv
restricie: metilaza poate recunoate i modifica un singur situs de recunoastere, pe cnd restrictaza
are nevoie de 2 situsuri inversate, ambele nemetilate (Fig..3.30.). Deoarece replicarea a 2 situsuri
inversate duce ntotdeauna la secvene care au unul dintre situsuri metilat, aceste situsuri sunt inte
pentru modificare i nu pentru restricie.

5
 Cap. 3-2 Endonucleaze de restricie

Numrul i dimensiunea
fragmentelor generate de o
*
AGACC GGTCT
*
AGACC GGTCT
enzim de restricie depind de
TCTGG CCAGA TCTGG CCAGA
*
frecvena cu care apar
*
AGACC GGTCT
situsurile de recunoatere ale
TCTGG CCAGA enzimei respective. ntr-o
* Replicare Metilare
*
molecul de ADN care conine
AGACC GGTCT AGACC GGTCT
TCTGG CCAGA TCTGG CCAGA 50% GC, o secven de
* *
recunoatere de 4 perechi de
baze va apare cu o frecvena
de 44 (256) bp, o secvena de
6 bp cu o frecvena de 64
AGACC GGTCT AGACC GGTCT
(1096) bp, iar o secvena de
TCTGG CCAGA TCTGG CCAGA
Restrictie recunoatere de 8 bp cu o
frecvena de 84 (65536) bp.
Fig.3.30. Enzimele tipului III au nevoie de 2 situsuri inversate nemetilate pentru
a exprim activitatea de restricie

Fragmente mici de ADN sunt obinute prin digestie cu enzime care recunosc secvene de 4
bp, cum ar fi Hae III, utile n aplicaii cum ar fi ADN fingerprinting. Pentru cartare sau clonare
genomica, unde sunt necesare fragmente mari de ADN, se folosesc enzime care recunosc secvene
de 8 sau mai multe bp; enzimele care recunosc secvene de 6 bp sunt cel mai des folosite pentru
inserarea de ADN heterolog n vectori de clonare, vectori n care au fost introduse, prin inginerie
genetica, o serie de situsuri unice pentru endonucleaze, cunoscute ca polilinkeri sau situsuri de
policlonare.

Enzimele izoschizomere i neoschizomere

n general, enzimele de restricie recunosc secvene de ADN diferite. Cu toate acestea, din gazde
diferite au fost izolate enzime care au acelai situs de recunoatere. Enzimele care au aceeai
secvena de recunoatere i taie n aceleai poziii se numesc izoschizomere; spre exemplu, secvena
^G-A-T-C
este recunoscut de enzimele Mbo I i Sau3A I, care taie n aceeai poziie; prin urmare aceste
enzime sunt izoschizomere.
O enzim este neoschizomer fa de alt enzim dac ambele enzime recunosc aceeai secvena,
dar au situsuri de clivare diferite:
C^-C-C-G-G-G XmaI
C-C-C^-G-G-G SmaI

Endonucleaze de tip Homing

Aceste endonucleaze se pot autopropaga n cadrul unui genom ca urmare a funciei lor
catalitice. Aceste enzime se gsesc n toate regnurile biologice, i prezint mecanisme care asigur
viabilitatea genomului gazda. O astfel de clasa de enzime (notata cu prefixul I, cum ar fi, spre
exemplu, I-CreI) sunt codificate de ORF-uri coninute n grupul I de introni de la eucariote i bacterii,
ca i n intronii grupului archaea. O alt clas de astfel de enzime (notat cu prefixul PI PI-SceI)
rezult din splicingul unor proteine precusor; n urma procesrii acestei proteine precursor, rezult o
endonucleaz i proteina homing funcional. Aceste endonucleaze invadeaz alele care nu conin
secvene de ADN codificatoare de endonucleaze, realiznd rupturi dublu-catenare la nivelul unor
secvene specifice de ADN; procesele de reparare i recombinare care urmeaza duc la conversia
alelei respective ntr-o form care codific pentru endonucleaze. Exist mai multe caracteristici care
deosebesc endonucleazele tip homing de endonucleazele de tip II tipice. Endonucleazele tip homing
recunosc secvene de ADN lungi, degenerate, de 15-40 pb. n al doilea rnd, endonucleazele de
gazd prezint similaritate de secvena, la nivelul secvenei de aminoacizi, secvena consens cel mai
des ntlnit fiind LAGLIDADG, care, n unele cazuri se ntlnete de 2 ori n cadrul aceleiai secvene
proteice.

6
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator

Recomandri generale pentru realizarea reaciilor de digestie a unor molecule de ADN cu

endonucleaze de restricie

Principalele componente ale unei reacii de restricie ADN

Componentele obligatorii ale oricrei reacii de restricie ADN sunt :
1. Enzima de restricie
2. ADN
3. Tamponul de reacie
4. a.d.s. (ap distilat steril)
Aceste componente se adaug n urmtoarea ordine: a.d.s., tampon, ADN, enzim , toate n fundul
unui tub Eppi mic (0.5 ml) steril, si nu pe peretii acestuia.
Se lucreaza steril, cu mnui i se schimb vrful pipetei la fiecare component al reaciei i la fiecare
tub de reacie (cu excepia primului component a.d.s.)
Opional: n afar de componentele obligatorii, n anumite reacii de restricie este recomandabil s se
adauge:
BSA (Bovine Seric Albumine) n concentraie final de 100 ug/ml (n mod special n reaciile de
restricie a unor molecule mari de ADN, de ex. ADN cromosomal, sau n cazul
anumitor enzime de restricie pentru care se consult cataloagele productorilor).
RNazaA n concentraie final de 100-200 ug/ml (n cazul n care n etapele de purificare a ADN
nu a fost fcut si tratament cu RNazaA sau n cazul RFLP pe ADN cromosomal).
Enzima
1 unitate [U] de activitate a unei enzime de restricie este definit ca fiind cantitatea de enzim
necesar pentru digestia complet a 1 ug ADN substrat, n 60 min, la temperatura adecvat, folosind
un tampon adecvat, ntr-un volum total de reacie de 50 ul. Aceast definiie este valabil n cazul
folosirii ADN din diverse virusuri (fag , fag T4, adenovirusul Ad-2, virusul SV40) i pentru vectorii de
clonare/exprimare.
Cantiti recomandate :
Pentru digestia unor vectori de clonare 1 5 U / ug ADN
Pentru digestia unor molecule de ADN plasmidial extras din tulpini naturale de MO 4 8 U / ug ADN
Pentru digestia unor molecule de ADN cromosomal 5 15 U / ug ADN

Enzimele de restricie se stocheaz la 200C. La utilizare se menin pe gheata.

n cazul majoritii enzimelor de restricie, concentraia produsului comercializat este de 10-20 U/l.
Din acest motiv, n multe situaii este necesar efectuarea unei prediluii a soluiei stoc de enzim n
tampon de reacie.
Alegerea enzimei
Este preferabil s se fac n funcie de ADN-ul prob, fiind necesar s se tie pentru ce enzime de
restricie prezint acesta situsuri de recunoatere.
Alegerea enzimelor de restricie depinde i de scopul aplicaiei- pentru restricie de ADN plasmidial se
folosesc enzime obinuite (Eco RI, Hind III etc.), n timp ce pentru RFLP genomic, spre exemplu, se
poate opta fie pentru enzimele uzuale (cele de mai sus), fie pentru enzime de restricie cu situsuri
rare.
Se recomand, de asemenea, ca volumul de enzim utilizat s reprezinte ntre 1/10 i 1/5 din volumul
total de reacie.
ADN (cantitatea de prob, puritatea si concentraia acestuia)
n reaciile de restricie, probele de ADN trebuie s fie:
- suficient de pure, mai ales n ceea ce privete contaminanii proteici;
- suficient de concentrate, dat fiind c se recomand ca volumul probei de ADN s nu depaeasc
1/3-1/2 din volumul total de reacie;
ntr-o reacie de digestie trebuie introdus o cantitate de ADN suficient de mare pentru ca n gel s se
obina fragmentele de dimensiunea dorit sau (n funcie de aplicaie) benzi vizibile.
Tamponul de reactie
Se livreaz n preul enzimei. Este comercializat n form 10X (de zece ori concentrat), motiv pentru
care se adaug n amestecul de reacie n proporie de 1/10 din volumul total al acestuia.
Temperatura de reacie
Este de 370C, pentru majoritatea enzimelor de reacie. Trebuie verificat, ns, ntotdeauna ntr-un
catalog de produse, deoarece exist i enzime de restricie care au optimum-ul de activitate la diferite
alte temperaturi.

7
 Cap. 3-2 Endonucleaze de restricie

Timpul de reacie
Indiferent de volumul de reacie, enzima de restricie utilizat, sau varianta tehnicii de lucru aplicate
timpul minim de reacie este de o or.
Tipul probei ADN digerate Timpul de reacie
ADN fag , vectori 1.5 - 2.5 h
Plasmide naturale 3-5h
ADN cromosomal 6 - 24 h

Variante de stopare a reaciei de restricie

- scderea temperaturii amestecului de reacie pn la 200C;
- adugarea la amestecul de reacie a 0,2 volume (fa de volumul total al amestecului) de
EDTANa2 0.5 M;
- adugare de BFE sau BFER (n vederea ncrcrii gelului de electroforez).
Electroforeza n gel de agaroz
Concentraia agarozei se apreciaz n funcie de dimensiunile presupse ale fragmentelor de digestie-
spre exemplu, n cazul fragmentelor obinute la digestia ADN sau a vectorilor se utilizeaz agaroza
0,8- 0,9 %. Tamponul de electroforez folosit: TBE 0.5X