ENZIME DIN HIPERTERMOFILE

Enzime xianolitice din hipertermofile

Au fost inregistrate numeroase rapoarte despre productia, proprietatile si aplicatiile

xylanazelor in ultimii 25 de ani. Dar cunostiintele privind hemicelulazele exitente in bacteriile
extrem termofile (Aquifex sp. Si Thermatoga sp.) sunt inca limitate si se cunosc putine despre
aceste enzyme la archae.
Prima descrierea a aparitiei xilanazelor in bacteriile extrem termofile a fost facuta de catre
Bragger et al iar recent au fost purificate doua endoxylanaze extreme de termostabile denumite
Xyn A si Xyn B din Thermotoga maritima. S-a constatat ca majoritatea xylanazelor inalt
termostabile investigate pana in acest moment apartin acestei familii enzimatice.
Interesant este ca in ultima decada, enzimele xyanolitice archaene au fost descoperite in
doua tulpini de Thermophilum, izolate in Noua Zeelanda, care pot creste la 88ºC si un pH de 6
dar nu se pot face studii mai detaliate deoarece cresterea tulpinilor de Thermophilum este foarte
dificila.
Recent, o xylanaza archaela a fost detectata in extractul unui hipertermofil denumit
Pyrodictium abyssi. Enzima a prezentat activitate optima la 110ºC si un pH de 6, de asemenea
este foarte stabila din punct de vedere termic prezentand activitate si dupa o incubare de 100
minute la 105ºC. [important]

[sursa: articolul Extremophiles: as a source of novel enzymes for industrial app]

Xilanul este o molecula heterogena ce constituie principalul compus polymeric al

hemicelulozei, o fractiune din peretele cellular al unei plante si care constituie un rezervor major
de carbon fixat in natura.
Pentru degradarea completa a xilanului este nevoie de actiunea a numeroase enzyme printre
care xilanaze, xilohidrolaze si xilobioze.
In ultimii ani, interesul major acordat xilanazelor termostabile s-a datorat implicarii acestei
enzyme in albirea hartiei fiind o alternativa la inalbitoarele uzuale foarte daunatoare pentru
mediu.
Totodata, xilanazele provenite de la microorganisme moderat termofile se denatureaza foarte
rapid la temperature de peste 70ºC. Astfel, pana la ora actuala au fost descoperite putine
microorgasnime extreme termofile ce sunt capabile sa creasca pe xilan si totodata sa secrete
enzime- xilanaze ce sunt active si stabile la termperaturi mari, acestea apartinand familiilor
Thermotogales si Dictyoglomus thermophilum.
Cele mai termostabile endoxilanaze care au fost descrise pana in acest moment sunt cele
provenite de la Thermotoga sp, tulpina FjSS3-B.1 (Simpson et all, 1991), T. maritime
(Winterhalter and Liebl, 1995), T. neapolitana (Bok et all, 1994) si T. thermarum (Sunna et all,
1996). Aceste enzime sunt active in intervalul 80-105ºC.
Gena din T. maritima ce codifica o xilanaza termostabila a fost deja clonata si exprimata in
specia E. coli iar comparatia dintre xilanaza recombinanta de la T. maritima si enzima
comerciala Pulpenzyme (Yand and Eriksson, 1992) a demonstrat ca xilanaza termostabila este de
interes in industria celulozei si a hartiei (Chen et al, 1997).
 Enzime implicate in hidrolizarea amidonului din termofile si hipertermofile

Numeroase microorganisme, inclusive bacteriile, fungi si drojdiile sunt capabile sa degradeze

amidonul si polizaharidele derivate prin actiunea enzimelor. Microorganisme termofile si
hipertermofile au fost descoperite crescand pe mediu cu amidon ceea ce indica faptul ca poseda
enzyme ce degradeaza amidonul. Activitate amilolitica a fost detectat in 2 specii de Sulfolobales
(S. acidocaldarius si S. solfataricus) si in tulpini de Thermophilium, Desulfurococcus,
Thermococcus si in bacteria termofilica Thermotoga.
Dupa cresterea pe amidon, bacteria termofilica Thermotoga maritime produce enizme
amilolitice care contin trei componente diferite: β-amilaza, α-amilaza si glucoamilaza. Acestea
au prezentat inalta stabilitate termica cu o limita superioara in jurul temperaturii de 95°C.
Enzime amilolitice extrem de stabile s-a descoperit ca sunt produse de hipertermofilele
Pyrococcus woesei si P. furiosus iar genele care codifica aceste amilaze inalt termostabile au fost
clonate si exprimate in E. coli. […]
Majoritatea amilazelor archaeale din Thermococcus celer, Desulfurococcus mucosus,
Staphylothermus marinus au prezentat activitate optima la 100ºC, cu exceptia primei specii ce
are temperature optima la 90ºC. O singura amilaza extracelulara termostabila de la
Thermococcus profundus a expus activitate maxima la pH 5.5 si este stabila in intervalul de pH
5.9-9.8.
O alta amilaza extracelulara a fost izolata din supernatante de cultura ale Sulfolobus
solfataricus in timpul cresterii pe amidon iar nivelul acesteia in supernantant variaza in functie de
sursa de carbon folosita pentru cresterea organismului.

[sursa: articolul Extremophiles: as a source of novel enzymes for industrial app ]

Amidonul este compus exclusiv din unitati de α-glucoza ce sunt conectate prin legaturi α-1,4
sau α-1,6 glicozidice, formand 2 componente moleculare cu masa moleculara mare: amiloza (15-
25%) si amilopectina (75-85%). Datorita acestei compozitii complexe a amidonlui este nevoie
de un numar mare de enzime pentru a-l degrada. Acestea pot fi impartite in 2 categorii: enzime
cu actiune interna (α-amilaze) ce duc la formarea de oligozaharide si cu actiune externa (β-
amilaze, glucoamilaze si α-glucozidaze) cu producere de oligo- si/sau monozaharide.
Enzimele capabile sa hidrolizeze legaturile α-1,6- glicozidice din pullulan si amilopectina se
numesc enzime “debranching” sau pullulanaze. Acestea sunt clasificate in 2 grupuri: tipul I ce
hidrolizeaza specific legaturile α-1,6 din pullulan si din oligozaharidele ramificate si tipul II
(amilopullulanaze) ce ataca legaturile α-1,6 din pullulan precum si pe cele α-1,4 din alte
oligozaharide si polizaharide, acestea din urma fiind majoritare.
Descoperirea unor enzime ce hidrolizeaza amidonul extem de termostabile precum amilazele
si pullulanazele care sunt active in acelasi conditii, ar imbunatati semnificativ procesul industrial
de bioconversie al amidonului. (lichefiere, zaharisire si isomerizare).
Enzimele provenite din microorganisme hipertermofile ce sunt active la temperaturi de peste
100°C si in intervalul de pH necesar sunt urmarite ca si candidati pentru utilizarea in procesul de
bioconversie a amidonului iar unele din acestea sunt amilazele. Familia α-amilazelor este
constituita dintr-un grup larg de amidon-hidrolaze si enzime derivate, cunoscute sub denumirea
de familia glicozil hidrolazelor 13. (Henrissat, 1991).
α–amilazele termostabile au fost izolate de la speciile Pyrococcus woesei, P. furiosus (Koch et
al, 1991), si Thermococcus profundus (Chung et al, 1995). Temperatura optima de activitate a
acestor enzime este de 100°C. Activitate amilolitica a fost observata de asemenea si in
hipertermofilele archaeane din genul Sulfolobus, Desulfurococcus, Thermococcus si
Staphylothermus (Bragger et al, 1989, Canganella et al, 1994)

Pullulanazele din archaeale termofile si hipertermofile

Odata cu descoperirea Klebsiella pneumonia, mai multi cercetatori au purficat si caracterizat

mai multe pululanaze microbiene din bacteriile termofile si archaeane (11,12,41,85). Printre
enzimele amilolitice produse de archaeonul termofilic Pyrococcus furiosus, pululanazele prezinta
o temperatura optima la 100°C si un grad inalt de termostabilitate (5).
O amilo-pululanaza extracelulara de la Thermococcus litoralis (6) prezinta activitate optima
la 110°C iar prezenta ionului de Ca extinde intervalul de temperatura ce poate fi masurat (mai
mult de 130-140°C). De asemenea, s-a identificat o pululanaza extracelulara izolata dintr-un
mediu de cultura dupa fermentarea amidonului, Thermococcus hydrothermalis (29), productia
enzimatica extracelulara fiind de 80% din totalul pululanazelor produse.
Pululanazele termoactive au fost descoperite la urmatoarele specii: Thermococcus celer,
Desulfurococcus mucosus, Staphylothermus marinus, enzimele prezentand activitate optima la
temperatura de 90-105°C.
Pululanaza din Pyrococcus woesei a fost purificata iar gena ulterior clonata si exprimata la
specia de E. coli. Cele 2 enzime sunt identice ca si proprietati fizico-chimice si prezinta o
activitate optima la 100°C si un pH de 6. (41)
Spre deosebire de pululanazele termoactive cunoscute pana acuma, cele din Pyrodictium
abyssi au prezentat cea mai inalta activitate la un pH alcalin de 9.0 si o temperatura optima foarte
ridicata (100°C). Totodata, rezultatele preliminare au scos la iveala faptul ca aceasta specie
“secreta” o enzime real de deramificare, pululanaza de tipul I, foarte rara in randul bacteriilor si
archaeaelor. (2)