Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Modele Experimentale PDF
Modele Experimentale PDF
Generalitati
Cuprins
1
a. Stabilirea clară a obiectivelor experimentului este foarte importantă pentru:
- obţinerea informaţiilor într-un mod raţional şi economic
- alegerea modelului experimental care oferă maximul de informaţii cu un număr
minim de investigaţii efectuate
- realizarea unui număr minim de repetări ale aceluiaşi experiment
- utilizarea unui număr minim necesar de animale de laborator
- minimalizarea disconfortului sau durerii animalului de laborator.
Orice cercetător care planifică un experiment pe animale de laborator ar trebui să ia în
considerare în primul rând aspectele etice implicate utilizând cei 3 R stabiliţi de Russell and Burch
(1959):
- replace – oricând este posibil se recomandă înlocuirea animalelor de laborator cu
culturi celulare sau simulări computerizate
- refine – minimalizarea durerii şi stressului pentru animalul de laborator
- reduce – folosirea numărului minim de animale necesare pentru atingerea
obiectivelor studiului experimental.
Utilizarea unui model experimental are multiple limitări. Pot fi extrapolate rezultatele obţinute cu
ajutorul modelului la situaţia reală de la care s-a pornit? Ce probleme etice sau legale determină
utilizarea anumitor modele?
Un model experimental animal trebuie să îndeplinească mai multe criterii:
- o reproducere cât mai exactă a fenomenului patologic observat la om
- posibilitatea unei game largi de investigaţii
- identificarea factorilor care diferenţiază modelul experimental animal de procesul patologic aşa
cum este descris la om
2
- posibilitatea extrapolării datelor
- posibilitatea de a utiliza mai multe specii de animale pentru acelaşi model
- realizare facilă a modelului experimental animal.
Etapa premergătoare alegerii unui model experimental implică 3 paşi importanţi:
1. Identificarea celui mai potrivit model experimental pe baza informaţiilor
actuale în ceea ce priveşte evoluţia procesul patologic studiat la animalul
de laborator
2. Efectuarea unor teste care să valideze şi să standardizeze modelul
experimental
3. Stabilirea relevanţei rezultatelor obţinute la specia utilizată şi a
posibilităţii de extrapolare a rezultatelor la om
Modelul experimental ales trebuie să permită testarea corespunzătoare a ipotezei de lucru şi
evaluarea unor parametri relevanţi pentru obiectivele experimentului. De exemplu, pentru testarea
efectului hipoglicemiant al unei substanţe se poate folosi un model experimental care presupune
inducerea diabetului zaharat la şobolan sau pentru testarea efectului analgezic se foloseşte un model
experimental care presupune inducerea durerii şi cuantificarea acesteia după administrarea substanţei
presupus analgezice. După alegerea modelului experimental ce va fi folosit, se alege specia de animal de
laborator pe care se va aplica respectivul model.
După ce s-a stabilit modelul experimental care va fi utilizat, se identifică variabilele independente -
factorii de influenţă (de ex.greutatea, tipul de tratament aplicat, etc) şi variabilele dependente –
răspunsurile sistemului – parametrii masurati (de ex. valoarea tensiunii arteriale sistolice sau volumul
edemului inflamator, etc.)
SISTEM (animalul de
laborator) 3
În general, variabilele independente sunt reprezentate de tratamentul aplicat (substanţele
administrate) fiecărui lot de animale.
Sensibilitatea unui parametru este cu atât mai mare cu cât respectivul parametru este capabil să
deceleze diferenţe mai mici de variaţie. Cu cât sensibilitatea este mai mare cu atât există un risc mai mic
de rezultate fals negative. Cu alte cuvinte, cu cât sensibilitatea este mai mare cu atât există un risc mai
mic ca pe baza acelui parametru să se spună că nu s-a întâmplat nimic când de fapt s-a întâmplat un
eveniment.
Specificitatea unui parametru este cu atât mai mare cu cât acel parametru are calitatea de a varia
numai când variază boala evaluată. Cu cât specificitatea este mai mare cu atât există un risc mai mic de
valori fals pozitive.
Stabilitatea se referă la faptul că acelaşi parametru măsurat la intervale diferite de timp furnizează
aceeaşi valoare dacă boala nu a evoluat.
În fine validitatea apreciază în ce măsură parametrul utilizat măsoară cu adevărat ceea ce se doreşte
a se măsura.
4
Variabilele care vor fi analizate se stabilesc înainte de efectuarea fiecărei experienţe şi nu este
recomandată modificarea lor (de ex. modificarea dozei în timpul experienţei) sau introducerea de noi
variabile în timpul experienţei.
5
În realizarea designul experimental trebuie să se ţină cont de faptul că este obligatorie folosirea de
loturi martor/control negativ cărora nu li se aplică factorul de influenţă (tratamentul) testat ci doar un
tratament placebo (de ex. excipientul medicamentului testat) sau niciun tratament. Uneori este necesară
şi folosirea de loturi referinţă/control pozitiv cărora li se aplică un factor de influenţă cu efect demonstrat
în modelul experimental utilizat. De exemplu în testarea unei substanţe cu presupus efect antidiabetic se
foloseşte un lot control negativ căruia i se administrează doar excipienţii substanţei testate (excipienţii –
substanţe fără activitate biologică) şi un lot control pozitiv căruia i se administrează insulină (substanţă
cu efect hipoglicemiant clar demonstrat şi la animalele diabetice).
Se pot folosi diferite tipuri de design experimental:
- Designul paralel – este cel mai folosit şi presupune testarea mai multor loturi in paralel; pentru toate
loturile experienţa începe şi se termină în aceleaşi timp; succesiv, se foloseşte câte un subiect din fiecare
lot (nu se testează întâi un lot apoi al doilea, etc ci primul subiect din primul lot, apoi primul subiect din
lotul 2, etc.). Analiza statistică a datelor obţinute într-un experiment cu design paralel este simplă iar
rezultatele obţinute pentru fiecare lot pot fi analizate mai întâi independent şi apoi comparate.
Lotul A
Lotul B
Lot control
Moment Moment
iniţial final
Lot A : C Lot B : C
Lot B : T Lot A : T
De exemplu, în prima perioadă a experimentului lotul A este lotul control (A:C) iar lotul B este
lotul tratat (B:T). După o pauză (wash-out) în care se presupune că animalul de laborator revine la starea
iniţială, anterioară perioadei I, (fapt care nu se prea întâmplă în cazul animalelor de laborator!) începe
perioada II în care lotul B devine lotul control (B:C) iar lotul A, lotul tratat (A:T).
Acest tip de design experimental prezintă unele avantaje: sunt necesare mai puţine animale de
laborator iar fiecare animal este propriul său martor, dar dezavantajele sunt importante: în perioada de
wash-out nu toate animalele revin la starea iniţială, prelucrarea statistică a datelor este mai complicată
iar loturile trebuie să fie foarte omogene pentru obţinerea unor rezultate fiabile.
- designul factorial – permite testarea unor posibile interacţiuni între diferite tratamente sau proceduri şi
diferite caracteristici ale animalului de laborator. De exemplu testarea efectului a 3 substanţe asupra
şoarecilor - 3 linii genetice diferite (vezi tabelul de mai jos). Numărul de şoareci necesari pentru fiecare
lot va fi evaluat statistic (ecuaţia Mead’s) pentru a se putea evalua corect rezultatele obţinute.
Linia genetică NMR1 C57B CB6F
Substanţa 1 4 4 4
Substanţa 2 4 4 4
Substanţa 3 4 4 4
Control 4 4 4
7
- designul secvenţial – nu se foloseşte în experimentele realizate pe animale de laborator ci doar în
studiile clinice în care nu este posibilă recrutarea în acelaşi moment a unui număr suficient de pacienţi,
ci succesiv.
După stabilirea unui design experimental, pot fi efectuate studii pilot realizate pe un număr mic
de animale (1-3/lot) pentru testarea logisticii experimentului şi pentru a obţine eventuale date în ceea ce
priveşte posibilul răspuns care pot fi folosite în stabilirea numărului de animale /lot pentru următoarele
experimente: exploratorii sau de confirmare. Experimentele exploratorii sunt realizate atunci când nu
există date în ceea ce priveşte un anumit tratament sau când se testează toxicitatea unei substanţe şi au
un număr mare de variabile dependente măsurate. Experimentele de confirmare folosesc date obţinute în
experimentele exploratorii şi vizează măsurarea unui număr redus de variabile dependente care prezintă
interes şi sunt menţionate în ipoteza de lucru a experimentului.
8
găzduite în condiţii de mediu standard pentru a evita stressul care reprezintă un alt factor important de
variabilitate.
Pentru randomizare se folosesc programe statistice care atribuie numere aleatorii fiecărui subiect.
Loturile obţinute după randomizare trebuie să fie omogene şi, ideal, să conţină acelaşi număr de animale
de laborator.
După randomizarea animalelor utilizate într-un experiment ar trebui realizată „secretizarea” astfel
încât să fie evitată intervenţia unor elemente subiective în măsurarea rezultatelor. „Secretizarea”
presupune codificarea tratamentelor (substanţelor) aplicate, animalelor folosite şi a diferitor probe (când
este cazul) şi necunoaşterea acestei codificări de către persoanele care realizează efectiv experimentul.
Ulterior, după înregistrarea rezultatelor şi analiza lor, schema de codificare este dezvăluită şi are loc
interpretarea finală a datelor.
9
4. Cântărirea animalelor de laborator înainte de experiment – o etapă foarte
importantă deoarece de obicei se administrează doze/kg corp
5. Ordinea şi intervalul de administrare al substanţelor – se realizează un orar
în care se notează fiecare animal de laborator folosit în experiment în
funcţie de ordinea de administrare a substanţelor (de ex.primul şoarece din
lotul A, după 5 minute primul şoarece din lotul B, după încă 5 minute al
doilea şoarece din lotul A, etc. într-un experiment cu design paralel care
foloseşte 2 loturi de şoareci, A şi B).
6. Descrierea amănunţită a testului care va fi efectuat
7. Definirea modului de măsurare a parametrilor evaluaţi
8. Ordinea de testare a animalelor de laborator şi intervalul dintre testări – se
realizează un orar în care se notează fiecare animal de laborator în ordinea
testării.
Ora Soarece Greutate Vol. soluţiei administrate (se calculează funcţie de
concentraţia soluţiei şi de doza administrată/kg corp
..........
Ex. de orar de administrare: experiment cu design paralel realizat pe 2 loturi de şoareci; administrarea
substanţelor se efectuează din 5 în 5 minute.
Ora Soarece Parametrul 1 Parametrul 2
..........
Ex. de orar de testare: experiment cu design paralel realizat pe 2 loturi de şoareci; testarea şoarecilor se
realizează la o oră după administrarea substanţelor cu urmărirea a 2 parametri; testul durează 5 minute
ceea ce justifică alegerea intervalului de 5 minute în cazul administrării substanţelor.
10
Pentru a obţine rezultate corecte şi pentru a reduce numărul factorilor care ar putea influenţa
desfăşurarea experimentului (experienţelor), protocolul experimental trebuie să fie complet, riguros şi să
corespundă designului experimental stabilit. Toate persoanele implicate în efectuarea experimentului
trebuie să cunoască protocolul experimental şi sarcinile care le revin (pentru a evita încurcăturile ☺!!! )
Conform definitiei, modelul experimental presupune inducerea unui proces patologic la animalul de
laborator. Cu ajutorul modelelor experimentale se testeaza diferite efecte ale medicamentelor.
11
Testul placii incalzite presupune inducerea durerii prin aplicarea unui stimul termic. Animalul este
plasat pe o placă încălzită la aproximativ 55ºC, temperatura ce trebuie menţinută constantă în timpul
experimentului. Timpul de reacţie se măsoară în momentul în care animalul atinge placa şi până când
începe să-şi lingă labele sau să sară. Un medicament analgezic creste timpul pana la aparitia primelor
semne de disconfort.
Medicamente sedative – pentru testarea acestor medicamente se poate folosi un test care
permite masurarea activitatii locomotorii stiindu-se ca sedativele scad acest tip de activitate.
Testul de explorare simpla - permite măsurarea activităţii motrice in situaţii libere a fiecarui
animal de laborator (şoareci). Se foloseste o cutie de plexiglas, transparenta pe a carei podea sunt
marcate 20 de carouri cu latura de 8 cm (4 x 5 carouri). Fiecare soarece estet pus într-un colţ al cutiei
(acelaşi colţ pentru toţi şoarecii) şi timp de 5 minute se numără carourile prin care şoarecele trece cu
toate cele 4 lăbuţe. Un medicament sedativ scade numarul de carouri parcurse de soarecele tratat.
Medicamente anxiolitice – animalul de laborator este pus in situatii cunoscute a induce o stare
de anxietate.
12