Sunteți pe pagina 1din 12

Modele experimentale realizate pe animale de laborator

Generalitati

Motto: Science is built up of facts, as a house is built of stones; but an


accumulation of facts is no more a science than a heap of stones is a house. ~ Henri
Poincaré, Science and Hypothesis, 1905

Cuprins

a. Stabilirea clară a obiectivelor experimentului


b. Alegerea modelului experimental
c. Stabilirea variabilelor independente şi dependente
d. Alegerea designului şi stabilirea programului experimental
e. Randomizarea şi identificarea factorilor de variabilitate care ar putea influenţa procesul
investigat
f. Realizarea protocolului experimental
g. Efectuarea experimentului şi colectarea datelor
h. Analiza statistică a rezultatelor experimentului

1
a. Stabilirea clară a obiectivelor experimentului este foarte importantă pentru:
- obţinerea informaţiilor într-un mod raţional şi economic
- alegerea modelului experimental care oferă maximul de informaţii cu un număr
minim de investigaţii efectuate
- realizarea unui număr minim de repetări ale aceluiaşi experiment
- utilizarea unui număr minim necesar de animale de laborator
- minimalizarea disconfortului sau durerii animalului de laborator.
Orice cercetător care planifică un experiment pe animale de laborator ar trebui să ia în
considerare în primul rând aspectele etice implicate utilizând cei 3 R stabiliţi de Russell and Burch
(1959):
- replace – oricând este posibil se recomandă înlocuirea animalelor de laborator cu
culturi celulare sau simulări computerizate
- refine – minimalizarea durerii şi stressului pentru animalul de laborator
- reduce – folosirea numărului minim de animale necesare pentru atingerea
obiectivelor studiului experimental.

b. Alegerea modelului experimental


Conform Oxford English Dictionary un model este o reprezentare a unui obiect sau proces real care
este folosită pentru testarea unor ipoteze de lucru sau pentru simplificarea unor probleme complexe. Un
model experimental animal poate fi definit ca un organism viu care prezintă un proces patologic natural
sau indus şi care este foarte asemănător cu acelaşi proces patologic întâlnit la om (de ex. modele
experimentale animale utilizate pentru studiul inflamaţiei sau durerii).

Utilizarea unui model experimental are multiple limitări. Pot fi extrapolate rezultatele obţinute cu
ajutorul modelului la situaţia reală de la care s-a pornit? Ce probleme etice sau legale determină
utilizarea anumitor modele?
Un model experimental animal trebuie să îndeplinească mai multe criterii:
- o reproducere cât mai exactă a fenomenului patologic observat la om
- posibilitatea unei game largi de investigaţii
- identificarea factorilor care diferenţiază modelul experimental animal de procesul patologic aşa
cum este descris la om
2
- posibilitatea extrapolării datelor
- posibilitatea de a utiliza mai multe specii de animale pentru acelaşi model
- realizare facilă a modelului experimental animal.
Etapa premergătoare alegerii unui model experimental implică 3 paşi importanţi:
1. Identificarea celui mai potrivit model experimental pe baza informaţiilor
actuale în ceea ce priveşte evoluţia procesul patologic studiat la animalul
de laborator
2. Efectuarea unor teste care să valideze şi să standardizeze modelul
experimental
3. Stabilirea relevanţei rezultatelor obţinute la specia utilizată şi a
posibilităţii de extrapolare a rezultatelor la om
Modelul experimental ales trebuie să permită testarea corespunzătoare a ipotezei de lucru şi
evaluarea unor parametri relevanţi pentru obiectivele experimentului. De exemplu, pentru testarea
efectului hipoglicemiant al unei substanţe se poate folosi un model experimental care presupune
inducerea diabetului zaharat la şobolan sau pentru testarea efectului analgezic se foloseşte un model
experimental care presupune inducerea durerii şi cuantificarea acesteia după administrarea substanţei
presupus analgezice. După alegerea modelului experimental ce va fi folosit, se alege specia de animal de
laborator pe care se va aplica respectivul model.

c. Stabilirea variabilelor independente şi dependente

După ce s-a stabilit modelul experimental care va fi utilizat, se identifică variabilele independente -
factorii de influenţă (de ex.greutatea, tipul de tratament aplicat, etc) şi variabilele dependente –
răspunsurile sistemului – parametrii masurati (de ex. valoarea tensiunii arteriale sistolice sau volumul
edemului inflamator, etc.)

Factori de influenţă (substanţa Răspunsuri (parametrii măsuraţi în


administrată) timpul experimentului)

SISTEM (animalul de
laborator) 3
În general, variabilele independente sunt reprezentate de tratamentul aplicat (substanţele
administrate) fiecărui lot de animale.

Variabilele dependente sunt reprezentate de parametrii evaluaţi în timpul experimentului şi pot fi de


tip cantitativ (date numerice obţinute prin măsurători) sau calitative (scoruri, aprecieri calitative de genul
0, +, ++, +++). Este de preferat utilizarea parametrilor cantitativi deoarece numărul necesar de animale
este mai scăzut decât în experimentele care evaluează parametrii calitativi. Nu se recomandă
transformarea parametrilor calitativi în parametri cantitativi şi astfel calcularea de medii şi deviaţii
standard.

Caracteristicile parametrilor masurati:

Sensibilitatea unui parametru este cu atât mai mare cu cât respectivul parametru este capabil să
deceleze diferenţe mai mici de variaţie. Cu cât sensibilitatea este mai mare cu atât există un risc mai mic
de rezultate fals negative. Cu alte cuvinte, cu cât sensibilitatea este mai mare cu atât există un risc mai
mic ca pe baza acelui parametru să se spună că nu s-a întâmplat nimic când de fapt s-a întâmplat un
eveniment.

Specificitatea unui parametru este cu atât mai mare cu cât acel parametru are calitatea de a varia
numai când variază boala evaluată. Cu cât specificitatea este mai mare cu atât există un risc mai mic de
valori fals pozitive.

Fiabilitatea se evaluează prin aprecierea reproductibilităţii şi concordanţei. Reproductibilitatea se


referă la faptul că acelaşi parametru măsurat de mai multe ori în aceleaşi condiţii de acelaşi investigator
furnizează de fiecare dată aceeaşi valoare. Concordanţa se referă la faptul că acelaşi parametru măsurat
de mai multe ori în aceleaşi condiţii de investigatori diferiţi oferă rezultate apropiate.

Stabilitatea se referă la faptul că acelaşi parametru măsurat la intervale diferite de timp furnizează
aceeaşi valoare dacă boala nu a evoluat.

În fine validitatea apreciază în ce măsură parametrul utilizat măsoară cu adevărat ceea ce se doreşte
a se măsura.

4
Variabilele care vor fi analizate se stabilesc înainte de efectuarea fiecărei experienţe şi nu este
recomandată modificarea lor (de ex. modificarea dozei în timpul experienţei) sau introducerea de noi
variabile în timpul experienţei.

În afară de variabilele independente şi dependente definite de experimentator, în orice studiu


experimental intervine un anumit număr de variabile „necontrolate” (ritmul circadian, etc.) care trebuie
luate în considerare când se realizează designul experimental şi analiza datelor (vezi randomizarea).

d. Alegerea designului şi stabilirea programului experimental

Designul experimental reprezintă modalitatea de alcătuire (randomizare, etc.) a loturilor utilizate în


experiment, tratamentul aplicat fiecărui lot, momentul testării/testărilor fiecărui lot. În realizarea
designul experimental trebuie să se ţină cont de: obiectivele studiului, de datele existente privind
caracteristicile farmacodinamice şi farmacocinetice ale substanţelor folosite, de tipul de animal folosit în
experiment, precum şi de modelul experimental utilizat. Din motive etice şi economice este foarte
important ca designul unui experiment realizat pe animale de laborator să fie corect şi să folosească
numărul minim necesar de animale pentru îndeplinirea obiectivelor ştiinţifice fără a împiedica
observarea unor efecte biologice importante şi fără a fi necesară repetarea experimentului.
În general, o singură experienţă nu este suficientă pentru atingerea obiectivelor experimentale iar în
acest caz este necesar un program experimental care să organizeze şi să structureze activitatea
experimentală. Acest program trebuie să includă o succesiune logică şi economică de experienţe care să
urmărească obiectivele experimentale. Pot fi realizate experimente monofactoriale în care se variază o
singură variabilă independentă dar acest tip de experimente sunt neeconomice. Se preferă experimentele
factoriale care permit varierea simultană a mai multor factori după un anumit algoritm care permite şi
studiul interacţiunilor dintre factori.
Designul experimental depinde de obiectivele studiului şi trebuie planificat în detaliu înaintea de
începerea efectivă a experimentului, realizându-se protocoalele de experiment şi stabilindu-se metoda
statistică de analiză a datelor. Un experiment cu un design corect evită apariţia erorilor şi are suficientă
putere statistică pentru detectarea efectelor biologice importante. Designul experimental nu trebuie să fie
foarte complicat pentru a evita apariţia greşelilor în execuţia sa.

5
În realizarea designul experimental trebuie să se ţină cont de faptul că este obligatorie folosirea de
loturi martor/control negativ cărora nu li se aplică factorul de influenţă (tratamentul) testat ci doar un
tratament placebo (de ex. excipientul medicamentului testat) sau niciun tratament. Uneori este necesară
şi folosirea de loturi referinţă/control pozitiv cărora li se aplică un factor de influenţă cu efect demonstrat
în modelul experimental utilizat. De exemplu în testarea unei substanţe cu presupus efect antidiabetic se
foloseşte un lot control negativ căruia i se administrează doar excipienţii substanţei testate (excipienţii –
substanţe fără activitate biologică) şi un lot control pozitiv căruia i se administrează insulină (substanţă
cu efect hipoglicemiant clar demonstrat şi la animalele diabetice).
Se pot folosi diferite tipuri de design experimental:

- Designul paralel – este cel mai folosit şi presupune testarea mai multor loturi in paralel; pentru toate
loturile experienţa începe şi se termină în aceleaşi timp; succesiv, se foloseşte câte un subiect din fiecare
lot (nu se testează întâi un lot apoi al doilea, etc ci primul subiect din primul lot, apoi primul subiect din
lotul 2, etc.). Analiza statistică a datelor obţinute într-un experiment cu design paralel este simplă iar
rezultatele obţinute pentru fiecare lot pot fi analizate mai întâi independent şi apoi comparate.

Lotul A

Lotul B

Lot control

Moment Moment
iniţial final

Aplicarea diferitelor tratamente pentru fiecare


lot în parte (factorul de influenţă – variabila
independentă)

Măsurarea parametrilor prestabiliţi


(răspunsul sistemului – variabila dependentă) 6
- Designul in bloc – presupune utilizarea unor criterii de grupare a animalelor în blocuri (de ex. vârsta,
sexul). În cadrul blocurilor se aplică designul paralel. Acest tip de design este simplu dar experimentele
sunt mai dificil de realizat şi necesită un număr mare de animale pentru o bună randomizare.
- Designul de tip cross-over – presupune ca animalul de laborator să fie supus succesiv mai multor
tratamente sau proceduri.

Lot A : C Lot B : C

Lot B : T Lot A : T

Perioada I Wash-out Perioada II

De exemplu, în prima perioadă a experimentului lotul A este lotul control (A:C) iar lotul B este
lotul tratat (B:T). După o pauză (wash-out) în care se presupune că animalul de laborator revine la starea
iniţială, anterioară perioadei I, (fapt care nu se prea întâmplă în cazul animalelor de laborator!) începe
perioada II în care lotul B devine lotul control (B:C) iar lotul A, lotul tratat (A:T).
Acest tip de design experimental prezintă unele avantaje: sunt necesare mai puţine animale de
laborator iar fiecare animal este propriul său martor, dar dezavantajele sunt importante: în perioada de
wash-out nu toate animalele revin la starea iniţială, prelucrarea statistică a datelor este mai complicată
iar loturile trebuie să fie foarte omogene pentru obţinerea unor rezultate fiabile.

- designul factorial – permite testarea unor posibile interacţiuni între diferite tratamente sau proceduri şi
diferite caracteristici ale animalului de laborator. De exemplu testarea efectului a 3 substanţe asupra
şoarecilor - 3 linii genetice diferite (vezi tabelul de mai jos). Numărul de şoareci necesari pentru fiecare
lot va fi evaluat statistic (ecuaţia Mead’s) pentru a se putea evalua corect rezultatele obţinute.
Linia genetică NMR1 C57B CB6F

Substanţa 1 4 4 4

Substanţa 2 4 4 4

Substanţa 3 4 4 4

Control 4 4 4

7
- designul secvenţial – nu se foloseşte în experimentele realizate pe animale de laborator ci doar în
studiile clinice în care nu este posibilă recrutarea în acelaşi moment a unui număr suficient de pacienţi,
ci succesiv.
După stabilirea unui design experimental, pot fi efectuate studii pilot realizate pe un număr mic
de animale (1-3/lot) pentru testarea logisticii experimentului şi pentru a obţine eventuale date în ceea ce
priveşte posibilul răspuns care pot fi folosite în stabilirea numărului de animale /lot pentru următoarele
experimente: exploratorii sau de confirmare. Experimentele exploratorii sunt realizate atunci când nu
există date în ceea ce priveşte un anumit tratament sau când se testează toxicitatea unei substanţe şi au
un număr mare de variabile dependente măsurate. Experimentele de confirmare folosesc date obţinute în
experimentele exploratorii şi vizează măsurarea unui număr redus de variabile dependente care prezintă
interes şi sunt menţionate în ipoteza de lucru a experimentului.

e. Randomizarea şi identificarea factorilor de variabilitate care ar putea influenţa procesul


investigat
În orice experiment intervin variabile care pot influenţa rezultatul final, cele mai importante fiind:
- Variabilele „auxiliare” – specia, rasa, tulpina, sexul, condiţiile de mediu care pot
fi controlate de experimentator
- Variabile aditionale ca ritmul circadian, erori de măsurare care pot fi controlate
partial
- Variabile aditionale ca diferentele interindividuale care nu pot fi controlate de
experimentator.
Aceste variabile ar trebui notate şi luate în considerare la analiza datelor dar de cele mai multe ori, în
mod greşit, sunt ignorate. Pentru a minimaliza intervenţia acestor tipuri de variabile asupra rezultatelor
experimentului, la formarea loturilor de animale se foloseşte tehnica randomizării.
Randomizarea presupune împărţirea animalelor de laborator în loturi omogene minimalizând
influenţa diferenţelor interindividuale asupra procesului investigat (diferenţe genetice, de vârstă,
greutate, etc.). Este recomandat ca animalele folosite într-un experiment să fie din aceeaşi rasă – cât mai
uniforme din punct de vedere fenotipic, fără diferenţe semnificative în ceea ce priveşte vârsta, greutatea
şi condiţiile de mediu în care au fost crescute), să provină din aceeaşi sursă (crescătorie), să fie sănătoase
(animalele bolnave nu trebuie folosite în proceduri experimentale). Animalele de laborator trebuie

8
găzduite în condiţii de mediu standard pentru a evita stressul care reprezintă un alt factor important de
variabilitate.
Pentru randomizare se folosesc programe statistice care atribuie numere aleatorii fiecărui subiect.
Loturile obţinute după randomizare trebuie să fie omogene şi, ideal, să conţină acelaşi număr de animale
de laborator.
După randomizarea animalelor utilizate într-un experiment ar trebui realizată „secretizarea” astfel
încât să fie evitată intervenţia unor elemente subiective în măsurarea rezultatelor. „Secretizarea”
presupune codificarea tratamentelor (substanţelor) aplicate, animalelor folosite şi a diferitor probe (când
este cazul) şi necunoaşterea acestei codificări de către persoanele care realizează efectiv experimentul.
Ulterior, după înregistrarea rezultatelor şi analiza lor, schema de codificare este dezvăluită şi are loc
interpretarea finală a datelor.

f. Realizarea protocolului experimental


Protocolul experimental trebuie realizat obligatoriu înainte fiecărei experienţe/experiment efectuat şi
presupune descrierea detaliată a materialelor necesare şi a modului de lucru.
- Materialele necesare – se realizează o listă completă a tuturor materialele
necesare desfăşurării corespunzătoare a experienţelor (animalele de laborator
necesare, substanţele administrate, eprubete, pahare Berzelius, baghete sticlă,
seringi, cronometre, etc. – absolut toate materialele care vor fi utilizate)
- Modul de lucru – se descrie foarte detaliat şi cu rigurozitate paşii care vor fi
parcurşi în timpul experimentului astfel încât acesta să se desfăşoare în cele mai
bune condiţii:
1. Prepararea soluţiilor de administrat
2. Modul de administrare – se descrie în amănunt tehnica folosită pentru
administrarea substanţelor la animalul de laborator
3. Identificarea fiecărui animal de laborator – de obicei prin realizarea unor
marcaje standard de culori diferite caracteristice fiecărui lot utilizat în
experiment şi fiecărui animal de laborator, modalitatea de randomizare
aplicată

9
4. Cântărirea animalelor de laborator înainte de experiment – o etapă foarte
importantă deoarece de obicei se administrează doze/kg corp
5. Ordinea şi intervalul de administrare al substanţelor – se realizează un orar
în care se notează fiecare animal de laborator folosit în experiment în
funcţie de ordinea de administrare a substanţelor (de ex.primul şoarece din
lotul A, după 5 minute primul şoarece din lotul B, după încă 5 minute al
doilea şoarece din lotul A, etc. într-un experiment cu design paralel care
foloseşte 2 loturi de şoareci, A şi B).
6. Descrierea amănunţită a testului care va fi efectuat
7. Definirea modului de măsurare a parametrilor evaluaţi
8. Ordinea de testare a animalelor de laborator şi intervalul dintre testări – se
realizează un orar în care se notează fiecare animal de laborator în ordinea
testării.
Ora Soarece Greutate Vol. soluţiei administrate (se calculează funcţie de
concentraţia soluţiei şi de doza administrată/kg corp

8:00 A1 (primul şoarece din lotul A) X1 V1

8:05 B1 (primul şoarece din lotul B) X2 V2

8:10 A2 (al doilea şoarece din lotul A) X3 V3

..........

Ex. de orar de administrare: experiment cu design paralel realizat pe 2 loturi de şoareci; administrarea
substanţelor se efectuează din 5 în 5 minute.
Ora Soarece Parametrul 1 Parametrul 2

9:00 A1 (primul şoarece din lotul A)

9:05 B1 (primul şoarece din lotul B)

9:10 A2 (al doilea şoarece din lotul A)

..........

Ex. de orar de testare: experiment cu design paralel realizat pe 2 loturi de şoareci; testarea şoarecilor se
realizează la o oră după administrarea substanţelor cu urmărirea a 2 parametri; testul durează 5 minute
ceea ce justifică alegerea intervalului de 5 minute în cazul administrării substanţelor.

10
Pentru a obţine rezultate corecte şi pentru a reduce numărul factorilor care ar putea influenţa
desfăşurarea experimentului (experienţelor), protocolul experimental trebuie să fie complet, riguros şi să
corespundă designului experimental stabilit. Toate persoanele implicate în efectuarea experimentului
trebuie să cunoască protocolul experimental şi sarcinile care le revin (pentru a evita încurcăturile ☺!!! )

g. Efectuarea experimentului şi colectarea datelor

După stabilirea designului şi protocolului experimental, se poate trece la realizarea efectivă a


experimentului/experienţei. Experimentele trebuie realizate în condiţii standard de mediu în camere
special amenajate în acest scop. Toate manevrele (administrarea substanţelor, măsurarea parametrilor,
etc.) trebuie realizate de persoane calificate care cunosc bine protocolul experimental şi este recomandat
ca o anumită manevră să fie efectuată de o singură persoană. Animalele de laborator trebuie manipulate
cu blândeţe (pentru a nu le induce un stress suplimentar) de persoane cărora le place lucrul cu animale
de laborator. Măsurarea parametrilor trebuie realizată cu rigurozitate şi conform definiţiilor din
protocolul experimental.

• Exemple de modele experimentale utilizate pentru testarea a diferitor clase de


medicamente

Conform definitiei, modelul experimental presupune inducerea unui proces patologic la animalul de
laborator. Cu ajutorul modelelor experimentale se testeaza diferite efecte ale medicamentelor.

Medicamentele analgezice – testarea acestei clase de medicamente presupune inducerea durerii


la animalul de laborator prin diferite procedee si observarea efectului medicamentului testat asupra
durerii.
Testul torsiunilor presupune inducerea durerii prin aplicarea unui stimul chimic Injectarea
intraperitoneala la şoareci, a unei substanţe iritante (fenilquinona sau acid acetic diluat), provoacă
mişcări reflexe de contorsionare a trunchiului animalului ca manifestare a durerii profunde. In acest
test, efectul analgezic al unei substanţe administrate în prealabil, se manifestă prin scăderea numărului
de torsiuni efectuate de animalele testate sau chiar inhibarea completă a producerii lor. Se consideră
torsiune : întinderea animalului, urmată de torsiunea trunchiului, retracţia abdomenului şi opistotonus,
astfel încât trenul posterior apasă suprafaţa pe care se află animalul. O substanta cu efect analgezic
scade numarul de torsiuni efectuate.

11
Testul placii incalzite presupune inducerea durerii prin aplicarea unui stimul termic. Animalul este
plasat pe o placă încălzită la aproximativ 55ºC, temperatura ce trebuie menţinută constantă în timpul
experimentului. Timpul de reacţie se măsoară în momentul în care animalul atinge placa şi până când
începe să-şi lingă labele sau să sară. Un medicament analgezic creste timpul pana la aparitia primelor
semne de disconfort.

Medicamente antiinflamatorii – testarea acestor medicamente presupune producerea unei


zone de inflamatii prin diferite metode.
Testul cu caragenina – metoda pletismometrica - inflamaţia este produsă prin injectarea de
carageenina la nivel plantar. Se măsoară volumul edemului inflamator cu ajutorul unui pletismometru.
Administrarea unui medicament antiinflamator va scadea volumul zonei inflamate.

Medicamente sedative – pentru testarea acestor medicamente se poate folosi un test care
permite masurarea activitatii locomotorii stiindu-se ca sedativele scad acest tip de activitate.
Testul de explorare simpla - permite măsurarea activităţii motrice in situaţii libere a fiecarui
animal de laborator (şoareci). Se foloseste o cutie de plexiglas, transparenta pe a carei podea sunt
marcate 20 de carouri cu latura de 8 cm (4 x 5 carouri). Fiecare soarece estet pus într-un colţ al cutiei
(acelaşi colţ pentru toţi şoarecii) şi timp de 5 minute se numără carourile prin care şoarecele trece cu
toate cele 4 lăbuţe. Un medicament sedativ scade numarul de carouri parcurse de soarecele tratat.

Medicamente anxiolitice – animalul de laborator este pus in situatii cunoscute a induce o stare
de anxietate.

Testul labirintului suspendat se bazeaza pe frica de inaltime si spatii deschise a soarecilor. Se


foloseste un dispozitiv alcatuit din 4 brate perpendiculare. 2 brate sunt inchise – au o platforma
inconjurata de pereti, iar celelalte 2 brate sunt deschise – sunt formate doar din platforma. In mod
normal un soarece va explora mult mai mult timp bratele inchise decat cele deschise. Un medicament
anxiolitic scade anxietate produse de spatiile deschise si inaltime astfel incat soarecele va petrece un
timp mai mare in bratele deschise.

Medicamentele antiepileptice – se induc convulsii animalului de laborator prin stimulare


cerebrala electrica sau chimica (pentetrazol). Antiepilepticele impiedica producerea convulsiilor induse
electric sau chimic.

Medicamentele antidiabetice – testarea lor presupune inducerea diabetului zaharat (DZ) la


animalul de laborator. In prezent exista modele experimentale atat pentru diabetul zaharat de tip I cat si
pentru cel de tip II. Evaluarea antidiabeticelor urmareste efectul acestora asupra simptomelor DZ
(polifagie, polidipsie, poliurie, scadere ponderala, etc.) sau asupra modificarilor metabolice ce apar
caracteristic in DZ. De exemplu, administrarea de aloxan la sobolan determina distrugerea selectiva a
celulelor beta-pancreatice cu producerea DZ de tip I.

12

S-ar putea să vă placă și