BIOFILMUL … sau energia

microbilor !

Biofilmul este o structura complexa tri-dimensionala creata de microbi, pentru a

se proteja de actiunea sistemului imunitar, bacteriofagi sau medicamente. Biofilmul
microbian a fost studiat inca din 1936, iar astazi se considera ca el este implicat in
cel putin 60% din infectiile cronice si 90% din infectiile sistemice.
Biofilmul apare in tractul gastrointestinal, placa dentara, infectii ca sinuzita, otita,
amigdalita, fibroza chistica, endocardita bacteriana, infectia biliara cronica, prostatita
bacteriana, cistita, osteomielita, infectii asociate dispozitivelor medicale, infectiile
spitalicesti etc.

Matricea care contine agregatele de celule microbiene este alcatuita din substante
polimerice, extracelulare (EPS) si ea constituie partea elastica a biofilmului, care ii
confera stabilitate mecanica. Matricea propriu-zisa contine ADN extracelular,
polizaharide, (zahar, amidon, inulina, celuloza), proteine, fibre de amiloid etc.
Matricea EPS este “ecranul” care protejeaza comunitatea microbiana de
“pradatori” (protozoare si fagii litice) sau substante chimice (antibiotice, biocide). De
asemenea ea ajuta la achizitia si distributia nutrientilor.
*
Biofilmul are consistenta semi-lichida (vasco-elastica), dar, pe masura ce colecteaza
sedimente sau se impregneaza cu ioni de fier si calciu, structura sa devine
asemenatoare unui solid casant.
Biofilmul este o structura dinamica si responsiva la mediu. Celulele bacteriene se pot
separa de biofilm individual sau in grupuri . Atunci cand se detaseaza in grupuri, ele
pastreaza proprietatea de susceptibilitate redusa la antibiotice specifica biofilmului
initial.

Cel mai fascinant aspect al biofilmului este faptul ca microbii pot comunica intre ei
folosind semnale chimice. Aceasta comunicare se face nu doar intre microbii
apartinand aceleiasi specii, ci si cei aprtinand speciilor diferite.
Microbii liberi secreta si ei semnale chimice (HSL=homoserine lactone), dar
concentratia scazuta a acestora nu permite schimbarea expresiei genetice. In cazul
biofilmului, semnalele chimice ajung la concentratii mari, care traverseaza
membranele celulare si induc modificari in activitatea genetica. Astfel, agregatele de
bacterii isi vor activa anumite gene numai cand sunt capabile sa sesizeze, prin
intermediul semnalarii celulare, ca populatia lor este suficient de numeroasa pentru a
initia o activitate genetica: de exemplu, anumite bacterii vor produce toxine numai
daca sunt sesizeaza ca suficient de multe ca sa supravietuiasca mecanismelor de
aparare ale gazdei. Acest tip de recunoastere se numeste “quorum sensing”.

Biofilmul protejeaza bacteriile de actiunea agentilor anti-microbieni.

Mecanismele propuse sunt:

A. Reducerea activitatii metabolice in microzona
Microbii liberi utilizeaza nutrientii din organsim, dar nu au suficienta activitate metabolica
pentru a saraci substratul celulelor adiacente. Spre deosebire de acestia, activitatea
metabolica colectiva a celulelor din biofilm este suficient de mare ca sa afecteze substratul
celulelor invecinate –> o activitate metabolica redusa a tesutul uman adiacent care face
intreaga zona mai putin susceptibila la agentii anti-microbieni.

B. Activarea raspunsului genetic la stres la celulele interioare

Patogenii liberi au numeroase raspunsuri protective la stresori, dar ei sunt depasiti de un
raspuns antimicrobial puternic. Ei mor inainte de a-si activa raspunsul la stres.
In contrast, celulele din interiorul biofilmului pot sa-si activeze raspunsul la stres, cu pretul
sacrificarii celulelor exterioare.

C. Putere sporita de neutralizare a agentilor microbieni

Microbii liberi neutralizeaza partial agentul antimicrobian, dar capacitatea lor individuala este
prea redusa pentru a scadea semnificativ concentratia antimicrobiana in intreaga zona.
In contrast, puterea de neutralizare a grupurilor de celule permite incetinirea sau penetrarea
incompleta a agentilor antimicrobieni in structura biofilmului.

D. Acumularea celulelor rezistente la agentii anti-microbieni

Microbii liber pt da nastere unor celule rezistente la agentii antimicrobieni, dar acestea nu
pot rezista prea mult timp, si redevin sensibile la stresori.
In contrast, celulele rezistente se acumuleaza in biofilm deoarece sunt retinute fizic de
matricea EPS si redevin mai greu sensibile la agentii antimicrobieni.

Microbii din biofilm sunt mai putin susceptibili la atacul sistemului imunitar
si, in consecinta, o infectie asociata cu biofilm poate persista o perioada indelungata de
timp.
Fagocitele au dificultati in a ingera bacteriile dintr-un biofilm datorita proprietatilor anti-
fagotitare ale matricii biofilmului. In absenta anticorpilor specifici, componneta polizaharida a
matricii biofilmului blocheaza activarea complementului. Daca anticorpii sunt prezenti, atunci
matricea polimerica ii face ineficienti.
Structura biofilmului este in asa fel formata incat raspunsul sistemului imunitar este
directionat doar spre acei antigeni aflati la suprafata exterioara a biofilmului, iar anticorpii si
alte proteine serice nu pot penetra suficient de adanc in biofilm. Raspunsul sistemului
imunitar implica generarea unor cantitati mari de enzime si citokine pro-inflamatorii,
ceea ce duce la inflamatia cronica si, eventual, distrugerea tesuturilor din
vecinatatea biofilmului.

Microbii din biofilm sunt de 1000 de ori mai rezistenti la antibiotice fata
de cei liberi !
… si de aceea tratamentul oricarei infectii cronice sau recurente trebuie sa inceapa
prin “spargerea” biofilmului.

Suport energetic pentru spargerea biofilmului

Deoarece fortele electrostatice joaca rolul principal in coeziunea biofilmului, este
important ca orice metoda de spargere a biofilmului sa includa si o procedura de
electrochelare. Centru EuVITA ofera aceasta procedura, impreuna cu o combinatie
personalizata de electroterapie si suplimente, care adreseaza infectiile majore
prezente in organism: bacterii, fungi etc, stimuleaza sistemul imunitar, astfel incat
acesta sa “vada” patogenii, detoxifica organismul de compusii toxici ai microbilor
(endotoxine, micotoxine etc), deblocheaza meridianele energetice etc
 Biofilmul in Industria Alimentara

Suprafetele si utensilele de lucru folosite in industria alimentara pot fi sursa de contaminare

pentru alimentele care vin in contact cu acestea chiar si dupa ce au fost sanificate si
dezinfectate.

Aceste microorganisme, patogene sau alterante, pot fi ga site aderente pe suprafete

de lucru diferite (cum ar fi benzi rulante, masini de tocat, tuburi etc.) sub forma de
biofilm. Biofilmul este o structura complexa unde microorganismele sunt legate de
suprafete in mod ireversibil si sunt incluse intr-o matrice amorfa formata din polimeri
extra celulari (EPS extracellular polymeric substances) secretata de ei insisi.
Biofilmele pot fi formate dintr-o singura specie microbiana sau din mai multe specii.

Observandu-le la microscopul optic arhitectura biofilmelor poate fi formata din:

1. Microcolonii microbiene separate de spatii interstitiale care functioneaza ca si

microcanale care au un rol important in transportul substantelor nutritive, a
catabolitilor si a difuzarii moleculelor de semnal intercelulare (Quorum sensing);

2. Microcolonii dense ce nu pot fi distincte, apar ca un strat unic de bacterii.

In interiorul biofilmelor microorganismele tind sa-si incetineasca cresterea si de

obicei trec intr-o faza de viata VBNC (Viable But Non Culturable cell) adica, de
crestere stationara, de celula vie dar nevitala. Inchise in acest stadiu de viata,
bacteriile devin mult mai rezistente stresurilor ambientale cum ar pH, lipsa de apa
libera etc. In plus, se observa variatii in transcrierea genelor comparandule cu
aceleasi celule in stadiul liber, se inregistreaza cresterea sintezei exopolizaharidelor
si cresterea rezistentei la tratamente cu dezinfectante si sanificante. Se estimeaza
ca celulele in stadiul de biofilm sintetizeaza in jur de 90 tipuri de proteine in plus in
comparatie cu cele in stadiul de plancton. Multe proteine sunt molecule specifice
implicate in mecanismele de rezistenta la stres, cum ar fi proteine de acid shock sau
de termic shock.

In formarea unui biofilm intervin urmatoarele faze:

1. Aderarea bacteriilor pe suprafata;

2. Colonizarea suprafetei de catre bac terii;

3. Colonizarea altor suprafete prin distacarea ciclica a unei parti a coloniei cu

eliberarea de fragmente.

Aderarea bacteriilor pe suprafata

Aderarea reversibila pe suprafete este favorizata, sau mai bine zis cauzata, de
prezenta umiditatii si de reziduuri organice care provin din lavorarea alimentelor cum
ar fi proteinele carnii, ale lap telui, grasimi, componente minerale (milk - stone) dar si
reziduuri de detergenti si dezinfectanti. Acumularea moleculelor la nivelul interfetei
lichid - solid determina o concentratie a substantelor nutritive, favorizand formarea
unui film „con ditionant“ care altereaza unele caracteristici fizico-chimice ale
suprafetei, energia libera si sunt modificate incarcarea electrostatica, proprietatea
hidrofobica. A fost demonstrat ca micro or ga nismele nu adera intotdeauna doar pe
suprafetele „conditionate“.

Prezenta de crapaturi microscopice, fisuri pe suprafete precum si suprafetele

poroase determina acumularea microorganismelor. Microorganismele reusesc sa
adere pe suprafetele „conditionate“ datorita unui proces fizicochimic de interactie
intre molecule le stratului extern de material care for meaza suprafata de atac si cea
a stratului extern a microorganismelor cu moleculele interpuse intre cele doua
structuri, moleculele fluidului care acopera suprafata si impregna agregatele
celulare.

Legaturile care determina aceasta interactie sunt slabe:

1. Forte Van der Waals;

2. Interactiile hidrofobice;

3. Forte de interactie electrostatica.

In aceasta faza bacteriile urmaresc miscarea de tip brownian, aderarea este de tip
reversibil si o simpla clatire a suprafetei determina eliminarea microorganismelor.
Aderarea ireversibila, faza in care fortele de respingere intre suprafete si
microorganisme sunt anulate, incepe in momentul in care microorganismele produc
exopolizaharide care se amesteca cu proteine, acizi nucleici, lipide formand o retea
cu aspect vascos datorita capacitatii sale de a retine apa.

Aderarea microorganismelor devine si mai stabila o data cu producerea flagelilor,

fimbrilelor, pililor si a instaurarii urmatoarelor legaturi:
1. Interactiile dipol-dipol;

2. Legaturi de hidrogen, ionice, covalente;

3. Interactiile hidrofobice.

Eliminarea microorganismelor in aceasta faza este dificila, biofilmul le protejeaza de

actiunea dezinfectantilor care nu reusesc sa patrunda in interiorul acestuia. Pentru a
obtine rezultate, trebuie eliminata aceasta patina prin actiune mecanica cu ajutorul
periajului etc. Sporele are o capacitate de aderare mai mare decat cea a formelor
vegetative, asta si datorita hidrofobicitatii ridicate. Dupa aderare sporele pot germina
si produc exopolizaharide consolidand astfel pelicula.

Colonizarea suprafetei de catre bacterii

Dupa aderarea in mod ireversibil microoganismele se multiplica folosind substantele

nutritive si lichidele prezente in filmul „conditionant“ formand microcolonii care cresc
si se unesc intre ele pa na la formarea unui strat care acopera suprafata. in aceasta
faza exopolizaharide (EPS) pot capta alte bacterii ducand la producerea unui biofilm
stratificat. in in teriorul unui biofilm microorganismele nu sunt distribuite in mod
uniform.

Arhitectura unui biofilm depinde de o serie de factori printre care putem cita:

- Microorganisme heterogenee (biofilm compus din mai multe specii microbiene) sau
nu;

- Clona bacteriana;

- Disponibilitate de substante nutritive in substrat;

- Conditii hidrodinamice;

- Conditii ambientale.

Timpul necesar pentru realizarea unui biofilm intalneste pareri diferite, dupa unii
autori zile, dupa altii saptamani sau chiar luni. In interiorul biofilmelor, doar 10% din
microorganismele prezente se pot multiplica; celelalte se gasesc cum am mentionat
anterior, intr-o faza VBNC (Viable But Non Culturable cell).
In industria de prelucrare a carnii si a laptelui, biofilmele sunt constituite in mare
parte din Pseudomonas si Staphylococcus. in industria produselor de panificatie
predomina coryneformi si levuri. Colonizarea altor suprafete prin distacarea ciclica a
unei parti a coloniei Distacul unei parti de colonie microbiana are loc in momentul in
care acesta imbatraneste si poate duce la colonizarea altor suprafete sau la
contaminarea alimentelor.

Se pare ca celulele distacate formeaza un biofilm intr-un timp mult mai redus decat
celulele libere. Contaminarea alimentelor poate fi cauza de toxinfectii alimentare
cand biofilmele sunt constituite din bacterii patogene sau pot determina alterarea
produselor alimentare in momentul in care biofilmele sunt formate din germeni
alteranti.

Proprietatile biofilmelor

Proprietati legate de substante extracelulare polimerice (EPS) Compozitia substantelor

extracelulare polimerice nu se cunoaste inca in mod definitiv. Se stie ca EPS este format din doi
componenti fundamentali si anume exopolizaharide si proteine, despre care nu sunt inca studii
aprofundate.

A fost demonstrat ca EPS reuseste sa retina, ca un burete, multe

substante nutritive derivate din matrici alimentare care vin in
contact cu biofilmul sau produse din metabolismul
microorganismelor. Unele exopolizaharide retin ioni me ta lici toxici,
ioni pozitivi si alte substante care intra in contact cu biofilmele.
Aceasta capacitate de a retine unele substante este foarte
importanta in ambiente apoase deoarece moleculele si ionii extrasi
sunt metabolizati mult mai repede de microorganime, contribuind la
purificarea apei.

O alta proprietate legata de EPS este aceea de a proteja bacteriile

de desicare, pierderea apei putând duce la moartea celulelor. Multe
polizaharide au capacitatea de a produce un tip de gel cu
proprietatea de a retine cu usurinta apa. A fost demonstrat ca,
reducând apa libera, avem o crestere a productiei de EPS; asa s-ar
putea explica rezistenta bacteriilor Gram negative pe suprafetele de
lucru care sunt supuse periodic la o intensa pierdere de apa prin
evaporare.
Rezistenta la detergenti

A fost demonstrat ca detergentii acizi nu au efect asupra biofilmelor

iar detergentii alcalini au o eficacitate relativa. Asupra biofilmelor
artificiale realizate in laborator au fost testati detergenti alcani care
au reusit sa mobilizeze intre 10 si 90% din microorganismele
continute in biofilm. Rezistenta la substante antimicrobiene Cea mai
importanta caracteristica a biofilmelor este marirea rezistentei
microorganismelor inglobate in matricea or ga nica si aderenta la
suprafetele de lucru. Marirea rezistentei se inregistreaza in putine
minute dupa ce celula microbiana a aderat pe suprafata, inainte de
a fi inglobata intr-o cantitate apreciabila de EPS si este anulata
când celula trece intr-un stadiu de viata planctonica. Polizaharidele
si proteinele care formeaza EPS pot sa reactioneze chimic cu
agentii dezinfectanti. De exemplu, compusii proteici si proteinele
care provin din alimente, pot reactiona cu compusi continând clor
reducând cloratii, in consecinta eficacitatea acestora. Acest aspect
este foarte important deoarece majoritatea industriilor alimentare
folosesc ca si dezinfectanti substante alcaline clorurate.

Aceasta crestere a rezistentei este expli cata prin trecerea

microorganismelor intr-o faza de viata latenta indusa de doi factori:

1. Reducerea cantitatii de oxigen si de nutrienti in straturile

profunde deoarece acestea sunt consumate de straturile
superficiale;

2. Celule care provin din celule in faza de suferinta sunt mult mai
rezistente la stres, bineinteles si la dezinfectanti. in concluzie,
marirea rezistentei la dezinfectanti este determinata de modificarea
fiziologiei bacteriilor aderente pe suprafete in comparatie cu cele in
faza de plancton.

Recente cercetari au demonstrat cresterea rezistentei nu numai la

dezinfectanti dar si la antibiotice.

Controlul si eliminarea biofilmelor

Reducerea formarii biofilmelor se poate face mentinând suprafetele
de lu cru, ustensilele uscate si controlând umidi tatea atmosferica.
Suprafetele de lucru trebuie sa fie din materiale neporoase, netede,
fara denivelari sau fisuri. De exemplu, pardoselile din rasini
sintetice prezinta des gauri mici care pot determina formarea de
biofilm. Aplicarea unui program adecvat de sanificare si
dezinfectare in industriile alimentare nu permite acumularea
reziduurilor de alimente si de microorganisme, in consecinta,
formarea bio fil melor. Cum am amintit in alte articole, proiectarea
masinilor de lucru, benzilor rulante, este foarte importanta in
formarea si eliminarea biofilmelor.

Tratamentul mecanic in timpul operatiilor de sanificare este foarte

important pentru a elimina biofilmele, dar aceasta operatiune este
adesea ingreunata de masinile de lucru, care, in foarte multe
cazuri, nu sunt usor de demontat si nu toate componentele sunt
construite in asa fel incât sa permita sanificarea fara probleme.

Controlarea biofilmelor reprezinta o provocare pentru industria

alimentara. Armele la dispozitie sunt de natura fizica, chimica si
biologica.

Metode fizice

Noile metode pentru eliminarea si controlul biofilmelor cuprind

folosirea:

- câmpurilor magnetice;

- tratamentelor cu ultrasunete;

- câmpurilor electrice pulsatile

Care pot fi combinate cu acizi organici sau câmpuri electrice.

Ramân valabile, fara indoiala, metodele fizice mentionate in
articolele precedente.

Metodele chimice

Inainte de aplicarea unui dezinfectant, eliminarea unui numar cât

mai mare de microorganisme, detasarea acestora de pe
suprafetele de lucru, ruperea stratului polizaharidic care le
protejeaza sunt factori fundamentali pentru o actiune chimica
eficace. Când nu este efectuat nici un tratament mecanic,
dezinfectantii lasa stratul intact, in consecinta nu au nici un fel de
actiune, lasând biofilmul sa-si continue evolutia. Dezinfectantii care
contin unii aditivi, cum ar fi EDTA, sunt utili in eliminarea biofilmelor
deoarece aceste substan te se leaga de ionii de calciu si magneziu
destabilizând membrana externa a microorganismelor.

Unii detergenti au o actiune bactericida iar altii pot sa

depolimerizeze EPS, favorizând desprinderea biofilmelor de pe
suprafete. Mentionez unii dintre acesti detergenti: agenti oxidanti
cum ar fi acidul peracetic, agenti pe baza de clor, iod, peroxid de
hidrogen, monolaurina (glicerol mono laurat) s-au dovedit eficace
impotriva biofilmelor formate de Listeria monocytogenes in special
daca este asociat cu un tratament termic (circa 65°C). Folosirea
anhidridei carbonice pentru eliminarea biofilmelor in special pentru
conducte. in practica, se foloseste gheata tocata aditionata cu un
detergent si pompata sub presiune in conducte. Are o actiune
mecanica asupra conductorilor si topindu- se este eliminata cu
usurinta.

Metode biologice

Incorporarea substantelor bioactive, cum ar fi bacteriocine, in

suprafetele care vin in contact cu alimentele, impiedica aderarea
bacteriilor pe suprafete. Nizina, un peptid foarte folosit in industria
alimentara, are proprietati inhibante impotriva multor bacterii
patogene si alte rante, in special sporogene. Suprafete de lucru
impregnate cu nizina au dus la limitarea incidentei contaminarii cu
Listeria monocytogenes. Culturile de bacterii lactice s-au dovedit
eficace impotriva unor microorganisme alterante si patogene.
Folosirea enzimelor in eliminarea biofilmelor, datorita capacitatii
acestora de a dezagrega EPS, s-au dovedit eficace inainte de
aplicarea metodelor traditionale de sanificare si dezinfectare.