DIAGNOSTICUL ÎN BRUCELOZĂ

EXAMENUL ALERGOLOGIC

Structura antigenică a brucelelor. Brucelele au o structură antigenică

complexă, reprezentată de antigene specifice şi fracţiuni antigenice comune
cu cele ale altor specii. Astfel, se deosebesc antigene de suprafaţă
reprezentate de determinanţi ai peretelui celular şi antigene de profunzime,
citoplasmatice. Au fost identificate două antigene majore, denumite M
(melitensis) şi A (abortus). Aceste antigene, regăsite în proporţie diferită la
diferitele specii, comune fazei S (vezi mai jos), permit tipajul serologic al
tulpinilor. Ulterior, studiul bacteriilor aflate în fază R a dus la identificarea
antigenelor R şi Z.
Antigenele de suprafaţă comune fazei S sunt reprezentate în principal
din complexul LPS-proteină, cu roluri biologice cum sunt: acţiune necrozantă
cutanată, datorită lipidului, participarea la reacţiile serologice datorită
portajului antigenelor A şi M, apirogenitatea, inducţia de interferon. În
reacţiile cutanate provocate de acest complex, se disting o fază imediată,
datorată polizaharidului şi mediată prin anticorpi respectiv o fază tardivă,
indusă de polipeptid şi mediată prin răspunsul imun celular.
Antigenul LPS-R prezent în membrana bacteriilor în fază R, este distinc
de cel anterior şi nu participă decât la reacţiile de aglutinare cu serul anti
brucella R, fiind utilizat pentru identificarea acestor infecţii.
Antigenele solubile de suprafaţă sunt cele mai imunogene conferind
protecţie în timp ce acelea profunde (citoplasmatice) intervin în reacţiile
cutanate tardive, determinând o reacţie cutanată cu infiltraţie caracteristică de
mononucleare.
Antigene comune cu alte genuri bacteriene: cu Vibrio holerae,
Fransisella tularensis, Salmonella grup N, Yersinia enterocolitica.
Proporţia factorilor antigenici M şi A la diferite specii de brucele

Factorul antigenic %
M A
Specia
B. melitensis 95 5
B. abortus 5 95
B.suis 40 60

Testul cutanat se practică pentru diagnosticul brucelozei la animalele

din import, în perioada de carantină profilactică, la efectivele de reproducţie
precum şi în cadrul diagnosticului complex al brucelozei. Speciile la care
acest examen este standardizat sunt bovinele şi suinele.
Alergenul utilizat în scop de diagnostic este un extract proteic purificat,
obţinut din tulpini de brucele. Există în uz un brucelohidolizat bovin şi unul
porcin. Ambele sunt lichide limpezi, de culoare uşor gălbuie. Se folosesc
numai atunci când îşi păstrează calităţile prevăzute în prospect şi se află în
termen de valabilitate.
Testul intradermic la bovine. Se efectuează de obicei pe latura stânga a
gâtului, în mijlocul treimii mijlocii a acestuia. Anterior testării, se verifică
integritatea pielii, urmărindu-se ca aceasta să nu prezinte deformări sau plăgi.
Se tunde un pătrat cu latura de 5 cm, se măsoară grosimea pliului cutanat cu
ajutorului unui cutimetru, apoi pielea se dezinfectează şi se inoculează strict
intradermic 0,2 ml brucelohidrolizat de tip bovin. Reacţia se citeşte după 48
ore de la inoculare şi se interpretează pe baza modificărilor de grosime a
pielii.
Variaţie grosime pliu Categoria
> 3 mm +
2-3 mm ±
< 2 mm -

Alergenul brucelic nu este sensibilizant, deci testarea se poate repeta în

cazurile pozitive şi dubioase ori de câte ori este nevoie, fără a se respecta
anumite intervale de repaus.
Testul intradermic la suine. Locul de elecţie pentru inoculare este
reprezentat de mijlocul bazei de inserţie a urechii de cap, pe faţa externă a
acesteia. Inocularea se face fără măsurarea grosimii pliului cutanat, strict
intradermic cu o cantitate de 0,2 ml brucelohidrolizat (brucelină) de tip
porcin. Reacţia se apreciază după 24 şi 48 ore, comparativ cu cealaltă ureche.
Reacţia este pozitivă atunci când la locul de inoculare apare un edem păstos,
cald, dureros însoţit de eritem şi eventual necroză. Edemul de dimensiuni
reduse, fără eritem sau eritem moderat, reprezintă o reacţie dubioasă iar
absenţa modificărilor la locul de inoculare indică o reacţie negativă.
Testele alergice cu rezultat pozitiv sau dubios se repetă concomitent cu
efectuarea examenelor serologice. În cadrul diagnosticului complex al
brucelozei, testele celulare in vivo (testul cutanat) pot fi înlocuite de teste de
hipersensibilizare in vitro (reacţia de inhibare a migrării leucocitelor şi testul
de transformare blastică a limfocitelor).

EXAMENUL DE LABORATOR

Materiale patologice: avortoni, lichide şi învelitori fetale (îndeosebi

cotiledoanele), organele avortonului (cheag, pulmon, măduvă osoasă), laptele,
materialul seminal, serul sanguin (în caz de supraveghere sau după avort),
lapte.
Examenul microbiologic

Examenul bacterioscopic. Uneori este de mică valoare dată fiind pauci-

bacilaritatea materialelor patologice. Amprentele pot fi efectuate din organe
cu leziuni sau brucelel se pot evidenţia în frotiuri din lichidele fetale,
punctate articulare, etc. Metodele de colorare utilizate în scopul examenului
microscopic sunt: Koslovski, Köster modificată, recomandată de FAO şi
OMS, sau Stamp.
 Metoda Köster. Frotiul uscat şi fixat la flacără se colorează timp de 1
min cu un amestec proaspăt din 2 părţi soluţie apoasă saturată de safranină şi
5 părţi hidroxid de potasiu 1 mol/l. Se spală cu apă de robinet, se decolorează
de 2 ori cu acid sulfuric 0,1% (10 –20”), după care se spală cu apă şi se
colorează cu albastru de metilen fenicat 1% (1’). Rezultatul colorării:
brucelele apar de culoare roşu-oranj pe fond albastru.
Metoda Stamp. Frotiul uscat şi fixat prin căldură se colorează cu fuxină
Ziehl diluată 1/5, timp de 8-10 min. Se spală cu apă de robinet şi se
decolorează cu acid sulfuric 0,05% timp de 2-3”, până la uşoara decolorare.
Operaţiunea se efectuază într-un pahar Borell, care poate servi pentru 50-100
frotiuri. După decolorare, se spală din nou cu apă de robinet, se colorează 20-
40” cu soluţie verde malachit. După o nouă spălare, se uscă şi se examinează
cu obiectivul de imersie. Brucelele apar colorate în roşu pe un fond (proteine
tisulare, alte bacterii) verde pal.

Examenul bacteriologic. Izolarea agentului etiologic este dificilă în

afara fazei acute a bolii. Exigenţele nutritive ale brucelelor se caracterizează
prin posibilitatea de utilizare a ionilor de amoniu ca unică sursă de azot.
Majoritatea tulpinilor se dezvoltă în prezenţa unor aminoacizi, necesitând
tiamină, niacină şi biotină. Mediile utilizate pentru cultivarea şi identificarea
brucelelor pot fi lichide sau solide. Cele mai frecvent utilizate sunt bulionul,
agarul sau cartoful la care se adaugă glicerină 2% şi/sau glucoză 1% şi ser 1-
5%. Unele specii (B. abortus) necesită CO 2 5-10%, această necesitate fiind un
criteriu de diferenţiere. Dacă materialul patologic este suprainfectat cu alte
specii bacteriene, se efectuează un tratament prealabil însămânţării cu KOH
2,5% timp de 30 min. Diferenţierea speciilor de brucele se poate realiza prin
cromobacteriostază, respectiv cultivarea pe medii conţinând substanţe
colorante (tionina, fuxina). Caracterele culturale şi unele criterii de
diferenţiere ale tipurilor de colonii de brucele sunt prezentate mai jos.
 Caracterul Metoda Colonii
cercetat S R M
Observaţie di- Fine, umede, Aspre, uscate, De regulă ro-
Aspectul colo- rectă bombate, ro- granuloase, tunde, bomba-
niilor pe medii tunde, margini turtite, contur te, mucoase
gelozate regulate, trans- neregulat, Ø 1-
lucide, Ø 0,5- 4mm Ø 1-4mm
2mm
Cu lumină ob- Translucide, Mate, alb- Gălbui-cenu-
lică irizaţii albăs- gălbui, strălu- şii, suprafaţă
trui citoare, granu- netedă sau
loase zbârcită, aspect
vâscos
După tratare Nu se Coloraţie obişnuită între roz-
cu cristal vio- colorează violaceu
let
Dezvoltare în bulion Omogenă Peliculă la su- Peliculă la su-
prafaţă, sedi- prafaţă, sedi-
ment pulveru- ment vâscos
lent, clarifica-
re
Stabilitatea şi caracterul Uniform, omo- Granulare, ne- Floconoase,
suspensiilor în ser fiziologic gene, stabile stabile nestabile

Termoaglutinare la 90ºC negativ Pozitiv, sedi- Pozitiv, sedi-

mentare abun- mentare slabă
dentă
Aglutinare cu tripaflavină Suspensie o- Aglutinare a- Aglutinare
1:1000 mogenă, aglu- bundentă ime- slabă, filamen-
tinare fină la diată, flocoane te mucoase
formele S-R sau grunji
Aglutinabilitate Foarte bună Foarte slabă Foarte slabă
Patogenitate Normală, a Nepatogene Nepatogene (cu
speciei (cu excepţia B. excepţia B.
ovis şi B. ca- ovis şi B. ca-
nis) nis)
Senisbilitatea faţă de Variabilă după Rezistent Rezistent
bacteriofagul brucelic Tb specie

Culturile au o longevitate de două luni. Pe cartof glicerinat, cultura

devine brună ciocolatie prin păstrare în timp.
Infecţia experimentală

Infecţia experimentală poate fi realizată pe cobai sau pe hamster, de

regulă fiind inoculate cel puţin două animale / probă. Calea de administrare a
materialului patologic este dependentă de gradul de contaminare al acestuia
cu alţi germeni. Atunci când se consideră că proba nu conţine decât brucele,
ea se poate inocula intraperitoneal (1-2 ml). Când gradul de contaminare este
redus, se poate recurge la inocularea subcutanată iar atunci când este intens,
proba se aplică conjunctival sau pe pielea rasă sub bandaj. În cazul în care
apare o reacţie a ganglionului regional, acesta se extrage aseptic după două
săptămâni şi se fac însămânţări pentru izolarea şi identificarea brucelelor.
Animalele inoculate se testează serologic la 2 şi 4 săptămâni şi alergic la 4-6
săptămâni, după care, dacă nu mor între timp, se sacrifică, pentru examen
bacteriologic şi anatomopatologic.
Şoarecele şi iepurele sunt de asemenea sensibile, şobolanul infectându-
se doar cu doze mari de germeni.

Examenul histopatologic

Leziunea histologică este brucelomul, constituit din celule epiteloide şi

gigante în centru, celule limfoide şi rare polimorfonucleare, eozinofile şi
neutrofile la periferie.

Examenul serologic

Urmăreşte depistarea anticorpilor la animalele fără semne clinice de

boală (femele între avorturi şi masculi). Se poate efectua pornind de la probe
de ser, lapte, material seminal, mucus vaginal, lactoser, etc. Testele aplicate
sunt: reacţia de aglutinare rapidă pe lamă, reacţia de aglutinare lentă în
tuburi, reacţia de fixare a complementului şi testul inelar cu lapte.
Reacţii de aglutinare
Aceste reacţii permit evidenţierea anticorpilor pe baza capacităţii lor de
a determina agregarea antigenelor particulare (aglutinare directă) sau a
particulelor inerte acoperite cu antigene solubile (aglutinare indirectă sau
pasivă). Reacţiile de aglutinare posedă avantajul sensibilităţii şi al
vizualizării rezultatelor.
a) Reacţia de aglutinare rapidă pe lamă (Huddleson) foloseşte
antigenul brucelic concentrat şi colorat în albastru violet, titrat faţă de serul
etalon şi faţă de antigenul pentru RAL şi RFC (Wright). Pe o lamă bine
degresată se depune o picătură de antigen la care se adaugă o picătură de ser
de cercetat. Cele două picături se omogenizează prin înclinări repetate ale
lamei, care se menţine la temperatura camerei. Rezultatul pozitiv se exprimă
prin apariţia unor grunji de culoare albastră în interval de 3 minute de la
contact, cu limpezirea amestecului.
Reacţia de aglutinare rapidă se poate efectua şi în diluţii, după schema:

Reacţia propriu-zisă
Elementele reacţiei 1 2 3 4 Martor Martor
ser antigen
-Ser suspect 0,08 0,04 0,02 0,01 0,04 -
-Antigen
-Ser fiziologic 0,03 0,03 0,03 0,03 - 0,03

- - - - 0,03 0,03
Corespunde unei diluţii a
serului prin titrarea 1/50 1/100 1/200 1/400
antigenului în RAL

În această schemă, rezultatul se notează după sistemul 1-4+,

corespunzător intensităţilor de 25-100% aglutinare. Se consideră pozitivă
aglutinarea cu o intensitate de 50% la diluţia serului ce corespundei cele de
1/100 din RAL.
b) Reacţia de aglutinare lentă în tuburi (după Wright). În această
reacţie se foloseşte un antigen brucelic corpuscular inactivat, standardizat ca
şi concentraţie şi aglutinabilitate, de culoare albă-lăptoasă. Reacţia se execută
în minim trei diluţii: 1/25, 1/50 şi 1/100. Rezultatele reacţiei se exprimă în
unităţi aglutinante internaţionale (UAI) şi se interpretează pe baza acestui
titru. Serul etalon, care conţine 1000 UAI se standardizează astfel încât
diluţia 1/1000 să producă o aglutinare cu intensitatea de 50% (++).
 Materiale necesare: ser de cercetat, antigen brucelic Wright diluat în
ser fiziologic fenolat în proporţia înscrisă pe flacon, tuburi de aglutinare 1/10
cm Wassermann, pipete gradate sau pipete automate de 20-200 şi 1000
microlitri, stativ, termostat.
Tehnica de lucru: Se efectuează diluţia serului în antigen după cum
urmează:

Tubul 1 2 3 Martor Martor ser

antigen suspect
Ser suspect 0,15 - - - 0,15
Antigen 3,6* 1 1,5 1 -
Amestec - 1 0,5 - -
antigen+ser
suspect
Ser fiziologic - - - 1 1,85
Diluţia finală 1/25 1/50 1/100

* - după amestecarea serului cu antigenul în primul tub, 1,75 ml se scot şi se

repartizează în tuburile 2 şi 3 astfel: 1 ml în tubul 2, 0,5 ml în tubul 3 iar 0,25
ml se aruncă

Tuburile se incubează la 37ºC timp de 24 ore, după care se citesc

rezultatele, luându-se în considerare mărimea depozitului şi limpezimea
supernatantului. Pentru eliminarea reacţiilor de aglutinare nespecifice, se
poate lucra cu ser inactivat la 56ºC sau reacţia poate fi incubată pe baia de
apă la 56 ºC timp de 18 ore.
Încadrarea animalelor în categoria pozitiv după legislaţia românească se
face în funcţie de intensitatea aglutinării de 50% (++) la diluţia 1/100 la
bovine şi 1/50 la suine. Dubioase sunt considerate animalele la care acelaşi
grad de aglutinare apare la diluţia 1/50 la bovine şi 1/25 la suine.
Reacţiile pozitive de aglutinare, în funcţie de diluţie şi intensitatea
aglutinării, sunt convertibile în UAI:

1/25 + = 21 UAI 1/50 + = 42 UAI 1/100 + = 84 UAI

1/25 ++ = 25 UAI 1/50 ++ = 50 UAI 1/100 ++ =100 UAI
1/25 +++ = 30 UAI 1/50 +++ = 60 UAI 1/100 +++ = 120 UAI
1/25 ++++ = 36 UAI 1/50 ++++ = 72 UAI 1/100 ++++ = 144 UAI

Interpretarea reacţiei de aglutinare lentă în diagnosticul brucelozei

Criteriul Interpretarea serodiagnosticului

Specia de
interpreta negativ dubios pozitiv
re
Tauri- Nr. UAI Sub 30 30 - 100 100 şi peste
n Echivalenţi 1/25 – 1/25 +++ 1/50 +++ 1/100 ++
e de diluţii 1/25 + 1/25 ++++ 1/50 ++++ 1/100 +++
1/25++ 1/50 ++ 1/100 + 1/100 ++++
Suine Nr. UAI Sub 25 25 - 50 50 şi peste
Echivalenţi 1/25 – 1/25 ++ 1/25 ++++ 1/50 ++
de diluţii 1/25 + 1/25 +++ 1/50 + 1/50 ++++

Reacţia de aglutinare rapidă în placă (testul Roz Bengal, set de

diagnostic Bruceroben)
Testul de diagnostic prin aglutinarea rapidă în placă tinde să
înlocuiască reacţia de aglutinare rapidă pe lamă în diagnosticul brucelozei
determinate de B. abortus, B.suis, B. melitensis.

Materiale necesare:
Setul de diagnostic preparat de Institutul Pasteur, conţine antigenul
brucelic colorat cu Rose-Bengal, cu aspectul unui lichid de culoare roz opac.
Este o suspensie de 8% de B. abortus 99-Weybridge, inactivată prin căldură şi
fenol 0,5%, colorată cu soluţie de 1% Rose-Bengal, în diluant tamponat şi
acidifiat. După un timp mai îndelungat de păstrare, corpii bacterieni pot
sedimenta, dar prin agitarea se omogenizează uniform. Flacoanele cu antigen
au 20 respectiv 50 ml (echivalentul a 660 respectiv 1650 doze).
Setul mai conţine serul pozitiv, un lichid de culoare galben-roz, cu un
uşor sediment. Este serul provenit de la iepuri inoculaţi cu B. abortus tulpina
99-Weybridge şi etalonat la un conţinut de 100 UAI/ ml. Se livrează liofilizat,
fiind reluat pentru lucru în 1-2 ml de diluant (33-66 doze).
 Serul negativ este serul provenit de la bovine sănătoase, fără anticorpi
antibrucella. Se prezintă similar cu serul pozitiv.
Dozarea se face cu picurătorul calibrat la 0,03 ml.
Testarea serurilor suspecte se face în plăci cu 96 godeuri, cu profil în
U. Agitarea amestecurilor se face cu agitatorul electric pentru plăci.
Tehnica de lucru: (schemă)
Pentru utilizare, antigenul şi serurile de cercetat se aduc la temperatura
de 30ºC - 37ºC. Serurile martor de reacţie liofilizate se solubilizează în 1 ml
apă distilată. Se agită energic flaconul de antigen pentru omogenizarea
suspensiei bacteriene. Se depune în placă (sau pe lamă) o picătură (0,03 ml)
ser de cercetat şi o picătură (0,03 ml) antigen colorat cu Rose-Bengal. Se
omogenizează cele două picături timp de 4 minute. În paralel se efectuează
testul similar cu serul martor pozitiv şi cu serul martor negativ.
Citirea şi interpretarea rezultatelor reacţiei se face după 4 minute exact,
astfel:
- Aglutinarea minimă vizibilă pe lamă indică prezenţa anticorpilor
antibrucelici şi serul se încadrează ca pozitiv;
- Lipsa aglutinării indică absenţa anticorpilor antibrucelici şi serul se
încadrează ca negativ.
Serurile testate, considerate pozitive prin RSAR cu antigen colorat cu
Rose-Bengal se vor testa în continuare prin RAL şi RFC.

Reacţia inelară în lapte (Brucella Ring test, Abortus-Bang Ring-probe)

 În contextul precizării lanţului epidemiologic, examinarea laptelui
proaspăt recoltat aduce informaţii importante. Se pot efectua însămânţări
din laptele integral, smântână sau sediment sau inoculări experimentale
pe cobai.
Anticorpii din laptele de oaie sau vacă sunt depistaţi prin reacţia
inelară, pozitivitatea intensă a probelor indicând eliminarea bacteriilor vii pe
cale mamară. Reacţia inelară este o aglutinare obişnuită, particulele de
antigen fiind cuplate prin intermediul anticorpilor; complexul format are
sarcină electrică modificată, ceea ce îi permite fixarea pe particulele de
grăsime, prin care sunt antrenate la suprafaţa coloanei de lapte.
În condiţiile consumului de lapte şi derivate din produse pasteurizate,
controlul pentru bruceloză nu mai este indicat.
Reacţia inelară a laptelui se execută pe lapte crud, nesmântânit, recoltat
fie individual, fie din amestec de la mai multe animale (din bidoane sau
cisterne). Sunt improprii pentru testare: laptele colostral sau din perioada de
înţărcare, mastitic, acidifiat. Pentru efectuarea acestui test trebuie avută în
vedere standardizarea antigenului folosit (antigen brucelic colorat cu
hematoxilină) pentru a depista anticorpii în diluţie de maximum 1/16. De
aceea, în cazul examinării laptelui în amestec, se constituie o probă medie din
cantităţi egale provenite de la maximum 16 animale sau se calculează gradul
de diluţie pentru fiecare cantitate de lapte nou adăugată în bidon (capacitate
25 l). De ex:
Cantitate de lapte Diluţia
7l 7/25 (1/3,57)
5l 5/25 (1/5)
3l 3/25 (1/33)
10 l 10/25 (1/2,5)
Pentru un astfel de amestec testul se poate efectua pe proba medie.
Cantitate de lapte Diluţia
7l 7/25 (1/3,57)
5l 5/25 (1/5)
 3l 3/25 (1/33)
2l 2/25 (1/12,5)
7l 7/25 (1/3,57)
1l 1/25
În acest caz, diluţia ultimei cantităţi de lapte depăşeşte capacitatea
antigenului de a depista anticorpii, de aceea proba medie nu poate fi utilizată
pentru testare în reacţia inelară. În astfel de situaţii fie că se testează
conţinutul bidonului fără a mai adăuga ultima cantitate, sau se recoltează
probe individuale de la animalele implicate, dacă amestecul a fost deja
realizat incluzând cantitatea de 1 litru.
În unităţile în care mulsul se face mecanic, colectarea efectuându-se
direct prin conducte, testul inelar se execută în momentul controlului
producţiei, cumulând probe de la câte 16 animale.
Materiale necesare: antigen brucelic colorat cu hematoxilină, laptele
de cercetat, eprubete Wassermann, stative, pipete de 1 ml, sonde pentru
recoltarea laptelui, recipienţi pentru lapte.
Tehnica de lucru: În tubul de reacţie se introduce 1 ml din laptele de
cercetat şi o picătură de antigen colorat. Amestecul se omogenizează timp de
1 min după care se lasă în repaus la temperatura camerei (22 - 24ºC) timp de
2 ore, sau la termostat (37ºC) timp de 1 oră. Rezultatele se evaluează prin
examinarea aspectului coloanei de lapte şi a inelului de smântână.
Rezultat intens pozitiv (++): inelul este colorat în roz-roşu intens,
coloana de lapte este albă;
Rezultat pozitiv(+): inelul este colorat în roz-roşu intens, în timp ce
coloana este slab sau moderat colorată;
Rezultat dubios (±): inelul de smântână şi coloana de lapte au culori de
intensităţi egale;
Rezultat negativ(-): inelul de smântână are culoare albă, iar coloana de
lapte este colorată în roz-roşu.
Probele intens pozitive, pozitive şi dubioase se recontrolează prin
identificarea indivizilor participanţi la proba comună şi testarea individuală.
În funcţie de rezultatele retestării, pentru cele reacţionate pozitiv sau dubios,
se execută examene serologice prin RAL şi RFC. Reacţia inelară a laptelui
depistează animalele eliminatoare de brucele prin lapte, dar nu toate
animalele bruceloase. Confirmarea diagnosticului necesită efectuarea
concomitentă a câtorva teste de laborator.

Reacţia de fixare a complementului (RFC)

Este utilizată pentru depistarea anticorpilor din sângele animalelor
infectate. Se efectuează după tehnica clasică (vezi tabel), antigenul utilizat
fiind antigenul Wright, acelaşi care este implicat în efectuarea RAL.
Principiul reacţiei: tehnica se bazează pe competiţia pentru
complement a două sisteme antigen anticorp: antigenul brucelic-anticorpii
antibrucelici şi hematia de oaie- anticorpul antihematie de oaie.
Anticorpii prezenţi în serul animalelor infectate se cuplează cu
antigenul standardizat, fixează complementul introdus în reacţie iar sistemul
revelator (hematii de oaie-anticorpi antihematie de oaie), introdus ulterior
rămâne nealterat. Acesta din urmă se prezintă fie sub forma unei suspensii de
hematii, fie, în timp, sub forma unui depozit de culoare roşie, aspectul
indicând o reacţie pozitivă. Intensitatea reacţiei de inhibare a hemolizei se
notează cu un număr variabil de +.
În cazul absenţei anticorpilor antibrucelici, complementul introdus în
reacţie nu se va cupla cu antigenul liber (deoarece situsul de fixare pentru
complement este regiunea balama de pe anticorpul complexat cu antigen), dar
se va fixa pe sistemul revelator, ducând la distrugerea hematiilor, prin
activarea cascadei complementului. În acest caz, lichidul din tubul de reacţie
are culoare roşie şi este limpede, fără a forma depozit, indiferent de durata
timpului de păstrare (soluţie de hemoglobină).
Între cele două extreme (RFC++++ şi RFC -) există situaţii
intermediare, în care intensitatea reacţiei de inhibare a hemolizei este
dependentă de concentraţia anticorpilor.
 Astfel, dacă anticorpii antibrucelici sunt în concentraţie mai mică,
aceştia vor fixa doar o parte din antigenul brucelic şi ulterior, din
complement. O altă parte a complementului rămâne liberă şi se va fixa pe
sistemul revelator, inducând hemoliza parţială. Un astfel de tub de reacţie va
conţine un lichid supernatant de culoare roşietică (hemoliză parţială) dar şi
depozit (sistem revelator intact).
Materiale necesare: antigen brucelic Wright, seruri de cercetat, ser
fiziologic, eprubete Wassermann, stative, pipete gradate sau pipete automate,
termostat.
Tehnica de lucru :
Ser de Martor ser Martor ser Martor Martor alexină
Tub cercetat pozitiv negativ antigen
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Ser de 0,05 0,05 - - - - - - - - -
cercetat
Ser - - 0,05 0,05 - - - - - - -
pozitiv*
Ser - - - - 0,05 0,05 - - - - -
normal (-)
Antigen 0,2 - 0,2 - 0,2 - 0,2 0,4 - - -
diluat
(1/20)
Alexină 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,20 0,25 0,30
diluată
Sol 1,00 1,20 1,00 1,20 1,00 1,20 1,05 0,85 1,30 1,25 1,20
tampon
45 min la 37C (baie marină sau termostat)
Sistem 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
hemolitic
15 min la 37C (sau 20 min daca s-a folosit alexină conservată)

 - ca ser martor pozitiv se foloseşte serul aglutinant antibrucelic inactivat,

diluat ½ şi respectiv 1/16 în soluţie cloruro-sodică tamponată, pentru
intensităţi diferite de fixare
 Alexina conservată şi liofilizată , se va dilua în prealabil, conform
instrucţiunilor. Titrul alexinei corespunde cantităţii de alexină din primul tub
cu hemoliză completă
 Eritrocitele de oaie spălate pot fi proaspete sau conservate în sol. Alsever
 Hemolizina folosită în sistem corespunde la 4u/ml. Sensibilizarea sistemului
hemolitic se face la 37C timp de 15 min
 Pentru diluţii şi titrări se foloseşte sol. Salină 0,85% cu tampon veronal (după
Kabat-Meyer)

Notarea rezultatelor se va face astfel:

 ++++ - hemoliză inhibată 100 % (sau hemoliză 0)
+++ - hemoliză inhibată 75% (sau hemoliză 25%)
++ - hemoliză inhibată 50% (sau hemoliză 50%; in acest caz apare o
echivalenţă a inhibării cu hemoliza)
+ - hemoliză inhibată 25% (sau hemoliză 75%)
- - hemoliză inhibată 0% (hemoliză 100%)

RFC este considerată pozitivă atunci când hemoliza este total (++++,
100%) sau aproape total (+++, 75%) inhibată; dubioase atunci când hemoliza
este parţială (++, 50%) sau aproape completă (inhibarea +, sau 25%).

Rezultatele furnizate de RFC şi RAL sunt coroborate astfel:

Pozitive : probele care dau rezultat pozitiv la una din cele două reacţii
(RAL sau RFC);
Dubioase : probele cu rezultat dubios la RFC şi negativ la RAL
Negative : probele cu rezultat dubios la RAL şi negativ la RFC (dacă la
tot lotul RFC a fost negativ iar la RAL nu a fost nici un rezultat pozitiv), sau
probele cu rezultate negative la ambele.