20

16

Microbiologie
SUBIECTE REZOLVATE – SEMESTRUL I
DIMITRI APOSTOL
1. CELULE EUCARIOTE ȘI PROCARIOTE, CARACTERISTICI COMPARATIVE 7

2. CLASIFICAȚI BACTERIILE DUPĂ FORMĂ

EXEMPLE
ȘI DIS PUNERE – 7

3. ENUMERAȚI COMPONENTELE CONSTANTE ȘI FACULTATIVE ALE CELULEI BACTERIENE 8

4. STRUCTURA PERETELUI LA BACTERIILE GRAM P OZITIVE ȘI GRAM NEGATIVE 9

5. ROLUL PERETELUI BACTERIAN 10

6. COLORAȚIA GRAM, TIMP I – INTERPRETARE –

EXEMPLE 10

7. PROTOPLAȘTI
FORME
– SFEROP
L LAȘTI – 11

8. COLORAȚIA ZIEHL -NEELSEN, TIMPI –EXEMPLE

INTERPRETARE – 11

9. STRUCTURA ȘI ROLUL MEMBRANEI CITOPLASMATICE 12

10. RIBOZOMII, STRUCTURĂ ȘI ROL 13

11. MEZOZOMI – INCLUZII

VACUOLE
– (ÎN STRUCTURA CELULEI BACTERIENE) 13

12. MASA NUCLEARĂ BACTERIANĂ – STRUCTURĂ, CARACTERISTICI 14

13. CUM ESTE ÎNSCRISĂ INFORMAȚIA GENETICĂGENOMUL

ÎN CELULEI BACTERIENE 14

14. ENUMERAȚI ȘI DESCRIEȚI SUCCINT ETAPELE B IOSINTEZEI PROTEICE 15

15. CAPSULA BACTERIANĂ – STRUCTURĂ, ROL, LOCALIZARE 15

16. FLAGELII BACTERIENI – STRUCTURĂ, ROL, LOCALIZARE 16

17. FIMBRIILE BACTERIENE* 17

18. SPORII BACTERIENI – STRUCTURĂ, ROL, LOCALIZARE 17

19. APA, SUBSTANȚELE MINERALE ȘI PIGMENȚII ÎN STRUCTURA CELULEI BACTERIENE 18

1
20. GLUCIDELE, PROTEINELE ȘI LIPIDELE ÎN STRUCTURA CELULEI BACTERIENE 19

21. SUBSTANȚE CU ACȚIUNE ANTIBIOTICĂDEPRODUSE

BACTERII* 20

22. NUTRIȚIA PRINCIPALELOR BACTERII STUDIATE: TIPURI DE NUTRIȚIE 20

23. CLASIFICAREA BACTERIILOR ÎN FUNCȚIE DE T IPUL RESPIRATOR 21

24. DEFINIȚI FACTORII DE CREȘTERE BACTERIENI; EXEMPLE 22

25. CLASIFICAȚI BACTERIILE ÎN FUNCȚIE DE TEMPERATURA OPTIMĂ DE D EZVOLTARE; EXEMPLE 22

26.PEPTIDOGLICANULUI
STRUCTURA ȘI SINTEZA 23

27. DEFINIȚI NOȚIUNEA DE CULTIVARE A BACTERIILOR; ENUMERAȚI PE CE SUBSTRATURI SE REA LIZEAZĂ

24

28. DEFINIȚI NOȚIUNEA DE CREȘTERE ȘI MULTIPLICARE BACTERIANĂ* 25

29. DEFINIȚI NOȚIUNEA DE MEDIU SELECTIV, ELECTIV ȘI DE ÎMBOGĂȚIRE; EXEMPLE 25

30. DEFINIȚI NOȚIUNEA DE MEDIU DIFERENȚIAL; EXEMPLE* 25

31. CE ESTE O COLONIE BA CTERIANĂ ? CUM SE POT OBȚINE COLONII BACTERIENE IZOLATE ? 26

32. FAZELE DEZVOLTĂRII U NEI CULTURI BACTERIENE 27

33. ASPECTELE CULTURILOR BACTERIENE PE MEDII SOLIDE; CORELAȚII ÎNTRE ACESTEA ȘI PATO GENITATE;
EXEMPLE 28

34. ASPECTELE CULTURILOR BACTERIENE PE MEDII LI CHIDE; CORELAȚII ÎNTRE ACESTEA ȘI

PATOGENITATE; EXEMPLE 29

35. SISTEME DE CULTURI CONTINUE; DEFIN IȚII ȘI EXEMPLE 29

36. DEFINIȚI NOȚIUNILE DE ASEPSIE ȘI ANTISEPSIE; EXEMPLE DE ANTISEPTICE; APLICAȚII 30

37. DEFINIȚI NOȚIUNILE DE STERILIZARE ȘI DEZINFECȚIE; EXEMPLE DE DEZINFECTANTE; APLICAȚII 30

38. ANTISEPTICE ȘI DEZIN FECTANTE. MECANISME DE ACȚIUNE 31

39. STERILIZAREA PRIN CĂLDURĂ UMEDĂ; METODE, PRESIUNE, TEMPERATU RĂ, APLICAȚII 32

2
40. AUTOCLAVAREA – PRINCIPIU, PARAMETRII TEHNICI, UTILIZĂRI 32

41. STERILIZAREA PRIN CĂLDURĂ USCATĂ; METODE, PRESIUNE, TEMPERATURĂ, APLICAȚII 33

42. CONGELAREA ȘI LIOFILIZAREA BACTERIILOR – DEFINIȚIE, EFECTE ASUPRA VIABILITĂȚII GERMENILOR,

APLICAȚII 34

43. BACTERIOFAGII – DEFINIȚIE, STRUCTURĂ, TIPURI DE INTERACȚIUNE FAG-BACTERIE (ENUMERARE) 35

44. INTERACȚIUNEA FAG-BACTERIE: CICLUL LITIC (ETAPE, EVIDENȚIERE) 36

45. INTERACȚIUNEA FAG-BACTERIE: CICLUL LIZOGEN, PROPRIETĂȚILE BACTERIILOR LIZOGENE 36

46. ADN BACTERIAN; LOCAL IZARE, STRUCTURĂ, ROL 38

47. REPLICAREA ADN BACTERIAN; MECANISM 40

48. PLASMIDELE; DEFINIRE, TIPURI, ROLURI ÎN CELULA BACTERIANĂ 41

49. FACTORUL F ȘI FACTORUL R; DEFINIȚIE, ROL URI 42

50. DEFINIȚI NOȚIUNILE DE GENOM, GENOTIP ȘI FENOTIP; VARIABILITATEA GENETICĂ ȘI FENOTIPICĂ 43

51. MUTAȚIILE LA BACTERII; DEFINIȚIE, TIPURI DE MUTAȚII, CLASIFICARE 44

52. TRANSFORMAREA LA BACTERII; DEFINIȚIE, MECANISM 45

53. TRANSDUCȚIA; DEFINIȚIE, MECANISM, TIPURI DE TRANSDUCȚIE 45

54. CONJUGAREA BACTERIANĂ 46

55. SUBSTANȚE ANTIBIOTICE ȘI CHIMIOTERAPICE; DEFINIȚIE, UTILIZĂRI ÎN CLINICĂ ȘI LABORATOR 46

56. ANTIBIOTICE BACTERICIDE ȘI BACTERIOSTATICE; DEFINIȚII, EXEMPLE 47

57. CLASIFICAREA SUBSTANȚELOR ANTIMICROBIENE DUPĂ MECANISMUL DE ACȚIUNE; EXEMPLE 47

58. CLASIFICAREA ANTIBIOTICELOR DUPĂ STRUCTURA CHIMICĂ; CLASE PR INCIPALE, EXEMPLE 48

59. REZISTENȚA LA ACȚIUN EA ANTIBIOTICELOR; DEFINIȚII, TIPURI 49

60. ANTIBIOGRAMA DIFUZIMETRICĂ; PRINCIPIU, INTERPRETARE 50

3
61. DEFINIȚI NOȚIUNEA DE CMI ȘI CMB; CUM SE DETERMIN Ă ȘI CARE ESTE UTILITATEA DETERMINĂRII
CMI ȘI CMB ? 51

62. DEFINIȚI NOȚIUNILE DE SIMBIOZĂ, COMENSALISM, PARAZITISM; EXEMPLE 52

63. DEFINIȚI PATOGENITATEA ȘI VIRULENȚA; EXEMPLE DE FACTORI DE PATOGENITATE 53

64. FLORA MICROBIANĂ NORMALĂ A ORGANISMULUI UMAN 53

65. DEFINIȚI NOȚIUNILE DE EXOTOXINĂ, ENDOTOXINĂ, ANATOXINĂ ȘI ANTITOXINĂ; EXEMPLE 55

66. INFLAMAȚIA; DEFINIȚIE, FACTORI CARE DETERMINĂ PROCESUL INFLA MATOR 56

67. ETAPA MECANISMELOR D E DECLANȘARE A INFLAMAȚIEI 58

68. SUB-ETAPELE VASCULARĂ ȘI EXSUDATIVĂ, ÎN CADRUL PROCESULUI INFLAMATOR 60

69. CONSECINȚELE ACTIVĂRII MECANISMELOR INFLAMATORII 61

70. DEFINIȚI NOȚIUNILE DE INFECȚIE, INFECȚIE INAPARENTĂ, STARE DE BOALĂ ȘI STARE DE PURT ĂTOR
DE GERMENI 63

71. DEFINIȚI NOȚIUNEA DE RĂSPUNS IMUN ȘI PRECIZAȚI PRINCIPALELE SALE ATRIBUTE 64

72. DEFINIȚI RĂSPUNSUL IMUN UMORAL ȘI SPECIFICAȚI CEL ULELE IMPLICATE ÎN REALIZAREA SA 65

73. ENUMERAȚI TIPURILE DE IMUNITATE ȘI DESCRIEȚI -LE PE SCURT 66

74. ORGANELE CENTRALE ȘI PERIFERICE ALE SISTEMULUI IMUN; LOCALIZ ARE, FUNCȚII 67

75. ENUMERAȚI CELULELE IMPLICATE ÎN RĂSPUNSUL IMUN 69

76. LIMFOCITELE T – ORIGINE, EVOLUȚIE, TIPURI, FUNCȚII 69

77. LIMFOCITELE B – ORIGINE, EVOLUȚIE, TIPURI, FUNCȚII 71

78. SISTEMUL MONONUCLEAR – ORIGINE, TIPURI D E CELULE, FUNCȚII 72

79. GRANULOCITELE – ÎN IMUNITATE

TIPURI, ROL 73

80. SISTEMUL COMPLEMENT – DEFINIRE, ELEMENTE COMPONENTE, ROLURI ȘI EFECTE BIOLOGICE 74

4
81. CALEA CLASICĂ DE ACTIVARE A COMPLEMENTULUI 75

82. CALEA DE ALTERNATIVĂ

DE ACTIVAREA A COMPLEMENTULUI 75

83. INTELEUKINELE –
ORIGINE, TIPURI, EFECTE 76

84. COOPERĂRI CELULARE DIRECTE,

IMUN ÎN RĂSPUNSUL 77

85. COOPERĂRI CELULARE ( INDIRECTE) MEDIATE D E CITOKINE, ÎN RĂSPUNSUL IMUN 77

86. PREZENTAȚI SCHEMATIC PRINCIPALELE COOPERĂRI CELULARE CE INTERVIN ÎN RĂSPUNSUL IMUN 78

87. PRECIZAȚI SUCCESIUNEA DE EVENIMENTE DIN CADRUL RĂSPUNSULUI I MUN UMORAL, PÂNĂ LA
SINTEZA DE ANTICORPI 79

88. EXPUNEȚI PRINCIPIILE TEORIEI SELECȚIEI CLONALE ÎN RĂSPUNSUL IMUN 80

89. RĂSPUNSUL IMUN PRIMAR ȘI SECUNDAR; CARACTERISTICI PRINCIPALE 80

90. VACINURI; CE SUNT ȘI ÎN CE SCOP SE UTILI ZEAZĂ ? 81

91. CLASIFICAREA VACCINURILOR; EXEMPLE 82

92. DESCRIEȚI SCHEMATIC STRUCTURA UNEI MOLECULE DE IMUNOGLOBULINĂ 82

93. TIPURI DE IMUNOGLOBULINE 84

94. IGM ȘI IG G; STRUCTURĂ ȘI ROL 84

95. IGA ȘI IG E; STRUCTURĂ ȘI ROL 85

96. CE SUNT ANTIGENELE: DEFINIȚIE, TIPURI, EXEMPLE 85

97. ANTIGENELE; FACTORI DE CARE DEPINDE IMUNOGENITATEA 86

98. REACȚII ANTIGEN-ANTICORP; MECANISM GENERAL ȘI FORME DE EVIDENȚIERE 87

99. REACȚII DE PRECIPITA RE ÎN MEDIU LI CHID; EXEMPLE, UTILIZĂRI 88

100. REACȚII DE PRECIPITA RE ÎN GEL; EXEMPLE, UTILIZĂRI 90

101. REACȚII DE AGLUTINARE; PRINCIPIU, TIPURI, EXEMPLE 92

5
102. REACȚIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI; PRINCIPIU, ETAPE, UTILIZĂRI, EXEMPLE 93

103. REACȚIA DE SERONEUTR ALIZARE; PRINCIPIU, TIPURI, UTILIZĂRI, EXEMPLE 95

104. REACȚII ANTIGEN-ANTICORP CARE UTILIZEAZĂ COMPONENTE MARCATE; TIPURI DE MARCARE,

UTILIZĂRI 98

105. HIPERSENSIBILITATEADEFINIRE,
– TIPURI DE HIPERSENSIBILITATE, EXEMPLE 99

106. REACȚII ANAFILACTICE

MECANISM,
– FORME DE MANIFESTARE 100

107. –
HIPERSENSIBILITATEA DE TIP IIIMECANISM, BOALA SERULUI, ALTE EXEMPLE 103

108. HIPERSENSIBILITATEA DE TIP IV – MECANISM, EVIDENȚIERE, APLICAȚII PRACTICE 105

BIBLIOGRAFIE 109

6
 Celula bacteriană este o celulă procariotă și are caracteristici structurale diferite în comparație cu
celula eucariotă
Tabel: Caracteristici comparative (celula eucariotă / celula procariotă)

Celula eucariotă Celula procariotă

Nucleul - prezintă membrană - nu prezintă membrane
- are mai mulți cromozomi - are un singur cromozom, circular

- prezintă aparat mitotic - absența mitozei

- nucleul este tipic, prezintă nucleol - nu este tipic ci apare ca nucleoid
Citoplasma prezintă: nu prezintă:
- reticul endoplasmic - reticul endoplasmic,
- mitocondrii - mitocondrii,
- lizozomi - lizozomi
- ribozomi 80S prezintă ribozomi 70S
- membrana citoplasmatică conține membrana citoplasmatică nu
sterol conține steroli (excepție Mycoplasma)
Peretele - absent sau compus din celuloză - are structură complexă,
celular sau chitină. prezentând glicopeptid, proteine, lipide
- nu prezintă glicopeptid etc.
Diviziune Mitoză diviziune directă (binară)
Capsula Absentă adesea prezentă

În funcție de formă, bacteriile se pot grupa în mai multe categorii și pot avea:

A. formă cocoidală, cu diametre egale sau inegale (coci), dispuse izolat sau grupat. Majoritarea
steptococilor și stafilococii sunt sferici, enterococii sunt ovalari, pneumococii sunt lanceolați, gonococii și
meningococii pot fi reniformi.

Dispunerea bacteriilor depinde de mediul de cultură în care se dezvoltă, de vârsta culturii

bacteriene, de alte aspecte fiziologice precum și de modul în care are loc diviziunea în cursul procesului de
creștere și multiplicare (planul de diviziune).

Modul de dispunere poate fi considerat, cu anumite rezerve, caracteristic pentru unele genuri de
bacterii, de ex.:

 stafilococii sunt coci sferici dispuși în grămezi („ciorchine”);

 pneumococii sunt coci lanceolați dispuși doi câte doi, eventual înconjurați de o capsulă comună (în
diplo);
 streptococii sunt coci dispuși în lanțuri etc.;
B. formă de bastonaș (bacili, „rods”), drepți cu capetele ușor rotunjite (enterobacterii), drepți cu capetele
tăiate drept (Bacillus anthracis), fuziformi, cu ambele capete ascuțite (Fusobacterium nucleatum), dispuși

7
 uneori într-un mod caracteristic (de exemplu „în palisade”, ca și scândurile dintr-un gard - bacilii
pseudodifterici);
C. aspect cocobacilar (exemplu H. influenzae, B. pertussis, B. abortus);
D. actinomicete, care în culturi tinere formează filamente lungi, ramificate (asemănător mucegaiurilor);
aceste filamente se fragmentează și rezultă aspecte bacilare (ex. Actinomyces israelli);
E. forma spiralată (bacili curbi - V. cholerae, spirili și spirochete - T. pallidum).

Unele bacterii, chiar și atunci când rezultă prin multiplicarea unei singure celule „mamă” prezintă un
pleomorfism deosebit de accentuat (de exemplu Proteus spp.).

În culturi vechi sau sub influența unor factori fizici, chimici, biologici, sub tratament cu antibiotice
etc., pot apărea forme modificate: filamentoase, umflate, ramificate etc., care pot crea confuzii de diagnostic
pentru examinatorul fără experiență sau care nu face o examinare ținând cont de context. Dacă are loc
repicarea acestora pe mediu de cultură proaspăt iar examinarea ulterioară se face la timpul potrivit (având în
vedere durata optimă de multiplicare) vor rezulta forme „tipice” pentru specia respectivă.

Atât din punct de vedere structural cât și funcțional, există o serie de asemănări între celula
procariotă și celula eucariotă. Bacteriile prezintă atât elemente structurale interne cât și structuri externe
care pot și merită a fi studiate având implicații în relațiile dintre celula bacteriană și organismul gazdă. Există
două tipuri de elemente structurale, unele dintre acestea fiind întâlnite la toate speciile de bacterii
(constante), altele fiind întâlnite numai în anumite condiții și doar la anumite specii sau tulpini bacteriene
(facultative).

Structurile constante ale celulei bacteriene sunt reprezentate de:

1. Peretele bacterian
2. Membrana citoplasmatică
o Mezozomii
3. Citoplasma
o Ribozomii
o Incluziile
o Vacuolele
o Plasmide
4. Nucleul

1. Capsula
2. Flagelii
3. Fimbriile (pilii)
4. Sporii

8
 Peretele bacterian înconjoară membrana citoplasmatică. Lipsește la bacteriile din
genul Mycoplasma. Are o grosime de circa 15-30 nm.

Bacteriile Gram-pozitive conțin aproximativ 80-90% mureină (peptidoglican, glicopeptid parietal).

Mureina este un heteropolimer al cărui schelet este format din lanțuri polizaharidice. Aceste lanțuri sunt
formate prin polimerizarea, alternantă, a 2 structuri zaharidice:

 acidul N-acetil-muramic (NAM)


N-acetil-glucozamina (NAG)
Fiecare moleculă de NAM
are substituit un tetrapeptid
alcătuit din D și L-aminoacizi (se
consideră că aminoacizii în formă D
conferă un grad de protecție față
de enzimele proteolitice). Între
tetrapeptidele substituite, la
lanțurile polizaharidice alăturate,
se stabilesc legături peptidice prin gruparea terminală COOH a unui tetrapeptid și grupări terminale libere
ale tetrapeptidului vecin. Astfel se formează structuri bidimensionale, destul de complicate, sub forma unor
straturi care înconjoară întreaga celulă bacteriană.

Bacteriile Gram-pozitive rețin violetul de metil (violet de gențiană în colorația „clasică”) și au culoare
violet pe frotiul colorat Gram. Dintre bacteriile Gram-pozitive se pot aminti stafilococul, streptococul,
enterococul, bacilul difteric, bacilul listeriozei, actinomicetele, bacilul antraxului, clostridiile etc.

În cazul bacteriilor Gram-negative se descrie un perete celular în general mai subțire dar mult mai
complex. Peretele este alcătuit dintr-un strat fin de peptidoglican (circa 10-20% din structura peretelui) care
9
este acoperit de o membrană externă. Spațiul dintre membrana citoplasmatică și membrana externă
(include peptidoglicanul) reprezintă spațiul periplasmic. Din punct de vedere chimic, membrana externă este
alcătuită din fosfolipide, proteine și cantități variabile de lipopolizaharide. Alte proteine importante care se
află la acest nivel sunt porinele. Lipopolizaharidul (endotoxina) are în componență două structuri esențiale:
lipidul A și polizaharidul O. Bacteriile Gram-negative se decolorează cu alcool-acetonă și se recolorează cu
fucsină diluată (au culoare roșie la colorația Gram). Dintre bacteriile Gram-negative am putea aminti
meningococul, gonococul, enterobacteriile, vibrionul holeric, bacilul piocianic, cocobacilii Gram-negativi
(ex. Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella abortus ) etc.

Rolurile peretelui bacterian:

 prin rigiditate asigură forma caracteristică bacteriei (coci, bacili etc);

 asigură rezistența bacteriei (de exemplu la variații ale presiunii osmotice și la presiuni interioare care
pot ajunge până la 20 atm.);
 flexibilitatea peretelui celular la unele bacterii (ex. spirochete) poate fi explicată atât prin
flexibilitatea membranei cât și prin grosimea redusă a peptidoglicanului;
 are rol antigenic (carbohidratul C la streptococ, antigenul O - polizaharidic etc);
 prezintă receptori, de exemplu pentru bacteriofagi;
 are rol în diviziunea bacteriană participând la formarea septului transversal;
 la nivelul lui pot acționa unele antibiotice (exemplu beta-lactaminele, vancomicina);

la bacteriile Gram-negative este asociat cu numeroase enzime (situate în spațiul periplasmic și la
nivelul membranei externe).

 diluăm într-un recipient fucsină (9 părți apă distilată / 1 parte fucsină)

 acoperim frotiul cu violet de metil sau cristal violet (violet de gențiană din punct de vedere istoric),
pentru 1-3 minute (nu are rost să acoperim cu colorant lama în întregime)
 îndepărtăm colorantul
 acoperim frotiul cu lugol (mordant, fixator) pentru 1-3 minute
 îndepărtăm lugolul
 acoperim frotiul cu un amestec de alcool-acetonă (1 parte acetonă / 3 părți alcool de 96º) pentru

un timp foarte scurt, 7-8 secunde

 spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet
 acoperim frotiul cu fucsina diluată 1/10 pentru 1 minut
 spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet
 așezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare cu sugativă
sau hârtie de filtru
 examinăm la microscop, notăm observațiile, interpretăm

10
 În cazul în care frotiul a fost realizat din cultură pură putem vizualiza microorganisme cu aceeași
formă, aceleași dimensiuni (excepție Proteus spp.), o anumită dispoziție, cu sau fără capsulă (halou
necolorat), gram pozitive (colorate în violet) sau gram negative (colorate în roșu), levurile se colorează în
violet

În cazul în care frotiul a fost realizat din produs patologic putem vizualiza celule diferite (în funcție de
sediul recoltării) și celule inflamatorii pentru care nucleul și citoplasma apar în diverse nuanțe de roșu,
bacterii gram pozitive și / sau gram negative, fibrină și levuri care se colorează în violet etc

Are formă rotundă înconjurată de membrana citoplasmatică și reprezintă bacteria Gram-pozitivă

după îndepărtarea completă a peretelui, de exemplu sub acțiunea lizozimului care lizează mureina. În medii
hipotone protoplastul se lizează. Este o structură care nu se poate multiplica.

Reprezintă bacteria Gram-negativă după degradarea parțială a peretelui (conține o cantitate mai
mică de mureină). Lizozimul poate acționa asupra peptidoglicanului numai după alterarea membranei
externe (ex. după tratare cu EDTA). În medii hipotone sferoplastul se lizează. Spre deosebire de protoplast,
se poate multiplica.

Anumite bacterii produc autolizine (enzime hidrolitice care degradează peptidoglicanul, spre exemplu
glicozidaze, amidaze, peptidaze). Este probabil ca aceste substanțe să aibă un rol în creșterea și multiplicarea
bacteriană.

În 1935 s-a observat prezența unor germeni modificați structural. Au fost numite forme „L”, după
numele Institutului Dr. Lister unde au fost descoperite. Nu sunt microorganisme noi, ci variante ale unor
microorganisme cu peretele bacterian modificat. Utilizându-se lizozim sau penicilină ca agenți inductori s-au
putut obține forme „L” de la majoritatea bacteriilor. Este posibil ca aceste forme „L” să explice, prin prezența
lor în organism, anumite infecții cronice (de exemplu infecții ale aparatului urinar).

Este o colorație utilă în identificarea prezenței de bacili acid-alcool rezistenți (BAAR), solubilizând
peretele bacterian prin creșterea temperaturii, facilitând penetrarea colorantului.

 punem frotiul uscat și fixat pe un suport situat deasupra tăviței de colorare

 acoperim complet lama cu fucsină bazică nediluată (filtrată extemporaneu)

11
  trecem becul de gaz aprins pe sub lama acoperită de fucsină, până începe emiterea de vapori (nu
atingem temperatura de fierbere). În cazul în care lama nu mai este acoperită complet cu fucsină,
adăugăm colorant. Timpul de lucru este de 10 minute, perioadă în care repetăm de 3 ori operația de
încălzire a lamei până la emiterea de vapori.
 spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet
 adaugăm amestecul decolorant acid-alcool (3 ml acid clorhidric concentrat / 97 ml alcool etilic 90-
95º), pentru 2-3 minute
 spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet
 recolorăm cu albastru de metilen, 1 minut
 spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet
 așezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare cu sugativă
sau hârtie de filtru
 examinăm la microscop, notăm observațiile, interpretăm

Frotiu colorat Ziehl-Neelsen - putem vizualiza: bacili de culoare roșie, relativ fini (în cazul prezenței
BAAR), alte bacterii (ne-AAR), celule diferite (în funcție de sediul recoltării) și celule inflamatorii de culoare
albastră (toate structurile ne-AAR apar colorate albastru) etc; în cazul colorării unui frotiu din cultură pură
vom evidenția numai bacili de culoare roșie.

Între perete și citoplasmă există membrana citoplasmatică având grosimea de 7-10nm; poate
reprezenta circa o zecime din greutatea uscată a peretelui bacterian. Electronomicrografic apare formată din
2 straturi întunecoase separate de un strat mai clar. Este considerată un „mozaic fluid”, compusă dintr-un
film fosfolipidic în care flotează proteine globulare cu extremitățile polare hidrofile expuse spre spațiul
intracelular, extracelular sau ambele. Aproape 10% din proteinele celulei bacteriene, peste 200 de feluri de
proteine, sunt localizate la nivelul membranei citoplasmatice. Fosfolipidele, dispuse în dublu strat, au
extremitățile polare, hidrofile, expuse contactului cu apa pe ambele fețe ale membranei și extremitățile
nepolare, hidrofobe, orientate spre stratul mijlociu al membranei. Nu conține steroli (excepție Mycoplasma
spp).

Rolurile membranei citoplasmatice sunt:

 filtru selectiv, datorită permeazelor (rol în permeabilitate și transport);

 barieră osmotică;
 conține enzime ale metabolismului respirator (de exemplu citocromi);
 este sediul majorității activităților enzimatice ale celulei bacteriene (de exemplu intervine activ
în procesele de biosinteză);
 excretă unele enzime hidrolitice;
 intervine activ în procese de biosinteză;
 contribuie la formarea septului transversal (rol în diviziunea celulară);
 participă la procesul de chemotaxie prin receptorii de pe suprafața sa.

Asupra membranei pot acționa anumite antibiotice (de exemplu polimixinele).

12
 Ribozomii au formă aproximativ sferică, pot fi văzuți la microscopul electronic. Mărimea lor (circa 10-
20 nm) depinde de concentrația ionilor Mg2+ și K+. Unii ribozomi sunt liberi în citoplasmă, în timp ce alții apar
legați de fața internă a membranei citoplasmatice. Din punct de vedere chimic conțin circa 65% ARNr
(ribozomal). Au constanta de sedimentare de 70S (unități Svedberg) dar sunt constituiți din două subunități
de câte 30S (O subunitate ARN 16S legat de 21 de proteine) și respectiv 50S (ARN 5S, ARN 23S și 31

proteine). Întreproteice.
cursul sintezei cele douăSesubunități
apreciazăse
căformează canalul
într-o bacterie cuprin care trecmedii,
dimensiuni moleculele defaza
aflată în ARNmde (mesager) în
creștere activă,
se sintetizează circa 500 ribozomi / minut, metabolismul bacterian fiind foarte intens.

Ribozomii au rol esențial în procesul de biosinteză proteică . Au tendința de a se grupa în polisomi

(poliribozomi) cu eficiență sporită în biosinteza proteică. În aceste condiții, la un moment dat pe aceeași
moleculă de ARNm se află în scopul traducerii mesajului genetic mai mulți ribozomi, care constituie un
ansamblu care poartă numele de polisom.

Mezozomii sunt structuri care se formează prin invaginarea membranei citoplasmatice de care
rămân legați. Sunt prezenți în special la bacteriile Gram-pozitive. Au structura chimică a membranei
citoplasmatice și aceleași funcții în permeabilitate și respirație. Cu un capăt se pot fixa de materialul nuclear,
favorizând distribuirea în mod egal a genomului între cele două celule fiice. Au rol și în formarea septului
transversal.

Incluziile sunt formațiuni care apar în citoplasmă la sfârșitul perioadei de creștere activă.
Dimensiunea și forma incluziilor citoplasmatice pot varia în funcție de condițiile externe. Pot conține
polimeri anorganici (de exemplu, corpusculii metacromatici ai genului Corynebacterium, la a căror
descoperire a avut un rol important Profesorul Victor Babeș), substanțe anorganice simple, polimeri organici
(rezervor energetic mai ales la germenii sporulați aerobi), lipide, cristale, granulații de sulf etc.

Vacuolele sunt formațiuni sferice care conțin diferite substanțe în soluție apoasă. Au o membrană
lipoproteică numită tonoplast. Au fost descrise în mai ales la bacteriile acvatice și ar putea avea un rol în
plutirea acestora.

13
 Masa nucleară vine în contact direct cu citoplasma. Este localizată în partea centrală a celulei.
Conține ADN, nu are nucleoli. Are afinitate pentru coloranții bazici, dar pe preparatele colorate uzual este
mascat de bazofilia intensă a citoplasmei bogată în ARN.

Unicul cromozom bacterian este alcătuit dintr-o singură moleculă de ADN dublu catenar, cu aspectul
unui fir lung (1.000-2.000 µm), închis într-un inel și replicat pe el însuși, superspiralat. Mărimea
cromozomului poate să difere în funcție de specia bacteriană (și respectiv numărul de perechi de baze); cea
mai mică celulă bacteriană ar fi cea de Mycoplasma spp., la care dimensiunea este de 4.700 kpb, în timp ce
cromozomul de E. coli poate avea o dimensiune de circa 3 ori mai mare. Având în vedere că dimensiunea
bacteriilor este de circa 1-2 mm în cazul cocilor și de câteva ori mai mare în cazul bacililor, pentru ca
materialul genetic să poată fi conținut în acest spațiu redus, acesta trebuie să fie compactat într-un mod
remarcabil și astfel, rezultă nucleoidul bacterian care poate fi diferențiat microscopic. Nucleoidul este format
din molecula de ADN asociată cu proteine și o cantitate variabilă de ARN.

În 1989 s-a descoperit că există și bacterii care dețin cromozomi lineari (ex. Borrelia burgdorferi).
Toate speciile din genul Borrelia dețin și plasmide lineare.

Replicarea cromozomului bacterian se face printr-un mecanism semiconservativ. Așa cum am

menționat, cromozomul este unic, însă în celula care se dezvoltă rapid există posibilitatea ca înainte ca prima
replicare să se fi încheiat să se inițieze încă o replicare și în acest caz celula bacteriană va putea fi meroploidă
(doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori) sau chiar poliploidă (tot cromozomul a
fost copiat de mai multe ori). Dacă replicarea cromozomială nu este succedată de diviunea celulei (așa cum
se întâmplă în mod obișnuit), putem remarca în celula bacteriană existența mai multor cromozomi.
Cromozomii suplimentari (în total 2 sau 4) nu aduc o informație genetică diferită pentru că ei sunt copii ale
cromozomului inițial (identici cu acesta).

Nucleul deține informația genetică necesară proceselor vitale de creștere și multiplicare.

Din punct de vedere funcțional, 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de ADN formează
un codon. Codonii dețin informația genetică pentru a plasa într-o anumită secvență un anumit aminoacid, în
lanțul polipeptidic care va fi sintetizat la nivelul ribozomilor.

Cistronul reprezintă o subunitate funcțională a genei, capabilă să determine independent sinteza

unui lanț polipeptidic.

Gena structurală reprezintă o porțiune a genomului, respectiv o anumită secvență de nucleotide

dispuse liniar. Genele structurale reprezintă circa 90% din ansamblul informației genetice. Poartă înscrisă în
14
structura sa informația genetică necesară pentru sinteza unei proteine specifice, structurale sau funcționale
(enzime).

Biosinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor.

Cu toate că secvența de aminoacizi din structurile proteice este „dictată” de secvența de baze

azotate din ADN, pentru că nu există afinitate și posibilitate de cuplare între ADN și aminoacizi este necesar
ca o altă structură să permită poziționarea aminoacizilor în lanțul viitoarei proteine.

Inițial are loc transcrierea informației genetice pe ARNm (mesager), care va transporta această
informație de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare. Gena este segmentul de
ADN care deține informația genetică pentru sinteza unei proteine. Segmentul de ADN care controlează
sinteza unui polipeptid poartă numele de cistron.

ARNm care deține informația genetică pentu sinteza unei singure catene de polipeptid poartă
numele de ARNm monocistronic.

La bacterii, de obicei, o moleculă de ARNm trebuie să poarte informația necesară pentru sinteza mai
multor catene diferite și în acest caz ARNm poartă numele de ARNm policistronic. Această situația
particulară este datorată dimensiunii mici a acestor procariote precum și metabolismului intens care are loc
în cursul procesului de creștere și multiplicare. Spre exemplu, la E. coli, pentru metabolizarea lactozei sunt
necesare potențial 3 enzime diferite, iar mesajul genetic pentru sinteza acestora se află deținut de o singură
moleculă de ARNm policistronic.

De regulă, numai o catenă de ADN este folosită drept matriță pentru ARNm. Transcrierea mesajului
genetic este selectivă (se desfășoară între promotor și semnalul de terminare) și este controlată de ARN
polimeraza ADN-dependentă.

Pentru traducerea mesajului genetic este necesară intervenția la nivel ribozomal a moleculelor de
ARNt (de transfer). Acestea au o dublă specificitate (pentru fiecare dintre cei 20 de aminoacizi există una sau
mai multe molecule de ARNt; în același timp există enzime specifice fiecărui tip de aminoacid care
controlează legarea corectă a aminoacizilor activați pe ARNt corespunzător). La nivelul fiecărui ARNt există
trei nucleotide (anticodon) complementar codonului care corespunde aminoacidului.

ARNt nu are niciodată la anticodon succesiunea UUA, CUA sau ACU și în aceste condiții ne putem
explica motivul pentru care codonii UAA, UAG și UGA sunt codoni stop.

Succesiunea specifică a nucleotidelor este transpusă într-o secvență specifică de aminoacizi care
intră în constituția lanțului polipeptidic din proteina în curs de formare.

Numeroase bacterii sintetizează polimeri organici (de obicei polizaharide) care formează în jurul
celulei o matrice fibroasă, numită glicocalix.

15
 La unele bacterii glicocalixul aderă strâns de celula bacteriană și reprezintă capsula. Există bacterii
care dețin o capsulă bine definită, cu structură polizaharidică (S. pneumoniae, K. pneumoniae, unele tulpini
de E. coli etc) sau cu structură polipeptidică (Bacillus anthracis etc).

La alte bacterii, glicocalixul f ormează o rețea laxă de fibrile care se pierde parțial în mediu și poate fi
separată de corpul bacterian prin centrifugare, capsula flexibilă, care nu este vizibilă la microscopul optic.

Roluri:

 factor de virulență, împiedicând fagocitarea bacteriei și favorizând invazivitatea;



rezistență față de surfactanți, anticorpi;

 permite aderarea unor bacterii (rol de adezină);
 barieră protectoare față de bacteriofagi, protozoare;
 conține substanțe cu specificitate antigenică (de specie sau de tip) - antigenul K. Spre exemplu, în
cazul S. pneumoniae există peste 90 tipuri antigenice capsulare în timp ce la E. coli sau la Klebsiella
pneumoniae există peste 80 tipuri antigenice capsulare.

Referitor la modalitățile de evidențiere ale structurilor capsulare, este de menționat că prin colorația
cu albastru de metilen sau tuș de China / India, în jurul bacteriei apare un halou necolorat. Există și colorații
speciale pentru capsulă, de exemplu colorația Hiss. Structura antigenică a capsulei permite identificarea
bacteriilor, spre exemplu prin reacția de umflare a capsulei (Neufeld) atunci când se folosesc seruri
polivalente sau monovalente anti-capsulare pentru identificarea pneumococilor.

Cilii sau flagelii conferă mobilitate bacteriilor. Mobilitatea poate fi evidențiată în preparatul proaspăt
(între lamă și lamelă) sau pe anumite medii speciale (ex. MIU). Mobilitatea germenilor din genul Proteus este
observată pe orice mediu de cultură solid pe care acest microorganism foarte mobil se dezvoltă (fenomenul
de „invazie”).

Flagelii sunt formațiuni fine, alungite, flexibile, cu srcine la nivelul corpusculului bazal. Acesta este
alcătuit (de ex. la majoritatea bacteriilor Gram-negative) din patru discuri aranjate ca două perechi pe o
structură care trece prin mijlocul lor. Corpusculul bazal este plasat în perete și membrana citoplasmatică. Din
punct de vedere chimic flagelul este de natură proteică (flagelina).

Roluri:

 în mobilitate (cu o viteză de circa 50 µm / secundă); cilul are o mișcare de rotație, asemănătoare
unei înșurubări în mediu și ca atare corpul bacterian este împins în direcția opusă; „motorul” rotației
e reprezentat de corpusculul bazal iar energia este obținută din ATP;
 antigenic (datorită structurii proteice - antigenul H, specific de tip);
 în clasificarea bacteriilor (prin număr și distribuție), bacteriile putând fi
 monotriche (cu un flagel dispus la o extremitate), de exemplu Vibrio cholerae, Pseudomonas
aeruginosa;
 lofotriche (cu un mănunchi de flageli dispus la o extremitate);

16
  peritriche (cu mai mulți flageli dispuși de-a lungul suprafeței bacteriene), de exemplu E. coli, Proteus
mirabilis, Salmonella typhi.

Sunt formațiuni scurte, fine, nu au rol în mobilitate. De obicei pilii sunt mai subțiri decât cilii. Pot fi
foarte numeroase pe suprafața majorității bacteriilor; pot fi observate numai la microscopul electronic.

Există pili comuni, cu următoarele roluri:

 în aderența bacteriană (adezine);
 conțin receptori specifici pentru
bacteriofagi;
 antigenic (la unele bacterii), ex. N.
meningitidis și N. gonorrhoeae.

Există pili „F” (sexuali), determinați

genetic de factorul de fertilitate F (episom).
Aceștia îndeplinesc rolul canalului de conjugare.

Fenomenul de sporogeneză este mai des întâlnit

la Bacillaceae (genurile Clostridium și Bacillus). Pe sol, în condiții
de uscăciune, la adăpost de lumina solară directă, endosporii
persistă zeci și poate sute de ani.

Materialul genetic este concentrat și, împreună cu apa

legată, lipide, Ca++, Mg++, este înconjurat de un strat protector
(membrana sporală, cortexul sporal, învelișurile sporale).
„Sâmburele” sporal împreună cu membrana citoplasmatică
formează protoplastul sporal.

 formă de rezistență și conservare a speciei (în condiții favorabile un spor se poate transforma într-o
bacterie / forma vegetativă; procesul de formare a sporului ar putea fi considerată una dintre cele

mai primitive forme de diferențiere, dar nu este un proces de reproducere celulară așa cum se
întâmplă la fungi sau paraziți);
 rezistă la căldură, uscăciune, la anumite substanțe chimice și antibiotice, raze UV etc.

 central sau subterminal, mai mic decât celula (ex. la Bacillus anthracis);
 central sau subterminal, mai mare decât celula (ex. la Clostridium hystoliticum etc);

17
  terminal (ex. la Clostridium tetani, cu aspectul de „băț de chibrit”).

Poate fi evidențiat prin colorații speciale (de exemplu verde malachit) sau prin colorația Gram (locul
sporului rămâne necolorat).

Este sensibil la formol, propiolactonă etc. Este distrus prin autoclavare.

Apa reprezintă peste 75-85% din greutatea umedă a bacteriei. Există apă liberă (mediu de dispersie)
și apă legată fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au puțină apă, în special apă legată. Bacteriile sunt ființe
„acvatice” prin excelență. Vacuolele sunt formațiuni sferice care conțin diferite substanțe în soluție apoasă.
Au o membrană lipoproteică numită tonoplast. Au fost descrise în special la bacteriile acvatice și ar putea
avea un rol în plutirea acestora.

Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti faptul că apa reprezintă un mediu de dispersie, este
reactiv în reacțiile metabolice, reprezintă etapa finală a unor reacții oxidative etc.

Prin deshidratare (desicare) este posibilă prezervarea culturilor bacteriene timp îndelungat. O
metodă des utilizată datorită eficienței sale este liofilizarea (criodesicarea). Studiile științifice au arătat că, în
general, germenii Gram-negativi rezistă mai puțin timp liofilizării decât cei Gram-pozitivi, fenomen care a
fost pus pe seama stratului mai subțire de peptidoglican. (1)

Substanțele minerale reprezintă 2-30% din greutatea uscată a bacteriei și variază în funcție de
specie, vârsta culturii, compoziția chimică a mediului. Unele elemente intră în compoziția diferitelor structuri
(exemplu sulful intră în structura aminoacizilor, fosforul în structura fosfolipidelor etc).

Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti următoarele:

 favorizează schimburile cu mediul,

 participă la reglarea presiunii osmotice,
 pot stimula creșterea și funcția bacteriei (de exemplu fierul în cazul bacilului difteric, care
condiționează și producerea de toxine),
 activează unele sisteme enzimatice, contribuie la reglarea pH-ului și a potențialului de oxido-
reducere.

Așa cum am menționat anterior, la nivel ribozomal se găsesc Mg++ și K+.

Pigmentogeneza este caracteristică bacteriilor cromogene și este dependentă de condițiile de

cultivare.

18
 Producerea de pigmenți poate reprezenta un criteriu de identificare (ex. în cazul tulpinilor
de Pseudomonas aeruginosa sau în cazul unor specii din genul Staphylococcus). Trebuie să reținem încă de la
început faptul că în cazul stafilococilor, pigmentogeneza este doar un caracter orientativ și nu vom clasifica
drept „patogenă” o tulpină de stafilococ în funcție de „culoarea” coloniei. Stafilococii sunt condiționat
patogeni. Testul orientativ privind patogenitatea este testul coagulazei care ar trebui efectuat în mod
obligatoriu pentru toate tulpinile izolate de la pacienți.

După localizarea pigmentului, bacteriile pot fi:

 cromofore (pigmentul este legat în citoplasmă);

 paracromofore (pigmentul este prezent în perete sau în stratul mucos, de exemplu la S. aureus sau
laStaphylococcus epidermidis);
 cromopare (pigmentul este difuzibil în mediu, de exemplu la Pseudomonas aeruginosa).

În afară de faptul că datorită producerii de pigmenți (albastru, galben-verde, maro etc. în

cazul Ps. aeruginosa sau auriu, citrin, alb în cazul tulpinilor de Staphylococcus) medicul de laborator se poate
orienta în alegerea testelor de identificare într-un anumit context clinic și microbiologic.

Putem aminti și faptul că pigmenții pot avea o serie de roluri, de ex.: rol de protecție față de
radiațiile UV (pigmenți carotenoizi), rol antibiotic (exemplu piocianina elaborată de P. aeruginosa față de B.
anthracis) și rol enzimatic.

În structura bacteriană se pot găsi glucide simple cu rol în metabolismul intermediar glucidic, precum
și glucide complexe, de exemplu poliozide. Acestea din urmă au o serie de roluri, spre ex. participă la
realizarea structurii peretelui celular, fac parte din capsula unor bacterii etc.

Există teste biochimice în care se urmărește utilizarea sau imposibilitatea utilizării unui anumit zahar
de către o bacterie. Aceste teste sunt utile pentru identificarea bacteriei respective (în special în cazul
enterobacteriilor folosind mediile TSI, MIU, sistemele API etc). Testările biochimice sunt de mare utilitate și
în studiul fungilor (auxanogramă, zimogramă).

Există proteine simple (cu rol în metabolismul intermediar protidic) și proteine complexe, cum ar fi:

mucoproteinele (ex. mucopolizaharidul de grup al S. pneumoniae, acidul hialuronic din structuri de

tip capsular),
 cromoproteinele (ex. catalaze, peroxidaze, citocromi),
 nucleoproteinele (ex. în acizii nucleici).

Este de remarcat prezența în structurile bacteriene a unui aminoacid special, acidul diaminopimelic,
precum și a aminoacizilor în forma D (ceea ce reprezintă o adaptare biochimică a bacteriilor față de acțiunea
nocivă a enzimelor proteolitice).

19
 Reprezintă mai puțin de 10% din greutatea uscată a bacteriilor și variază cantitativ în funcție de
specie, vârsta culturii (cresc în celulele „îmbătrânite”, reprezentând probabil un semn de degenerescență) și
compoziția mediului. La mycobacterii, sunt în cantitate mai mare (circa 20-40%), în special la nivel parietal și
determină o serie de proprietăți specifice, inclusiv afinitatea tinctorială. Lipidele se pot găsi libere în vacuole,
combinate sau făcând parte din diferite structuri ale celulei bacteriene (perete, membrană, mezozomi).

Dintre lipidele bacteriene putem aminti:

acizii grași speciali (ex. acidul mycolic la mycobacterii),

 cerurile (acizi grași plus alcooli monovalenți superiori), care se găsesc în cantitate mare la bacteriile
acid-alcoolo-rezistente (ex. în peretele mycobacteriilor, nocardiilor etc). Dintre acestea, ceara D pare
a fi implicată în inducerea hipersensibilității întârziate (de tip IV).
 fosfolipidele, cum este lipoidul ubiquitar (difosfatidil glicerol) din Treponema pallidum (agentul
etiologic al sifilisului) sau lipidul A din structura lipopolizaharidului bacteriilor Gram-negative, cu
activitate toxică.

 plasmidul „Col” codifică proprietatea unor bacterii de a elabora bacteriocine, cu efect asupra altor
bacterii receptive înrudite (de exemplu colicinele elaborate de E. coli);
 unele bacterii din genul Bacillus produc antibiotice polipeptidice (de exemplu, B.
licheniformis produce bacitracina, B. brevis sintetizează gramicidina, iar B. polymyxa sintetizează
polimixina; ultimele 2 specii fac parte, astăzi, din alte genuri, vezi capitolul nr. 48).

Nutriția bacteriană reprezintă suma proceselor metabolice care conduc la producerea de materiale
convertibile în energie și în diferite componente celulare. Nutrienții sunt substanțe ale căror soluții pot
traversa membrana citoplasmatică pentru a fi antrenați în reacțiile metabolice care asigură creșterea și
multiplicarea celulară.
În raport cu sursa de energie, bacteriile se împart în:
 bacterii care folosesc energie luminoasă și trăiesc la lumină (photobacterii) și
 bacterii care își procură energia prin procese de oxidoreducere catalizate enzimatic și trăiesc la
întuneric (scotobacterii, chimiosintetizante).

În raport cu sursele folosite ca material de sinteză în ambele diviziuni se diferențiază:

 bacterii autotrofe, capabile să-și sintetizeze toți compușii organici din materie anorganică
 bacterii heterotrofe, dependente de prezența unor compuși organici.

20
 Majoritatea bacteriilor comensale, condiționat patogene sau patogene importante pentru om, sunt
chimiosintetizante, heterotrofe. Se diferențiază în funcție de tipul respirator. Există și bacteriile paratrofe, a
căror energie trebuie oferită de gazdă. Bacteriile paratrofe sunt parazite strict intracelular (de exemplu
microorganismele din genurile Rickettsia și Chlamydia , care depind nutrițional de o gazdă vie).
Creșterea microbiană necesită polimerizarea unor substanțe mai simple pentru a forma: proteine, acizi
nucleici, polizaharide și lipide. Aceste substanțe se obțin fie din mediul de cultură, fie sunt sintetizate de
către celulele în creștere (sunt necesare diferite coenzime și legături macroergice de tipul celor din ATP).
Substanțele necesare și coenzimele implicate se pot obține dintr-un număr relativ redus de precursori
metabolici.
Dacă o celulă bacteriană primește substanțele necesare, va sintetiza diferite macromolecule, iar
secvența aranjării componentelor în aceste macromolecule este determinată fie după un model ADN-ADN
(pentru acizii nucleici) sau ADN-ARN (pentru proteine), fie cu un determinism enzimatic pentru carbohidrați
și lipide.
După ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansamblează, formând structuri supramoleculare:
ribozomi, perete, flageli, pili etc. Rata sintezei macromoleculelor și activitatea căilor metabolice sunt foarte
bine reglate (există o permanentă balanță a biosintezei).

Respirația reprezintă suma reacțiilor biochimice aerobe sau anaerobe producătoare de

energie. Mecanismul de bază este reprezentat de oxido-reducerea biologică (pierderea ionilor de hidrogen
sau a electronilor) de către o substanță chimică (donor) și transportul lor pe molecula unei alte substanțe

numită acceptor (prima se oxidează, a doua se reduce: AH2 + B <=> A + BH2). În funcție de natura
acceptorului final, respirația poate fi: aerobă sau anaerobă.

În respirația aerobă, acceptorul final de electroni este reprezentat de oxigen. Respirația aerobă
necesită existența membranei celulare. Electronii sunt pasați de la un reducător la un oxidant prin
membrană cu ajutorul unui set specific de transportori. Substratul reducător frecvent utilizat este NADPH-ul.

În respirația anaerobă acceptorul final de electroni este reprezentat de orice substanță anorganică
diferită de oxigen sau de orice substanță organică (fermentația); fosforilarea se face la nivelul substratului.

În raport cu utilizarea proceselor pentru obținerea

energiei și de relația cu oxigenul din mediu, bacteriile se
pot grupa în 4 „tipuri respiratorii” principale:

1. strict aerob, atunci când bacteriile (spre

exemplu Bordetella pertussis) se dezvoltă numai în
prezența unei presiuni crescute a O2, care este folosit
ca acceptor final unic. Aceste bacterii posedă catalază,

21
 peroxidază, citocromi (de exemplu catalaza desface H2O2 toxic pentru celula bacteriană;) și utilizează
numai procese de respirație. Unele specii aerobe (exemplu Pseudomonas aeruginosa) se pot dezvolta în
medii lipsite de oxigen, dacă în mediu sunt prezenți nitratul sau nitritul;
2. strict anaerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Clostridium tetani, Clostridium botulinum,
Fusobacterium, Veillonella, Peptostreptococcus etc) cresc numai în absența O2. Nu pot supraviețui în
prezența O2, care nefiind redus are o acțiune bactericidă. Nu au catalază, peroxidază (care acționează
asupra ionilor de O 2 sau asupra H2O2). Aceste bacterii folosesc pentru obținerea energiei numai procese
de fermentație. Pentru cultivarea lor este necesară utilizarea unui mediu cu potențial redox foarte
scăzut.
3. aerob facultativ anaerob, atunci când bacteriile (E. coli, S. aureus, S. pyogenes etc) se dezvoltă mai bine
în mediile cu oxigen, prin procese de respirație, dar pot prezenta ambele tipuri respiratorii, în funcție de
potențialul redox. Majoritatea au catalază sau citocromoxidază, dar nu au peroxidaze flavoproteice. În
acest tip se încadrează majoritatea bacteriilor studiate.
4. anaerob microaerofil, atunci când bacteriile (de exemplu Campylobacter) tolerează mici cantități de O2.
5. Tolerante aerobe, nu necesită oxigen întrucât metabolizează energia anaerob. Spre deosebire de cele
strict anaerobe (2), acestea nu sunt otrăvite de O 2. Pot fi găsite răspândite uniform în întreaga eprubetă.

Factorii de creștere sunt metaboliții esențiali pe care bacteria nu-i poate sintetiza pe baza
substanțelor care se găsesc în mediul extern. Factorii de creștere trebuie neapărat incluși în mediul de
cultură în cazul în care dorim să izolăm microorganismul respectiv, numit „microorganism pretențios” (ex.
factorii X și V trebuie incluși în mediul de izolare pentru Haemophilus influenzae).
Bacteriile patogene sunt heterotrofe. Adaptându-se la viața parazitară, devin dependente de o serie
de astfel de factori de creștere (unele sunt atât de dependente încât nu pot fi cultivate „in vitro”, de exemplu
bacilul leprei - Mycobacterium leprae).

Unele bacterii (de exemplu E. coli) nu necesită factori de creștere. Aceste bacterii pot sintetiza
purinele esențiale, pirimidinele, aminoacizii și vitaminele pornind de la o sursă de carbon.

În funcție de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi:

 mezofile, cu temperatura optimă de 30-37°C;


psichrofile, cu temperatura optimă în jur de 20°C (unele acceptând temperaturi apropiate de
0°C; Listeria spp. poate supraviețui sau se poate chiar și multiplica la temperatura din frigider). Ele sunt
adaptate la acest mediu prin numărul mare de acizi grași nesaturați conținuți de membrana plasmatică.
Gradul de nesaturare al unui acid gras se corelează cu timpul de solidificare sau stadiul de tranziție
termică (temperatura la care se topește sau se solidifică lipidul). Acizii grași nesaturați rămân în fază
lichidă la temperaturi joase, dar sunt denaturați la temperaturi moderate. Fie că acizii grași din
membrană se află în fază lichidă sau solidă, ei afectează fluiditatea membranei, care afectează în mod
direct capacitatea de a funcționa.
22
 termofile, cu temperatura optimă de 50-60°C (unele putând să se multiplice și la temperaturi apropiate
de 95°C, ca de ex.Thermus aquaticus). Bacteriile termofile sunt adaptate să reziste la temperaturi de
peste 60°C printr-o varietate de modalități. Acizii grași din membrana bacteriilor termofile sunt acizi
grași saturați, permițând membranelor să rămână stabile și funcționale la temperaturi ridicate.
 extrem termofile sau hipertermofile, cu temperatura optimă de 80°C sau mai mare și o temperatură de
dezvoltare maximă de 115°C. (2) Nu sunt patogene.

Bacteriile studiate de microbiologia medicală sunt în marea lor majoritate mezofile.

Sinteza peptidoglicanului se desfășoară pe parcursul mai multor etape. Începe prin sinteza în
citoplasmă a UDP-acid N-acetil muramic-pentapeptid (NAM). Această structură se atașează de bactoprenol
(un lipid din membrana celulară), după care urmează un lanț de reacții biochimice.

Legarea încrucișată finală se

realizează printr-o reacție de
transpeptidare în care terminațiile
amino libere ale pentaglicinei
înlocuiesc reziduurile terminale ale
D-Ala de la peptidul învecinat.
Reacția este catalizată de
transpeptidaze, un set de enzime
numite și PBPs (penicillin binding
proteins) care au atât activitate de
transpeptidaze și carboxipeptidaze,
dar controlează și gradul de legare a
peptidoglicanului (aspect foarte
important în diviziunea celulară). La
nivelul lor se pot lega penicilinele și
alte medicamente beta-lactamice.

Această cale de biosinteză are o importanță particulară în medicină, oferind și baza acțiunii selective
a unor antibiotice (peniciline, cefalosporine, bacitracină, vancomicină, cicloserină etc). Spre deosebire de
celulele gazdei, microorganismele sunt izotone cu fluidele organismului. În interiorul lor presiunea osmotică
este foarte mare și viabilitatea lor depinde de integritatea peretelui (peptidoglican) pe tot parcursul ciclului
celular. Orice compus care inhibă o etapă în biosinteza peptidoglicanului la o bacterie în creștere va putea

produce liza bacteriană (efect bactericid).

23
 Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecții, trebuie ca din produsul recoltat de la pacient să
obținem mai întâi respectivul microorganism în cultură pură, pentru ca ulterior să îi putem studia diferitele
caractere în vederea identificării.

Metodele de cultivare a bacteriilor urmăresc mai multe obiective:

 obținerea unei populații microbiene suficiente cantitativ pentru investigațiile propuse,

 prevenirea contaminării produsului cercetat cu un microorganism străin și
 izolarea fiecărei tulpini microbiene urmărite în cazul unui produs plurimicrobian în culturi
monomicrobiene denumite „culturi pure”.

Nu există un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricărei bacterii. Termenul „însămânț are”
definește operația de introducere a unei cantitați de germeni într-un mediu de cultură artificială, în timp ce
pentru culturile celulare, ouă embrionate și mai ales animale de experiență folosim termenul „inoculare”.

Cultivarea se realizează prin însămânțarea bacteriilor pe medii de cultură. Mediile solide sau lichide
care asigură nutrienții și condițiile fizico-chimice necesare creșterii și multiplicării bacteriene se
numesc medii de cultură.

Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea într-un mediu de cultură poartă numele
de cultură bacteriană.

Microorganismele pot fi cultivate pe gazde vii și pe medii artificiale.

Există anumite microorganisme (de exemplu virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu pot fi cultivate
decât pe gazde vii, așa cum se întâmplă în cazul virusurilor, respectiv: animale de laborator, ouă de găină
embrionate sau culturi de celule.

Majoritatea bacteriilor, fungii și unele protozoare se pot cultiva și pe medii artificiale.

Mediile de cultură artificiale trebuie să fie nutritive (să conțină factorii de creștere necesari), să fie
sterile, să aibă un anumit pH (de obicei între 7,2-7,6), să aibă o anumită presiune osmotică, să aibă
umiditatea favorabilă multiplicării germenilor etc.

Factorii de creștere reprezintă substanțe esențiale pe care microorganismele nu sunt capabile să le

sintetizeze din nutrienții de care pot să dispună. Ei sunt necesari în cantitați mici. Îndeplinesc anumite roluri
în biosinteză. Factorii de creștere pot fi grupați în:

1. Purine si pirimidine: necesare pentru sinteza acizilor nucleici (ADN și ARN);

2. Aminoacizi: necesari pentru sinteza proteinelor;

3. Vitamine: necesare în calitate de coenzime și grupări funcționale pentru enzime.

Unele bacterii (de exemplu E. coli) nu necesită factori de creștere. Aceste bacterii pot sintetiza
purinele esențiale, pirimidinele, aminoacizii și vitaminele pornind de la o sursă de carbon.

24
 Alte bacterii necesită purine, pirimidine, vitamine și anumiți aminoacizi pentru a crește. Acești
compuși trebuie adăugați în prealabil în mediile de cultură.

Factorii de creștere nu sunt metabolizați direct ci sunt asimilați de către bacterii pentru a-și îndeplini
rolul în metabolism. Tulpinile mutante care necesită anumiți factori de creștere ce nu sunt necesari tulpinii
din care au provenit sunt numite auxotrofe. Spre exemplu, o tulpina de E. coli care necesită triptofan pentru
dezvortare se va numi auxotrof-triptofan și va fi desemnată E. coli trp- (2).

Creșterea oricărui organism are loc prin sinteza de noi molecule. Deoarece creșterea volumului
celular raportată la creșterea suprafeței este mai mare, în cursul creșterii se ajunge la un punct critic.
Multiplicarea celulară este o consecință a creșterii. Se restabilește raportul optim dintre volumul și suprafața
celulei.

Multiplicarea majorității bacteriilor se face prin diviziune simplă (binară). Sporii nu reprezintă forme de
multiplicare (așa cum se întâmplă în cazul fungilor sau paraziților).

Mediul electiv conține ingredientele care convin cel mai bine dezvoltării unei anumite bacterii (de
exemplu mediul Lőffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric).

Prin conținutul său în substanțe antimicrobiene, mediul selectiv inhibă dezvoltarea altor bacterii
decât cea a cărei izolare se urmărește. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului
difteric sau medii în care includem antibiotice (față de care bacteria care se dorește a fi izolată este
rezistentă)

Mediul de îmbogățire favorizează înmulțirea anumitor bacterii patogene, inhibând dezvoltarea florei
de asociație dintr-un produs patologic. Funcționează concomitent ca mediu selectiv și ca mediu electiv (de
exemplu, mediul hiperclorurat pentru stafilococ sau mediile de îmbogățire utilizate pentru
izolarea Salmonella typhi).

Mediul diferențial conține un anumit

substrat (de exemplu unele zaharuri) care poate
fi sau nu metabolizat, determinând modificarea
culorii sau aspectului culturii. De exemplu,
agarul cu albastru de brom-timol lactozat
(AABTL) care diferențiază bacteriile lactoză-
pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactoză-negative (Shigella, Salmonella). Alte exemple: ADCL (agar

25
dezoxicolat citrat lactoză), TSI (3 zaharuri și fier), MIU (mobilitate indol uree).

Pe medii solide, germenii însămânțați în suprafață produc colonii. Colonia este totalitatea bacteriilor
rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie este o clonă bacteriană.

Coloniile izolate se pot obține de exemplu prin tehnica însămânțării prin dispersie (cu ansa
bacteriologică sau cu tamponul). După prelevarea cu ansa a unei porțiuni din produsul patologic, inoculul
este dispersat pe latura unui viitor poligon; se resterilizează ansa; se verifică temperatura, prin atingerea
mediului într-o zonă neînsămânțată, cât mai periferic; cu ansa sterilă se trasează a doua latură a poligonului;
se resterizează ansa și se repetă procedeul descris până la realizarea a 4-5 laturi, fără a atinge prima latură.
În acest mod, pe ultimele „laturi” ale poligonului se vor putea observa după trecerea timpului necesar
multiplicării bacteriene, colonii izolate, bine individualizate. (Schema nr. 1)

Se poate utiliza pentru urocultura și în alte scopuri în care

aproximarea numărului de microorganisme dezvoltate pe mediul

de cultură este utilă, în ziua următoare vom număra coloniile

apărute și spre exemplu vom înmulți numărul de colonii cu 1000
dacă am utilizat pentru însămânțare ansa de 0,001 ml

26
 Descărcăm tamponul încărcat cu produs patologic (există mai multe modalități de descărcare a
tamponului, dintre care vom prezenta două):

 descărcăm tamponul prin rulare, pe toate fețele pe o rază a plăcii, urmând ca să dispersăm produsul
cu o baghetă de sticlă în “L”, sterilă, pe toată suprafața plăcii
 descărcăm tamponul prin rulare, pe toate fețele pe un cadran al plăcii, urmând ca să dispersăm
produsul cu ansa bacteriologică în celelalte cadrane, ca în metoda “pentagonului deschis” (după
însușirea tehnicii, pentru economie, se poate realiza cultivarea pe jumătatea unei plăci).

Teoretic, dinamica unei populații bacteriene ar trebui să evolueze exponențial. Dinamica reală a
populației bacteriene în cultură discontinuă are însă o evoluție caracterizată printr-o curbă la care distingem
patru faze: faza de lag; faza de multiplicare logaritmică; faza staționară și faza de declin.

Numărul bacteriilor însămânțate rămâne staționar sau scade; germenii se adaptează la condițiile
mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, î și consumă până la dispariție incluziile, cresc mult în
dimensiuni, sintetizează enzime, proteine, acizi nucleici etc., dar nu se divid; sunt foarte sensibile la
antibiotice. Faza de lag durează aproximativ 2 ore. Această fază este aparent dependentă de o varietate de
factori incluzând dimensiunea inoculului, timpul necesar pentru a-și reveni din șocul fizic datorat
transportului, timpul necesar pentru sinteza coenzimelor esențiale sau a factorilor de diviziune și timpul
necesar pentru sinteza a noi enzime ce sunt

necesare
prezent înpentru
mediu.a (2)
metaboliza substratul

Celulele bacteriene prezintă

caracteristicile tipice speciei (dimensiunile
sunt însă ceva mai mari), citoplasma este
intens bazofilă și omogenă, lipsită de
incluzii. Bacteriile sunt foarte sensibile la
antibiotice. Această fază este adecvată
pentru studierea bacteriilor sau pentru recoltarea lor în vederea preparării de vaccinuri. Faza de multiplicare
exponențială durează aproximativ 2-3 ore.

Multiplicarea este realizată în progresie aritmetică, dar pentru că numărul bacteriilor care sunt
distruse este aproximativ egal cu numărul bacteriilor nou apărute rata de creștere devine nulă.

Germenii au morfologia caracteristică speciei; în această fază realizăm identificarea germenilor. Apar
incluziile caracteristice. La speciile sporogene începe formarea sporilor. Faza staționară durează aproximativ
2-3 zile.

27
 Substratul nutritiv sărăcește, apar metaboliți toxici, bacteriile sunt distruse progresiv, se produc și
enzime autolitice, rezervele de hrană din incluzii (ex. acidul poli-β-hidroxi butiric sau glicogenul) se consumă,
pentru un timp sursa de energie rămâne doar ARN-ul celular. Unele bacterii pot persista 2-3 luni. În acest
scop se pot activa mecanisme speciale de reglare și se exprimă o serie de gene care duc la sinteza unor
proteine speciale care permit adaptarea pentru o durată limitată de timp. La speciile sporogene, fenomenul
de sporogeneză devine foarte intens.

Condițiile de cultivare și aspectul culturii sunt caractere cheie în identificarea bacteriilor. Aspectul
coloniilor variază între diferitele bacterii, fără a permite diferențieri definitive de specie (dar au utilitate în
contextul studierii tuturor caracterelor bacteriene și în contextul general al diagnosticului de laborator, care
la rândul său trebuie să aibă loc într-un context în care punem în balanță și alte elemente, clinice,
paraclinice; colaborarea între medicii de diferite specialități este esențială). Se examinează:

 dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm; medii, de circa 1-2 mm și mici, sub 1 mm),
 conturul (circular, lobat, zimțat),
 relieful (plat, bombat, acuminat, papilat),
 suprafața (lucioasă, granulară, rugoasă),


culoarea (pigmentate, nepigmentate),

 opacitatea (transparente, opace),
 consistența,
 aderența la mediu,
 prezența sau absența hemolizei (pe medii de tipul geloză-sânge).

Colonia S (smooth) are suprafață bombată și netedă, margini circulare și

adesea aspect strălucitor. Germenii păstrează structura antigenică și nu aglutinează
spontan cu soluție salină fiziologică. Germenii capsulați își păstrează capsula.
Virulența este conservată. Majoritatea bacteriilor studiate formează colonii de tip S
(S. aureus, S. pyogenes, E. coli (figura) etc).

Colonia R (rough) este plată,

suprafața ei prezintă rugozități, marginile sunt crenelate. Structura
antigenică nu este caracteristică. Nu păstrează capsula. Virulența nu
este conservată (excepții Bacillus anthracis, Mycobacterium
tuberculosis,Corynebacterium diphteriae). O bacterie care în mod
caracteristic duce la apariția unei colonii de tip S (ex. o enterobacterie), în cazul în care testele de identificare
prin reacții antigen-anticorp (ex. aglutinare pe lamă, folosind anticorpi cunoscuți) nu se efectuează la timpul
potrivit ci mai târziu, prin „înbătrânire” va suferi anumite modificări, coloniile vor deveni de tip R iar
identificarea pe baza caracterelor antigenice nu va mai fi posibilă.

28
 Colonia M (mucoid) este mare, strălucitoare,
mucoasă. Este dată de exemplu de bacteriile care prezintă
capsule mari (exemplu Klebsiella pneumoniae) Coloniile
de Streptococcus pneumoniae pot fi și de tip S și de tip M.

În cazul bacteriilor foarte mobile (de ex. Proteus

spp.) pe mediile obișnuite nu vom putea obține colonii
izolate (a fost descris fenomenul de „invazie”).Cultura se
întinde pe toată suprafața plăcii în strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de „invazie”

poate fi inhibat prin incorporarea în mediu de acizi sau săruri biliare, tiosulfat de sodiu etc.

Bacteriile și fungii facultativ anaerobi se dezvoltă în toată masa de lichid, tulburându-l. Bacteriile
strict aerobe se dezvoltă preponderent la suprafața mediului. Ca un aspect particular, în apa
peptonată Vibrio cholerae se poate dezvolta și formează un „văl” la suprafața mediului. În acest caz, pH-ul
mediului este 9-9,5.

Bacteriile care pe medii solide produc colonii de tip S, pe medii lichide tulbură omogen mediul
(majoritatea bacteriilor).

Variantele R realizează o tulburare mai puțin omogenă. Pot lăsa mediul limpede, formând flocoane
care se depun sau un strat (văl) la suprafața mediului (de exemplu bacilul difteric sau bacilul tuberculos).
În urma dezvoltării microorganismelor în medii de cultură lichide se mai pot remarca și
pigmentogeneza (ex. Pseudomonas aeruginosa) sau utilizând simțul olfactiv se poate constata apariția unui
miros caracteristic (ex. un miros de corn ars în cazul clostridiilor).

Câteva exemple, menționând că există și variații de la regulă:

 mediul este tulburat omogen (ex. Staphylococcus spp.)

 mediul este clar, cu depozit grunjos pe pereți și la baza tubului (ex. S. pyogenes)
 mediul este clar, cu văl la suprafață (V. cholerae în apă peptonată alcalină)
 dezvoltarea culturii se realizează ca un “inel” aderent de pereții tubului, la suprafața mediului (ex. E.
coli)
 mediul este clar cu dezvoltarea unei membrane uscate, la suprafață (ex. Bacillus subtilis)
 mediul este clar cu apariția unui depozit floconos aderent la baza tubului (B. anthracis)

mediul este clar, iar la suprafață se dezvoltă o membrană groasă, plisată (M. tuberculosis).

Culturile bacteriene sunt discontinue când se realizează în volum limitat de mediu, care nu este
reînnoit și continue atunci când mediul de cultură este continuu reînnoit. O populație bacteriană poate fi
menținută indefinit în faza de multiplicare exponențială dacă se adaugă continuu mediu de cultură proaspăt,
29
cu omogenizare prin curent de aer steril și evacuare a unei cantități corespunzătoare de cultură (de exemplu
în dispozitivul numit chemostat sau turbidostat).

Chemostatul utilizează un mediu de cultură în care unul dintre nutrienți, aflat în concentrație mai
redusă decât ceilalți, funcționează ca factor limitant al creșterii. Mediul de cultură proaspăt este admis în
vasul de cultură în ritmul în care este consumat factorul limitant, iar cultura este evacuată cu același ritm.
Cultura este menținută astfel la o valoare constantă și submaximală ratei de creștere, reglată prin factorul
limitant. Chemostatele sunt foarte utile pentru obținerea de tulpini mutante pentru că după ce rata de
multiplicare a fost determinată șansa de selectare a acestor tulpini este mai mare.

În laboratorul de microbiologie clinică, de regulă se utilizează culturile discontinue.

Populația care rezultă prin diviziunea unei bacterii crește în progresie geometrică cu rația 2. Timpul
necesar pentru dublarea populației se numește timp de dublare sau timp de generație. Timpul de generație
în faza exponențială și în condiții optime de cultivare este determinat genetic. De exemplu, pentru E.
coli este de circa 20 minute (ca și pentru majoritatea bacteriilor studiate). Pentru Mycobacterium
tuberculosis timpul de generație poate avea o valoare între 12-27 ore.

Asepsia reprezintă ansamblul de metode prin care evităm contaminarea mediului ambiant cu
germeni microbieni sau prin care putem menține „sterilitatea” țesuturilor, mediilor de cultură,
medicamentelor injectabile etc.

Antisepsia reprezintă înlăturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe tegumente,

mucoase sau din plăgi. Se realizează cu ajutorul substanțelor antiseptice, netoxice pentru tegument (ex.
alcool etilic 70°, tinctură de iod 5%, KMnO 40,1%, detergenți cationici etc).

Sterilizarea reprezintă distrugerea sau îndepărtarea tuturor microorganismelor patogene sau

nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafață sau dintr-un mediu (lichid sau solid). Toate
materialele utilizate în laboratorul de microbiologie trebuie să fie sterile înainte de utilizare. Există o mare
diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel încât și metodele de sterilizare sunt destul de variate,
după cum urmează:

 Metode de sterilizare prin căldură (căldura uscată sau căldura umedă);

 Metode de sterilizare prin filtrare;
 Metode de sterilizare utilizând radiațiile, dar și
 Metode chimice de sterilizare.

Metodele de sterilizare care utilizează radiațiile (cu excepția radiațiilor ultraviolete) și metodele
chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilenă) sunt utilizate rareori în laboratorul de microbiologie.

30
 Dezinfecția reprezintă distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori și a sporilor) din anumite
medii (lichide, solide) sau de pe suprafețe. Se realizează cu ajutorul unor agenți fizici sau cu ajutorul
substanțelor dezinfectante bactericide (cu efecte negative asupra țesuturilor gazdei). Împiedică răspândirea
bolilor infecțioase.

Dezinfecția igienică a mâinilor, prin spălare, reprezintă utilizarea unui produs cu acțiune directă
asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia, fără a acționa asupra florei rezidente.

Dezinfecția chirurgicală a mâinilor, prin spălare, reprezintă utilizarea unui produs cu acțiune directă
asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia și cu acțiune asupra florei rezidente.

Produsul pentru dezinfecție ”de nivel scăzut” este un agent chimic care distruge bacteriile
vegetative, unii fungi (ex. Candida albicans), virusurile capsulate și virusurile mari necapsulate.

Produsul pentru dezinfecție ”de nivel intermediar” este un agent chimic care distruge bacteriile
vegetative, fungii, virusurile capsulate, virusurile necapsulate și mycobacteriile.

Produsul pentru dezinfecție ”de nivel înalt” este un agent chimic care, în condiții bine definite de
timp și temperatură, distruge microorganismele, are acțiune sporicidă și reprezintă un potențial sterilizant
chimic.

A. Substanțe care denaturează proteinele (au în general efect bactericid): acizii, bazele, alcoolii și derivații
lor (de exemplu alcoolul etilic, CH3-CH2OH, de 70º, folosit pentru antiseptizarea tegumentelor).
B. Substanțe care oxidează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): hipermanganatul de
potasiu, KMnO71‰, util în antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen, H2O2, soluție 3% în apă,
utilizat în antiseptizarea plăgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) și derivații lor (hipocloriți, cloramine, soluții
iodurate etc. Există și diferite clase de compuși halogenați cu potență mai mare, cum ar fi cei care au în
componența lor radicalul benzil -C6H5. Indiferent de substanța folosită este necesară realizarea
concentrației corespunzătoare.
C. Substanțe care blochează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): metale grele [sărurile
de mercur, preparatele organomercuriale (cum ar fi spre exemplu merthiolatul de sodiu, C 9H9HgO2SNa ),
sărurile de argint, compuși de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide],
grupările alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei (C 9H9HgO2SNa), oxidului de etilen (C 2H4O) etc.
D. Substanțe care lezează membranele celulare: fenolii [acidul fenic are utilizări limitate datorită
proprietăților caustice și toxicității sale; este etalonul față de care se măsoară activitatea antimicrobiană
a antisepticelor și dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte
toxice mai reduse) etc], detergenții [anionici (săpunuri, perlan etc), cationici (săruri cuaternare de
amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu
propilenglicolul)].
E. Substanțe care alterează acizii nucleici: coloranții bazici (violet de gențiană, albastru de metilen, fucsină
bazică etc), derivații de acridină, de exemplu rivanolul.

31
 Sterilizarea prin căldură umedă este cea mai eficientă metodă de sterilizare și are ca mecanism
coagularea proteinelor și degradarea enzimelor. Se poate folosi pentru diferite substanțe în soluție, sticlărie
(cu excepția pipetelor și lamelor), instrumentar chirurgical (metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de
cultură, aparate de filtrat etc.
Tindalizarea (sterilizarea fracționată) este o metodă de sterilizare prin căldură umedă care evită
depășirea unei temperaturi de 100ºC. Substanțele de sterilizat se mențin la 56-100ºC timp de 30-60 minute,
3 până la 8 zile succesiv. Astfel, utilizând medii care permit germinarea, după prima încălzire timp de 30-60

minute sunt distruse formele vegetative iar după răcire are loc germinarea sporilor. În ziua următoare sunt
distruse prin încălzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar după răcire are loc germinarea
sporilor care nu au germinat în prima zi etc. Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la care se va
menține permanent deschis robinetul de vapori (și astfel nu se va depăși în interior temperatura de 100ºC),
băi de apă sau băi de nisip. Prin tindalizare se pot steriliza alimente, unele medii de cultură etc.

Nu reprezintă metode de sterilizare, dar sunt utilizate în anumite situații.

Pasteurizarea folosește căldura umedă și are aplicații în conservarea pentru scurtă durată a unor
alimente (lapte, bere etc). Există o pasteurizare joasă (30 minute la 56-65ºC), o pasteurizare medie (15
minute la 65-75ºC) și o pasteurizare înaltă (2-5 minute la 85-90ºC). Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile
în formă vegetativă dar nu și sporii.
Fierberea poate fi utilizată atunci când nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare, iar
mecanismul de acțiune este denaturarea proteinelor. Fierberea timp de 30 minute la 100 oC, distruge
bacteriile în formă vegetativă, fungii și virusurile, dar nu și sporii bacterieni. Timpul se înregistrează după ce
apa a început să fiarbă. Eficiența acestei metode poate fi crescută prin adăugarea de carbonat de sodiu 1-
2%.

Autoclavarea este esențială atât pentru laboratoarele de microbiologie cât și pentru unitățile
sanitare în general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de apă realizează
 la 0,5 atmosfere o temperatură de 115ºC,
 la 1 atmosferă o temperatură de 121ºC și respectiv
 134ºC la 2 atmosfere.

Autoclavul are ca piesă principală un cazan cu pereți metalici, care se închide etanș cu un capac
prevăzut cu un sistem special de închidere și în interiorul căruia, vaporii de apă sunt comprimați la presiunea
necesară în vederea sterilizării (Schema nr. 2).
Există mai multe tipuri de autoclave:
 autoclave cu perete simplu
o verticale
o orizontale
 autoclave cu manta de aburi
o verticale
32
 o orizontale.

În continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, vertical, la
care vaporii provin din apa aflată în cazanul de presiune și ajung în camera de sterilizare de jos în sus.
Presiunea din interiorul cazanului este înregistrată de un manometru. Pentru punerea în funcțiune a
autoclavului, în dotare există 2 robinete: unul superior (robinetul de aer și vapori, care permite legătura între
cazan și mediul exterior) și unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita
accidentele există o supapă de siguranță care se deschide și permite evacuarea vaporilor atunci când,
accidental, presiunea vaporilor depășește limita de siguranță. În momentul de față pentru evitarea riscului

de apermite
nu veni în deschiderea
contact cu vapori de apă
capacului fierbinți
până aflați sub presiune,
când presiunea autoclavele
din interior sunt dotate
nu o egalizează pe ceacu
dinunexterior.
sistem care
Cazanul de presiune este inclus într-un perete exterior solid care la partea inferioară are un spațiu în care se
află sursa de căldură.
În partea inferioară a cazanului de presiune se află un suport pe care se așează o placă de metal
perforată. Pe suport se așează materialele care trebuie sterilizate iar faptul că placa este perforată permite
trecerea vaporilor de apă produși după încălzirea apei. În vederea sterilizării se procedează astfel:
 verificăm nivelul apei din partea inferioară a cazanului, care trebuie să fie până la o distanță de 2-3
centimetri de suport; dacă nivelul a scăzut, se completează (recomandabil se va utiliza apă distilată);
 așezăm pe suport obiectele și materialele de sterilizat, ambalate corespunzător;
 închidem etanș capacul, folosind sistemul special de etanșeizare cu care este dotat autoclavul pe
care îl avem la dispoziție;
 conectăm sursa de căldură;
 deschidem robinetul pentru evacuarea aerului și vaporilor (dacă rămâne aer în cazanul cu presiune

eficiența sterilizării va scădea considerabil; vaporii de apă fiind mai ușori, vor încălzi în special partea
superioară a cazanului în timp ce aerul, care va atinge temperaturi inferioare, fiind mai greu, va
rămâne în partea inferioară a cazanului) ;
 închidem robinetul după evacuarea aerului și apariția unui jet continuu de vapori;
 presiunea din cazan începe să crească și este urmărită cu ajutorul manometrului; atunci când
presiunea atinge valoarea dorită (de ex. 1 atmosferă), reglăm sursa de căldură în așa fel încât
această presiune să fie menținută pentru toată durata sterilizării (de ex. 30 minute) ;
 după trecerea celor 30 minute întrerupem sursa de căldură și lăsăm autoclavul să se răcească până
când presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice;
 deschidem lent robinetul de vapori;
 deschidem sistemul de etanșeizare și capacul autoclavului;
 lăsăm obiectele și materialele să se răcească în autoclavul deschis;
 atunci când temperatura scade suficient de mult putem scoate materialele sterilizate.

Sterilizarea prin căldură uscată are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor bacteriene.
Amintim câteva dintre variantele tehnice:

33
Sterilizarea prin încălzire la incandescență („la roșu”) reprezintă introducerea și menținerea în flacăra
becului Bunsen până la înroșire, pe toată lungimea, a obiectului care urmează a fi sterilizat. Se poate aplica
pentru ansa bacteriologică (cu buclă sau fir) sau pentru spatulă.

Flambarea reprezintă trecerea prin flacără (de câteva ori) a unui obiect, fără a se atinge temperatura de
incandescență. Flambarea se aplică pentru portansă, gâtul unui recipient de sticlă (tub, eprubetă, flacon etc)
sau pentru capilarul pipetelor Pasteur și nu reprezintă sterilizare.

Sterilizarea cu aer cald se realizează în etuvă (pupinel, cuptor Pasteur). Etuva este o cutie metalică cu
pereți dubli. Cu ajutorul unor rezistențe electrice și a unui termostat se obține și menține temperatura
pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii în interiorul aparatului este realizată cu ajutorul unui sistem
de ventilație (Schema nr. 1).

Pentru majoritatea materialelor care urmează a fi sterilizate, temperatura din etuvă trebuie să atingă
180ºC, pentru o durată de 1 oră sau 160°C pentru o durată de 2 ore. Pot exista și alte variante, de exemplu în
funcție de dimensiunea obiectelor de sterilizat.

Sterilizarea cu aer cald este indicată pentru obiecte de sticlă, obiecte de porțelan, pulberi inerte și
termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de menționat
faptul că repetarea sterilizării, în timp, conduce la decălirea oțelului) etc.

Nu se vor steriliza în etuvă soluțiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vată, bumbac,
fibră sintetică, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator.

Reprezintă arderea până la obținerea de cenușă. Există anumite reguli stricte privind incinerarea,
pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. În cazul spitalelor, în România au existat astfel de incineratoare
în structura unității sanitare respective. Odată cu procesul de aderare la Uniunea Europeană și respectiv
necesitatea aplicării unor reguli impuse pentru toate țările membre, majoritatea incineratoarelor de spital au
fost închise.

Modul în care s-a realizat în perioada 2003-2004 negocierea privind stoparea activității acestor
incineratoare nu a ținut cont de situația reală din țara noastră. În lipsa unui incinerator propriu, unitatea
sanitară trebuie să încheie un contract de prestări servicii cu o firmă de profil. Din punctul de vedere al
laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse incinerării materiale de unică folosință din plastic, reziduuri
organice solide, gunoi, cadavrele animalelor de experiență etc.

Temperaturile joase (în jur de 0-4ºC) au în general un efect bacteriostatic. La temperaturi scăzute,
reacțiile biochimice încetinesc, multiplicarea poate fi stopată. Majoritatea produselor biologice/patologice
pot fi transportate (menținând viabilitatea germenilor și încetinind în același timp multiplicarea acestora) la
o temperatură de circa 4ºC. O serie de culturi pot fi de asemenea menținute la temperatura frigiderului

34
pentru o durată limitată de timp în vederea prezervării și posibilității de a repeta anumite teste de
identificare etc.

În funcție de viteza cu care are loc răcirea, întâlnim situații diferite, cu următoarele posibile efecte
asupra structurilor celulare bacteriene.

A. Congelarea lentă, la temperaturi mai mici -21,3ºC are efecte bactericide prin formarea de cristale de
gheață și prin hiperconcentrarea salină cu denaturarea proteinelor;

B. Congelarea bruscă la -70ºC are efecte de conservare a bacteriilor prin solidificarea în masă a apei fără

apariția cristalelor de gheață;

C. Liofilizarea (criodesicarea) reprezintă congelarea bruscă concomitent cu desicația (deshidratarea în vid).
O suspensie microbiană în mediu protector, liofilizată, poate fi păstrată în fiole închise timp îndelungat (de
exemplu vaccinul BCG).

Bacteriofagii sunt virusuri care parazitează bacteriile (de exemplu, bacteriofagii T1-T7 cu specificitate
pentru E. coli). Bacteriofagii (fagii) au fost descoperiți în 1915. Prof. Mihai Ciucă obține în anul 1921 primele
tulpini lizogene. În 1949 se înființează în România un Centru național pentru bacteriofagi. Fagii au o structură
mai complexă decât cea a virusurilor obișnuite. Se descriu:

1. capul fagului are formă de prismă hexagonală bipiramidală. Conține ADN dublu catenar helicoidal sau
ARN înconjurat de capsida formată din capsomere (înveliș proteic); fagii ARN pot avea un număr mic de
gene (ex. 3) în timp ce fagii ADN pot avea până la 150 gene;
2. coada fagului are structură proteică, simetrie helicoidală; are rol de adsorbție, ajutând fagul să penetreze
bacteria. Se descriu următoarele formațiuni:
 cilindrul axial;
 teaca cozii;
 placa bazală (cu croșetele de fixare);
 fibrele cozii (formând un strat în jurul tecii cozii).

Toate proteinele fagice pot conduce la apariția de

anticorpi, descoperire utilizată în studierea înrudirii dintre
diferiți bacteriofagi.

Între bacteriofag și bacteria gazdă se pot stabili

două tipuri de relații:

 de tip litic sau productiv;

 de lizogenizare sau de tip reductiv.

Relațiile sunt strict specifice și sunt mediate de receptori.

35
1. Adsorbția: Atașarea este specifică. Există receptori strict specifici la nivelul bacteriofagului, ce recunosc
receptori de la nivelul bacteriei. Fixarea pe receptori este inițial reversibilă (prin fibrele cozii), apoi
ireversibilă (prin croșetele plăcii bazale). Adsorbția fagică modifică permeabilitatea membranei
citoplasmatice bacteriene.
2. Penetrarea: Fagul eliberează muramidaza care lizează mureina din peretele bacterian. Teaca cozii se

contractă și antrenează cilindrul axial prin peretele bacterian, ducând apoi la injectarea ADN-ului fagic în
citoplasma bacteriană;
3. Multiplicarea: După aproximativ 4-5 minute, funcția ADN-ului bacterian este blocată și preluată de ADN-
ul fagic ce coordonează sinteza componentelor proprii. Se sintetizează un număr însemnat de proteine
virale.
4. Maturarea (ansamblarea) fagului
5. Liza bacteriei (ex. datorită sintezei unor enzime asemănătoare lizozimului) și eliberarea bacteriofagului
matur, virulent.

Bacteriile lizosensibile permit adsorbția, penetrarea și multiplicarea fagilor virulenți până la

realizarea lizei celulei bacteriene.

În mediu lichid (tulbure), inocularea fagului litic corespunzător duce după câteva zeci de minute

(uneori chiar și câteva zile) la limpezirea mediului;

Pe mediu solid, însămânțat uniform, inocularea fagului litic duce la apariția unei zone de liză, clară,
bine circumscrisă (spotul de bacteriofagie), metodă utilizată în lizotipie;

Dacă se amestecă o suspensie de fagi cu o picătură de cultură (pură) bacteriană, iar tulpina
respectivă are receptori potriviți bacteriofagilor și această suspensie se amestecă cu geloză încălzită putem
transfera suspensia într-o placă petri;

Bacteriofagii infectează bacteriile; după circa 30 minute bacteriile sunt lizate și eliberează fagii;
aceștia difuzează prin geloză și infectează bacteriile situate în apropiere și ciclul se reia;

Parte dintre bacterii (cele care nu au receptori potriviți) nu sunt infectate și în timp se multiplică iar
cultura bacteriană opacizează mediul; după circa 18-24 de ore putem observa arii cu celule lizate
(transparente) pe un fond produs de cultura bacteriană (bacterii nelizate), aceste arii numindu-se plaje de
bacteriofagie; plajele produse de bacteriofagii virulenți sunt clare, în comparație cu plajele mai puțin clare

produse de bacteriofagii temperați (fagii virulenți sunt acei bacteriofagi care nu pot evolua decât în ciclul
litic)

După adsorbție și penetrare, ADN-ul fagic:

36
  fie se integrează liniar în cromozomul bacteriei gazdă și se replică sincron cu aceasta,
 fie se circularizează și atașat de membrana citoplasmatică se replică sincron cu diviziunea bacteriei.

Bacteria a devenit lizogenă, se reproduce și transmite descendenților fagul latent (profag, fag
temperat). În anumite condiții profagul poate deveni fag virulent. Fagul temperat cel mai bine studiat este
bacteriofagul Lambda specific pentru E. coli capsulat (K12).

1. este imună față de un fag omolog profagului;

2. pot apărea fenomene importante din punct de vedere genetic:
a. transducția;
b. conversia genetică (cu producerea de exotoxine de către unele bacterii lizogenizate, cum ar fi toxina
difterică, toxina scarlatinoasă, toxina botulinică de tip C etc);
c. recombinarea genetică (atunci când o bacterie parazitată de doi fagi diferiți, dar înrudiți, eliberează
la sfârșitul ciclului litic pe lângă tipurile parentale și tipuri de fagi care însumează unele din
proprietățile celor doi fagi parentali) etc.;
d. inducția fagică (sub influența unor agenți inductori, de ex. raze UV, sau spontan, profagul își
recâștigă virulența, devine fag virulent, și produce liza bacteriei respective).

Bacteriile lizorezistente nu permit infecția cu un fag fie datorită lipsei receptorilor specifici, fie
datorită unei stări de imunitate. Bacteriile lizogene sunt imune la fagii virulenți omologi profagului găzduit.

Fagul defectiv reprezintă profagul care persistă indefinit în stare latentă (nu se reactivează).

37
 Genetica bacteriană studiază ereditatea și
variabilitatea la bacterii.

Suportul material al eredității este reprezentat de

ADN (acidul dezoxiribonucleic). Molecula de ADN conține
codificată informația ereditară, care se exprimă prin sinteza
unor proteine și se transmite prin replicare și diviziune la
descendenți. Gena reprezintă unitatea funcțională a
eredității iar noțiunea de genă este cunoscută încă din anul
1909.

Dacă nu au loc modificări genetice, toți descendenții

unei bacterii vor fi identici cu bacteria „mamă” și identici
între ei. O celulă bacteriană inoculată pe un mediu de cultură
(având la dispoziție nutrimentele necesare) va produce prin
multiplicare în condiții prielnice (de pH, temperatură,
umiditate etc.) o colonie bacteriană, o clonă.

ADN-ul este un macropolimer de

dezoxirbonucleotide.
Unitatea structurală este formată dintr-o bază
azotată purinică (adenina, A; guanina, G) sau pirimidinică
(timina, T; citozina, C), o pentoză (dezoxiriboza) și acid fosforic.

Legături fosfodiester unesc carbonul 5 al unei molecule de dezoxiriboză cu carbonul 3 al moleculei

adiacente, formând o catenă lungă polinucleotidică. Prin analiza compoziției în baze azotate a ADN-ului
(provenit din surse diferite) s-a demonstrat că există o anumită compoziție care diferă la diversele specii.

Compoziția de nucleotide a ADN-ului este surprinzător de variabilă. Suma procentuală a citozinei și

guaninei variază la bacterii de la 22% până la 74%, în timp ce la organismele eucariote intervalul este ceva
mai restrâns (28 - 58%). La om variază între 39-40% în funcție de tipul de țesut (timus 39%; ficat 39,4%).
Acest fapt se explică prin evoluția în decursul a mai multor mii de ani a procariotelor comparativ cu a
eucariotelor în general și a omului în particular.

Comparațiile conținutului de C+G ale diferitelor organisme și microorganisme au fost folosite drept
fundament în vederea stabilirii relaționării/legăturii genetice. Timina fiind susceptibilă la alterări fotochimice
(lumină UV), bacteriile cu un conținut bogat de C+G este posibil să fi evoluat în medii supuse unei lumini
solare foarte puternice sau unor temperaturi înalte, iar cele cu conținut redus de C+G s-ar fi dezvoltat în
locuri mai protejate.

Așadar, compoziția în baze azotate, numită și procentul de C+G, este diferită în funcție de specie,
dar se păstrează constantă în cadrul unei anumite specii.
38
 Procentul de C+G se calculează după formula: (C+G)/ (C+G+A+T). De exemplu acest raport diferă la
diferitele specii bacteriene, sper exemplu este 26,8% la Clostridium perfringens, 40% la Streptococcus
pneumoniae, 40,5% la Proteus vulgaris,51,7% la Escherichia coli, 53% la Proteus morgani și67%
la Pseudomonas aeruginosa. Așa cum a fost precizat de către diverși autori, compoziția de baze azotate este
un index taxonomic. (1)

La celulele procariote ADN-ul este inelar, împachetat în nucleoidul din citoplasmă. La bacteria
intestinală E. coli cele 4,7 milioane de perechi de baze alcătuiesc o macromoleculă de 1,4 milimetri lungime,
dar numai 2 nanometri lățime. Aceasta conține 4.400 de gene deja secvențiate. În ciuda lungimii sale, de

peste o mie
jumătate dinde ori diametrul
diametrul celular, ADN-ul este extrem de bine înfășurat în nucleoid, în aproximativ
celular.

ADN-ul apare ca o macromoleculă formată din două catene polinucleotidice antiparalele și

complementare răsucite în dublu helix. Cele două catene sunt unite prin punți de hidrogen formate între
bazele azotate opuse (A=T și G≡C). Modelul structural al ADN-ului a fost propus de către Watson și Crick în
anul 1953. Complementaritatea bazelor azotate este cea mai importantă proprietate a acizilor nucleici și
condiționează toate proprietățile ADN-ului, mai ales cea de autoreplicare și cea de transfer al informației
genetice.

Rolul genetic al ADN-ului a fost dovedit prin experiențe succesive, inițial prin cercetările lui W.
Griffith (1928) privind fenomenul de transformare bacteriană, ulterior prin experiențe care au confirmat
rezultatele obținute de Griffith, dar abia în 1944 Avery, MacLeod și Mc Carthy demonstrează faptul că ADN-
ul este substratul chimic al eredității și reprezintă materialul genetic al oricărei celule (funcție îndeplinită așa
cum știm astăzi de ARN, la ribovirusuri).

La temperatura camerei ADN-ul este o structură stabilă în condiții fiziologice normale, datorită
legăturilor intercatenare (2 între A și T și 3 între C și G). Dacă temperatura depășește 65ºC, stabilitatea
punților de hidrogen începe să cedeze, dublul helix începe să se desfacă și rezultă două catene
complementare (proces numit denaturare termică). Denaturarea devine completă la temperaturi care
depășesc valoarea de 90ºC.

Renaturarea („reannealing”) reprezintă refacerea structurii bicatenare a ADN-ului, iar prin acest
proces se poate stabili relația filogenetică între două specii (în funcție de procentul de renaturare). De
exemplu dacă se utilizează ADN denaturat provenit de la E. coli și ADN denaturat provenit de la Salmonella
spp., fiecare marcat cu același izotop (ex. C14), fracțiunea de ADN marcată și evaluată prin diferite tehnici va
fi fracțiunea din ADN care este complementară pentru cele două specii (aceste experiențe au stat la baza
brevetării tehnicilor de hibridare moleculară). Renaturarea este un proces mai lent decât denaturarea.

Denaturarea și renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice importante, folosite fie în tehnologia
ADN-ului recombinant, fie în studierea relațiilor filogenetice între diferite specii. Cu cât speciile sunt mai
înrudite, cu atât secvențele de baze azotate au un mai mare grad de similitudine (lanțurile lor monocatenare
renaturează mai rapid).

 conservarea informației genetice;

39
  replicarea;
 transcrierea și traducerea materialului genetic;
 protejarea materialului genetic propriu („self”);
 reglarea și controlul activității celulare.

Transmiterea mesajului genetic se face prin dublarea cantității de material genetic urmată de
diviziune.
Replicarea ADN constă în sinteza unor
noi molecule de ADN, identice cu molecula
parentală și identice între ele, pe bază de
complementaritate (replicare
semiconservativă). După ruperea legăturilor de
hidrogen și separarea celor 2 catene, fiecare
catenă servește drept matriță pentru sinteza
unei noi catene. Replicarea ADN este una dintre
cele mai importante reacții din lumea vie.
Watson și Crick au fost primii care au propus
modelul semiconservativ de replicare a ADN.
În celula care se dezvoltă rapid, există
posibilitatea ca înainte de terminarea primei replicări să se inițieze încă o replicare. În acest caz celula
bacteriană va putea fi merodiploidă (doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori decât
în mod normal) sau chiar poliploidă (tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori decît în mod normal).
În general, dacă replicarea cromozomială nu este succedată de diviunea celulei (așa cum se întâmplă în mod
obișnuit), putem remarca în celula bacteriană existența cromozomilor supranumerari. Cromozomii
suplimentari (în total 2 sau 4) nu aduc o informație genetică diferită, pentru că ei reprezintă copii ale
cromozomului inițial (deci sunt identici cu acesta).

In vivo se pot replica numai

moleculele de ADN constituite într-o
unitate de replicare independentă numită
replicon. Indiferent dacă celula are mai
mulți cromozomi (celula eucariotă este
diploidă) sau un singur cromozom (celula
procariotă), tot genomul trebuie să fie
replicat.

40
 Repliconul bacterian este bicatenar și circular, caracterizat prin:
 secvență nucleotidică specifică marcând începerea replicării;
 gene care codifică sinteza unor proteine specifice numite inițiatori;
 secvență nucleotidică semnal pentru terminarea replicării.

Exemple de repliconi:
 cromozomul și plasmidele bacteriene;
 genomul bacteriofagilor.
Cromozomul bacterian este unul dintre cele mai ilustrative exemple de repliconi. O genă structurală

din cromozom are toată informația necesară sintezei inițiatorului replicării (o proteină complexă). După ce
replicarea a început, nu mai poate fi oprită până în momentul când se ajunge la dedublarea cromozomului.
Cromozomul bacterian funcționează ca un replicon, fapt dovedit de experiența în care fragmentele
de ADN introduse într-o celulă bacteriană (de ex. prin conjugare) nu se pot replica dacă rămân „libere” în
citoplasmă, dar vor putea fi replicate odată cu întregul cromozom în cazul în care sunt integrate în
cromozomul bacterian.
Replicarea corectă este controlată de un mecanism foarte precis care „identifică” apariția de
nucleotide libere, împerecheate eronat și în momentul apariției unui astfel de eveniment nucleotidul este
„tăiat” iar polimerizarea se oprește (corectitudinea citirii este realizată cu ajutorul ADN-polimerazei I).

Genomul bacterian este alcătuit din două categorii de determinanți genetici:

1. genele esențiale, localizate în structura cromozomului bacterian și

2. genele accesorii extracromozomale prezente în structura:
a. plasmidelor și
b. elementelor genetice transpozabile.

Plasmidele sunt elemente genetice extracromozomiale, capabile de

replicare fizic independentă de cromozom (replicon), dar
depinzând de factori codificați de nucleul bacterian. Conțin
informație genetică neesențială pentru viața celulei
bacteriene. Sunt transmise stabil de-a lungul generațiilor.
Dimensiunea plasmidelor variază între 1kb și circa 200 kb.
Majoritatea sunt alcătuite din molecule de ADN circular, dar
există și plasmide liniare (ex. la Borrelia burgdorferi). Unele

plasmide sunt ADN dublu catenar, dar există și plasmide de

ADN monocatenar (se consideră că plasmidele de ADN
monocatenar reprezintă de fapt o situație intermediară în cursul
procesului de replicare; au fost detectate de ex. la Staphylococcus
aureus).
Unele plasmide (numite și epizomi) pot exista alternativ în stare autonomă (libere în citoplasmă) sau
integrate în cromozomul celulei gazdă (de exemplu factorul F, bacteriofagul temperat etc). Celelalte
plasmide persistă indefinit numai în stare autonomă (de exemplu plasmida R, Col, F etc).
41
 În raport cu caracterele exprimate fenotipic, plasmidele se pot clasifica în:
1. plasmide care codifică rezistența la agenți antibacterieni:
a. factorii R (primul factor R a fost izolat de la o tulpină de Shigella dysenteriae);
b. plasmidele de rezistență la UV etc.
2. plasmide care codifică sinteza unor agenți antimicrobieni:
a. factorii Col (conferind capacitatea de producere de colicine cu activitate antibiotică) etc.
3. plasmide de patogenitate care codifică sinteza de:
a. hemolizine;
b. factori de colonizare;
c. enterotoxine sau alte exotoxine etc.
4. plasmide care codifică enzime ale unor căi metabolice particulare:
a. în anumite condiții, unele bacterii pot utiliza ca sursă de C diferite substanțe cu potențial
toxic, precum octanul sau toluenul, iar plasmidele care permit supraviețuirea și dezvoltarea
în aceste condiții se numesc plasmide degradative;
5. plasmide care permit transferul genelor cromozomiale de la o celulă care deține respectivul plasmid (F)
la alta, putând fi transmis inclusiv plasmidul (factorul) F;
6. plasmide criptice, pentru care nu se cunosc caracterele fenotipice exprimate.

Plasmidele „Col” codifică proprietatea unor bacterii de a elabora substanțe antibiotice de tip special,
numite bacteriocine (colicine, pesticine, vibriocine, piocine etc).
Plasmidele „Col” sunt transferabile de la tulpinile Col + la tulpini Col- prin transformare genetică,
transducție fagică sau prin conjugare.
Bacteriocinele sunt bactericide, au un spectru de activitate limitat (față de specia omologă), iar
biosinteza lor nu are efect letal pentru specia producătoare.

Factorul F controlează capacitatea unor bacterii de a acționa ca donoare de material genetic în

procesul de conjugare. Factorul F codifică structurile (de exemplu pilul „F”) și enzimele necesare transferului
de ADN.
În funcție de prezența plasmidelor F, de raportul lor cu cromozomul bacterian și de modul în care facilitează
transferul de material genetic, bacteriile se pot grupa în patru categorii distincte: bacterii F -; bacterii F+;
bacterii Hfr; bacterii F’.

Bacteriile F-
Bacteriile F- sunt lipsite de factorul F. Sunt echivalente unor celule „femele” care se comportă ca
receptoare de material genetic.
Bacteriile F+
Bacteriile F+ dețin factorul F autonom în citoplasmă. Sunt echivalente unor celule „masculine”,
donoare de material genetic, capabile să transmită factorul F.
42
 Bacteriile Hfr (High frequency of recombination)
Bacteriile Hfr (cu mare frecvență de recombinare) dețin factorul F integrat în cromozomul bacterian.
Se comportă ca donoare de material genetic, au o mare frecvență de conjugare și recombinare. De obicei
prezența factorului F integrat determină transferul unui număr variabil de gene cromozomale și mai rar,
chiar transferul factorului F.
Bacteriile F’
Bacteriile F’ dețin o structură plasmidică de tip special (factor de fertilitate recombinant) care a fost
anterior integrată în structura unui cromozom și s-a desprins din acesta, încorporând în structura sa unele
gene cromozomale. Aceste bacterii au caracter de „mascul” și se comportă ca donoare de material genetic
(factorul F’).

Plasmidele R (de rezistență la antibiotice) conferă celulei purtătoare rezistența la unul sau la mai
multe antibiotice. Plasmidele R au o structură genetică complexă, fiind alcătuite din:
 gene care asigură proprietatea de rezistență la antibiotice;
 gene care formează „factorul de transfer al rezistenței” (RTF).
Asigură capacitatea de replicare autonomă și de transfer prin conjugare (cele două tipuri de
elemente pot exista independent sau se pot asocia).
Transferul plasmidelor R se poate face prin conjugare bacteriană sau prin transducția mediată de
bacteriofagi.

Genomul reprezintă suma genelor unui organism.

Totalitatea informației genetice a unui organism se numește genotip.
Suma caracterelor observabile, specifice unui organism, produse de genotip în interacțiune cu mediul
ambiant se numește fenotip.

Bacteriile sunt microorganisme haploide (cu excepțiile prezentate anterior), au un singur cromozom
iar pentru remanierea prin recombinare a genomului este necesară transferarea de material genetic de la o
tulpină („donoare”) la tulpina receptor („acceptoare”). În mod clasic poate avea loc un transfer „pe
orizontală” între tulpini care fie fac parte din aceeași specie fie fac parte din specii foarte înrudite, chiar dacă
genotipic sunt diferite. Relativ recent a fost demonstrată posibilitatea unor schimburi genetice între tulpini
din specii diferite (ex. în ecosistemul intestinal). Variabilitatea bacteriană presupune modificarea la un
moment dat a comportamentului celulei bacteriene sau a descendenților ei și pot exista în principiu două
variante:
 variabilitatea fenotipică;
 variabilitatea genotipică.

Variațiile fenotipice reprezintă modificări morfologice sau fiziologice de tip adaptativ, care nu se
transmit ereditar. Genomul nu este afectat.
Variațiile genotipice reprezintă modificări definitive ale materialului genetic (cromozomial sau
extracromozomial) care se transmit descendenților.
43
 Mecanismele variației genotipice sunt reprezentate de:
 mutație;
 transfer genetic urmat de recombinare genetică.

Materialul genetic al unei celule bacteriene poate fi modificat fie prin incorporarea unui fragment de
material genetic exogen (prin procesul de recombinare genetică), fie prin apariția spontană sau indusă a unei
mutații care poate consta în adăugarea, pierderea, substituirea sau inversarea ordinii unor baze în secvența
ADN-ului.

Mutația reprezintă o modificare accidentală în secvența nucleotidică a unei gene, ducând la

modificări ale mesajului genetic. Mutațiile pot apărea la nivelul materialului genetic prin:
 substituții;
 inversii;
 inserții;
 deleții.

Mutațiile care apar în condiții de mediu obișnuite și fără intervenția unui factor decelabil se numesc
mutații spontane.

Mutațiile care se produc sub acțiunea unor factori fizici (de exemplu raze UV, radiații ionizante etc.)
sau chimici (de exemplu agenții alchilanți), care acționează ca agenți mutageni, se numesc mutații induse.
Rata mutațiilor induse este semnificativ mai mare decât rata mutațiilor spontane.
Mutația punctiformă are ca substrat alterarea unui singur nucleotid, respectiv a unui singur codon.
Mutațiile extinse reprezintă alterări care depășesc limitele unui codon, putând afecta secvențe mai
mari ale uneia sau mai multor gene (mutație poligenică).

Afectează celule mutante, determinând revenirea acestora la tipul inițial, restabilind secvența
nucleotidică srcinară.

Permit exprimarea funcției anterioare a genei, deși o modificare a secvenței bazelor nucleotidice
persistă.

44
 Principalele mecanisme de transfer al materialului genetic de la o bacterie donor la o bacterie
receptor sunt:
 transformarea;
 transferul mediat de bacteriofagi (transducția);
 conjugarea.

Transformarea este un transfer genetic realizat atunci când bacteria acceptă ADN liber provenit de la
o bacterie donor sau din alte surse. Bacteria receptor trebuie să fie „competentă” în a accepta ADN-ul de la
bacteria donor.
Prima transformare a fost descrisă în 1928 de către Griffith, în experimente referitoare la virulența
pneumococilor față de șoarecele alb.
Transformarea poate avea loc doar atunci când bacteriile intră în faza staționară a ciclului celular.
Pătruns în celula receptoare, un fragment de ADN exogen poate înlocui (prin recombinare genetică) o
secvență nucleotidică omologă, bacteria receptoare dobândind un caracter genetic nou (de exemplu sinteza
unei structuri capsulare/capsidice).
Unele bacterii sunt „competente” în mod natural. În cazul bacteriilor care nu sunt „natural
competente”, pentru a putea realiza fenomenul de transformare este necesară tratarea chimică a acestora,
de ex. cu ioni de calciu.

Transferul genetic mediat de

bacteriofagi se poate realiza prin:
 transducție;
 conversie lizogenică.

Reprezintă transferul unui fragment

genetic (cromozomial sau extracromozomial)
de la o bacterie la alta prin intermediul unui
bacteriofag (de obicei un fag temperat). Fagul
se numește transductor. Bacteria receptoare
se numește transductant.
Transducția specializată (restrictivă)
este caracteristică fagilor transductori care au proprietatea de a transfera numai un număr restrâns de gene
bacteriene situate în imediata apropiere a situsului de legare a profagului în cromozomul bacterian.
Transducția generalizată (nerestrictivă) presupune că teoretic, oricare din genele cromozomului
bacterian, indiferent de poziția lor în genom, pot fi încorporate în mod accidental în particula virală matură
pentru a forma un fag transductor, care le poate transmite unor bacterii receptoare. Transducția

45
generalizată poate fi realizată de un mare număr de fagi neintegrați în cromozomul bacterian atunci când
aceștia intră în ciclul litic.

Reprezintă apariția unui caracter nou la bacteriile care găzduiesc un profag, de exemplu producerea
toxinei difterice este realizată numai de către C. diphtheriae purtător al fagului temperat (profagul β care
deține gena tox) iar producerea toxinei scarlatinoase este posibilă numai în cazul în care Streptococcus
pyogenes de grup A este lizogenizat. Există și fagi care sunt integrați în regiuni care codifică un anumit
produs din genomul bacterian (ex. fagul P4 de la E. coli se integrează într-o genă care codifică leucina).

Conjugarea bacteriană reprezintă un proces de transfer de material genetic (cromozomial sau

extracromozomial) realizat prin intermediul unei legături intercelulare directe. Este condiționată de prezența
factorului F în celula donoare.

Pentru realizarea legăturii intercelulare este necesară existența unor „receptori” de suprafață atât la
celula donoare, cât și la celula receptoare. Aceștia vor permite „recunoașterea reciprocă”.

+ -
După un număr de alipiri întâmplătoare, bacteriile F formează cu bacteriile F „perechi de
recombinare” și între celulele alăturate se formează un canal de conjugare. Prin canalul de conjugare se
realizează transferul unidirecțional al materialului genetic. Fragmentul transferat poate fi apoi integrat
parțial sau total în genomul celulei receptoare, ducând la apariția unor proprietăți noi ale acesteia, manifeste
sau nu.

Antibioticele și chimioterapicele antimicrobiene reprezintă un grup de substanțe medicamentoase

capabile să distrugă sau să inhibe multiplicarea unor microorganisme implicate etiologic în bolile infecțioase.
Au o acțiune selectivă asupra celulelor microorganismelor, exercitând acțiuni minime asupra celulelor
organismului gazdă. Aceste substanțe pot fi:
 antibacteriene,

antivirale,
 antifungice,
 antiparazitare.

În mod clasic, în această grupă de medicamente au fost incluse și antineoplazicele (ex.

dactinomycina, doxorubicina, bleomycina). Există și antibiotice folosite ca:
 inhibitori enzimatici (ex. Lipstatin, sintetizat de Streptomyces toxytricini),
 imunosupresori (ex. Ciclosporina, sintetizată de Tolypocladium inflatum),
46
  hipocolesterolemiante (ex. Lovastatin, sintetizat de Aspergillus terreus),
 insecticide,
 ierbicide etc (1).

Un antibiotic este bacteriostatic dacă efectul său se limitează la oprirea multiplicării bacteriene (ex.
tetraciclinele, cloramfenicolul, eritromicina, clindamicina, sulfonamidele etc).
Un antibiotic este bactericid dacă acțiunea sa duce la distrugerea bacteriilor (ex. penicilinele,
cefalosporinele, polimixinele, aminoglicozidele, rifampicina, vancomicina, streptograminele etc).
Trebuie cunoscute situațiile patologice în care se poate administra un antibiotic bacteriostatic,
precum și situațiile în care este absolut necesară administrarea unui antibiotic cu efect bactericid (spre
exemplu la persoanele care prezintă imunodepresie).

A. agenți antimicrobieni care acționează prin inhibarea sintezei peretelui celular; au efect bactericid și sunt
reprezentați de antibioticele beta-lactamice (peniciline, cefalosporine, carbapeneme etc), glicopeptidele
(vancomicina, teicoplanina), bacitracina, cicloserina, fosfomicina, izoniazida etc;
B. agenți antimicrobieni care acționează prin inhibarea funcției membranei celulare; au efect bactericid și
sunt reprezentați de polimixine (polimixină B, colistin), gramicidină, tirocidină, imidazoli, nistatină,
amfotericină B etc (ultimele trei fiind medicamente antifungice);
C. agenți antimicrobieni care acționează prin inhibarea sintezei proteice la nivelul ribozomilor; de exemplu
aminoglicozidele, tetraciclinele, cloramfenicolul, macrolidele, lincosamidele (lincomicina, clindamicina),
acidul fusidic, streptograminele etc;

47
D. agenți antimicrobieni care acționează prin inhibarea sintezei acizilor nucleici, de exemplu rifampicina,
chinolonele, sulfonamidele, trimetoprimul, pirimetamina, novobiocina etc.

1. Antibioticele betalactaminice
a. Penicilinele


penicilinele naturale (de exemplu penicilina G);

 penicilinele penicilinazorezistente (de exemplu meticilina)
 aminopenicilinele (de exemplu ampicilina)
b. Cefalosporinele
 din generația I (de exemplu cefalotina, cefaloridina);
 din generația a II-a (de exemplu cefamandola, cefoxitina, cefuroxima);
 din generația a III-a (de exemplu cefotaxima, ceftriaxona);
 din generația a IV-a (de exemplu cefepima, cefpiroma).
c. Alte antibiotice beta-lactaminice (aztreonamul)
d. Inhibitori de beta-lactamaze ( ex. acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul).
2. Glicopeptidele (teicoplanina și vancomicina);
Vancomicina este utilizată în tratamentul infecțiilor cu S. aureus meticilino-rezistent. Se administrează
intravenos deoarece nu se absoarbe în tractul gastrointestinal. Printre reacțiile adverse amintim reacțiile
anafilactice, febră, eozinofilie, neutropenie, pierderea auzului.
3. Aminoglicozidele
a. streptomicina (care este de fapt un oligozaharid);
b. kanamicina, gentamicina, amikacina, spectinomicina, tobramicina, netilmicina etc.;
4. ciclinele (ex. tetraciclina, oxitetraciclina, minociclina, doxiciclina etc);
5. Ansamicinele (ex. rifampicina, rifabutina);
6. Macrolidele (ex. eritromicina, claritromicina, azitromicina, telitromicina);
7. Polipeptidele ciclice (polimixina B, colistinul);
8. Antibioticele care nu se încadrează în nici una din grupele de mai sus
a. cloramfenicolul;
b. lincosamidele (lincomicina și clindamicina);
c. acidul fusidic (cu o structură asemănătoare steroizilor);
d. streptograminele (pristinamicin, quinupristin, dalfopristin);
e. oxazolidinonele (linezolid);
f. mupirocinul; ultimele 4 grupe de medicamente au fost descoperite în special ca răspuns la
apariția tulpinilor de stafilococ rezistente la meticilină etc.

1. Sulfamidele (sulfonamidele) (ex. sulfadiazina, sulfafurazolul);

2. Co-trimoxazolul (asociere trimetoprin + sulfametoxazol)
3. Dapsona (diaminodifenilsulfona);
4. Ethambutolul;

48
5. Hidrazida acidului izonicotinic (HIN, izoniazida);
6. Chinolonele (ex. acidul nalidixic, ofloxacina, ciprofloxacina, norfloxacina, levofloxacina, moxifloxacina,
gatifloxacina, gemifloxacina etc);
7. Nitrofuranii (ex. furazolidonul, nitrofurantoina);
8. Nitroimidazolii (ex. metronidazolul, tinidazolul, ornidazolul) etc.

Utilizarea cu succes a oricărui agent terapeutic poate fi compromisă de dezvoltarea rezistenței.

Rezistența poate să apară atât pentru antibioticele utilizate în tratamentul infecțiilor bacteriene cât și pentru
antifungice, antivirale, antiparazitare sau pentru medicamentele utilizate în tratamentul unor boli cronice.
Trei condiții trebuiesc îndeplinite ca un anumit antibiotic să inhibe bacteria susceptibilă:
 antibioticul trebuie să poată să ajungă la țintă într-o concentrație suficientă;
 antibioticul nu trebuie să fie inactivat înainte să se lege de țintă;
 trebuie să existe în celula bacteriană o țintă vitală susceptibilă la acțiunea antibioticului.

Rezistența microbiană la antibiotice reprezintă capacitatea unor microorganisme de a supraviețui și

de a se multiplica în prezența antibioticului.
Fenomenul de rezistență la antibiotice a fost descris relativ rapid după introducerea acestora
(ex. Streptococcus pyogenesrezistent la sulfonamide, Staphylococcus aureus rezistent la penicilină
sau Mycobacterium tuberculosis rezistent la streptomicină) în practica medicală.
Pe măsură ce au fost descoperite mecanismele prin care medicamentele antiinfecțioase afectează

multiplicarea sau distrug diferitele tipuri de bacterii (ex. mecanismul de acțiune al beta-lactaminelor) au fost
descoperite și mecanismele prin care bacteriile pot rezista față de acțiunea medicamentului antibacterian
(ex. producerea de enzime numite beta-lactamaze / penicilinaze, cefalosporinaze etc).
Rezistența poate fi naturală sau dobândită.

Rezistența naturală (intrinsecă) reprezintă rezistența tuturor membrilor unei specii bacteriene față
de un antibiotic și este determinată genetic, de exemplu rezistența bacilului tuberculozei (Mycobacterium
tuberculosis) la penicilina G.

Rezistența dobândită este acea rezistență necaracteristică unei specii bacteriene, dar achiziționată
de anumite subpopulații din acea specie în circumstanțe date; de exemplu, antibioticul acționează ca un

presor selectiv (pacientul

antimicrobian, are o infecție
dar există tulpini în carerezistență;
care prezintă majoritatea înpopulației bacteriene
aceste condiții, este
tulpinile sensibilăvor
sensibile la fiagentul
inhibate
sau distruse în timp ce tulpinile rezistente vor fi „selectate”; această situație nu poate fi detectată decât
utilizând tehnicile de testare a sensibilității bacteriilor la antibiotice și chimioterapice, de ex. antibiograma
difuzimetrică standardizată). Rezistența dobândită poate fi cromozomială sau extra-cromozomială.

1. Rezistența față de un agent antimicrobian poate fi:

49
 a. monovalentă (monorezistența), atunci când germenii rezistă la un singur antibiotic;
b. plurivalentă (rezistența multiplă, la mai multe antibiotice);
2. Din alt punct de vedere, rezistența se poate manifesta:
a. direct (leagă o anumită bacterie de un singur anumit antibiotic);
b. încrucișat (rezistența unei bacterii față de mai mulți agenți antimicrobieni cu structură și/sau
mecanism de acțiune asemănător); de ex. rezistența la o sulfonamidă sau la o tetraciclină
conferă rezistență la toate sulfonamidele sau la toate tetraciclinele în timp ce stafilococii
rezistenți la meticilină (MRSA) sunt rezistenți la toate medicamentele beta-lactamice;
3. După ritmul de instalare, rezistența poate fi:
a. cu ritm rapid de instalare (monostadială), „tip streptomicină”;
b. de ritm intermediar, „tip eritromicină”;
c. cu ritm lent de instalare (pluristadială), „tip penicilină”;
d. cu ritm foarte lent de instalare, „tip vancomicină”.

Din punct de vedere tehnic însămânțăm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar Mueller-
Hinton) turnat în plăci Petri. Însămânțarea se poate realiza de exemplu prin „inundarea” plăcii urmată de
aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul unui tampon (există și alte variante tehnice). După
circa 20 minute (timp în care placa Petri se lasă cu capacul întredeschis în vecinătatea becului de gaz, aprins)
se aplică microcomprimatele în care sunt încorporate antibiotice în concentrație standardizată. Aplicarea
microcomprimatelor se poate face cu ajutorul unei pense, în condiții aseptice, sau cu ajutorul unui aplicator

„automat” (la minim 30 mm distanță între ele și minim 15 mm de marginea plăcii; vom utiliza 5 antibiotice
diferite pentru o placă Petri cu diametrul de 9 cm).

Microcomprimatele trebuie să vină în contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu ajutorul unei
pense le presăm ușor (după caz). După încă 15-20 minute, incubăm plăcile peste noapte în termostat, la 28
sau 35-37°C, în funcție de temperatura optimă de multiplicare a microorganismului testat.

Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în mediu, realizând zone de inhibiție în care
coloniile microbiene nu se dezvoltă.

Cu cât zona de inhibiție este mai largă, cu atât germenul va fi considerat mai sensibil. Dacă în
interiorul zonei de inhibiție (chiar dacă diametrul înregistrat este foarte mare) se dezvoltă colonii, „mutanți
rezistenți”, germenul va fi considerat rezistent.

Această metodă, cu toate că este folosită pe scară largă în laboratoare, permite de fapt numai
eliminarea antibioticelor complet inactive și eventual selecționarea antibioticelor foarte active, pentru că

tehnica nu este standardizată.

50
 Antibiograma difuzimetrică standardizată
(Kirby-Bauer, NCCLS)

Din punct de vedere tehnic se realizează

asemănător cu prima metodă prezentată, dar este
standardizată, fiind singura metodă difuzimetrică
recunoscută pe plan internațional, care permite
obținerea unor rezultate reproductibile și corelabile
între laboratoare diferite
Elementele necesare standardizării sunt:

 mediul (agar Mueller-Hinton)

 pH-ul mediului (între 7,2 și 7,4);
 grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm
(25 ml de mediu/placă de 9 cm);
 inoculul (din 5 colonii izolate - cultură
pură) cu tubiditate corespunzătoare (0.5
McFarland – aprox. 108 unități/ml)
 timpul, atmosfera, umiditatea de incubare;
 concentrația substanțelor și diametrul
 interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiție și se compară rezultatele cu
cele din tabelele puse la dispoziție de producători și/sau centrele de referință).

Metodele difuzimetrice au dezavantajul că nu permit aprecierea concentrațiilor eficace ale antibioticului la

nivelul focarului infecțios.

Acest tip de metodă oferă informații cu privire la CMI ale antibioticelor studiate, față de
microorganismul testat. CMI = concentrația minimă inhibitorie, reprezintă cea mai mică concentrație de
agent antimicrobian, exprimată în micrograme/ml, care mai exercită o acțiune bacteriostatică asupra
germenului testat.

Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi cu bulion
Mueller-Hinton în concentrații descrescânde (diluții binare), plus 2 tuburi martor, fără antibiotic (cantitatea
finală va fi de 1 ml în fiecare tub). Preparăm un inocul standardizat turbidimetric și în condiții aseptice
inoculăm toate cele 10 tuburi cu câte 1 ml de inocul. Agităm pentru a omogeniza. Incubăm cele 8 tuburi cu
antibiotice și 1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-37°C iar al doilea tub martor îl men ținem pentru aceeași
perioadă la temperatura frigiderului. Pentru controlul de calitate utilizăm și un șir de tuburi pe care le
inoculăm cu o tulpină de referință corespunzătoare. În ziua următoare citim și interpretăm rezultatele.

51
 Deoarece am utilizat o cantitate de inocul egală cu
cantitatea de mediu, concentrația finală de antibiotic se va
înjumătăți (de ex. în tubul în care diluția inițială a fost de
16 mg/ml, diluția finală va fi 8 mg/ml etc.). În tubul martor
menținut la +4°C ar trebui să nu fie prezentă creșterea, în
tubul martor menținut la 35-37°C creșterea trebuie să fie
prezentă.

În tuburile inoculate cu tulpina de referință trebuie

să avem rezultatul
cunoaștem privitorcorespunzător datelor pe care le
la respectiva tulpină.

În tuburile cu microorganismul testat, ultima diluție care a inhibat dezvoltarea microorganismului

corespunde CMI. Se consideră (în general, pentru că CMI diferă în funcție de specia microbiană) că
microorganismele în cazul cărora CMI este = 3 mg/ml vor fi eficient inhibate de către antibioticul respectiv și
in vivo.

Pornind de la rezultatul obținut prin

metoda diluțiilor în mediu lichid, se vor utiliza
ca sursă de inocul tuburile în care
dezvoltarea microbiană a fost inhibată.

Este necesară o placă Petri cu agar

Mueller-Hinton care va fi împărțită în
sectoare, numărul de sectoare fiind
corespunzător numărului de tuburi fără creștere microbiană. Însămânțăm în condiții aseptice din fiecare tub
fără creștere microbiană, fiecare în sectorul de placă corespunzător. Incubăm pentru 16-18 ore la 35-37°C.
CMB va corespunde ultimei concentrații de antibiotic care a distrus microorganismele însămânțate (sectoare
de placă fără apariția culturii). Se consideră că antibioticul va fi eficient in vivo dacă în serul pacientului se
pot atinge concentrații de antibiotic care să depășească de 4-8 ori CMB.

Determinarea CMI și CMB este extrem de importantă pentru aprecierea eficacității antimicrobiene a
unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentul infecțiilor severe (de exemplu endocardite,
meningite, sepsis etc), precum și la imunodeprimați, efectuarea acestei metode este indispensabilă.

Cu o parte din microorganismele întâlnite organismul stabilește relații de simbioză, conviețuirea

fiind folositoare pentru ambii parteneri (de exemplu sinteza de vitamine la care participă unii coliformi
intestinali).

Foarte multe din microorganismele care alcătuiesc microflora normală se află în relații de
comensualism cu organismul, germenii depinzând nutrițional de gazdă, căreia nu îi creează prejudicii .
52
Această conviețuire exprimă însă un echilibru instabil, care poate fi ușor tulburat. Diferiți factori (ai gazdei,
din mediul extern sau biologici intrinseci ai germenilor) pot modifica aceste relații, astfel încât unele
microorganisme din flora normală pot manifesta aspecte patogene - este vorba de microorganismele
condiționat patogene.

Relația de parazitism tipic apare însă doar atunci când microorganismele se dezvoltă în detrimentul
gazdei, cu manifestări clinice mai mult sau mai puțin evidente.

Astfel, în cazuri extreme unele bacterii sunt obligatoriu parazite, nu se pot dezvolta decât în
organismul gazdei (de exemplu Mycobacterium leprae,Treponema pallidum, Chlamydia pneumoniae etc).
Alte bacterii sunt facultativ parazite, putând trăi și libere în natură, dar o dată pătrunse în organism stabilesc
cu acesta relații de parazitism (de exemplu Clostridium tetani, Clostridiile gangrenei gazoase, Salmonella
typhi etc).

Patogenitatea reprezintă capacitatea unui germen de a declanșa în organismul gazdă fenomene

morbide, patogene, modificări locale, generale și „ functio laesa”. Patogenitatea este un atribut de specie și
este determinată genetic.

Virulența reprezintă gradul diferit de patogenitate exprimat în cadrul unei specii. Este un atribut al
tulpinii microbiene agresoare. Variabilitatea în exprimarea patogenității depinde de condițiile în care trăiește
microorganismul respectiv (de exemplu, o populație bacteriană care a pierdut virulența în condiții

nefavorabile poate redeveni virulentă în anumite condiții, așa cum se întâmplă cu tulpina vaccinală BCG la
pacienții cu infecție HIV / SIDA). Virulența poate fi cuantificabilă de ex. prin numărul de microorganisme
necesare în condiții standard pentru a omorî 50% dintr-un grup de animale (acest număr este numit DL50,
adică doza letală 50%).

Factorii care condiționează patogenitatea și virulența unei specii (tulpini) microbiene pot fi:

 multiplicarea și invazivitatea manifestată de germenii patogeni;

 multiplicarea și elaborarea de toxine de către germenii toxigeni (în general „exotoxine”).

Flora microbiană a organismului poate fi divizată în două grupuri:

 flora normal rezidentă, care se găsește în mod regulat și care dacă este perturbată se restabilește
prompt (sau destul de prompt)
 flora tranzitorie care poate coloniza gazda pe o perioadă variabilă de timp, de la ore la săptămâni.

Flora microbiană prezintă tropism pentru anumite regiuni anatomice.

53
 În funcție de contactul cu mediul înconjurător, flora bacteriană prezintă un grad marcat de
variabilitate. Mai frecvent, la nivel tegumentar se pot găsi Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium
spp., Micrococcus spp.,dar,temporar, tegumentul poate fi contaminat cu germeni coliformi, chiar stafilococi
potențial patogeni precum Staphylococcus aureus, însă fără manifestări nete de agresivitate.

Conjunctiva este puțin colonizată, deoarece secrețiile lacrimale conțin substanțe bactericide (ex.
lizozim), iar clipitul asigură îndepărtarea mecanică a corpilor străini, inclusiv a bacteriilor. Pot fi totuși
identificați Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium spp.

În mod normal se pot găsi stafilococi aurii și albi, streptococi, corynebacterii, pneumococi etc, floră
supusă numeroaselor contaminări prin contacte și traumatisme locale.

La nivelul cavității bucale flora conține diferiți coci și bacili Gram-pozitivi și Gram-negativi, aerobi și
anaerobi (de exemplu stafilococi, streptococi precum S. salivarius), de srcine aeriană sau alimentară. Există
o adevărată microbiologie orală, cu diferențe în funcție de localizare. Spre exemplu, pentru o celulă de la
nivelul dosului limbii există aproximativ 100-150 bacterii, într-un ml de salivă sunt circa 100M bacterii, iar la
nivelul plăcii dentare, circa 100B bacterii (aproximativ 35 de specii, dominant fiind Streptococcus
sanguis și Streptococcus mutans). Placa dentară, cariile și boala parodontală sunt cauzate de bacteriile ce
constituie flora normală bucală.

Mucoasa nazală este întotdeauna bogat colonizată, fiind supusă unor numeroase contaminări prin
contacte și traumatisme locale. În mod normal se pot găsi Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus
aureus (la aproximativ 20% din populație), streptococi, corynebacterii, pneumococi etc. Flora de la nivelul
faringelui se aseamănă în compoziție cu flora cavității bucale. Tractul respirator inferior este steril, fapt
datorat și clearance-ului mucociliar.

La acest nivel există o diferență evidentă în funcție de segmentele acestuia, exprimate mai ales prin
chimismul local. Luând ca exemplu colonul copilului mare și al adultului, la acest nivel se găsesc o serie de
bacili Gram-negativi (enterobacterii), precum și foarte numeroși germeni anaerobi (enterococi) etc, în total
existând aproximativ 1011 bacterii la 1 g de materii fecale.

Urina este în mod normal sterilă, iar în timpul micțiunii bacteriile de pe tractul urinar inferior sunt cel
mai frecvent îndepărtate. Totuși, în uretra anterioară poate exista o floră care este cel mai frecvent alcătuită
din fungi, staflococi, corinebacterii și enterobacterii.

Flora vaginală este dominată de lactobacili (flora Döderlein) asociați în proporții diferite cu
mycoplasme nepatogene, stafilococi, streptococi, enterococi, clostridii, Candida spp. etc. Predominanța
54
lactobacililor menține local un pH acid nefavorabil multiplicării altor germeni (în special patogeni). Mucusul
cervical are în plus o acțiune bactericidă prin lizozim. La femeile fără activitate sexuală predomină
lactobacilii, pe când la restul compoziția florei este mixtă.

Germenii se multiplică la poarta de intrare și elaborează exotoxine care produc alterări celulare și
distrucții tisulare la distanță, prin inhibarea metabolismului celulei eucariote și prin „functio laesa” („toxikon”
era otrava în care erau înmuiate săgețile luptătorilor greci). Din punct de vedere didactic trebuie menționate
următoarele noțiuni:

Exotoxinele sunt elaborate în general de microbi Gram-pozitivi

lizogenizați (de exemplu bacilul difteric, streptococul beta hemolitic de grup
A, Clostridium botulinum) sau codificat plasmidic (Clostridium tetani, Bacillus
anthracis), dar și de bacili Gram-negativi, prin mecanism cromozomial (V.
cholerae, Bordetella pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas aeruginosa) sau sub
control plasmidic (unele tulpini de E. coli).

Au structură proteică, fiind formate dintr-un domeniu B (bind)

obligatoriu, necesar legării de receptorii celulei gazdă și internalizării ulterioare a
porțiuni enzimatice A (active). Exotoxina nu î și exercită efectele toxice decât
după ce porțiunea A este eliberată din structura inițială. Sunt secretate în timpul
vieții germenilor. Sunt difuzibile la distanță. Toxicitatea lor este foarte mare,
doza letală fiind de circa 0,1 µg/kg corp (până la 1 ng/kg corp în cazul toxinei
botulinice).

Au putere antigenică mare, față de ele apărând anticorpi antitoxină .

Având structură proteică, exotoxinele sunt imunogene și determină apariția de anticorpi specifici
(antitoxine) care pot neutraliza in vitro sau in vivo activitatea toxică prin cuplare specifică cu toxina. Se pot
obține astfel seruri imune utile în seroterapia specifică. De regulă aceste seruri sunt preparate pe cal și sunt
utile în neutralizarea exotoxinelor (ex. în tratamentul difteriei, tetanosului, botulismului).

Administrarea antitoxinelor trebuie făcută cu precauție datorită faptului că anticorpii preparați pe

cal reprezintă în același timp și antigene pentru gazda umană, dar în același timp cât mai curând posibil.

Exotoxinele pot fi detoxifiate într-un anumit interval de timp sub acțiunea conjugată a temperaturii
și formolului. Prin acest procedeu își pierd puterea toxică, dar își mențin puterea imunogenă și devin
anatoxine. Anatoxinele se utilizează în profilaxia bolilor produse de germenii respectivi (în cadrul vaccinurilor
DTP, DT, dT, ATPA, ADPA etc), precum și pentru hiperimunizarea animalelor în scopul obținerii de seruri
antitoxice (antidifteric, antitetanic, antibotulinic etc).
55
 Endotoxinele au fost evidențiate la germenii Gram-negativi, la nivelul membranei externe. Sunt
elaborate de aceștia și apoi incluse în peretele bacterian, eliberându-se în urma distrugerii germenilor. Au
structură lipopolizaharidică (LPZ sau LOZ), în constituția lor intrând acizi grași, un lipid A și lanțuri de
polizaharide.

Au efecte toxice la nivelul celulelor majorității mamiferelor; aceste efecte sunt similare indiferent de
specia bacteriană care le eliberează. Toxicitatea lor este ceva mai redusă (în comparație cu exotoxinele), dar
pot acționa la mai multe nivele inducând apariția febrei, leucopeniei, hiperpermeabilității vasculare,
hipotensiunii arteriale până la colaps, sindromului de coagulare intravasculară diseminată etc. Sunt implicate
între altele în apariția șocului endotoxic (se eliberează o cantitate de endotoxină proporțională cu numărul
germenilor distruși). Studiile arată că mortalitatea în șocul endotoxic este în relație destul de directă cu
cantitatea de endotoxină / ml, fiind de circa 80% la cazurile la care se identifică 100 unități endotoxină / ml
de plasmă.

Așa cum am menționat în capitolul

privind structura bacteriană, componenta
toxică este reprezentată de lipidul A; totuși,
și polizaharidul O (structură antigenică)
contribuie la patogenitate – s-a dovedit că
bacteriile de la care s-a extras polizaharidul
O sunt mai ușor distruse prin mecanisme
care implică sistemul complement. LPZ aflat

în circulație(se
plasmatice cuplează cu proteine
LPS-binding plasma proteins) și
apoi este recunoscut prin intermediul receptorilor CD14 de către monocite și macrofage. Se activează
răspunsul inflamator, coagularea intravasculară, apariția de hemoragii și în final poate rezulta șocul. Sunt
implicate mai multe citokine, de ex. IL-1, IL-6, IL-8 și TNF-α care la rândul lor stimulează „cutia Pandorei” și
respectiv producția de leucotriene și prostaglandine (cu efect de creștere a fenomenelor inflamației). Sunt
activate atât sistemele de coagulare cât și sistemul complement iar cascadele de reacții care apar sunt
rareori reversibile în urma tratamentului.

Puterea antigenică și imunogenă este mai redusă față de exotoxine. LPZ în calitate de mitogen
stimulează o activare policlonală a LB, cu secreția de IgG și IgM.

Inflamația este un proces fiziopatologic complex ce include: fenomene alterative, fenomene de tip
reactiv, vasculo-exudative și proliferative (este vorba despre o reacție tisulară nespecifică, cu caracter de
apărare locală) și fenomene reparatorii. Inflamația are drept principal scop limitarea acțiunii și eventual
neutralizarea „agentului agresor” (indiferent de natura acestuia). Cu alte cuvinte, discutăm despre
fenomenul inflamator și în cadrul unor „agresiuni” microbiene (bacteriene, fungice, parazitare, virale,
prionice), dar inflamația reprezintă un concept mult mai complex (apare în mult mai multe circumstanțe,
decât în cele infecțioase).

56
 Inflamația poate interesa țesuturi, organe, sisteme sau chiar
întregul organism și are drept semne / simptome clasice, următoarele:
tumor (umflare, edem), rubor (eritem, înroșire locală), calor(temperatură
crescută în zona în care evoluează fenomenul inflamator), dolor(durere),
însoțite sau nu de „functio laesa” (tulburări funcționale mai ample sau
mai puțin ample, mergând până la impotență funcțională, de ex.
imposibilitatea deplasării membrului inferior datorită unei inflamații la
articulația genunchiului, în cadrul unei infecții diseminate cu Neisseria
gonorrhoeae).

Agenți determinanți

Există o mare diversitate de „agenți determinanți” ai unui proces

inflamator, printre aceștia putând fi enumerați:

 diferiții agenți fizici (radiații, frig, căldură, curent electric,

traumatisme etc.);
 microorganismele (prioni, virusuri, bacterii, fungi, paraziți);
 agenții chimici exogeni, unii încă necunoscuți până în acest moment,
dar exemplificarea încearcă să dea în primul rând sensul diversității și
să explice faptul că fenomenul inflamator poate fi determinat de
foarte multe substanțe dintre care vor fi enumerate doar câteva,

exogene
endogene(ex. ulei acizi
(uree, de croton, terebentină,
biliari etc.), caolin,
care produc dextran
leziuni etc) și / sau
la nivelul
sediului eliminării lor din organism pe alte căi decât cele fiziologice
(de exemplu în situația apariției unui reflux bilio-gastric).

Indiferent de „agentul determinant”, în urma acțiunii acestuia va

putea apărea o afectare a vaselor mici, a țesutului colagen (noțiune
foarte importantă pe care o vom reîntâlni în cadrul discutării diferitelor
maladii, cu sau fără o determinare precizată), a proteinelor interstițiale
etc., rezultând astfel eliberarea și de cele mai multe ori activarea unor
mediatori și a unor enzime. Acestea din urmă pot fi considerate mecanismelele de declanșare sau „trigger”
pentru procesul inflamator.

În rezumat, inflamația reprezintă reactivitatea diferitelor structuri ale organismului, structuri care
aparțin diferitelor rețele informaționale (de exemplu rețeaua imună ce include organe ale sistemului imun,

celule ale sistemului imun, substanțe sintetizate și eliberate în cursul reacțiilor imune, inter-relații mediate
celular sau umoral etc) ce declanșează diferite tipuri de răspunsuri care urmăresc, cel puțin în stadiile
inițiale, să realizeze o reechilibrare și „aducere la normal”, la situația anterioară intrării în contact cu
„agentul agresor”. Dintre variantele de posibile reacții putem să amintim:

 modificări la nivelul microcirculației, cu creșterea calibrului vascular,

 creșterea permeabilității vaselor mici și scăderea vitezei de circulație (stază);
 modificări ale hemostazei și respectiv marginația, diapedeza, migrarea leucocitelor.

57
 Rezultatul acestei reactivități este reprezentat de ex. de apariția exsudatului inflamator (care poate fi
examinat prin metode de laborator).

Așa cum am menționat mai sus, toate aceste fenomene sunt declanșate pentru neutralizarea
activității „agentului determinant” (al inflamației). Fenomenele vasculo-exsudative, la fel ca și exsudatul
inflamator, încearcă să limiteze efectele produse de agentul pro-inflamator și să împiedice extinderea
procesului inflamator spre zonele învecinate sau la nivelul întregului organism. În cazul în care aceste
activități au succes, alte fenomene vor conduce la asanarea focarului inflamator. Aceste fenomene, în
ansamblu, pot determina:


vindecarea anatomică în totalitate (restitutio ad integrum),
 vindecarea însoțită de cicatrizare sau
 cronicizarea inflamației.

Așa cum am aminitit, procesul inflamator este un proces fiziopatologic. Cel mai frecvent există
tendința către vindecarea țesuturilor lezate. Inflamația devine un fenomen patologic în cazul în care
sistemele de control sunt dezorganizate sau atunci când procesul inflamator se cronicizează.

Modificările fiziopatologice apar independent de cauza inflamației sau, cu alte cuvinte, indiferent de
„agentul determinant”. Chiar dacă acesta este reprezentat de un traumatism prin compresiune, o înțepătură
sau o tăietură (de ex. cu un instrument chirurgical), o arsură (indiferent de procentul de tegument afectat),
de bacterii, virusuri, paraziți, sau este vorba de o necroză (mortificare) tisulară care apare în cursul
dezvoltării unui neoplasm (cancer) sau în urma apariției metastazelor tumorii primare, în cursul procesului
inflamator va rezulta sinteza și eliberarea reactanților de fază acută (RFA).

(parțial) Diferitele particularități

diversitatea fenomenelor structurale ale identificate
inflamatorii organismuluicagazdă sau ale unui
fiind produse anumit
de către țesut
același ar putea
agent explica
etiologic.
Spre exemplu, Salmonella enteritidis serotipul typhimurium produce inflamații proliferative la nivelul
sistemului limfatic și respectiv inflamații exsudative în parenchimul pulmonar. Mycobacterium tuberculosis,
agentul etiologic al tuberculozei, produce inflamații alterative (la nivel pulmonar), inflamații exsudative (la
nivel pleural) sau inflamații proliferative (la nivel dermic).

Etapa de declanșare, în care „agentul determinant” produce modificări la nivelul țesutului interstițial
și în celulele parenchimatoase. Rezultatul detectabil prin metode de laborator este eliberarea unor factori
chemotactici, a unor proteaze și kinaze.

Factorii eliberați conduc la apariția răspunsului inflamator acut, respectiv:

 vasodilatație capilară (eritem, înroșire),

 exsudare de proteine plasmatice (edem, umflare) și
 acumulare de leucocite PMN.

Principalele proteine care apar în această etapă sunt componentele sistemului complement, dar și
diferite citokine. Elementele celulare importante în realizarea procesului inflamator sunt reprezentate de

58
sistemul monocit-macrofag (sistemul mononuclear fagocitar), colagenul vascular și celulele endoteliale. Este
de menționat și subliniat rolul important al ficatului.

Acumularea de celule inflamatorii la locul unde se află „agentul determinant” este esențială în
declanșarea inflamației. Dorim să menționăm că examinarea prin metode de laborator a prezenței acestor
celule (de ex. într-o inflamație de natură infecțioasă apărută la nivel faringian, realizăm un frotiu colorat și în
primul rând căutăm să identifică prezența leucocitelor PMN, astfel având o informație care susține ipoteza
unei infecții bacteriene) poate fi foarte utilă. PMN și macrofagele sunt atrase de moleculele chemotactice și
migrează direcționat de aceste molecule prin procesul de diapedeză, iar la locul inflamației fagocitează,

endocitează, prezintă
macrofagele secretă enzime lizozomale
receptori și generează
specifici de suprafață anioni
pentrusuperoxid.
componentaPe de
C5aaltă parte, leucocitele
a sistemului PMN și
complement,
pentru CCF (crystal-induced chemotactic factor ) și LTB4 (leucotriena B4), precum și pentru peptidele din
factorii chemotactici. Aceste peptide servesc cuplării PMN-factor chemotactic și astfel fagocitele se
îndreaptă spre locul unde acesta a fost produs. Ajungând la nivelul respectiv, PMN sau macrofagele î și pierd
configurația rotundă, devin oarecum triunghiulare, cu baza spre factorul chemotactic. Pentru ca modificarea
de formă să fie posibilă, are loc o rearanjare a elementelor din citoschelet, microtubulii generează o
polarizare „față-spate”, filamentele de actină se acumulează în fața și în spatele celulei. Se asigură astfel
forțele necesare deplasării (motilitatea celulară depinde de polimerizarea monomerilor de actină î n
filamente de actină).

Fagocitarea „agentului determinant” al procesului inflamator (de ex. o structură bacteriană) este
favorizată de opsonizare. Materialul fagocitat este inactivat la nivelul fagolizozomilor (atunci când acest lucru
este posibil) și / sau transformat în superantigen cu rol în declanșarea unor cascade de reacții imune. Până în
acest moment, sistemul complement a reprezentat elementul esențial, fie că a fost activat pe cale directă
sau pe cale alternă. Fragmentele rezultate în cascada complementului participă la stimularea secreției
macrofagice (mediatori ai răspunsului inflamator acut).

Activitatea leucocitelor PMN este facilitată și de prezența unei întregi game de proteine active de
tipul moleculelor de adeziune celulară (selectine, integrine, ICAM-1 (intercellular adhesion molecule), ELAM-
1 (endothelial cell leucocyte adhesion molecule), GMP-140, adezine, LECAM-1 (leucocyte endothelial cell
adhesion molecule), ISCOM (immunostimulating complex), PAF, MAC (membrane atack complex ), MACIF
(MAC inhibitory factor), precum și o serie de proteine sintetizate și eliberate de ficat drept reactanți de fază
acută (RFA). Dintre RFA am putea menționa: proteina C reactivă (PCR este secretată în mod predominant de
ficat și țesuturile adipoase ca răspuns la stresul inflamator și este reglat, în mare parte, de interleukina-6.
Valoarea semnificativă pentru prezența inflamației este de 1mg/dl sau mai mult. Fiind de încredere și ușor
de dozat, este foarte utilizată în practica medicală ca metodă de screening și monitorizare a inflamației, însă
nu trebuie să uităm ca PCR poate fi crescută și în sarcină sau în arsuri etc). (1)

Alți RFA sunt:a2-macroglobulina, a1-antitripsina, a1-antichimotripsina, fibrinogenul, haptoglobina,

hemopexina, ceruloplasmina, componenta C3 și amiloidul P seric. Am subliniat cu caractere speciale RFA
care se testează mai frecvent în practică, în țara noastră.

Aceste proteine de fază acută mediază procesul inflamator, în cursul căruia se și consumă.
Majoritatea sunt glicoproteine sintetizate de ficat (mici cantități sunt sintetizate și de către macrofage). Rolul
RFA nu este pe deplin elucidat. Se cunoaște, totuși, că o serie de RFA sunt implicați atât în procesele de
necrobioză cât și în cele de remaniere tisulară.
Informații cu privire la existența unui proces inflamator putem obține și verificând valoarea VSH.
59
 În continuare, evoluția procesului inflamator este determinată de tipul agentului agresor,
agresivitatea acestuia și momentul declanșării „conflictului imun”. Acesta din urmă corespunde de regulă
apariției semnelor clinice (de ex. febră).

În completare la răspunsul celular, citokinele sintetizate de către diferitele celule stimulate specific,
antigene, mitogeni, endotoxine etc. vor influența / stimula și activitatea celulelor producătoare de citokine,
rezultând sinteza și eliberarea de noi tipuri de citokine. Se constituie „anse de tip feed-back” endocrine și
autocrine, care sporesc sinteza de citokine de către o singură celulă, în timp ce o singură citokină poate
acționa asupra mai multor celule.

Spre exemplu, IFN-g(sintetizat și eliberat de limfocitul T) are cel puțin trei acțiuni importante și
anume: deviază sinteza la nivelul măduvei osoase hematopoietice spre linia monocito-macrofagică, activează
exprimarea Ag HLA de clasa a II-a la nivelul membranei macrofagelor și crește puterea de fagocitoză a
sistemului MM în vederea fagocitării atât a actualelor antigene, cât și a viitoarelor complexe imune ce se vor
constitui în cursul procesului inflamator.

Aproape simultan, celulele endoteliale reacționează eliberând diferiți produși de secreție, precum
endotelinele (ET) și EDRF (endothelium-derived relaxing factor). „Jocul” dintre cele două proteine vasoactive
condiționează pentru un timp aportul local de oxigen și nivelul acidozei. Inițial se eliberează local factorii
vasodilatatori (EDRF) și NO, care au drept scop creșterea fluxului sanguin local, cu creșterea atracției de
celule ale răspunsului imun la locul impactului cu ”agentul determinant” al procesului inflamator. EDRF este
rapid inactivată de hemoglobină și de substanțe antioxidante (care apar în urma stimulării activității PMN
dar și datorită prezenței eritrocitelor).

Pe măsură ce debitul sanguin local crește (determinat de sistemul kinină / bradikină), crește și
sinteza de EDRF (EDRF are însă o „viață” de numai 6-10 secunde). Vasodilatația locală se dezvoltă până în
momentul în care celulele endoteliale, fiind comprimate de edemul perilezional, încep să sintetizeze și să
elibereze local endoteline (ET), în special ET1. Această endotelină (care are de asemenea o „viață” foarte
scurtă) induce vasoconstricție brutală și foarte intensă, tocmai pentru scăderea debitului sanguin și limitarea
amplitudinii răspunsului inflamator local (endotelina este considerată cel mai puternic vasoconstrictor din
organism). Rezultatul etapei de declanșare este reprezentat de răspunsul inflamator acut, manifestat prin
vasodilatație capilară (eritem, înroșire), exsudarea proteinelor plasmatice (edem) și acumulare de leucocite
PMN.

Etapa efectoare, care la rândul ei se subîmparte în trei subetape:

În care se activează:

 cascada complementului;
 sistemul de coagulare-fibrinoliză;
 diferitele căi de metabolizare ale acidului arahidonic (care provine din peretele bacterian în urma
scindării date de fosfolipază), respectiv:
o calea ciclooxigenazei prin care rezultă prostaciclină (PGI) care determină vasodilatație, inhibă
agregarea trombocitelor și aderarea PMN, prostaglandină (ex. PGE2) și tromboxan (TxA 2) care
60
 determină agregare plachetară, are efect vasoconstrictor și de creștere a permeabilității
capilare);
o calea lipooxigenazei, care duce la apariția leucotrienelor, de exemplu LTD 4, LTG4(care determină
bronhoconstricție, vasoconstricție sistemică, vasodilatație la nivelul microcirculației) și
o calea epooxigenazei;
 sistemul kinină-bradikinină;
 familia citokinelor;
 superfamilia interferonilor;
 sistemul extracelular „gunoier” al actinei.

Actina este o proteină care se găsește în cantități mari și este responsabilă pentru motilitatea
celulară, schimbarea formei și mărimii celulelor (care depinde de proprietatea monomerilor de a polimeriza).
După apoptoză, actina eliberată are tendința de a polimeriza, ducând la apariția de filamente de actină în
vase, cu un rezultat catastrofal (de exemplu în șocul septic, necroza hepatică etc). Există însă și un mecanism
homeostatic ce are la bază două proteine plasmatice, gelsolina și proteina Gc (care sunt depășite însă din
punct de vedere funcțional în distrugerile masive).

În care au loc modificări ale calibrului vaselor mici, ale vitezei de circulație a sângelui, ale
permeabilității vaselor mici din aria tisulară lezată. Inițial se produce vasoconstricție, în decurs de secunde /
minute (are loc un aflux masiv de celule sanguine proinflamatorii - neutrofile, monocite, eozinofile - sub
acțiunea unor mediatori solubili eliberați din zona tisulară afectată, care produc două categorii de efecte:

a. vasculare (dilatație arteriolocapilară cu creșterea numărului de capilare active, hiperemie,

stimularea expresiei pe celulele endoteliale din zonă a unor receptori de adeziune intercelulară
astfel încât celulele sangiune recrutate vor adera la endoteliul vascular prin cuplaj receptorial și
în final o fază de stază vasculară pasivă, cu hipoxie și creșterea permeabilității vaselor mici) și
b. chemotactice (celulele proinflamatorii sunt atrase către țesutul lezionat și activate metabolic)..

În care se formează exsudatul inflamator (plasma exsudată, bogată în proteine și LDH) la care se
adaugă elementele figurate extravazate, elementele celulare mobilizate local și produși rezultați din diferite
modificări locale. Prin constituenții săi celulari și moleculari, exsudatul asanează focarul inflamator și tinde să
blocheze procesul infecțios la poarta de intrare, constituind bariera fibrino-imuno-leucocitară.

În funcție de cascadele activate poate rezulta un anumit tip de inflamație. Putem lua în discuție
diferitele forme clinice evolutive (acută, subacută, cronică) precum și formele anatomoclinice.

Se datorează agenților inflamatori care au proprietatea de a stimula în special sistemul efector

timodependent, autoantigenelor sau persistenței stimulului inflamator.
61
Inflamația cronică este din ce în ce mai mult privită nu numai ca o consecință a unui risc infecț ios continuu,
dar și ca o parte integrantă a multor boli neinfecțioase, cum ar fi disfuncțiile autoimune, diabetul sau bolile
cardiovasculare etc.

Astfel, nu este surprinzător că unele sisteme hormonale, cum ar fi sistemul renină-angiotensină

(SRA), care a fost descris prima dată în contextul bolilor cardiovasculare, s-a dovedit a fi factorul major de
reglare a răspunsului inflamator. (4).

Presupune:
 Asanarea focarului inflamator (începe concomitent cu constituirea barierei fibrino-leucocitare și cu
îndepărtarea resturilor celulare și a eventualelor microorganisme care sunt „agenți determinanți”);
devine maximă după acumularea de leucocite PMN și macrofage.
 Vindecarea propriu-zisă începe relativ rapid în cursul procesului inflamator; vindecarea începe aproape
concomitent cu fenomenele distructive, pe care tinde să le înlocuiască pentru a conduce la una dintre
variantele evolutive menționate anterior.

Varianta cea mai favorabilă este reprezentată de vindecarea completă, anatomică (numită și
„restitutio ad integrum”). Cealaltă posibilitate este reprezentată de evoluția spre apariția unei cicatrici
(cicatrizarea). Cicatrizarea apare în cazul unor inflamații însoțite de fenomene lezionale întinse, pierderi de
țesut și eventual de infecții și cronicizarea infecției.

 Inflamații alterative în care predomină procesele distrofice și necrobiotice (de exemplu în miocardita
difterică sau în miozita produsă de Clostridium spp.);
 Inflamații exsudative în care predomină procesele exsudative și care se pot subîmpărți în inflamații:
o seroase (3-5% proteine, număr scăzut de leucocite, cu eozinofile), de exemplu în pleurezia sau
meningita produse de Mycobacterium tuberculosis;
o fibroase, destul de frecvent rezultate în urma unui proces infecțios, cu acumulare de fibrinogen
care determină apariția fibrinei și formarea de depozite care se organizează și duc la apariția
„aderențelor”, care se organizează (de ex. în pneumonia cu Streptococcus pneumoniae, în
dizenteria bacteriană, în miocardita difterică etc.);
o purulente, produse de exemplu de coci piogeni, precum Streptococcus pneumoniae,
Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis etc., de ex. cu formarea de abcese;
o hemoragice, de exemplu în ciumă (produsă de Yersinia pestis) sau în pneumonia hemoragică
produsă de Bacillus anthracis (extrem de gravă, însoțită de hemoptizie și asociată frecvent cu
pleurezie hemoragică și adenopatie mediastinală importantă).
 Inflamații proliferative, având ca formă particulară granulomul, de aspect nodular (de ex. apărute după
infecții cu Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, diferite specii de Brucella sau datorate
prezenței unui corp străin).

62
 Infecția reprezintă un tip particular de relație între microorganismele condiționat patogene și
patogene pe de o parte și organismul gazdă pe de altă parte. Pentru ca să se declanșeze un proces infecțios
și să apară infecția, microorganismele trebuie să pătrundă în organismul gazdă, să depășească barierele și
mecanismele de apărare, să-l colonizeze, să se multiplice și eventual să intre într-un lanț de transmitere prin
intermediul căruia poate contamina o nouă gazdă.

infecție.Procesul infecțios definește ansamblul relațiilor stabilite între microorganism și gazdă, apărute după

Starea de boală (manifestă clinic sau fără ca modificările apărute să fie exteriorizate și constatabile
de către medicul clinician) se datorește interacțiunii dintre microorganism (bacterie, parazit, virus, fung,
prion) - gazdă și este urmată de apariția unor simptome (de ex. temperatură peste 39ºC, cefalee, eliminarea
unor scaune diareice etc.) și de reacții funcționale din partea gazdei (de ex. stare generală modificată,
senzație de febră, frisoane, creșterea numărului de respirații pe minut, creșterea numărului de bătăi
cardiace pe minut etc). Infecția nu este urmată obligatoriu de starea de boală, putând fi inaparentă,
subclinică sau latentă. Poate apărea și starea de purtător și / sau eliminator de germeni.

Datorită infecției pot apărea, sau nu, manifestări foarte variate în funcție de:

 agentul infecțios (factori de patogenitate, gradul de virulență);

 organismul gazdă (rezistența specifică și nespecifică);
 mediul extern (factori geografici, climatici, sociali, economici etc).

Infecția inaparentă nu se asociază cu semne sau simptome și ar putea fi decelată numai prin
examene de laborator. Spre deosebire de infecția latentă, infecția inaparentă este limitată în timp și poate
contribui la crearea unei stări de imunitate (ex. infecția cu Neisseria meningitidis, infecții cu Haemophilus
influenzae etc).

Boala subclinică se deosebește de infecția inaparentă prin apariția unor tulburări funcționale (febră,
transpirații, dureri etc) și chiar a unor leziuni organice (de multe ori fără o simptomatologie distinctă /
specifică, dar există și situații în care nu este decelat nici un simptom, de exemplu în formele subclinice de
hepatită virală acută).

Infecția latentă este asimptomatică, agenții patogeni putând persista timp îndelungat în țesuturile
gazdei. După un timp variabil, infecția latentă poate deveni evidentă clinic, de obicei în urma acțiunii unor

factori favorizanți externi sau interni, proprii organismului (de exemplu infecția cu Mycobacterium
tuberculosis care este un microorganism condiționat patogen, infectează circa o treime din populația
globului dar produce tuberculoză la circa 8 milioane de persoane, pe an).

Starea de purtător de germeni se referă la bolnavul cu o stare infecțioasă, la persoana aflată în

convalescență, înainte de „eradicarea” infecției suferite dar și la persoanele aparent sănătoase care
adăpostesc germeni patogeni (de exemplu Salmonella typhi la nivelul veziculei biliare, microorganismul
putându-se „cantona” la acest nivel după o febră tifoidă). Starea de purtător reprezintă atingerea unui

63
echilibru relativ între cele două verigi, de multe ori fiind însoțită de eliminarea în mediu a germenilor care au
produs infecția și se află în diferite focare latente (precum în exemplul de mai sus, situație în care starea de
purtător se elimină doar prin extirparea veziculei biliare). De exemplu, în țara noastră apar din când în când
izbucniri epidemice („outbreak”) de febră tifoidă, după inundații, dacă în zona respectivă există un purtător
de S. typhi, iar condițiile igienico-sanitare pentru prevenirea transmiterii pe calea fecal-orală nu sunt
respectate. În cursul stării de purtător există teste biologice și imunologice care pot certifica prezența
microorganismelor (direct, de ex. după cultivare sau amplificare genică și / sau indirect).

În momentul în care un Ag pătrunde pentru prima dată în organism, sistemul imun nu posedă decât
un număr redus de limfocite T sau B specifice recunoașterii porțiunilor peptidice (epitopilor) acestui Ag.
Astfel, dintr-un repertoriu preexistent de limfocite, Ag le va selecta numai pe cele care sunt capabile să
recunoască și să se combine cu Ag. În același timp (cu mici excepții) nu există nici o celulă sau moleculă
capabilă să elimine Ag sau microorganismul care îl poartă, motiv pentru care este necesară apariția
limfocitelor T citotoxice, secretoare de citokine (imunitate celulară) sau a plasmocitelor anticorp-secretante
(imunitate umorală).

Răspunsul imun (RI) include totalitatea evenimentelor care au loc după introducerea unui Ag, și
anume:


activarea limfocitelor,
 eliberarea a diverse molecule,
 multiplicarea celulelor specifice,
 producerea de limfocite T citotoxice sau de anticorpi capabili să se fixeze pe Ag și să participe la
 eliminarea acestuia (direct sau indirect).

După acest prim contact (ca și în cursul imunizării consecutive), sistemul imun produce limfocitele T
și B de memorie, capabile să reacționeze mai rapid, mai amplu, cu ocazia unei reintroduceri ulterioare a
aceluiași antigen.

Așa cum a fost menționat anterior, principala caracteristică a imunității este specificitatea. Pentru a
sugera cât de specific este răspunsul imun, o modalitate este de a discuta despre „potrivirea dintre cheie și
broască”, între structurile Ag și Ac. Acest exemplu are un grad de sugestivitate, dar este incomplet în
comparație cu realitatea. O altă modalitate de a sugera specificitatea răspunsului imun ar fi „potrivirea
dintre mâna așezată în fața oglinzii și imaginea din oglindă”.

Probabil, o modalitate și mai sugestivă ar fi cea discutată la cursurile de imunologie din INCDMI
”Cantacuzino”: răspunsul imun este atât de specific, încât dacă ne-am închipui că Ag este reprezentat de o
pagină dintr-un manual, dacă am schimba nu o frază, un rând, un cuvânt ci chiar o singură literă într-un
cuvânt de pe o anumită pagină, această schimbare ar fi sesizată de sistemul imun iar Ac produși se vor
„potrivi” cu această pagină în care a fost schimbată o singură literă. Totuși, așa cum am menționat la punctul
16. 2. 1., există și reacții încrucișate.

64
 O altă caracteristică foarte importantă a RI, în condiții fiziologice, este capacitatea de a discerne între
self și non-self și de a reacționa numai față de moleculele care îndeplinesc definiția de antigen (vezi și
MHC/CMH).

Răspunsul imun poate fi de tip umoral, mediat prin anticorpi sau de tipcelular, mediat de către
celule. În cazul antigenelor timodependente (cea mai mare parte a antigenelor), se dezvoltă un răspuns imun
celular specific prin LT citotoxice și unul umoral specific prin anticorpi. Diferite citokine pot activa sau inhiba,
în mod preferențial, unul sau ambele tipuri de răspuns. În cazul antigenelor timoindependente, răspunsul
imun este umoral. În continuare vor fi prezentate în mod schematic aceste două tipuri de răspuns imun

umoral și celular.

Răspunsul imun umoral (RIU) constă în producerea de Ac specifici și este transferabil pentru o
perioadă de timp (3-6 săptămâni), prin ser, la un alt animal. Imunitatea umorală intervine în distrugerea
bacteriilor extracelulare, neutralizarea virusurilor, inhibarea toxinelor.

Natura antigenelor față de care se dezvoltă un răspuns imun umoral include poliozide, proteine,
substanțe sintetice, rareori lipide și acizi nucleici sau anticorpi (în cazul proceselor autoimune). Unele
antigene („alergenii”) determină un RI cu anticorpi de tip IgE.

Introducerea antigenului pe cale subcutană, intramuscular sau intravenos determină un RIU cu

producerea de IgM și/sau IgG iar administrarea pe cale orală determină un răspuns preferențial cu IgA.

După o primă administrare intravenoasă , la un subiect care nu a mai venit în contact cu respectivul
antigen, Ag molecular parcurge următoarele etape succesive:

1. descreșterea cantitativă rapidă, datorată difuziei în spațiile extravasculare;

2. dispariția lentă, datorată catabolismului propriu al antigenului;
3. descreșterea rapidă după 8-10 zile, ca urmare a eliminării formațiunilor imune (complexele imune)
rapid fagocitate.

În cazul antigenelor particulate (celule, bacterii, virusuri) sau al antigenelor sub formă de agregate,
eliminarea este mult mai rapidă, prin procesul de fagocitoză (care antrenează o imunizare mai precoce).

În cazul utilizării căii subcutanate, antigenul rămâne, în parte, la locul de inoculare. Adăugarea unui
adjuvant menține antigenul în acest loc și favorizează o stimulare imunologică de durată (eventual și
formarea unui granulom inflamator). În următoarele ore, antigenul migrează în sinusurile subcapsulare ale
ganglionilor corespunzători anatomic, apoi în zona medulară și în final (24 de ore) ajunge în regiunea

corticală, la periferia foliculilor primari. În interiorul organelor limfoide, antigenul se regăsește în celulele
fagocitare. În prezența anticorpilor preformați și a sistemului C', unele antigene se localizează la suprafața
celulelor dendritice intrafoliculare din centrii germinativi. Contactul cu antigenul antrenează importante
modificări histologice ale organelor limfoide: centri germinativi se dezvoltă în foliculi și persistă mai multe
săptămâni; în paralel apar atât imunoblaștii și plasmocitele, cât și limfocitele de memorie; după 3-4 zile se
pot detecta limfocite cu anticorpi membranari, apoi celule care sintetizează anticorpi serici.

65
 Imunitatea poate fi moștenită (trăsătură de specie, se transmite ereditar) și dobândită.

Imunitatea poate fi dobândită activ, după contactul cu un anumit antigen (ex. bacterian).
Evenimentul imunologic poate apărea după o infecție (natural) sau după administrarea unor vaccinuri
(artificial). Avantajul imunității dobândite activ este faptul că, de regulă, protecția este de durată.
Dezavantajul principal este reprezentat de faptul că instalarea răspunsului imun are loc lent, mai ales în cazul
RIP.

Imunitatea poate fi dobândită și pasiv, preluând anticorpi produși de către o altă gazdă. Spre
exemplu, administrarea de anticorpi anti toxină difterică / tetanică / botulinică (artificial) pune la dispoziția
gazdei infectate, imediat, o cantitate importantă de antitoxină, în vederea neutralizării cât mai rapid a
toxinei implicate patogenic. În mod natural, fătul și nou născutul beneficiază de protecție prin intermediul
anticorpilor (IgG transplacentar, IgA prin colostru, lapte) proveniți de la mamă. Avantajul imunității
dobândite pasiv este rapiditatea, în timp ce dezavantajul este reprezentat, pe de o parte, de timpul scurt
pentru care este oferită protecția iar pe de altă parte, de riscurile unei hipersensibilizări, atunci când sunt
utilizați anticorpi provenind de la o altă specie (ex. în cazul administrării de ser recoltat de la cal
hiperimunizat).

Există și posibilitatea dobândirii unei imunități activ - pasiv, atunci când se administrează
concomitent (dar în locuri diferite) ser imun și un vaccin (ex. în suspiciunea infecției cu Clostridium tetani).

Mult timp s-a considerat că cele 2 tipuri de imunitate acționează independent, imunitatea înnăscută
oferind prima linie de apărare împotriva microbilor invadatori, iar imunitatea dobândită intervenind mai
târziu, pentru a elimina infecția. Însă, interacțiunea dintre cele 2 tipuri de imunitate este evidentă :
imunitatea adaptativă profită de abilitatea imunității înnăscute de a distinge între agenții patogeni, microbii
benefici și factorii de mediu.

Cele 2 tipuri de imunitate sunt complementare, în strânsă colaborare (un adevărat exemplu pentru
studenți, medici sau orice membru al sistemului sanitar).

Existența celulelor NK întărește aceste considerente. Conform unor descoperiri recente, celulele NK
au o proprietate esențială, atribuită numai celulelor imunității – memoria; în plus, au fost identificate celule
NK în locuri atribuite în mod clasic imunității adaptative: timus și ganglionii limfatici. (4)

66
Organele limfoide primare, numite și
centrale, sunt situate în afara căilor de acces
și circulație antigenică. În aceste organe
diferențierea apare precoce, în viața
embrionară, înaintea celor secundare.
Proliferarea limfocitară este intensă și
independentă de stimularea antigenică.

Organele limfoide primare au următoarele

roluri:

· permit multiplicarea limfocitelor T

(timodependente) și B (dependente de
măduva roșie hematogenă / bone marrow -
la mamifere).

· găzduiesc primele stadii de diferențiere, până la limfocitele T sau B mature, apte să recunoască
structurile antigenice și să fie stimulate de antigene.

· efectorii imuni „învață” la acest nivel să recunoască și să tolereze constituenții propriului organism
(auto-recunoaștere și toleranță față de „self”).

Un limfocit T sau B matur care a părăsit timusul, respectiv măduva osoasă hematogenă, nu mai revine
niciodată la acest nivel, cele două organe fiind în afara căilor de recirculare a limfocitelor antigen-specifice
din organele limfoide secundare.

Timusul este un organ situat în mediastinul anterior și superior, retrosternal, format din doi lobi uniți
printr-un istm median. Fiecare lob este format din lobuli compartimentați de septuri derivate din capsula
organului. Lobulul timic este alcătuit din 2 zone: corticală (la exterior) și medulară (la interior). Inițial se
dezvoltă zona corticală.
Greutatea sa variază cu vârsta (este bine dezvoltat la făt, greutatea crește până la pubertate -
dezvoltarea maximă se realizează la vârsta de 10-12 ani, apoi suferă o involuție lentă, fără să dispară total).

Rolul timusului se manifestă local și la distanță:

 rolul local, constă în transformarea limfocitelor nediferențiate în limfocite T mature, cu achiziția de


receptori pentruse
rolul la distanță antigene (TCR).
realizează prin factorii timici peptidici umorali (timostimulina, timopoietinele,
timozinele, factorul umoral timic etc.

Transformarea celulei stem în limfocit B matur are loc în măduva osoasă hematogenă (bone
marrow, LB). La copii, rolul de organ limfoid primar este asigurat atât de măduva din oasele late cât și din
oasele lungi; ulterior, măduva de la nivelul oaselor lungi este înlocuită cu țesut adipos, care mai târziu se
67
fibrozează, iar măduva activă rămâne la nivelul oaselor late (stern, coxal, coaste, vertebre). Transplantul de
măduvă osoasă hematogenă restaurează imunitatea umorală, ducând la dispariția perturbărilor.

Dintre funcțiile măduvei osoase hematogenă în imunitate amintim:

 menținerea unui procent de celule stem cu diferențiere spre linia limfocitară și primele stadii ale
seriei T și B;
 maturarea și diferențierea completă a limfocitelor B în celule B mature, apte să colonizeze organele
limfoide secundare.

Dezvoltarea organelor limfoide secundare, numite și periferice sau efectoare, este tardivă față de
cea a organelor limfoide primare, atingând dezvoltarea deplină numai după stimularea antigenică. Amintim
ca exemple de organe limfoide secundare: ganglionii limfatici, splina și organele limfoide atașate sistemului
digestiv (apendice, amigdale, plăci Peyer) etc. La nivelul acestor organe se cantonează limfocitele T provenite
din timus și limfocitele B provenite din măduva osoasă hematogenă, migrate pe calea torentului circulator.
În organele limfoide secundare, aceste celule se vor activa în urma contactului cu antigenele.

În anumite zone ale organelor limfoide secundare, precum cele din ganglionii limfatici sau din splină,
se găsesc grupuri de celule, constituite în special din limfocite B, denumite foliculi sau noduli limfatici.
Înaintea stimulării antigenice, acești foliculi primari sunt în repaus, cu limfocite mici apropiate unele de
altele, determinând un aspect dens, caracteristic. Aceste limfocite mature sunt denumite „naive”, deoarece
nu au avut contact cu antigenul. După circa 3-6 zile de la stimularea antigenică, foliculii primari se transformă
în foliculi secundari, cu un centru germinativ clar, înconjurat de o zonă mai întunecată. În jurul foliculului
există o zonă marginală puțin vizibilă, constituită din limfocite B cu memorie. Foliculul secundar persistă
câteva săptămâni după care redevine folicul primar.

Ganglionii limfatici (nodulii limfatici) reprezintă structuri imune, organizate, situate la „intersecțiile”
traseelor limfatice. Au următoarele roluri:

 colectează structurile antigenice care traversează teritoriul vaselor limfatice aferente (libere sau captate
de macrofage și/sau de celulele dendritice);
 induc un răspu ns imun față de antigenele de tip celular, în regiunea paracorticală (dând naștere la
limfocite T specifice) sau față de antigene de tip umoral, în foliculii limfatici cu limfocite B active,
maturate în măduva osoasă hematogenă și
 stochează informațiile im une datorită limfocitelor cu memorie dar au rol și în diseminarea răspunsului
imun prin circulația limfocitelor pe calea traseelor limfatice eferente, către torentul circulator și ulterior
spre alte teritorii ganglionare, splenice, digestive sau respiratorii.

Splina este cel mai mare organ limfoid secundar, având însă și alte funcții:

 joacă rolul unui „filtru” care în mod nespecific îndepărtează/elimină complexele antigen-anticorp
circulante, diferite microorganisme, eritrocite parazitate (ex. cu Plasmodium spp., Babesia microti);
 are o eficiență remarcabilă în îndepărtarea/eliminarea microorganismelor slab opsonizate precum și
celor capsulate (ex. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis,
Capnocytophaga spp .);
68
 eliminarea hematiilor degradate, îmbătrânite;
 reglarea volumului sângelui etc.

Căile respiratorii, tractul digestiv și cel uro-genital sunt înconjurate pe toată lungimea lor de țesut
limfoid difuz (sau nodular), bogat în limfocite B și plasmocite care secretă sIgA. Datorită particularităților
funcționale, MALT se subdivide în:

 Sistemul imunitar nazo-faringian (NALT - nasopharynx associated lymphoid tissue) reprezentat de inelul


lui Waldeyer
Sistemul cu diferitele
imunitar asociat amigdale (palatine,
tubului digestiv faringiană,
(GALT linguale)lymphoid
- gut associated și structuri adenoide.
tissue ) cuprinde plăcile Peyer
și formațiunile limfoide ale apendicelui (secretă IgA), limfocitele intra-epiteliale și limfocitele sub-
epiteliale.
 Sistemul imunitar asociat arborelui bronșic (BALT - bronchus associated lymphoid tissue);
 Sistemul imunitar asociat căilor uro-genitale, prezent în special la nivelul vaginului;
 Sistemul imunitar asociat glandelor mamare (mammary associated lymphoid tissue).

Toate celulele sistemului hematopoietic intervin, în diferite măsuri, în imunitate. Așa cum am
menționat anterior, aceste celule acționează ca niște adevărați „soldați” (de ex. LT citotoxice, celulele NK),
care pot avea atât o activitatea efectoare cât și de control și retro-control („depășindu-și condiția” de „simpli
ostași”).

 Limfocitele T și B suntelementele centrale ale răspunsului imun specific.

 Celulele NK sunt celule fundamentale (alături de fagocite) în imunitatea înnăscută.
 Monocitele / macrofagele, neutrofilele, eozinofilele, bazofilele și mastocitele acționează în diferite
momente ale răspunsului imun.
 Plachetele sanguine intervin în lupta anti-parazitară iar globulele roșii participă la eliminarea
complexelor imune.

Celule pot reacționa în mod nespecific, indiferent de natura agentului agresor (ex. granulocitele
PMN, eozinofilele, bazofilele, mastocitele, monocitele, macrofagele, celulele dendritice etc) sau pot participa
la o reacție specifică, condiționată de structura moleculelor antigenice, prin intermediul receptorilor (ex.
limfocitele).

Limfocitele T sunt majoritare în circulația sanguină, reprezentând circa 70% din totalul limfocitelor
[2/3 sunt LT4 (CD4+) și 1/3 sunt LT8 (CD8+)].

Limfocitele T sunt localizate la nivelul organelor limfoide secundare în zone speciale: zona
paracorticală a ganglionilor, manșonul limfoid în jurul arterelor centrale splenice.

Limfocitele T sunt implicate în principal în imunitatea mediată celular. Pe de o parte participă la

eliminarea structurilor străine dar și a structurilor proprii modificate (prin îmbătrânire, în urma unei infecții,

69
cu multiplicare neoplazică) iar pe de altă parte cooperează cu limfocitele B în răspunsul imun umoral. De
fapt, funcțiile exercitate de LT sunt mult mai complexe.

Cea mai importantă funcție a limfocitelor T este inducerea unui răspuns sau a unei reacții imune
specifice la antigene, prin recunoașterea unor peptide antigenice fixate pe moleculele MHC (complex major
de histocompatibilitate). În acest scop pe limfocitul T există un receptor pentru antigen (TCR), asociat
întotdeauna cu un complex molecular transductor CD 3.

Linia limfocitară T se maturează în două organe: (a) măduvă osoasă și (b) timus.

Din celula stem

hematopoietică multipotentă (CD34+,
CD38-), prima diferențiere conduce la
apariția CFU-L (colony forming unit-
lymphocyte) comună limfocitelor T și
B (CD34+, CD45RA+, CD10+) din care
rezultă protimocitul. Protimocitul
părăsește măduva roșie hematogenă
și se cantonează în corticala timică.
Maturizarea timocitelor nu a

putut fi studiată la om, astfel încât datele

se obțin prin extrapolarea informațiilor
obținute experimental, la animale de
laborator. Protimocitele și apoi timocitele
imature se găsesc în corticala timică (subcapsular), în contact cu celulele epiteliale și cu macrofagele (rare) de la acest
nivel. Aceste celule tinere au o capacitate foarte mare de multiplicare. Se deplasează prin cortex spre joncțiunea
cortico-medulară și vin în contact cu celulele dendritice și cu macrofagele. La acest nivel are loc o nouă multiplicare
relativ intensă. Este de remarcat faptul că în cursul acestui proces, doar 1-5% din celulele tinere ajung limfocite T
mature. Restul, de cel puțin 95% din celule, mor prin apoptoză.

70
 Limfocitele T ajutătoare (T helper, CD4+) (LTh/Th)
 Limfocitele T citotoxice (Tc, CD8+)
 Limfocitele T inductoare ale hipersensibilității întârziate
 Limfocitele T supresoare (Ts, CD8+)
 Limfocitele T γδ (γδ T cells)
 Limfocitele T NK (NKT cells)

Limfocitele B reprezintă 5% până la 15% din limfocitele din sânge (300 până la 600 elemente/mm 3) și
constituie majoritatea celulelor din foliculii limfatici, ganglioni și splină. Rolul lor esențial este sinteza
anticorpilor, în cursul RIU specific. Au fost denumite astfel deoarece s-a descoperit că la păsări LB se
dezvolvă în bursa lui Fabricius. La om LB se dezvoltă în măduva osoasă hematogenă (bone marrow).

Limfocitele B provin (la om și la mamifere) din celulele stem hematopoietice (CD34+, CD38-). Toată
linia limfocitară B (celule imature sau mature) are markeri specifici de suprafață CD19 și CD20, utilizați
pentru identificarea celulelor B (ex. în citometria în flux); identificarea prin aceeași metodă a markerului
CD10 permite încadrarea în stadiul de limfocit matur.

Limfocitul B părăsește măduva osoasă și trece în „zonele B” din organele limfoide secundare (ganglioni
limfatici, splină etc). LB „naiv” (virgin) este pregătit pentru a răspunde stimulului antigenic, deși se găsește în
stare de repaus, în așteptarea primei stimulări antigenice.

Transformarea unui LB naiv într-un LB activ și apoi în plasmocit necesită intervenția succesivă a
citokinelor (ca într-o „cascadă”).

71
 Activarea are loc datorită recunoașterii antigenice dar și datorită secreției de IL-1 de către celula
prezentatoare de antigen (APC) și respectiv secreției de IL-4 de către Th2.

Limfocitul B are următoarele funcții:

1. Prezentarea antigenelor către LT;

2. Sinteza imunoglobulinelor (anticorpilor).

Monocitele / macrofagele reprezintă o linie celulară cu funcție importantă în imunologie, prin

intervenția lor în imunitatea naturală, în prezentarea antigenică și în reacția imună specifică. Principalele
funcții ale sistemului MM sunt reprezentate de:
 recunoașterea structurilor străine (non-self) sau modificate,
 fagocitarea, prelucrarea și prezentarea acestora (în context MHC),
 citotoxicitate, citostatism,
 secreție a diferitelor molecule (ex. IL-1, TNF-α) și
 reglarea reacțiilor în cadrul răspunsului imun.

Macrofagele, alături de celulele dendritice și celulele epiteliale, formează sistemul reticulo-histiocitar

(SRH).

Macrofagele pot fi observate în toate țesuturile. Se formează în măduva osoasă hematogenă, dintr-
un precursor comun monoblast-mieloblast și când devin mature poartă numele de monocite. În acest stadiu,
moleculele MHC II fie nu există fie sunt slab exprimate, ca semn al unui status funcțional redus (devin foarte
bine reprezentate după stimulare).

Monocitele
îndeplinesc circulă în
funcții diferite: sânge 6-8
histiocite ore, după
în țesutul care migrează
conjunctiv; celuleîn țesuturi
gliale unde iau
(microglii) nume diferite
în țesutul nervos;și
osteoclaste; macrofage alveolare pulmonare; celule Kuppfer în ficat; macrofage splenice; macrofage
peritubulare în rinichi; macrofage ganglionare, în măduva osoasă și timus (macrofagele din aceste organe nu
trebuie confundate cu celulele dendritice, care pot avea, la rândul lor, o capacitate fagocitară față de
limfocitele în apoptoză).

Monocitele / macrofagele prezintă receptori pentru carbohidrați, receptori pentru M-CSF, receptori
pentru imunoglobuline și complement.
72
 În cadrul procesului de recunoaștere, fagocitare și prelucrare a structurilor străine sau a structurilor
proprii modificate, spre deosebire de PMN care distrug complet structurile fagocitate, sistemul MM produce
un anumit grad de distrugere, cu conservarea grupărilor specifice, necesare stimulării răspunsului imun.

Sunt cele mai abundente granulocite din circulația periferică.

Neutrofilele intervin în:

 imunitatea naturală prin fagocitoză și
 imunitatea specifică, datorită receptorilor proprii pentru
imunoglobuline și complement, în colaborare cu limfocitele și alte
APC.

Eozinofilele reprezintă în mod normal între 1% și 3-5% din

leucocitele sanguine. Procentul eozinofilelor crește în alergii sau în
infecțiile parazitare.

Funcția lor fagocitară, prin receptorii de IgG și IgE și mecanismul

ADCC, este relativ limitată. Totuși, eozinofilele pot fagocita fungi,
complexe Ag-Ac, bacterii. Granulele lor conțin produși toxici pentru

diferiți paraziți.

Conțin granule
metacromatice și receptori
pentru IgE. Au rol în reacția de
hipersensibilitate mediată
umoral (tip I). Principalul
mediator în declanșarea HS de
tip I este histamina.

Ambele sunt implicate

în apărarea anti-parazitară.

Mastocitele nu se găsesc în cantitate mare în sânge, dar sunt întâlnite la nivelul țesuturilor
conjunctive în apropierea vaselor sanguine și limfatice, aproape de sau în interiorul nervilor și sub epiteliile
organelor care vin în contact cu mediul extern (plămân, intestin, piele).

73
 Bazofilele se diferențiază și maturează în măduva osoasă hematogenă, apoi circulă prin sânge. Atât
bazofilele cât și mastocitele secretă citokine dar spre deosebire de mastocite, bazofilele secretă și IL-4. A fost
studiat un eventual rol în diferențierea limfocitelor helper spre linia Th2 (proces care necesită IL-4).

Plachetele au un rol accesoriu în reacția imună. Ele conțin serotonină și exprimă receptori pentru IgG
și IgE. Plachetele aderă la endoteliul vascular, se agregă și eliberează substanțe care cresc permeabilitatea
capilară și activează sistemul complement.

Alături de rolul principal de a transporta oxigenul la țesuturi și bioxidul de carbon la plămâni,

globulele roșii dețin receptori pentru sistemul complement, facilitează transportul complexelor imune din
sânge la celulele Kuppfer din ficat, prin fixarea lor pe receptorii pentru complement.

Complementul, un complex multienzimatic format

din circa 30 de componente, reprezintă unul dintre
principalii constituenți ai apărării naturale, ai imunității

umorale și respectiv
imune survenite un element
ca urmare important
a formării al reacției
complexelor antigen-
anticorp (are rol esențial în răspunsul inflamator). Sistemul
complement (C') reprezintă o componentă normală a
serului.

Sistemul complement are o serie de funcții

importante: apărarea nespecifică împotriva infecției (liza
virusurilor, liza bacteriilor, liza celulelor străine, favorizarea
prin opsonizare a fagocitozei, chemotactism pentru PMN și
sistemul MM etc); eliminarea complexelor imune și a
celulelor apoptotice; reglarea fiziologică a RI, dar participă
și la creșterea permeabilității capilarelor, stimularea
contractilității musculaturii netede etc. În cele mai multe împrejurări, sistemul complement are efecte
benefice; totuși sunt de menționat și unele efecte negative (ex. participă la reacțiile anafilactice, este
implicat în hipersensibilitatea citolitică-citotoxică etc).

Sistemul complement cuprinde circa 30 de componente celulare sau plasmatice. Componentele sale
suntsintetizate de hepatocite, macrofage, celule epiteliale intestinale etc. Substanțele activatoare reprezintă
5% din suma proteinelor serice (circa 3 g/l); componenta C3 este componenta care se găsește în cantitatea
cea mai mare (circa 1,3 g/l). (Tabelul nr. 1)

Sistemul C' se poate activa pe trei căi, respectiv calea clasică, calea lectinică și calea alternă.

74
 Componentele C' se găsesc în ser, în stare inactivă. Pentru a declanșa activarea lor este necesar un
stimul. Pentru calea clasică, punctul de pornire este reprezentat de către complexele antigen-anticorp, unde
anticorpii sunt de tip IgM (domeniul CH4) sau de tip IgG (domeniul CH2) corespunzând subclaselor IgGl, IgG2
sau IgG3. Complementul poate fi activat de o singură moleculă de IgM sau de către două molecule de IgG
apropiate una de alta. Activarea este posibilă și în cazul unor molecule de IgG agregate.

C1. În sângele circulant există un

complex plurimolecular ce conține o
moleculă de C1q (moleculă ce aparține
familiei colectinelor, precum MBL), două
molecule de C1r și două molecule de C1s,
situate în jurul ionilor de calciu și asociate
inhibitorului C1, denumit C1inh.

C4 este fragmentat în C4a, moleculă mică, cu activitate anafilactoidă și respectiv C4b, de dimensiuni
mai mari, care se leagă printr-o legătură covalentă fie de fragmentul Fab al anticorpului fie la nivelul
peretelui bacterian sau la nivelul unor celule (străine, proprii modificate, infectate etc). Ansamblul formează
complexul C1-C4b, notat pe scurt C14b.

C2. Aceeași esterază (C1s) împreună cu fragmentul C4b, clivează o moleculă de C2 în C2b (o
moleculă mică, cu activitate de tip kinină) și în C2a (molecula de dimensiune mai mare, care se leagă de
structura țintă). Ansamblul necesită prezența Mg2+ și formează C3 convertaza căii clasice sau C4b2a. În acest
moment, anticorpii și respectiv componenta C1 pot să se detașeze de structura țintă, iar procesul poate
continua.

C3 este clivată în C3a și C3b de către C4b2a. C3a este o moleculă mai mică și are, în mod primordial,
o activitate anafilactoidă și chimiotactică, în timp ce subcomponenta C3b se fixează pe structura țintă
datorită unei punți realizate între un radical tioester și o grupare (-OH) sau (-NH2) de pe suprafața celulară
acceptoare. C3b format permite constituirea C5 convertazei (C4b2a-C3b) pe calea clasică.

Calea alternă constituie una dintre primele linii de apărare a organismului față de un agent patogen,
înaintea constituirii răspunsului imun.
Calea alternă poate fi activată de complexele imune care cuprind IgG sau IgA.

C3. În plasmă, prin proteoliza spontană a C3, sunt formate în permanență mici cantități de C3b.
Moleculele de C3b se fixează de suprafețele acceptoare, în particular de peretele microorganismelor sau de

75
celulele infectate și alterate. Câteva bacterii, a căror structură este bogată în acid sialic, pot evita acțiunea
sistemului complement. La rândul său, C3b acționează asupra factorului B.

Factorul B. Element al căii de amplificare, factorul B este clivat în Ba și Bb. Complexul C3bBb, format
în prezența ionilor de Mg 2+, constituie C3-convertaza alternativă, care clivează noile molecule de C3 în C3b.
Acest clivaj accelerat de C3, dă naștere C5-convertazei (C3bBb)n.

Factorul D, factor prezent sub formă activă în ser înainte de activarea C’, clivează factorul B, ceea ce
facilitează formarea complexului C3bBb.

Ansamblul factorilor activatori ai căii clasice și alternative realizează o buclă de amplificare, care
permite transformarea numeroaselor molecule de C3 în C3b astfel încât C3b să acopere (opsonizeze)
peretele bacterian.

Interacțiunile între celulele imunitare se realizează prin două mecanisme complementare:

 contactul celular strâns, care necesită prezența moleculelor de adeziune (direct);

 prezența factorilor stimulatori, citokine, secretate de una din cele două celule aflate în contact sau,
uneori, de o celulă aflată la distanță (indirect).

76
 Rezultatul va fi activarea sau inhibarea funcției celulare, ca urmare a transportului informației prin
mesagerii secunzi spre organitele intracitoplasmatice, membrana celulară sau genele nucleare.

Citokinele sunt substanțe proteice, solubile, cu greutate moleculară mică, 8-70 kDa. cel mai frecvent
sunt sintetizate de către celule după activare prealabilă, acționând ca mediatori asupra altor celule sau
asupra lor însăși, în cantități foarte mici, de ordinul pico sau nanogramelor. În momentul de față au fost
identificate peste 100 de molecule diferite de citokine. O parte dintre citokine au în special efecte
„chemotactice” și din acest motiv au fost numite chemokine.

În cadrul procesului infecțios, diferitele microorganisme care au sau dobândesc prin variabilitate un
efect de agresiune față de organismul gazdă, antrenează un răspuns la nivelul endoteliului vascular; una
dintre primele reacții este reprezentată de mobilizarea leucocitelor polimorfonucleare neutrofile (PMN). În
această etapă intervin și o serie de citokine.

În această categorie sunt cuprinse mai multe interleukine.

 Spre exemplu interferonul a și β. IFN-a este produs de monocite și celulele hematopoietice iar IFN-β
este produs de alte celule de tipul fibroblaștilor și al celulelor endoteliale.
 IL-2, cu efect autocrin și paracrin, a fost prima interleukină utilizată în terapia cancerului

Citokinele cu rol în răspunsul imun celular au ca sursă de proveniență limfocitele Th1. În această categorie
sunt incluse următoarele citokine.

 IL-2 este produsă în special de LT CD4+ de tip Th0 și Th1 (cu rol în RIP de tip celular)
 IFN-g este produs de limfocitele Th1; sursa esențială pentru această interleukină este reprezentată
de celulele NK. Rolul principal al IFN-g este activarea macrofagelor.

 Activarea LyB prin antigene T-dependente:

o APC foliculare + LyB

o APC medulare + LyTh0 -> LyTh2 LyB + LyTh2 -> Activarea LyB

 Activarea LyT:

o APC + LyTh0 -> LyTh1/2/17

o

o
APC
LyTc ++ Celule
LyTc-> Infectate
Activare (Fas-FasL)
LyTc -> Inducere Apoptoză

 Activarea LyTh

• MØ + LyTh0 -> LyTh1 (IL-12, IL-18, TNFa, TNFb)

• MØ + LyTh0 -> LyTh2 (IL-4, acțiune autocrină)

77
• MØ + LyTh0 -> LyTh17 (IL-1, IL-6, IL-23)

• LyTh1 + LyTc -> Activare LyTc (IL-2)

• LyTh1 + MØ -> Activarea MØ (IFN-g)

• LyTh2 + LyB -> Activare LyB (IL-4)

• LyTh2 + LyB -> Switch al izotipului Ac LyB (IL-6)

78
 După pătrunderea antigenului și recunoașterea acestuia ca non-self urmează fagocitarea și
prelucrarea de către celulele prezentatoare de antigen care sunt reprezentate în principal de celulele
dendritice foliculare, macrofage și limfocitele B.

APC, prin IgM și IgD membranar, posedă tot ce este necesar pentru recunoașterea epitopilor
antigenici (diversitatea rearanjării genice demonstrează un repertoriu bogat de limfocite B, estimat la 10 7
posibilități; mutația somatică conduce la posibilități mult mai mari de diversificare).

Pentru majoritatea antigenelor (în special cele de natură proteică), activarea și etapele următoare
ale RIU necesită prezența limfocitelor Th CD4+ (cu intervenția TCR, APC cu expunerea pe MHC II de peptide
antigenice, molecula CD4 și moleculele de aderență).

După contactul cu antigenul și activarea completă, LTh se vor numi LThp (primitive), care ulterior
vor începe proliferarea și sinteza de IL2. Prin stimulări autocrine repetate LThp se vor diferenția în LTh0 și
apoi în LTh1 sau LTh2 în funcție de mediul citokinic din jur și de citokinele produse (vezi și 11.3.1. ).

Limfocitele Th2 sunt reprezentative pentru RIU. LTh2 secretă IL-2, IL-4, IL-5 și IL-6, care activează LB
și stimuleaza mecanismul de „switch” izotipic în genomul LB. Acest „switch” se realizează prin rearanjarea
ADN-ului, pentru sinteza Ac diferiți structural, dar cu aceeași specificitate pentru antigen.

Limfocitele B pot fi activate și direct, în cazul antigenelor timoindependente de srcine

polizaharidică, cu epitopi repetitivi. Aceasta se realizează prin formarea unor punți între receptorii de
suprafață și determină redistribuția Ig pe suprafața membranei celulare. În lipsa interleukinelor produse de

LT, activarea LB este limitată la sinteza de IgM, fără „comutarea” spre IgG.
Prima etapă constă în activarea limfocitelor B din stadiul G 0 al ciclului celular spre stadiul G 1 (celula
sintetizează ARN și crește în volum); stimulul este reprezentat de contactul cu antigenul.

IL-4, secretată de limfocitele Th, poate transforma limfocitele B din stadiul G0 și G1 și crește expresia
moleculelor MHC. În acest stadiu LB activat exprimă molecule noi: CD23, CD34 și CD40.

Al doilea timp corespunde proliferării policlonale a celulelor B activate, care trec din stadiul G 1 în
fazele S și M. Această fază necesită prezența IL-2 și IL-5.

Ultima fază constă în diferențierea în celule producătoare de anticorpi - plasmocite; secreția de IL-6
ajută procesului de maturizare iar diferitele interleukine permit orientarea izotipică spre sinteza unei clase
particulare de imunoglobuline.

Așadar, există o intensă colaborare între LB, LTh și APC atât prin contact direct cu ajutorul unor
molecule de adeziune, cât mai ales prin intermediul citokinelor, adevărați mesageri (”hormoni”) ai imunității.

79
 Teoria selecției clonale a fost propusă în jurul anului 1950 de
către McFarlane Burnet. Această teorie afirmă că la nivelul sistemului
imun există un număr imens de „capi” de clone de limfocite, fiecare
dintre acești „capi de serie” corespunzând unei structuri antigenice (unui
anume epitop); în cadrul aceleași teorii, Burnet a făcut estimarea că în
lume ar exista circa 100 de milioane de tipuri de epitopi diferiți. Clona,

așa cum se cunoaște, este o populație de celule identice din punct de

vedere genetic, descendente ale unei singure celule „mamă”.

Toate celulele unei anumite clone au la suprafață, molecule

identice cu structură imunoglobulinică; aceste imunoglobuline au rol de
receptori pentru structurile antigenice (pentru fiecare antigen diferit
există un receptor diferit).

Structurile antigenice „selectează” din acest număr imens de

limfocite „cap de serie” pe acelea care au receptori complementari
(configurație spațială etc) și astfel determină proliferarea și diferențierea
lor în celule producătoare de anticorpi. Celulele unei clone au aceeași
specificitate pentru structura antigenică datorită căreia au proliferat.

Clonele de limfocite care ar putea să producă anticorpi față de

structurile proprii („self”) sunt reprimate în timpul vieții intra-uterine și
numai celelalte clone pot ajunge la maturitate. În lipsa acestei represii
apar boli autoimune grave, potențial fatale.

Înaintea primului contact cu un anumit antigen, nu există anticorpi „potriviți” față de acesta.
Stimulul antigenic primar „selectează” LB care au receptori pentru respectivul Ag. După primul contact cu Ag
se dezvoltă RIP, cu următoarele caracteristici:

 Latența: reprezintă perioada de la contactul cu Ag până la prezentarea structurilor Ag către LB (în

conjuncție cu moleculele MHC); variază în funcție de natura antigenului, calea de administrare și doza
administrată; durează între 2 și 3 zile;
 Creșterea logaritmică: (sinteză activă de Ac, de către plasmocite) durează circa 3 zile; în timpul acestei
perioade, Ac devin decelabili prin reacții Ag-Ac; urmează o fază de stagnare (câteva zile), timp în care
titrul anticorpilor serici se menține relativ constant;
 Ulterior are loc scăderea progresivă a titrului anticorpilor serici.

De regulă, tehnicile imunologice uzuale permit identificarea Ac după 5-14 zile de la stimulul antigenic
primar.

80
examinarea claselor de anticorpi produși arată că primii anticorpi care apar sunt de tip IgM (cei din clasa IgG
apar câteva zile mai târziu iar nivelul lor crește pe măsură ce nivelul IgM scade);

în următoarele 2-3 săptămâni, în ser predomină anticorpii de tip IgG;

în următoarele luni, eventualii anticorpi care persistă sunt de tip IgG.

Răspunsul imun secundar apare după al doilea contact cu același antigen (sau după contacte ulterioare). RIS
are următoarele caracteristici:

· poate apărea chiar și după administrarea unor doze destul de mici de antigen;

· latența este redusă la circa 24 ore; se ajunge repede, abrupt la faza de creștere logaritmică;
· anticorpii sunt de tip IgG;

· titrul Ac produși este mult mai înalt;

· persistența acestora este mai lungă (Ac produși se mențin timp mai îndelungat, luni de zile).

Diferența dintre RIP și RIS este datorată în primul rând existenței limfocitelor cu memorie. După eliminarea
Ag, în organism continuă să „circule” celule cu memorie, reacția imună la al doilea contact cu același Ag
având caracteristicile de mai sus. Memoria imună se stabilește din timpul RIP și este specifică.

Determinarea claselor IgM și IgG are o dublă importanță practică:

· face posibilă distincția între o afecțiune recentă și una mai veche și

· permite recunoașterea unei infecții congenitale (cu anumite excepții).

Cunoașterea caracteristicile RIP și RIS are importanță practică. Ne permite să înțelegem și motivul pentru
care reacțiile Ag-Ac trebuie făcute, de regulă, „în dinamică”.

Pornind de la observațiile și experimentele lui Edward Jenner, Louis Pasteur a fundamentat științific
vaccinurile alcătuite din corpi microbieni. Gaston Ramon a pus la punct metodele de neutralizare a toxinelor
și a identificat utilizarea lor ca „anatoxine”.

Vaccinul este 1. o suspensie de microorganisme (bacterii, virusuri) vii atenuate sau inactivate sau 2.
cuprinde fracțiuni din microorganisme (subunități), în vederea stimulării mecanismelor de răspuns imun, de
regulă pentru prevenirea apariției unor infecții.

Vaccinarea este definită drept o metodă profilactică, care urmărește creșterea rezistenței specifice a
unei gazde, printr-o imunizare activă, cu stimularea răspunsului umoral sau celular, după caz. De fapt,
vaccinările incluse în programele naționale de vaccinare (conform recomandărilor Organizației Mondiale a
Sănătății, OMS) reprezintă metodele profilactice cu cel mai bun raport între cost și eficiență, în comparație
cu orice altă metodă cunoscută.

Strategiile de vaccinare au în vedere mai multe aspecte, inclusiv statusul imun al gazdei respective
(imunocompetentă sau imunodeprimată).

81
 Unele vaccinuri se pot administra și în timpul unei izbucniri epidemice („outbreak”) sau a unei
epidemii, pentru prevenirea apariției de cazuri noi și scurtarea duratei epidemiei.

Există și posibilitatea administrării unor vaccinuri în scop curativ, gazda fiind deja infectată în
momentul inoculării (ex. vaccin HBV la persoanele cu hepatită cronică, cu HBV).

care se dorește a fi prevenită, vaccinurile pot fi bacteriene sau virale.

Vaccinuri corpusculare (bacteriene, virale), incluzând, după caz, corpi vii atenuați sau distruși
(inactivați) prin acțiunea unor factori fizici (ex. căldură) sau chimici (ex. mertiolat de sodiu). Vaccinul BCG
conține bacterii vii atenuate, stimulează RIC și se administrează pentru a preveni tuberculoza. Vaccinurile
poliomielitic (Salk) sau hepatitic A includ virusuri omorâte. Vaccinurile poliomielitic (Sabin), rujeolos,
rubeolos conțin virusuri vii, atenuate și stimulează RIU și răspunsul imun la poarta de intrare.

Vaccinurile subunitare, preparate prin inginerie genetică, au un grad superior de siguranță (vaccin
hepatitic B, vaccin pertussis acelular).

Vaccinurile care conțin anatoxine bacteriene, purificate și adsorbite pe suport mineral (DTP conține
anatoxină tetanică și difterică plus corpi de Bordetella pertussis omorâți, DT, dT, ADPA, ATPA/VTA).

Vaccinuri monovalente (rujeolos/VVR, rubeolos, hepatitic A, hepatitic B, pertussis acelular, BCG etc),

Vaccinuri asociate, care conțin amestecuri de antigene (DTP, DT, dT, rujeolos-rubeolos etc).

Imunoglobulinele sunt glicoproteine cu rol de anticorpi. Imunoglobulinele există în plasmă, lichid

interstițial și secreții și au capacitatea de a recunoaște și de a se combina specific cu antigenul inductor al
răspunsului imun. Lor li se adaugă proteinele patologice cu aceeași structură dar fără activitate de anticorpi.
Termenul de imunoglobuline (Ig) îl înlocuiește pe cel de gama-globuline. Acest termen nu este corect,
deoarece nu toți anticorpii migrează electroforetic în regiunea „gama”.

Toți anticorpii sunt imunoglobuline. Imunoglobulinele pot fi anticorpi, dar au și alte roluri.

Denumirea de anticorp se pare că a fost dată pentru substanțele „împotriva corpilor” bacterieni,
ceea ce nu este corect, deoarece există anticorpi și față de alte structuri (inclusiv împotriva structurilor
proprii, în bolile autoimune) sau chiar și în cazul bacteriilor, pot exista anticorpi diferiți față de structuri
diferite ale aceleași bacterii (ex. anticorpi față de cele peste 90 de tipuri capsulare ale Streptococcus
pneumoniae).

82
 Structura de bază a unei Ig monomer (ex. IgG1) cuprinde două lanțuri grele identice și două lanțuri
ușoare identice, legate între ele prin punți disulfurice: două punți între cele două lanțuri grele (în cazul IgG1)
și o singură punte între fiecare lanț greu și ușor.

Fab: prima jumătate a

lanțului greu și întregul lanț ușor,

legate între ele printr-o punte
disulfurică, obținute sub acțiunea
papainei, prin scindarea înaintea
regiunii balama, cu un singur situs
de legare;

F(ab’) 2: cele două fragmente Fab și regiunea balama, care rezultă după acțiunea pepsinei, constituie
un fragment superior celor două fragmente Fab și conține două situsuri de legare;

Fc: jumătățile terminale ale celor două lanțuri grele unite prin punți disulfurice la nivelul regiunii
balama;

pFc’: cuprinde fragmentele peptidice rezultate după acțiunea pepsinei, cu întregul domeniu CH3
situat după aminoacidul 333 al lanțului greu;

Fd: corespunde primei părți a lanțului greu după acțiunea papainei, cu formarea fragmentului Fab, și
după reacția de reducere-alchilare, pentru a extrage lanțul ușor;
Fv: corespunde părților variabile ale lanțului greu și lanțului ușor (VH+VL).

Pentru Ig, noțiunea de domeniu se regăsește la lanțurile grele în 4 exemplare (IgG, IgA, IgD) sau 5
exemplare (IgM, IgE) și la lanțurile ușoare în 2 exemplare. Terminologia utilizată este următoarea:

VH - pentru fragmentul greu variabil ( variable heavy), comună tuturor claselor și subclaselor cu
aceeași specificitate.

CH 1, CH 2, CH 3 și CH 4, - pentru fragmentul greu constant ( constant heavy), care conține

diferențele pentru fiecare clasă și subclasă; de exemplu pentru IgG1 există fragmentele Cg11 , Cg12 și Cg13 și
pentru IgM, fragmentele Cm 1, Cm2, Cm3,Cm4.

VL pentru fragmentul ușor variabil (variable light), diferit pentru lanțurile kappa și lambda: Vk și Vl.

CL pentru fragmentul ușor constant (constant light), cu un singur lanț Ck și patru Cl funcționale.

Domeniile variabile VL și VH formează locul unde anticorpul se cuplează cu determinantul antigenic

(epitop). Fața interioară a situsului anticorpului (situs combinativ) vine în contact direct cu epitopul și se
numește paratop. Fața exterioară a situsului combinativ se numește idiotip.

83
 Sunt anticorpi aglutinanți și reprezintă cei mai eficace activatori ai complementului. Ac IgM sunt
caracteristici pentru RI primar, producția lor fiind stimulată de către IL-4, care nu activează mecanismul de
switch izotipic.

IgM membranară (IgMm) este exprimată pe suprafața LB. Are structură monomerică și se termină

prin aminoacizii 556-597,

intracitoplasmatici. cuprinzând
Fiecare în mod
moleculă de IgMmparticular o parte
este asociată cu intramembranară hidrofobă
2 lanțuri Iga și 2 lanțuri și 3 aminoacizi
Igβ. Ansamblul
formează BCR (B cell receptor), comparabil cu TCR-ul limfocitului T.

IgM serică (IgMs) cuprinde un lanț greu cu un domeniu variabil VH, 4 domenii constante Cm1 - Cm4
și un procent ridicat de hidrați de carbon (12 %). Molecula însăși este un pentamer cu un prim inel al punții
disulfurice la sfârșitul lui Cm3, un al doilea la terminarea lui Cm4 și un lanț J (joining chain). Masa moleculară
este foarte mare (circa 970.000 D), cu un coeficient de sedimentare de 19 S. Concentrația serică este de 1,2 g
/ l. Reprezintă circa 5-10% din totalul imunoglobulinelor din ser. Are 10 situsuri combinative dintre care
84
numai 5 sunt funcționale. IgM are receptori pentru sistemul complement. Nu poate trece prin bariera
hemato-placentară. Apare în RI primar.

IgG (prototipul de Ac) reprezintă circa 75% din totalul imunoglobulinelor din ser și are o distribuție
aproximativ egală în vase și țesuturi. Există patru subclase de IgG (molecule cu termorezistență mai mare),
cu structură asemănătoare, o masă moleculară de 146.000 (excepție făcând IgG3 cu o masă de 170.000), 3
domenii constante pentru lanțul greu și un procentaj de hidrați de carbon de 2-3 %. Concentrația sanguină a
IgG este de ordinul 11 g/l, din care IgG1 - 66 %, IgG2 - 23 %, IgG3 - 7% și IgG4 - 4 %. IgG are receptori pentru
sistemul complement. Poate trece prin bariera hemato-placentară (după a 20-a săptămână de viață intra
uterină). Apare în RI secundar.

IgA serică. Sub forma IgA1 (80%) și IgA2 (20%), ea se găsește ca monomer (GM 160.000, 7 S) sau ca
dimer sau trimer, ultimele două forme cu lanțul J de joncțiune. IgA2 are o structură srcinală. Lanț urile
ușoare unite între ele printr-o punte disulfurică nu sunt legate printr-o legătură covalentă cu lanțurile grele.
Concentrația sanguină a IgA este de 2,4 g / l. Nu are receptori pentru sistemul complement. Nu poate trece
prin bariera hemato-placentară. Nu participă la aglutinarea, precipitarea sau liza antigenelor corpusculare.
Are activitate bactericidă mai mare decât IgG și decât IgM.

IgA exocrină sau secretorie cuprinde două subclase IgA1 și IgA2. Masa moleculară este de 400.000,
cu coeficient de sedimentare de 11 S. Molecula cuprinde două unități de IgA reunite printr-un lanț J. Acest
ansamblu este înconjurat de unitatea secretorie sintetizată de celulele epiteliale ale tubului digestiv.

Au rol important în apărarea la nivelul mucoaselor (digestivă, respiratorie etc) și în reglarea

”compoziției” florei microbiene de la suprafața acestora. Este important ca nou-născutul să primească de la
mamă colostrul și apoi să fie alimentat pe cale naturală pentru a primi IgA (sinteza proprie începe după circa
1 lună de la naștere).

Deși concentrația lor serică este infimă (0,0001 g/l), fixarea pe bazofile și mastocite le conferă un rol
important în inflamație și hipersensibilitatea de tip imediat. posedă, ca și IgM, un al patrulea domeniu
constant, care îi conferă o masă moleculară de 190.000 D și un coeficient de sedimentare 8S, superior IgG.
IgE se fixează pe receptor prin intermediul domeniilorCe2 și Ce3,într-o poziție aproape orizontală.

Antigenul se definește drept o substanță recunoscută specific de către sistemul imun. Alți autori
consideră că antigenul este o substanță capabilă să inducă un răspuns imun (imunogenicitate) și să fie
recunoscută de către sistemul imun (specificitate). Răspunsul imun (RI) tinde să neutralizeze și să elimine

85
antigenul din cauza căruia s-a declanșat. Antigenele (Ag) care pot declanșa RI sunt definite drept substanțe
imunogene.

Haptenele reprezintă Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot declanșa
activarea limfocitelor (fără de care nu apare RI). Haptenele devin imunogene numai dacă se combină cu
macromolecule „carrier”. Așadar, haptena este un antigen incomplet, are specificitate dar nu are
imunogenicitate. Spre exemplu acidul penicilinoic rezultat prin degradarea moleculei de penicilină este o
haptenă. Pot apărea reacții de hipersensibilitate după cel puțin al doilea contact cu această structură și
numai în condi țiile în care gazda întră în categoria persoanelor „atopice”, având structura genetică de

codificare pentru o proteină „carrier”, care cuplează acidul penicilinoic stimulând astfel RI.
Tolerogenele sunt Ag care declanșează activarea limfocitelor, însă RI este inhibat activ, imediat.

Orice bacterie trebuie văzută ca un ansamblu de antigene, din care nu toate sunt imunogene (unele
pot fihaptene altele tolerogene). Mecanismele de apărare împotriva microorganismelor sunt diferite dar pot
fi deduse în funcție de structura și caracterele de patogenitate ale respectivei bacterii. Acesta este un alt
exemplu care demonstrează faptul că între capitole diferite există legături importan te, iar noțiunile citite și
înțelese ”la timpul lor” pot fi foarte utile, ulterior.

Există 4 tipuri principale de perete bacterian (tip gram pozitiv, gram negativ, tip micobacterian și
spirochetal) iar patogenitatea poate varia între 2 ”extreme” (toxicitate fără invazivitate și invazivitate fără
toxicitate).

Recunoașterea antigenului depinde de structurile complementare ale sistemului imun, preexistente

introducerii sale. Moleculele CMH clasa I sau II pot prezenta o multitudine de peptide antigenice diferite și

nu sunt specifice unui antigen în mod particular.

Moleculele simple precum apa, sărurile minerale și ureea sau comune majorității speciilor (ca acizii
grași, creatinina, mono- și dizaharidele, fibrina) nu sunt antigene. Pe de altă parte, moleculele mici de tipul
metalelor grele (crom, nichel), responsabile de apariția hipersensibilității, sau medicamentele, pot deveni
antigene după ce se asociază cu diferite macromolecule.

Structura chimică trebuie să fie cât mai diferită (provenind de la o specie cât mai îndepărtată) față
de structurile proprii [noțiunea de „structură străină” este de fapt o noțiune chimică; modificarea unui singur
aminoacid din structura primară a unei molecule proteice va fi „sesizată” ca atare și va duce la un RI, ca și
cum ar fi vorba de o structură „nouă” (diferită, străină, modificată)]; cu cât structura chimică antigenică
provine de la o specie mai îndepărtată filogenetic, cu atât RI va fi mai puternic;

Structura trebuie să aibă un grad de „rigiditate” (să se mențină ca atare);

86
 Structura trebuie să persiste suficient de mult în organism (în cazul în care respectiva structură este
rapid epurată, nu va duce la apariția unui RI); în acest sens pot fi date ca exemplu anumite structuri
antigenice care sunt necesare pentru prevenirea unor îmbolnăviri (vaccinuri), dar care nu persistă suficient
de mult în organismul gazdă, motiv pentru care au fost asociate cu substanțe adjuvante (sărurile de aluminiu
au fost folosite în calitate de adjuvanți pentru prima dată în 1950, în vaccinul Salk; diferite substanțe
adjuvante sunt utilizate în vaccinul DTP, vaccinurile anti-HBV, anti-Haemophilus influenzae tip b etc);

Greutatea moleculară trebuie să fie cât mai mare (de regulă peste 4-5.000 Da); antigenele cu
moleculă mică pot stimula răspunsul imun după cuplarea cu o „proteină carrier”;

Structura chimică trebuie să fie cât mai complexă (cele mai imunogene sunt proteinele iar cele mai
puțin imunogene sunt lipidele și acizii nucleici);

Doza de antigen, calea de administrare, momentul administrării antigenului etc. sunt alți factori de
care depinde imunogenitatea.

Toți acești factori sunt valabili „în contextul CMH al gazdei” care urmează să reacționeze față de
respectivul antigen.

Reacția antigen-anticorp este o reacție între un antigen (Ag) și un anticorp (Ac) și constă în legarea
grupării determinante de pe suprafața antigenului (epitop - o „proeminență”) cu situsul de combinare de pe
suprafața anticorpului (paratop - o „adâncitură”).

Reacția Ag-Ac are 2 proprietăți principale, specificitatea și reversibilitatea.

Specificitatea se referă la faptul că un antigen nu este recunoscut decât de anticorpii care au fost
produși în urma inoculării respectivului antigen, iar anticorpii nu recunosc decât antigenul față de care au
apărut. Trebuie menționat că specificitatea nu este absolută, întrucât un Ag cu reactivitate încrucișată, poate
reacționa cu un Ac format față de un alt antigen (reacția încrucișată se explică prin aceea că anumite Ag
posedă anumite grupări determinante comune).

Reversibilitatea complexului Ag-Ac se datorează faptului că legăturile necovalente sunt reversibile la

cald sau pH acid (<3).

Legarea antigenului cu anticorpul este determinată de complementaritatea reciprocă dintre conturul

suprafeței epitopului și paratopului, care apropie la câțiva Angstromi grupările chimice care le alcătuiesc,

87
permițând stabilirea unor forțe intermoleculare între epitop și paratop (hidrofobe între grupările nepolare,
de atracție electrostatică între grupările ionizate de semn contrar).

Inițial are loc cuplarea între Ag și Ac rezultând complexe Ag-Ac mici, solubile, care se pot desface
relativ ușor. În continuare, datorită existenței mai multor situsuri de legare, complexele Ag-Ac mici se
reunesc formând structuri de dimensiuni mai mari, adevărate rețele Ag-Ac, care pot fi evidențiate fie direct,
fie după utilizarea unor artificii tehnice.

În funcție
multe tipuri de natura
de reacții Ag-Ac,antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul urmărit există mai
după cum urmează:

 reacții de precipitare
o pot avea loc în gel (imunodifuzia radială simplă Mancini, dubla difuzie Ouchterlony etc) sau
o pot avea loc în mediu lichid (reacția Ramon, Ascoli etc.)
 reacții de aglutinare
o se pot folosi în diagnosticul bacteriologic (ex. reacția Huddleson) sau
o se pot folosi în diagnosticul serologic (ex. reacția Wright)
 reacția de fixare a complementului (RFC)
o în diagnosticul serologic al sifilisului (RBV – Reacția Bordet-Wasserman), leptospirozei etc.
o în diagnosticul serologic al infecțiilor virale etc.
 reacții de seroneutralizare
o reacția ASLO (în diagnosticul serologic al infecțiilor streptococice)
o testul plăcilor semineutralizate
o diferite intradermoreacții cu mecanism imun umoral etc.
 reacții în care componentele sunt marcate
o izotopic (radio immunoassay, RIA)
o enzimatic (enyzme-linked immunoassay, ELISA)
o fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA)
o chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA).

Au la bază unirea Ag cu Ac în mediul lichid, formându-se complexe Ag-Ac, care vor precipita atunci
când Ag și Ac se găsesc în anumite proporții.

Reacția de precipitare între Ag și Ac se poate cuantifica și este foarte utilă pentru a demonstra
prezența și respectiv absența precipitatului în funcție de concentrațiile relative de Ag și Ac. Spre exemplu,
pentru titrarea toxinei difterice (metoda Ramon) se pun în contact, în amestec în tuburi, cantități egale din
componenta care trebuie titrată (toxina difterică, Ag) cu cantități variabile de Ac la care titrul este cunoscut.
Cantitatea maximă de precipitat se găsește în tubul unde există raportul de echivalență. Pentru sistemul
toxină difterică - anticorpi anti-toxină difterică (ca și în cazul sistemului toxină tetanică - anticorpi anti-toxină
tetanică), raportul de echivalență se „suprapune” peste proporția optimă, astfel încât se poate observa
relativ ușor tubul în care apare cantitatea cea mai importantă de precipitat. Cunoscând titrul anticorpilor, se
88
află imediat titrul toxinei (1 Lf = 1 limes floculans = cantitatea de toxină care se combină cu o unitate de
antitoxină = 1 UA = 1 unitate antitoxică). Dacă spre exemplu precipitarea maximă apare în tubul în care titrul
anticorpilor este de 10 UA, titrul toxinei este de 10 Lf.

În mod asemănător, prin metoda Dean și Web se poate determina titrul anticorpilor anti-toxici,
cunoscând titrul toxinei.

Reacția de precipitare în inel, constă în punerea în contact a Ag și Ac astfel încât să nu se amestece;

reacția care apare la interfața dintre Ag și Ac se concretizează printr-un inel de precipitare albicios. Se
utilizează pentru identificarea srcinii petelor de sânge (reacția Uhlenhut, în medicina legală) și pentru
identificarea provenienței unor preparate pe bază de carne (în industria alimentară).

Demonstrativ, în cursul lucrărilor practice, reacția de precipitare în inel (reacția Ascoli) se poate
utiliza pentru identificarea prezenței antigenului cărbunos (Ag obținut de la Bacillus anthracis). Istoric,
soluția de antigen se prepara pornind de la organe (de ex. splină) recoltate de la un animal care a decedat și
pentru care se suspecta că decesul a fost produs de o infecție generalizată cu Bacillus anthracis. Fragmentul
de organ se mojarează în soluție de clorură de sodiu sterilă, adăugându-se ulterior câteva picături de acid
acetic, apoi se menținea la temperatura de fierbere timp de 5-10 minute. După decantarea și alcalinizarea cu
NaOH, urma filtrarea și rezulta soluția antigenică. Din punct de vedere tehnic vom utiliza 3 tuburi, 1 pentru
reacție și 2 tuburi martor. În primul tub martor vom pipeta 0,5 ml ser anticărbunos și 0,5 ml soluție salină
fiziologică iar în al doilea tub martor vom pipeta 0,5 ml ser normal de cal și 0,5 ml soluție de antigen. În ceea
ce privește tubul de reacție trebuie să pipetăm întâi 0,5 ml din serul anticărbunos, urmând ca soluția de
antigen (în cantitate de 0,5 ml) să fie pipetată foarte lent, eventual prin „scurgere picătură cu picătură” pe
peretele interior al tubului, în așa fel încât cele 2 soluții să nu se amestece. În cazul reacției pozitive
(prezența Ag cărbunos în soluția antigenică), după circa 5 minute, la interfața dintre cei 2 reactivi apare un
„inel” de precipitare.

În prezența unei cantități constante de Ag sau Ac, se formează complexe Ag-Ac care modifică
intensitatea și dispersia luminii direct proporțional cu concentrația de Ag sau Ac (principiul de măsurare este
proporționalitatea dintre cantitatea de complex antigen-anticorp formată și lumina „împrăștiată”). Cu
ajutorul unui nefelometru, care utilizează fascicule luminoase monocromatice intense și a unei măsurări a
precipitatului în mediu lichid prin difracție de raze luminoase, este posibilă dozarea ușoară, reproductibilă a
antigenului sau a anticorpilor, folosind o curbă de etalonare. Nefelometria se utilizează curent și determină
cantitativ proteine specifice din ser și urină (IgG, IgA, IgM, CRP, haptoglobină, orosomucoid, fibrinogen, C3,
C4, prealbumină, alfa1-antitripsină etc).

89
 Utilizarea gelozei, în care pot să migreze cei doi reactivi (se va utiliza o anumită concentrație de agar
în soluție de tampon veronal, în așa fel încât porii gelului să permită migrarea), va duce la vizualizarea
reacției Ag-Ac printr-un arc / linie de precipitare.

Imunodifuzia radială simplă (Mancini) se bazează pe difuzia spontană și radială a Ag din proba de
cercetat, într-un gel care conține o cantitate constantă de anticorpi, determinând apariția unui cerc de
precipitare al cărui diametru este direct proporțional cu concentrația de antigen din probă. Pentru a obține
un cerc de precipitare de mărime convenabilă, concentrația Ac înglobați în gel trebuie să fie aleasă în funcție
de titrul acestora și de concentrația Ag care urmează a fi testat. Metoda permite determinareacantitativă a
imunoglobulinelor (IgG, IgM, IgA), fracțiunii C3 a complementului, alfa1-antitripsinei, siderofilinei etc.

Sunt necesare plăcuțe (de ex. cu diametrul de 5 cm) în care se toarnă un gel care include Ac față de
structura a cărei concentrație dorim să o determinăm. Există un cod al culorilor și spre exemplu, plăcuțele
care vor fi utilizate pentru determinarea concentrației de IgG au culoare roșie, pentru IgA culoarea este
albastră, pentru siderofilină culoarea este portocalie etc. În gel sunt perforate mici godeuri (3 mm diametru).
Sunt necesare seruri de cercetat și un ser de referință în care se cunoaște concentrația diferitelor
componente (spre ex. câte 100 UI / ml pentru fiecare dintre cele 3 imunoglobuline). Înainte de pipetarea
serurilor în godeuri se realizează diluarea acestora, diluția fiind ¼ pentru IgG, IgA și siderofilină și respectiv ½
pentru IgM, complement C3 și alfa1-antitripsină. Diluția serului de referință se face în funcție de proteina
care urmează a fi determinată. Cantitatea de ser introdusă în fiecare godeu este de 5 ml (un godeu pentru

serul de referință și restul pentru serurile de cercetat).

După 10 minute de menținere a plăcuței pe masa de lucru aceasta se incubează la 37°C, cu stratul de
gel poziționat în sus, timp de 48 ore pentru IgA și IgM și respectiv 24 de ore pentru celelalte componente.
Citirea se realizează cu ajutorul unei rigle gradate, din plastic, o riglă specială pentru această analiză
(demonstrat în cursul lucrărilor practice). Se va măsura inițial diametrul cercului de precipitare din jurul
godeului în care se află serul de referință iar rezultatul obținut trebuie să corespundă așteptărilor (de ex. 6
mm pentru IgG care a fost diluat ¼ și astfel are concentrația de 25 UI / ml). În cazul că rezultatul este cel
așteptat, se poate face direct citirea diametrelor cercurilor de precipitare pentru serurile de cercetat; în caz
contrar este necesară o „corecție” (dacă spre exemplu diametrul este 6,5 mm în loc de 6 mm, din valoarea
obținută pentru serurile de cercetat se scad 0,5 mm). După citirea diametrelor, se compară rezultatele cu
cele puse la dispoziție în tabele iar cifra obținută se înmulțește cu diluția probei (spre ex. dacă obținem o
valoare de 50 UI / ml pentru IgG, vom înmulți cu 4 pentru a obține rezultatul real).

Imunodifuzia dublă se bazează pe difuzia Ag și Ac (unul spre celălalt) într-un gel. Deoarece mărimea
moleculelor de Ag și Ac este mai mică decât diametrul porilor gelului, iar distanța parcursă de reactant într-
un anumit timp este direct proporțională cu gradientul concentrației sale și invers proporțională cu
greutatea sa moleculară, migrarea reactanților unul spre celălalt determină formarea unor linii de precipitare
la locul de întâlnire Ag-Ac. În gelul transparent vor apărea linii opace, numărul lor corespunzând numărului
sistemelor Ag-Ac studiate.

90
 Metoda certifică prezența sau absența proteinei cercetate. Se pot evidenția alfa-fetoproteina,
proteina C reactivă, beta-2 microglobulina, proteine Bence-Jones tip kappa și lambda, produși de degradare
ai fibrinogenului (PDF) etc. În micologie, prin imunodifuzie se poate identifica prezența exoantigenelor
fungice (Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatidis, Coccidioides immitis etc) sau prezența Ac față de
Ag fungice, spre exemplu în diagnosticul serologic al unei aspergiloze invazive. Această metodă este încă
frecvent utilizată pentru determinarea specificității anticorpilor antinucleari sau a altor anticorpi în patologia
umană.

Sunt necesare lame de microscop pe care se toarnă un gel de agar 1%, lama putând fi folosită pe

parcursul uneifrigiderului,
temperatura zile (dacă acest lucru
pentru nu se
maxim poate îndeplini,
o săptămână). lamade
În gelul trebuie păstrată
pe lamă în cameră
se perforează umedă,
3 grupe delagodeuri,
câte 7 godeuri în fiecare grup (1 godeu central și 6 godeuri periferice, fiecare cu diametrul de 3 mm). Dacă
spre exemplu dorim să determinăm prezența proteinei C reactivă (CRP) în seruri de cercetat, avem nevoie de
un ser cu Ac anti-CRP, seruri de cercetat și un ser de referință care conține CRP. Numerotând godeurile
periferice, pipetăm Ac anti-CRP în godeul central și ser de referință cu CRP în godeurile 1 și 4. În celelalte
godeuri pipetăm serurile de cercetat. Incubăm la 37°C, timp de 24 de ore, în cameră umedă (într-o cutie
Petri putem pune o bucată de vată îmbibată în soluție salină fiziologică, alături de lama respectivă). Liniile de
precipitare pot deveni vizibile după 2-4 ore dar sunt mult mai clare după 24 de ore.

Pentru citire pot fi necesare o lupă și o sursă de lumină. Între godeul central și godeurile 1 și 4
(martori pozitivi) vor apărea linii (arcuri) de precipitare. În cazul în care de ex. în godeul 2 există CRP, va
apărea un arc de precipitare și între godeul central și godeul nr. 2. Este certificată prezența CRP în cazul în
care cele 2 linii de precipitare (dintre godeul central și godeurile 1 și 2) sunt una în continuarea celeilalte
(imagine de „genunchi îndoit”).

Această metodă permite depistarea capacității toxigene a unei tulpini de Corynebacterium

diphteriae . În cazul în care tulpina este toxigenă, toxina va difuza în mediu iar după unirea cu Ac anti-toxină,
complexele Ag-Ac vor da naștere unor linii de precipitare.

Într-o cutie Petri turnăm mediul Elek și după ce mediul s-a întărit, decupăm un șanț pe unul din
diametre. În șanțul respectiv pipetăm 0,5 ml ser antidifteric, ser care conține Ac anti-toxină difterică în
concentrație de 1.000 UI / ml. Ac anti-toxină difterică vor difuza în mediu. După circa 2 ore însămânțăm
perpendicular pe șanțul cu Ac anti-toxină, de fiecare parte a șanțului, o tulpină de Corynebacterium
diphteriae toxigenă (martor pozitiv), o tulpină de Corynebacterium diphteriae ne-toxigenă (martor negativ) și
tulpini de cercetat, câte un striu (de fiecare parte a șanțului) pentru fiecare tulpină. Incubăm la 37°C pentru
48 ore, dar urmărim zilnic apariția culturii și precipitatului (liniilor de precipitare). De-a lungul liniilor de
însămânțare apare cultură bacteriană. Din cultura de Corynebacterium diphteriae toxigen, toxina (Ag)
difuzează în mediu. Unirea dintre Ag și Ac duce la formarea unor complexe Ag-Ac care precipită, iar în mediu
vor apărea linii de precipitare în unghiurile dintre cultură și șanțul cu Ac anti-toxină. În cazul în care apar linii
de precipitare în unghiul dintre una dintre tulpinile de cercetat și șanțul cu Ac anti-toxină, respectiva tulpină
este toxigenă. Reacția va fi negativă pentru martorul negativ și pentru tulpinile de cercetat ne-toxigene.

91
 În reacția de aglutinare antigenele sunt de natură corpusculară. Reacția de aglutinare constă în
reacția Ac cu Ag (natural sau artificial) de pe suprafața unor particule (bacterii, hematii, latex, cristale de
colesterol etc), determinând aglutinarea acestora prin scăderea forțelor electrostatice de repulsie dintre
particule și formarea unor punți de legătură.

Aglutinarea este mai sensibilă decât precipitarea, Ag fiind o particulă și nu o moleculă solubilă.
Anticorpii de tip IgM sunt mai aglutinanți decât Ac de tip IgG (pentru că au mai multe valențe). Există și Ac
neaglutinanți (incompleți / blocanți) sau care aglutinează numai la rece.

Există mai multe variante tehnice de aglutinare. Dintre acestea vom prezenta în continuare, pe scurt,
aglutinarea directă, aglutinarea indirectă, inhibarea aglutinării, aglutinarea în coloană și aglutinarea mediată
de Ac anti-imunoglobuline. Ulterior vom discuta reacțiile de aglutinare utilizate în bacteriologie și micologie.

Aglutinarea directă reprezintă aglutinarea Ag naturale ale unor particule (bacterii, celule) de către Ac
specifici. Se poate utiliza în a. diagnosticul bacteriologic, de ex. pentru identificarea enterobacteriilor
(Shigella, Salmonella, E. coli etc) sau a altor germeni Gram-negativi (Vibrio cholerae) etc., pe baza structurii
antigenice, în b. diagnosticul serologic al unor boli infecțioase (febră tifoidă, bruceloză etc), c. pentru
determinarea grupelor sanguine (ABO) etc.

Este o reacție în care particule artificiale (globule roșii formolate, particule de latex, cristale de
colesterol, colodiu etc) sau naturale sunt „încărcate” in vitro cu Ag sau Ac și sunt aglutinate de către Ac sau
Ag corespondente din proba de cercetat. Se utilizează în principal pentru decelarea factorului reumatoid,
determinarea CRP, determinarea grupului streptococic etc.

Reacția constă în inhibarea aglutinării particulelor „încărcate” cu Ag, după ce în prealabil Ac

reacționează cu Ag corespondent. Se utilizează de ex. pentru decelarea mioglobinei sau în diagnosticul
imunologic al sarcinii.

Metoda permite o mai bună vizualizare a reacției. Dispozitivul utilizat are 2 compartimente, partea în
care se introduc reactivii (situată superior) și o coloană situată inferior, plină cu microparticule de sticlă.
După introducerea hematiilor și a serului de cercetat și „incubarea” acestora, dispozitivul este centrifugat. În
cazul unei reacții pozitive complexul Ag-Ac se va putea vizualiza la nivelul coloanei, în timp ce în cazul unei
reacții negative, hematiile se depun în porțiunea inferioară a coloanei.

92
 Anticorpii anti-Ig se vor cupla cu particule „încărcate” cu Ac și vor duce la apariția unor aglutinate
(prin apariția complexului imun). Se utilizează spre exemplu în decelarea factorului reumatoid (tehnica
Waaler-Rose).

utilizareaFace
unuiparte dintre
sistem reacțiile
hemolitic al căror. rezultat
indicator Motivul nu poate
pentru fi vizualizat
care fără acest
este necesar un artificiu
sistemtehnic, în acest
indicator se caz
datorează faptului că Ag este fie sub formă macromoleculară fie este reprezentat de corpi microbieni de
dimensiuni foarte mici, iar complexul Ag-Ac format nu devine vizibil cu ochiul liber. RFC a fost imaginată încă
din anul 1901 de către Jules Bordet și s-a perfecționat destul de mult de-a lungul timpului. Această reacție
este utilizată în peste 100 de sisteme Ag-Ac, prin tehnici clasice sau tehnici care au suferit modificări, inclusiv
introducerea micrometodelor RFC.

Se utilizează de ex. Ag cunoscute, puse în contact cu serul testat (în care căutăm Ac) care este
decomplementat (prin încălzire la 56°C timp de 30 minute) și cu o cantitate de C' de cobai (alexină); dacă în
serul cercetat există Ac, ei se vor cupla cu Ag formându-se complexe Ag-Ac, pe care se atașează C', care se va
consuma și nu va mai acționa în timpul doi (nu va mai produce hemoliza). Într-un al doilea timp este adăugat
un sistem hemolitic (substrat indicator) compus din globule roșii de oaie (acoperite cu anticorpi IgG de
iepure). Dacă globulele roșii nu sunt hemolizate, înseamnă că a fost utilizat C' în cursul primului timp și
reacția este pozitivă (Ac prezenți în serul de cercetat); dacă globulele roșii sunt hemolizate, înseamnă că nu
s-a utilizat C' care a rămas disponibil pentru a se atașa de sistemul hemolitic, reacția este negativă (nu sunt
prezenți Ac în serul de cercetat).

Reacția de fixare a complementului se poate folosi atât pentru identificarea Ag cât și în diagnosticul
serologic. Pentru că nu urmează să discutăm pe larg prima variantă, vom enumera doar câteva dintre
exemple, RFC permițând identificarea unor Ag rickettsiene, chlamydiene, virale etc. În diagnosticul serologic,
cea mai cunoscută metodă rămâne încă RFC Bordet-Wasserman, utilizată încă în diagnosticul serologic al
sifilisului.

Subliniem faptul că RFC este o metodă laborioasă, în care nu se admit erori tehnice, dar fiind
executată corect este foarte exactă, are o mare sensibilitate și specificitate. Este de asemenea una dintre
metodele cu un mare grad de reproductibilitate.

93
 RFC se bazează pe proprietatea sistemului C' de a se fixa pe
complexul imun Ag-Ac.

În prima fază a reacției se introduce serul de cercetat iar dacă

acest ser conține Ac specifici față de Ag cunoscut se va forma un
complex Ag-Ac, urmat de fixarea C', care se va activa pe calea clasică și
nu va mai fi „disponibil” pentru a se fixa pe sistemul hemolitic
indicator (hematii + Ac-antihematie). În cazul în care serul de cercetat
nu conține Ac specifici față de Ag cunoscut, nu va avea loc formarea
unui complex Ag-Ac în prima etapă a RFC.

După introducerea în reacție a sistemului hemolitic indicator,

hematiile și Ac-antihematie se vor cupla, vor forma un complex imun
iar C' „liber” se va fixa pe acesta. După fixare va urma activarea C' și
respectiv liza hematiilor, hemoliza putând fi examinată cu ochiul liber.

Așa cum am menționat, tehnica de lucru este laborioasă și nu

va fi prezentată în totalitate, în cele ce urmează.

Serul de cercetat se va menține 30 minute la 56°C, în baia de

apă, pentru inactivarea C' propriu.

Așa cum am menționat anterior, principial, RFC are loc în 2

etape:

1. în prima etapă se pun în reacție C', serul de cercetat și Ag cunoscut; există 2 posibilități: a. în serul de
cercetat există Ac specifici , rezultând un complex Ag-Ac pe care se va fixa C'; b. în serul de cercetat nu
există Ac specifici, nu se formează complex Ag-Ac, C' rămâne liber;
2. în a doua etapă se introduce în reacție sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac anti-hematie); există 2
posibilități: a. C' nu este liber, nu are loc hemoliza, b. C' se fixează pe sistemul hemolitic, lizează
hematiile și observăm apariția hemolizei.

Există anumite diferențe între tehnicile cantitative și cele calitative, dar principiile sunt aceleași.

În RFC Bordet-Wasserman (RBW), metodă calitativă, reacția se realizează în eprubete, 2 pentru

reacția propriu-zisă (una cu ser diluat 1/8, cealaltă cu ser diluat 1/16), 2 pentru martori sigur pozitiv și sigur
negativ și câte una pentru fiecare din ceilalți martori, respectiv martor pentru serul de cercetat, martor

pentru Ag, martor pentru C', martor pentru serul hemolitic).

Inițial se verifică rezultatele apărute pentru martori (fie că este vorba de o metodă cantitativă sau
calitativă); spre ex. în cazul metodei calitative, în tubul martor pentru serul de cercetat trebuie să fie
hemoliză, la fel ca și în tuburile martor pentru Ag, C' și ser sigur negativ. În tuburile martor sigur pozitiv și
martor pentru sistemul hemolitic, nu trebuie să fie hemoliză.

94
 În tuburile cu serul de cercetat, dacă apare hemoliza, înseamnă că nu există Ac iar testul este
negativ (lichidul din tub va avea un aspect roșu, limpede).

Testul este pozitiv atunci când în tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliză, hematiile se depun
formând un „buton” în partea inferioară a tubului (în serul de cercetat există Ac). Pentru a stabili
diagnosticul final, este necesar ca RBW să fie confirmată prin reacții specifice (vezi capitolul dedicat genului
Treponema).

Cu privire la controlul de calitate am menționat utilizarea martorilor, pentru fiecare reacție.

În RFC utilizată în diagnosticul serologic, Ag cunoscut va fi ales în funcție de suspiciunea de
diagnostic. RFC cantitativă se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infecțiilor produse de Mycoplasma
pneumoniae, Chlamydia spp., Rickettsia spp., Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella
spp., diferite virusuri etc.

În scopul creșterii sensibilității și specificității se aleg proprietățile Ag cunoscut, o anumită

temperatură „de incubare” (de ex. 4°C în loc de 37°C în RFC Kolmer) etc. Ac fixatori de C' apar precoce în
cursul bolii astfel încât identificarea prezenței lor poate semnifica o infecție acută sau recentă.

La fel ca și în cazul RFC, în reacția de seroneutralizare (RSN) este necesar un artificiu tehnic pentru a
permite vizualizarea rezultatelor. În cazul RSN, Ag are o anumită proprietate biologică (toxică, enzimatică)
care poate fi blocată (neutralizată ) prin cuplarea cu Ac specific. Neutralizarea efectului biologic respectiv se
poate realiza doar în cazul în care determinantul pentru toxicitate sau pentru activitatea enzimatică
respectivă este același cu determinantul antigenic (epitop).

Reacțiile de seroneutralizare ar putea fi utilizate în mai multe împrejurări, spre exemplu în:

 diagnosticul microbiologic direct

o identificarea Clostridium perfringens prin metoda plăcilor
o testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae
o toxinotipia în cazul suspicionării unei toxi-infecții alimentare cu Clostridium botulinum
 diagnosticul serologic
o reacția ASLO
 prevenirea unor boli infecțioase prevenibile prin vaccinare și evaluarea eficacității vaccinale
o vaccinarea cu anatoxine (DTP, DT, dT, ATPA, ADPA);
o titrarea prezenței Ac anti-toxine (difterică, tetanică etc);
o testarea prin IDR (intra-dermo-reacție) a susceptibilității față de o anumită boală infecțioasă care
are la bază drept mecanism patogenic efectul unei exotoxine. Intradermoreacțiile Schick sau
Dick, pentru a dovedi susceptibilitatea persoanei testate față de o infecție difterică sau
scarlatinoasă au intrat în istoria medicinii.
 tratamentul / profilaxia unor boli infecțioase prin utilizarea de imunoglobuline specifice omologe sau
utilizarea unor seruri hiperimune heterologe.

95
 Această reacție poate fi utilizată în diagnosticul retrospectiv al unei infecții streptococice sau pentru
confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice (împreună cu criteriile minore și majore de diagnostic).
Reacția ASLO determină titrul Ac anti streptolizină O (SLO).

Titrarea Ac anti-SLO se bazează pe faptul că SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau
de berbec. În cazul în care în serul de cercetat există Ac anti-SLO, acțiunea hemolitică a SLO este neutralizată.
Combinând diluții din serul de cercetat cu o cantitate constantă de SLO vom putea determina titrul ASLO.

Pornind de la o diluție inițială a serului de

1/10, după adăugarea tuturor reactivilor titrul
(numărul de unități ASLO) va fi 12, 50 în tubul
următor, 100, 125, 166, 250, 333 etc în tuburile
următoare. Titrul reacției ASLO este dat de cea mai
mare diluție de ser la care lipsește complet hemoliza. Pentru zona noastră geografică se acceptă ca normal
un titru de 200 (maxim 250) unități ASLO. Există teste serologice și pentru evidențierea prezenței și titrului
anticorpilor față de alte structuri antigenice (de exemplu streptodornază, hialuronidază, streptokinază).

Ultimele 2 tuburi sunt reprezentate de tubul martor pentru hematii, în care se verifică rezistența
hematiilor și respectiv tubul martor pentru SLO în care se pun SLO și suspensia de hematii.

Există și posibilitatea de a realiza o micrometodă ASLO, reacția efectuându-se în plăci de material

plastic cu godeuri.

Vaccinul DTP include o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) în faza I, combinată cu anatoxina
difterică și tetanică. Primovaccinarea se începe vârsta de 2 luni a nou-născutului, administrându-se 3 doze la
interval de 2 luni (la 2, 4, 6 luni). Pentru menținerea imunității se practică revaccinarea I la 6 luni de la primo-
vaccinare iar revaccinarea a II-a se practică la 36 de luni de viață a copilului respectiv. Datorită posibilelor
reacții adverse (față de componenta pertussis) se recomandă eliminarea acesteia la nou-născuții cu
probleme ale sistemului nervos, la cei predispuși la boală și la cei care au avut o reacție adversă semnificativă
la o administrare anterioară a DTP-ului. Se studiază posibilitatea utilizării pe scară largă a unui vaccin acelular
în care să fie inclusă toxina pertussis inactivată și care să permită obținerea unui RI eficient și de durată.
Vaccinul DTPa este deja utilizat în SUA și în țări din UE.

96
 Se recomandă testarea stării de imunitate indusă prin vaccinare, conform normativelor elaborate de
autoritățile de sănătate publică; metodele au la bază titrarea Ac anti-toxină (difterică, tetanică etc) în seruri
prelevate de la copii vaccinați, prin diferite tehnici. Spre exemplu se consideră că un copil este protejat
(prezintă rezistență specifică în cazul unei infecții difterice) dacă titrul Ac-anti toxină difterică este mai mare
de 0,03 UAI / ml (UAI = unitate anti-toxică internațională). În mod asemănător se consideră că există
protecție față de tetanos dacă titrul Ac-anti toxină tetanică este mai mare de 0,01 UAI / ml.

Se pot face teste de susceptibilitate, in vivo, pentru a verifica dacă persoana investigată este sau nu
protejată față de o eventuală infecție. În acest scop se practică IDR. În istoria medicinii au intrat IDR Dick,

care
A permite testarea
lizogenizat) susceptibilității
și respectiv fațăpermite
IDR Schick, care de scarlatină (toxina
testarea este elaborată
susceptibilității fațădedecătre streptococul
difterie de grup
(toxina este
elaborată de către bacilul difteric lizogenizat).

o Ambele IDR se realizează similar din punct de vedere tehnic;

o Spre ex. în cazul IDR Schick se injectează în treimea medie a antebrațului, strict intradermic o
cantitate de 0,1 ml toxină difterică diluată corespunzător. În cazul în care în sângele persoanei testate se
găsește o cantitate de Ac anti-toxină mai mare de 0,03 UAI / ml, toxina inoculată va fi neutralizată și nu va
apărea nici o modificare la locul inoculării (lipsa eritemului semnifică faptul că persoana testată nu este
susceptibilă să facă difterie, în cazul în care se infectează cu un bacil difteric toxigen). În cazul în care
persoana respectivă nu prezintă Ac anti-toxină difterică, Ag inoculat va conduce la apariția unui eritem la
locul de inoculare.

• Administrarea de imunoglobuline specifice omologe, obținute de la persoane imunizate (natural sau

artificial) față de o anumită maladie infecțioasă, de ex. în imunoterapia infecției cu Clostridium tetani
(tetanos) se pot administra intramuscular 3-6.000 UAI.
• Administrarea de seruri imune heterologe, obținute prin hiperimunizarea cailor, în tratamentul
tetanosului, difteriei, botulismului etc.
Terapia bolilor în care mecanismul patogenic implică exotoxine trebuie instituită cât mai rapid, deoarece
exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci când se găsesc în circulație. Pe de altă parte, administrarea de
ser heterolog trebuie realizată numai în caz de necesitate (datorită stării de hipersensibilitate care ar putea fi
indusă și care ar duce la reacții adverse).

Vaccinul DTP include o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) în faza I, combinată cu anatoxina

difterică și tetanică. Primovaccinarea se începe vârsta de 2 luni a nou-născutului, administrându-se 3 doze la

interval de 2 luni (la 2, 4, 6 luni). Pentru menținerea imunității se practică revaccinarea I la 6 luni de la primo-
vaccinare iar revaccinarea a II-a se practică la 36 de luni de viață a copilului respectiv. Datorită posibilelor
reacții adverse (față de componenta pertussis) se recomandă eliminarea acesteia la nou-născuții cu
probleme ale sistemului nervos, la cei predispuși la boală și la cei care au avut o reacție adversă semnificativă
la o administrare anterioară a DTP-ului. Se studiază posibilitatea utilizării pe scară largă a unui vaccin acelular
în care să fie inclusă toxina pertussis inactivată și care să permită obținerea unui RI eficient și de durată.
Vaccinul DTPa este deja utilizat în SUA și în țări din UE.
97
 • Se recomandă testarea stării de imunitate indusă prin vaccinare, conform normativelor elaborate
de autoritățile de sănătate publică; metodele au la bază titrarea Ac anti-toxină (difterică, tetanică etc) în
seruri prelevate de la copii vaccinați, prin diferite tehnici. Spre exemplu se consideră că un copil este protejat
(prezintă rezistență specifică în cazul unei infecții difterice) dacă titrul Ac-anti toxină difterică este mai mare
de 0,03 UAI / ml (UAI = unitate anti-toxică internațională). În mod asemănător se consideră că există
protecție față de tetanos dacă titrul Ac-anti toxină tetanică este mai mare de 0,01 UAI / ml.

• Se pot face teste de susceptibilitate, in vivo, pentru a verifica dacă persoana investigată este sau
nu protejată față de o eventuală infecție. În acest scop se practică IDR. În istoria medicinii au intrat IDR Dick,
care permite testarea susceptibilității față de scarlatină (toxina este elaborată de către streptococul de grup
A lizogenizat) și respectiv IDR Schick, care permite testarea susceptibilității față de difterie (toxina este
elaborată de către bacilul difteric lizogenizat).

o Ambele IDR se realizează similar din punct de vedere tehnic;

o Spre ex. în cazul IDR Schick se injectează în treimea medie a antebrațului, strict intradermic o
cantitate de 0,1 ml toxină difterică diluată corespunzător. În cazul în care în sângele persoanei testate se
găsește o cantitate de Ac anti-toxină mai mare de 0,03 UAI / ml, toxina inoculată va fi neutralizată și nu va
apărea nici o modificare la locul inoculării (lipsa eritemului semnifică faptul că persoana testată nu este
susceptibilă să facă difterie, în cazul în care se infectează cu un bacil difteric toxigen). În cazul în care
persoana respectivă nu prezintă Ac anti-toxină difterică, Ag inoculat va conduce la apariția unui eritem la
locul de inoculare.

• Administrarea de imunoglobuline specifice omologe, obținute de la persoane imunizate (natural

sau artificial) față de o anumită maladie infecțioasă, de ex. în imunoterapia infecției cu Clostridium tetani
(tetanos) se pot administra intramuscular 3-6.000 UAI.

• Administrarea de seruri imune heterologe, obținute prin hiperimunizarea cailor, în tratamentul

tetanosului, difteriei, botulismului etc.

Terapia bolilor în care mecanismul patogenic implică exotoxine trebuie instituită cât mai rapid,
deoarece exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci când se găsesc în circulație. Pe de altă parte,
administrarea de ser heterolog trebuie realizată numai în caz de necesitate (datorită stării de
hipersensibilitate care ar putea fi indusă și care ar duce la reacții adverse).

Reamintim că, în funcție de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul urmărit
există mai multe tipuri de reacții Ag-Ac, și anume:

 reacții de precipitare
 reacții de aglutinare
98
  reacția de fixare a complementului (RFC)
 reacții de seroneutralizare.

Dacă în cazul primelor 2 tipuri de reacții vizualizarea se poate face direct (cu ochiul liber, cu ajutorul
unei lupe etc) în cazul RFC și RSN este necesară utilizarea unor „sisteme indicator”. În continuare vom
discuta despre reacțiile Ag-Ac în care pentru interpretare este necesară marcarea reactanților, ceea ce se
poate face:

 izotopic (radio immunoassay, RIA);

 enzimatic (enzyme-linked immunoassay, ELISA);
 fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA);
 chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA) etc.

În prezent aceste metode sunt extrem de folosite având avantajul unei mari sensibilități, sunt
automatizate și adaptabile la testări utile în toate disciplinele bio-medicale.

Reacția imună este un răspuns normal fiziologic față de microorganisme sau celule tumorale.

Totuși, RI poate îmbrăca și aspecte patologice, de tipul hipersensibilității (HS) sau al autoimunității.
Primele observații privitoare la reacțiile de hipersensibilitate au fost făcute de Charles Richet în urmă cu un
secol, observații care vor acoperi tipul I din clasificarea Gell și Coombs de mai tȃrziu. Pornind de la diferite
tipuri de reacții observate, Gell și Combs (1968) au propus o clasificare folosind termenul de
hipersensibilitate de tip I-IV. În 1974, Roitt adaugă hipersensibilitatea de tip V, stimulantă (pornind de la
anticorpii stimulanți ai funcției tiroidei, prezenți în hipertiroidia primitivă, boala Basedow).

În mod clasic, HS reprezintă o stare de reactivitate crescută a organismului, pe baza unui mecanism
imunologic, indusă de expunerea (repetată) la anumite structuri antigenice (sau haptene). Cuvȃntul alergen
a fost pentru prima oară utilizat de Riquet; desemnează un antigen care dă naștere unei reacții de
hipersensibilitate.

HS este specifică și include

 un contact sensibilizant,
 perioadă de latență și
 un nou contact, contactul declanșator, cu același antigen care a fost implicat în contactul
sensibilizant.
HS se poate clasifica în funcție de tipul de răspuns imun în:

 HS mediată prin mecanism imun umoral (rol primordial LB și anticorpii)

 HS de tip I (anafilactică, atopică), așa cum se înregistrează în cazul șocului anafilactic, edemului Quincke,
conjunctivitelor sau rinitelor alergice, astmului alergic, urticariei, eczemei atopice etc;

99
 HS de tip II (citotoxică), așa cum se întâmplă în liza celulară prin anticorpi, complement dependentă sau
în citotoxicitatea anticorp dependentă, complement independentă (mecanisme ce pot fi implicate de ex.
în patogenia reumatismului articular acut, în anemii hemolitice inclusiv după infecții cu Mycoplasma
pneumoniae, reacții posttransfuzionale, sindromul Goodpasture etc);
 HS de tip III (prin complexe antigen-anticorp), așa cum se înregistrează în reacția Arthus, boala serului,
boala plămânului de fermier, glomerulonefrita extramembranară, lupusul eritematos diseminat,
crioglobulinemia mixtă, glomerulonefrita și periarterita poststreptococică etc.
 HS de tip IV mediată prin mecanism imun celular (rol primordial LT și citokinele), spre exemplu în
o HS tuberculinică sau
o
HS în testările intradermice care utilizează lepromină, candidină, histoplasmină, tricofitină etc și
o HS în multe dintre infecțiile virale.

Reacția imună anafilactică se poate instala rapid (în mai puțin de 15-30 minute) după un nou contact cu un
antigen la care organismul este sensibilizat. În această reacție intervin celulele (mastocite, bazofile) acoperite
de „reagine” (în principal IgE), care eliberează mediatori chimici (histamina fiind cel mai important și cel mai
cunoscut dintre aceștia).

Anafilaxia este un fenomen general, obținut ca răspuns la antigene variate: toxine, proteine, medicamente,
alloantigene de transplant. Codeina, morfina, vancomicina și substanțele de contrast folosite în imagistică
pot determina șoc anafilactoid, cu aceleași manifestări ca în șocul anafilactic, însă fără participarea IgE.

Anticorpii anafilactici (reaginele) sunt anticorpi care se fixează prin fragmentul lor Fc pe receptorii specifici
exprimați la suprafața bazofilelor și mastocitelor.

Controlul producerii de IgE este realizat de LT. LTh2 stimulează producerea IgE (sunt implicate IL-4, IL-5, IL-
10). LTh1 inhibă producerea IgE (fiind implicate IFNγ și IL-12).

100
Th2 are o acțiune autocrină, secretă IL-4 cu acțiune atât
asupra LB cât și asupra celulei secretoare.

Sinteza de IgG4 și sinteza de IgE se află sub controlul

acelorași citokine și se realizează de aceeași populație
celulară. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulină
sunt situate foarte apropiat una de cealaltă, pe
cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4
devine independentă de cea de IgE nu este clar elucidat,

dar se pare că un rol l-ar putea juca Il-10.

Efectele diferite induse de cele 2 tipuri de imunoglobuline
se datorează structurii diferite. IgE prezintă față de IgG4
un domeniu constant suplimentar, o zonă balama diferită
și zone de recunoaștere pentru ambele tipuri de receptori:
FcεRI (afinitate înaltă) și FcεRII (afinitate joasă).

IgE au un timp de viață mai scurt (<2 zile) comparativ cu

21-23 zile pentru IgG, iar concentrația acestora este foarte
scăzută în serul individului normal.

Atașarea IgE de mastocite și bazofile (ca dimeri cuplați cu

alergenul) duce la creșterea duratei de viață a IgE de la

mai puțin de 2 zile la 10 zile.

IgE nu trec de bariera feto-placentară datorită faptului că
placenta nu conține FcεR. Ȋn sângele fetal se pot găsi IgE în
cantități sub 1UI/ml prin atașare de FcγRI de pe
macrofagele fetale. FcγRI pot semnaliza pentru
degranulare și după cuplarea cu alte molecule (ex. lectine,
Ac anti lanțt α FcγRI).

Bazofilele și mastocitele se caracterizează prin prezența unor granule metacromatice, roșii după colorația cu
albastru alcyan, datorită histaminei și heparinei.

Mediatorii mastocitari sunt reprezentați de histamină, leucotriene, prostaglandine, factorul activator

plachetar (PAF), adenozină, factori chemotactici pentru eozinofile (ECF) și neutrofile (NCF) și o serie de
citokine proinflamatorii (IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, GM-CSF, TNF-a, TGF-β1, IFN-g). La suprafața bazofilelor și
mastocitelor sunt exprimați diverși receptori, dintre care cei mai importanți sunt FceRI, FceRII (CD23) și C3aR
și C5aR (CD88).

Legarea reaginelor de receptorii FceRI, FceRII inițializează semnalizarea spre interiorul celulei, ducând la
activarea celulară.

Activarea bazofilelor și mastocitelor se realizează prin mecanisme mediate imun și necesită prezența unui
mesager secund intracelular (Ca2+ sau AMPc). Procesul de activare constă dintr-o serie de reacții biochimice
în trepte, cu participarea fosfolipidelor membranare, activarea PKC, fosforilarea tirozinei, toate ducând la

101
creșterea influxului de Ca2+ extracelular alături de mobilizarea rezervelor de Ca2+ intracelular. Rolul Ca2+ este
de a iniția eliberarea mediatorilor preformați și sinteza de novo a mediatorilor lipidici.

Exemplificăm efectele acestor mediatori prin histamină care produce:

· bronhoconstricție prin acțiune directă pe receptorii H1 ai musculaturii netede traheo-bronșice,

· vasodilatație arterio-capilară prin contracția fibrelor musculare netede din peretele venulelor
postcapilare,

· creșterea permeabilității capilare,

· creșterea motilității intestinale și

· reacție urticariană la nivel cutanat.

Mastocitele eliberează histamină și LTD4, care vor determina edem, hipersecreție de mucus și
bronhoconstricție, cu scăderea FEV1, însă eliberează și IL-5, TNFα, care vor atrage eozinofile, limfocite,
neutrofile și macrofage.

Aceste celule inflamatorii vor determina modificări cronice la nivelul plămȃnului: hiperplazie a celulelor
secretoare de mucus, depunere de colagen la nivelul membranei bazale și hiperplazie musculară netedă.
Aceste modificări vor determina o hiperreactivitate bronșică, dar de data aceasta, nespecifică
(hiperreactivitate bronșică la aer rece, efort). Activitatea inflamatorie care are loc la nivelul bronhiilor se
corelează cu valoarea NO expirat (inducere iNOS la nivelul macrofagelor), cu un număr crescut de eozinofile

și cu valori mari ale ECP (eozinophil cationic protein) în sputa indusă. Aceste teste nu au valoare diagnostică,
însa pot fi utilizate orientativ pentru aprecierea severității astmului.

Faptul că mastocitele intervin în ambele faze, imediată și tardivă, o demonstrează efectul benefic pe care îl
are cromoglicatul (stabilizator de membrană, se opune degranulării) în tratamentul astmului bronșic.
Corticosteroizii acționează numai pe răspunsul tardiv. Ei nu pot face discriminarea între implicarea
mastocitelor și LT în inflamația cronică datorită faptului că inhibă ambele celule.

Dintre manifestările clinice sistemice care pot apărea în cazul unei stări de HS de tip I, sunt de reținut:

- șocul anafilactic, care la om se manifestă prin colaps cardio-vascular și bronhospasm; în lipsa tratamentului
poate evolua către deces. Principalele antigene care pot declanșa șocul anafilactic sunt înțepăturile de
himenoptere (albine, viespii), injectarea unor medicamente (penicilina, miorelaxante, ACTH etc), latexul (la
infirmiere, chirurgi) și

- edemul Quincke care cuprinde fața, gura și uneori faringele și laringele, ducând la asfixie și deces.

Dintre manifestările clinice localizate ar fi de amintit:

- manifestările localizate la nivelul mucoasei oculare sau respiratorii, având drept principali agenți
declanșatori polenul, acarienii, praful de casă, sporii de ciuperci (conjunctivite alergice, rinite alergice inclusiv
febra de fân, traheita spasmodică și astmul alergic);

- manifestările cutanate (urticarie, dermatite sau eczema atopică) și

102
- manifestările digestive (diaree, vomismente în caz de alergie la laptele de vacă, ouă, pește, fructe, țelină
etc).

Fenomene experimentale

Patologia umană
HS de tip III se poate datora:

- unei infecții persistente (ex. lepră, malarie,

hepatită virală, endocardită stafilococică);

- unei boli autoimune (ex. artrită reumatoidă, lupus

eritematos sistemic, polimiozită);

- inhalării de material antigenic (ex. actinomicete în

cazul plămȃnului de fermier, antigene aviare în
cazul plămȃnul crescătorilor de păsări).

Complexele imune activează o serie de căi ale

răspunsului imun. Aminele vasoactive eliberate în
cadrul activării acestor căi determină retracția
celulelor endoteliale, ceea ce are ca efect creșterea
permeabilității vasculare, depunerea complexelor
imune, dar și expunerea colagenului, care va stimula agregarea trombocitelor și formarea de microtrombi.

Se intră într-un cerc vicios deoarece complexele imune depuse pe membrana bazală continuă să genereze
C3a și C5a (anafilatoxine). Astfel, complementul, inițial cu rol protectiv, determină ulterior creșterea
suplimentară a permeabilității capilare. Polimorfonuclearele sunt atrase și își exocitează conținutul în loc să
endociteze complexele imune (acestea nu pot fi desprinse de pe membrana bazală vasculară). Enzimele
inhibitoare serice împiedică enzimele lizozomale să acționeze la nivel sistemic, însă nu și local, de aceea se
vor genera leziuni tisulare locale. Eritrocitele primatelor conțin receptori pentru C3b, importanți pentru
preluarea complexelor imune și transportul lor către splina și ficat, unde vor fi fagocitate. Ȋn HS de tip III,
sistemul este suprasaturat, ceea ce îi scade eficiența. Complementul menține complexele Ag-Ac solubile pe
calea clasică și resolubilizează complexele Ag-Ac agregate pe calea alternă, de aici putȃndu-se deduce rolul
depleției de componente ale complementului sau a unor boli ereditare (deficit C2) în patologia HS de tip III.

Este importantă și dimensiunea complexelor imune. Cele mari sunt repede preluate de ficat și eliminate, în
timp ce complexele mici rămȃn în circulație o perioadă mai lungă de timp. Un defect genetic ce determină
sinteza de Ac cu afinitate joasă, va favoriza producerea de complexe Ag-Ac mici și deci, leziunile
caracteristice HS de tip III.

Depunerea complexelor imune

Administrarea de metilsergida sau clorfenilamina (antagoniști ai aminelor vasoactive) reduce considerabil

depunerea complexelor imune prin scăderea permeabilității vasculare.
103
Depunerea complexelor mai este dependentă de regimul presional crescut și de prezența turbulențelor. Ȋn
capilarele glomerulare presiunea sȃngelui este de 4 ori mai mare decȃt în restul capilarelor. Turbulențe se
întȃlnesc în zonele de bifurcație a arterelor și în zonele de filtru vascular (plexurile coroide și corpii ciliari).
Preferința pentru un țesut sau altul poate fi dependent de sarcina electrică a complexului imun, de gradul de
glicozilare a Ac.

Fenomene experimentale

Reacția Arthus a fost descrisă în 1903 de Maurice Arthus și Nicholas Breton, după injectarea subcutanată de
ser de cal la un iepure hiperimunizat. Leziunile au fost maxime după aproximativ 6 ore. Boala serică acută,
descrisă în 1911 de von Pirquet, a fost studiată din nou în anii 1960, descriindu-se zece modele de
glomerulonefrite experimentale (Dixon). Deoarece complexele imune circulante (CIC) se depozitează în
țesuturi, apare conceptul de antigen in situ. După ce complexul imun se formează în locul respectiv sau este
fixat secundar, se inițiază (așa cum am menționat anterior) o cascadă de evenimente:

· activarea complementului și a factorilor anafilactoizi chimiotactici C3a și C5a;

· afluxul de neutrofile, care produc leziuni prin enzimele lizozomale și

· afluxul de trombocite, cu generarea fenomenelor de tromboză.

Fenomenul Arthus a fost observat la iepure, cobai, șoarece etc, dar și la om. Experimentul a fost efectuat pe
iepure prin injectarea de antigen netoxic (ex. albumină) de la altă specie, asociat cu un adjuvant imun. După
unele rapeluri, necesare uneori pentru obținerea de anticorpi circulanți IgG precipitanți, reacția Arthus poate
fi obținută prin injectarea subcutanată a antigenului. Manifestările apar după 2 ore, atingând maximum la 6
ore și dispar după 24-48 ore. Constau în edem, eritem indurat, peteșii și uneori purpură necrotică sau chiar
necroză. Leziunile de la locul injectării antigenului duc la fixarea de igG și C3b cu sediul perivascular sau în
peretele vascular.

Boala serului

a) Boala serului acută. Înaintea erei antibioticelor, multe boli infecțioase erau tratate prin injectarea de ser
de cal hiperimunizat. În 1911, von Pirquet descrie complicațiile acestei terapii sub termenul de boală serică
(febră, artralgii, vasculită cutanată), survenită la unii bolnavi după 8-12 zile de la prima injecție.

Injectarea unică, pe cale intravenoasă, a unei substanțe netoxice, ca serumalbumina bovină (BSA), în
cantitate mare, la animalul neimunizat (iepure), este urmată de apariția bolii serice acute (experimentală) cu
3 faze: 1. faza anterioară imunizării (durează 5-8 zile. BSA marcată radioactiv, scade, inițial brutal prin
difuziune în spațiile extravasculare, apoi după 24 de ore, lent, corespunzător propriului catabolism); 2. faza
complexelor imune (corespunde prezenței concomitente de BSA și a anticorpilor anti-BSA); este boala serică
cu glomerulonefrită. În jurul zilei a 5-a, concentrația sangvină de BSA scade rapid. Anticorpii anti-BSA liberi

nu sunt decelabili decât după dispariția BSA liberă. Detectarea complexelor imune corespunde acestei
perioade, ca și scăderea complementului seric. Manifestările patologice nu sunt datorate anticorpilor anti-
BSA liberi și nici complexelor imune circulante. Ca și în reacția Arthus, leziunile sunt datorate acțiunii
complementului, care este urmată de un aflux de neutrofile. La animalul fără complement apare o simplă
albuminurie fără glomerulonefrită); 3. faza de restitutio ad integrum (nu mai există antigen liber sau conjugat
decelabil; anticorpii anti-BSA sunt crescuți; manifestările clinice, în special glomerulonefrita, regresează
rapid).

104
b) Boala serică cronică. Este dificil de reprodus la animal. Totuși administrarea repetată a antigenului (din 2
în 2 zile), permite producerea unei glomerulonefrite cronice extramembranare proliferante.

Patologia umană

Principalele afecțiuni umane sunt:

· bolile comparabile cu reacția Arthus (în care antigenul induce o reacție locală prin difuziunea
anticorpilor IgG precipitanți); un exemplu este boala plămânului de fermier [după contactul în timpul zilei cu
fânul mucegăit (Actinomyces thermophylus), apare la începutul nopții (după 6 ore) o stare de asfixie care

dispare în următoarele ore];

· manifestări mai generale, cu atingerea rinichiului, articulațiilor, pielii și uneori a creierului; apar leziuni
de tipul glomerulonefritei extramembranare, uneori proliferative. Afecțiunile mai frecvente sunt lupusul
eritematos diseminat, crioglobulinemia mixtă, glomerulonefritele și periarteritele poststreptococice etc. În
2/3 din cazurile de anemie hemolitică imuno-alergică medicamentoasă se formează anticorpi IgM anti-
medicament. În aceste cazuri apar adesea manifestări generale: febră, frison, mialgii cu dureri lombare și
uneori anurie tranzitorie, prin necroză tubulară acută.

Hipersensibilitatea de tip IV reprezintă o reacție (mai) întârziată, care apare la 48-72 de ore după

contactul cu antigenul și se datorează limfocitelor Th1 specifice antigenului. HS de tip IV este un tip exagerat
de răspuns imun celular.

HS de tip IV poate fi considerată ca un martor al mecanismelor protective față de germenii

intracelulari dar și de alte substanțe chimice care se leagă puternic de membrana celulară. Totuși, corelația
protecție-hipersensibiltate nu e perfectă, în sensul că se poate ca un pacient cu HS de tip IV la un anumit
germen să dezvolte infecții progresive cu acel patogen (ex. situația din infecțiile cu M. leprae).

Au fost descrise patru tipuri diferite de hipersensibilitate (de tip IV), dintre care ultimele trei sunt
importante în patologia umană.

Este o reacție epidermică, care corespunde la om cu eczema de contact / dermatita de contact. În

experimentele pe animal se plasează pe piele diferite antigene, care penetrează ușor în epiderm și se leagă
solid de celule. Cel mai frecvent se utilizează DNCB (dinitroclorbenzen), DNFB (dinitrofluorbenzen), Oxazolina
sau Clorura de picryl. DNCB este un exemplu de haptenă care sensibilizează aproape toți contacții, și pe care
o putem folosi ca să stimulăm imunitatea mediată celular.

Un rol important în sensibilizare îl joacă keratinocitele și celulele Langerhans.

105
 Reacția de hipersensibilitate de contact survine după ce animalul a fost sensibilizat în prealabil. După
o injecție ulterioară intradermică sau după aplicarea antigenului pe tegument, urmează legarea haptenei de
un carrier, complexul antigenic este fagocitat de o
celulă Langerhans care se va activa, matura și își va
începe migrarea spre zona paracorticală a nodulilor
limfactici sub acțiunea IL-1 și TNF secretați de
keratinocitele agresate.

Corespunde unei infiltrări dermice și epidermice,

edemului
ore, epidermic
care va persista și eritemului
câteva apărut după
zile. Absența 48-72
reacției se
datorează unui deficit imun celular. Sensibilizarea
prealabilă cu DNCB (ex. la fotografii) poate declanșa
un șoc anafilactic la IgE.

Primele modificări apar începând cu a 6-a până la a 8-

a oră după contactul cu alergenul; LT activate și cele
cu memorie vor ajunge în circulatie și ulterior în zona
inflamată, alături de monocite, unde vor îndepărta
complexul haptenă-carrier. Ele înconjoară vasele
sanguine, glandele sudoripare, glandele sebacee,
foliculii piloși și infiltrează epidermul. Infiltratul
celular se accentuează progresiv și ajunge maxim
spre a 72-a oră.

Infiltratul conține celule T CD4+ (în majoritate), T

CD8+, celule Langerhans, macrofage și bazofile.

Aceleași keratinocite, dar și macrofagele, vor produce

ulterior PGE, cu rol inhibitor al reacției inflamatorii.

LTs intervin de asemenea în terminarea reacției de

HS (la fel ca și ultravioletele), prin scăderea
producerii de IL-1. Ultravioletele inhibă direct și
celulele Langerhans.

Ȋn concluzie, fenomenele apar în următoarea

succesiune: celulele Langherhans activează LT CD4+
cu memorie; acestea produc diferite citokine: IL-2, IL-3, IFN-g și GM-CSF. Celelalte celule sunt recrutate și
activează o reacție inflamatorie în care predomină celulele mononucleare.

Persoanele infectate cu unul din germenii ( M. tuberculosis, M. leprae, Leishmania tropica etc.) / sau
care vin în contact cu substanțele chimice (beriliu, zirconiu etc.) care pot provoca hipersensibilitatea de tip
tuberculinic au LT deja activate.

106
 În laborator, pentru sensibilizare se injectează la un animal Ag împreună cu adjuvantul complet
Freund (pregătirea animalului prin imunodepresie cu ciclofosfamidă permite și utilizarea adjuvantului Freund
incomplet). Această fază de sensibilizare începe cu 2-3 săptămâni înainte de testarea HS.

După injectarea antigenului la animalul sensibilizat, LT specific sensibilizate migrează în jurul vaselor
sanguine (la 12 ore) iar activarea lor duce la secreția de interleukine care recrutează alte celule
nesensibilizate. Infiltratul desparte fibrele de colagen din derm și atinge un maxim la 48-72 ore după injecție.
Celulele observateinițial sunt LT [predomină T CD4+ (raport CD4/CD8 - 2/1)], ulterior încep să se acumuleze
macrofagele (atingând un maxim spre finalul celei de a treia zi de la inoculare).

Fenomenele sunt maxime la nivelul dermului dar pot atinge și epidermul; keratinocitele exprimă la
suprafața lor molecule HLA DR (la 48-96 de ore după apariția infiltratului limfocitar, fapt care va amplifica
răspunsul imun al gazdei), circulația aferentă și eferentă a celulelor imunocompetente seamănă cu cea
observată în hipersensibilitatea de contact; se poate observa o infiltrare ușoară cu bazofile; în timp se poate
dezvolta o reacție granulomatoasă.

La om se practică intradermoreacția cu tuberculină (PPD, derivat proteic purificat, un amestec

relativ bine standardizat de antigene proteice mycobacteriene). Citirea rezultatului se face după 72 ore,
asigurând o bună iluminare a zonei examinate (de preferat lumina naturală). Se identifică existența unei
eventuale arii intens eritemato-violacee, circumscriind urma înțepăturii dermice. Apoi se apreciază tactil
(prin repetate mișcări într-un sens și altul deasupra zonei de reacție) cu pulpa inelarului, limitele unei zone
de indurație (percepută ca fiind reliefată) și care corespunde histopatologic infiltrației dermice (edem,
limfocite, macrofage, PMN), reprezentând răspunsul imun față de antigenul injectat. Se măsoară și se
înregistrează „diametrul maxim” al zonei de infiltrație (a se vedea și anexa nr. 3). Leziunile dezvoltate la

injectarea intradermică de tuberculină se rezolvă în mod normal în 5-7 zile; persistența acestora face ca
leziunea să se transforme dintr-una tuberculinică într-una granulomatoasă.

Este o formă mai gravă de hipersensibilitate (întârziată) de tip IV care survine atunci când antigenul
persistă și nu poate fi eliminat. Se caracterizează printr-o acumulare și o proliferare de macrofage, care stau
la srcinea granulomului care apare la 21- 28 zile după sensibilizare și poate să persiste mai multe săptămâni.
Hipersensibilitatea granulomatoasă poate succeda diferite hipersensibilități întârziate precedente, în general
după o perioadă de 3 - 4 săptămâni.

Elementul distinctiv al hipersensibilității granulomatoase este formarea de celule epiteloide, celulele

derivate din macrofage, de dimensiuni mari pe seama dezvoltarii reticulului endoplasmatic, cu rolul lor de a
întreține inflamația prin secreția continuă de TNF. Persoanele cu deficit de IFN nu dezvoltă granuloame, însă
nici nu se apără eficient împotriva tuberculozei, leprei, leishmaniozei, schistosomiazei etc. Prin fuziunea

celulelor epiteloide rezultă

celulele Langerhans! Acestecelule
celulegigante.
giganteMai suntmulți
au mai denumite
nuclei,șiînsă
celule Langhans.
periferici, Atenție,
reticulul sunt diferite
endoplasmic de
este
puțin dezvoltat, iar mitocondriile și lizozomii sunt în degradare. Se pare ca aceste celule Langhans ar
reprezenta etapa finală din diferențierea macrofagelor.

Reacțiile de hipersensibilitate de tip IV observate în patologia umană pot fi observate în trei grupe
principale de afecțiuni:

107
1. Eczema de contact care poate apărea datorită bijuteriilor care conțin nichel, produselor din piele de
animal, produselor cu săruri de crom, cremelor „solare”, compușilor chimici de cauciuc, produselor
farmaceutice (penicilină, streptomicină, neomicină) etc;
2. Maladii infecțioase în care agenții patogeni se dezvoltă intracelular (tuberculoză, lepră, leishmanioză,
listerioză, micoze profunde etc);
a. Ȋn cazul M. tuberculosis, leziunea granulomatoasă conține pe lȃngă macrofage, celule epiteloide,
celule gigante și LT dispuse centrifug, și o zonă de necroză centrală, un fel de puroi numit
cazeum. Ȋn jurul întregului ansamblu se află o zonă de fibroză și o cantitate crescută de colagen.
b. Ȋn cazul M. leprae, reacția granulomatoasă se numește reacția Mitsuda.
c. Apariția de leziuni la injectarea de antigene splenice de la un alt pacient cu sarcoidoză unei alte
persoane cu sarcoidoză, constituie pozitivarea testului Kweim.
3. Alte maladii (sarcoidoză ciroză biliară primitivă, hepatitele cronice virale B și C, SIDA, infecția HIV,
poliartrita reumatoidă, reumatismul articular acut, b. Crohn etc).

108
 Carte curs
 Carte LP

109