LP 1

Demonstrarea ubicvităţii microorganismelor

OBIECTIVE: după această lucrare practică studenţii vor trebui să fie în măsură:
1. să diferenţieze ce este murdar de ce este curat, ce este steril de ce este contaminat şi cum.
se menţin separate aceste două calităţi;
2. să demonstreze că microorganismele sunt ubicvitare;
3. să precizeze care sunt sursele şi modalităţile de vehiculare a microbilor în mediul
ambiant;
4. să înţeleagă necesitatea asepsiei şi antisepsiei
5. să precizeze care sunt condiţiile indispensabile manipulărilor aseptice.

PLACA 1
Demonstrează:
 Prezenţa microorganismelor pe suprafaţa amprentelor digitale;
 Eficienţa decontaminării cu apă şi săpun;
 Influenţa umidităţii amprentelor asupra condiţiei lor microbiologice;
 Recontaminarea endogenă.

Utilizăm o placă cu mediu de cultură agar-sânge, împărţită în 4 cadrane:

 Cadran I - amprentele indexului şi mediusului mâinii drepte, înainte de spălare
 Cadran II – aceleaşi amprente, după spălare cu degetele ude
 Cadran III – aceleaşi amprente, după uscare
 Cadran IV – aceleaşi amprente, după 1,5 ore fără a atinge alte suprafeţe.

Rezultate:
Înainte După 24 h de incubare la 37oC

Cadranul I – în aria amprentelor apar mai multe tipuri de colonii dar predomină colonii mici,
albe, netede şi lucioase.
Cadranul II – după spălare cu degetele umede, se observă reducerea numărului de colonii dar
persistă coloniile mici, albe, netede şi lucioase.
Cadranul III – după uscare se observă o reducere mai accentuată a numărului coloniilor albe,
netede, lucioase.
Cadradul IV – creşte numărul de colonii, faţă de cadranul III, dar se menţine aspectul
morfologic.

1
Concluzii :
 Constant dominantă pe suprafaţa degetelor apare o specie care formează colonii mici,
albe, S (smooth – neted) (aparţin speciei, Staphylococcus epidermidis, important
reprezentant al florei rezidente a tegumentelor); alte bacterii apar variabil, în număr redus
şi formează flora flotantă a tegumentelor.
 Spălarea cu apă şi săpun îndepărtează eficient flora flotantă şi doar o reduce pe cea
rezidentă.
 Mâna se recontaminează în timp cu microorganisme adăpostite în anfractuozităţile
tegumentului.
 Apa (umiditatea) aduce la suprafaţa pielii micororganisme ascunse în aceste
anfractuozităţi.

PLACA 2
Demonstrează: favorizarea contaminării prin intermediul unei pelicule de lichid.

Utilizăm o placă cu mediu de cultură agar-sânge, împărţită în 3 cadrane:

 Cadran I – amprenta indexului drept uscat ;
 Cadran II – aceeaşi amprentăm pe o picătură de apă sterilă
 Cadran III – o picătură de apă distilată sterilă (martor).
Rezultate:
Înainte După 24 h de incubare la 37oC

Cadranul I – în aria amprentei apar colonii mici, albe, netede şi lucioase.

Cadranul II – acelaşi tip de colonie, dar dispersate pe o suprafaţă mai mare.
Cadranul III – nu se observă nici o colonie.

Concluzii:
 Apar colonii cu aceaşi morfologie ca în experimentul anterior: colonii mici, albe, S
(aparţin speciei, Staphylococcus epidermidis, important reprezentant al florei rezidente a
tegumentelor);
 Contaminarea microbiană a unei suprafeţe uscate se circumscrie numai în punctele de
contact cu suprafaţa contaminată.
 Pe o suprafaţă udă microbii contaminanţi difuzează în afara punctelor de contact.

Se va discuta cu studenţii importanţa uscării tegumentului înaintea unei puncţii şi importanţa

utilizării instrumentelor medicale sau chirurgicale sterile şi uscate.

2
PLACA 3
Demonstrează:
 Varietatea microbiotei tegumentului în funcţie de regiuni
 Surse de recontaminare a mâinii

Utilizăm o placă cu mediu de cultură agar-sânge, împărţită în 3 cadrane:

 Cadran I – amprentele indexului şi mediusului drepte spălate, uscate
 Cadran II – amprenta indexului spălat după ce a atins plica cotului
 Cadran III – amprenta mediusului spălat după ce a atins sanţul naso-genian.

Rezultate:
Înainte După 24 h de incubare la 37oC

Cadranul I – în aria amprentelor apar colonii mici, albe, netede şi lucioase.

Cadranul II – în aria amprentei indexului apare un număr redus de colonii cu acelaşi aspect cu
cele din cadranul I
Cadranul III – în aria amprentei mediusului apare un număr mai mare de colonii şi de mai
multe tipuri, dar predomină cele mici, albe, netede şi lucioase.

Concluzii :
 Apar colonii cu aceaşi morfologie ca în experimentele anterioare colonii mici, albe, S
(aparţin speciei, Staphylococcus epidermidis, important reprezentant al florei rezidente a
tegumentelor);
 În toate regiunile cutanate flora este dominată de stafilococi.
 Există variaţii importante de la o regiune la alta privind densitatea florei rezidente şi
varietatea florei flotante.
 Importanţa practică a acestei demonstraţii este alegerea ca loc de elecţie a puncţiei
venoase, venele de la plica cotului deoarece tegumentul de la acest nivel reprezintă o
zonă cu o încărcătură microbiană mai redusă (protejată de îmbrăcăminte, expunere mai
redusă la flora flotantă, mai puţine glande sebacee).
 Mâna este un vehicul al microbilor de primă importanţă în practica medicală.

Se va discuta cu studenţii despre tipurile de spălare (medicală, chirurgicală), importanţa

igienizării unghiilor la personalul medical, importanţa utilizării mănuşilor de către chirurg.

3
PLACA 4
Demonstrează: Condiţia micorbiologică a părului şi scuamelor.

Utilizăm o placă cu mediu de cultură agar-sânge: un student îşi trece de câteva ori mâna prin păr
deasupra unei plăci deschise.

Rezultate:
Înainte După 24 h de incubare la 37oC

Rezultate: se observă predominat acelaşi tip de colonii, iar în jurul firului de păr se observă
cultură confluentă aparţinând probabil aceleiaşi specii bacteriene (suprafaţa alba, lucioasă,
netedă)
Concluzie:
 Apar colonii cu aceaşi morfologie ca în experimentele anterioare colonii mici, albe, S
(aparţin speciei, Staphylococcus epidermidis, important reprezentant al florei rezidente a
tegumentelor);
 Firele de păr şi scuamele cutanate vehiculează microbi din flora tegumentului şi sunt un
important element de contaminare a mediului.

Se va discuta cu studenţii despre importanţa folosirii corecte a bonetei. Boneta este utilizată de
personalul medical ce lucrează în secţiile chirurgicale şi de terapie intensivă şi care vine în
contact cu pacienţi imunocompromişi. Boneta trebuie să acopere părul în totalitate.

PLACA 5
Demonstrarea şi cuantificarea prezenţei microorganismelor din aerul sălii de lucrări practice.

Utilizăm o placă cu mediu de cultură agar-sânge: placa este lăsată deschisă pe masă timp de 10
minute.
Cuantificare:

Nr. Bacterii/mc = N x 10000/S x k, unde: N = nr. colonii pe placă, S = suprafaţa plăcii

(diametrul plăcii este 9 cm), k = constantă (=2 la expunerea de 10 minute)

4
Rezultate:

Înainte După 24 h de incubare la 37oC

Rezultat: mai multe tipuri de colonii cu aspect diferit faţă de cele observate pe piele, în
experimentele anterioare.
Nr. bacterii/mc = 39 x 10.000/63,58 x 2= 3067 bacterii/mc

Concluzie:
 Concentraţia microbilor din aer este direct legată de concentraţia pulberilor şi aerosolilor
care îi vehiculează.
 Surse de aerosoli contaminanţi sunt: nasul, naso- şi orofaringele, cavitatea bucală
(picături Flügge), funcţionarea unor instalaţii (aer condiţionat).
 Surse de pulberi sunt: scuamele animale, nucleii de picătură, solul, excretele desicate şi
fărâmiţate, scuamele din îmbrăcăminte şi lenjerie.

Se vor discuta cu studenţii modalităţile de reduce a încărcăturii microbiene a unei încăperi

(aerisirea încăperilor, ştergerea suprafeţelor şi utilizarea aparatelor de aer condiţionat prevăzute
cu filtru, utilizarea lămpilor UV în sălile de operaţie şi în încăperile de turnare a mediilor). De
subliniat, că ulterior, la Igiena mediului (respectiv a aerului) (anul IV) studenţii vor afla care sunt
limitele maxime admise pentru încărcătura microbiană, în funcţie de tipul încăperii (ex. săli
aşteptare, cabinete medicale, săli de pansamente, săli de operaţii, etc).

PLACA 6

Demonstrează: Condiţia microbiologică a picăturilor Flügge

Utilizăm o placă cu mediu de cultură agar-sânge: un student tuşeşte în faţa plăcii

deschise, aflate la 30 cm.

5
Rezultate:
Înainte După 24 h de incubare la 37oC

Rezultate – se observă mai multe tipuri de colonii cu predominenţa coloniilor mici înconjurate
de o zonă de culoare verzuie a mediului (colonii alfa-hemolitice).

Concluzie:
 Picăturile Flügge vehiculează un număr mare de microbi găzduiţi în căile aeriene
superioare sau duşi la acest nivel odată cu exsudatul traheo-bronho-alveolar.

PLACA 7
Demonstrează: Efecienţa măştii chirurgicale în reţinerea picăturilor Flügge

Utilizăm o placă cu mediu de cultură agar-sânge: un student tuşeşte în faţa plăcii

deschise, aflate la 30 cm, studentul purtând o mască.

Rezultate:
Înainte După 24 h de incubare la 37oC

Rezultat : absenţa coloniilor

Concluzie:
 Masca previne contaminarea mediului cu picături Flügge.

Se va discuta importanţa aplicări corecte a măştii şi protecţia ei în dublu sens (personal medical
versus pacient).

PLACA 8
Martor sterilitate mediu.

Bibliografie: Microbiota indigena - Cap. 6.2. pag 86-87

6
 LP 2 - 3
Decontaminarea microbiană

OBIECTIVE: după această lucrare practică studenţii vor trebui să fie în măsură:
1. Să definească noţiunile: steril, sterilizare, septic/aseptic, dezinfecţie, antiseptizare,
prezervare.
2. Să aleagă corespunzător metodele de sterilizare şi dezinfecţie în funcţie de condiţiile de
risc şi nivelul de eficienţa al acestora
3. Să discute despre decontaminarea mecanică
4. Să discute despre decontaminarea prin metode fizice
5. Să discute despre decontaminarea prin metode chimice

DEFINIŢII

Contaminar prezenţa microorganismelor pe o suprafaţă

e
Colonizare prezenţa şi multiplicarea unui microorganism pe suprafaţa gazdei, farǎ o reacţie
deosebitǎ din partea acesteia
Septic contaminat cu microbi patogeni sau infectat (în cazul plăgilor
Aseptic lipsit de microbi patogeni
Asepsie ansamblul metodelor prin care evităm contaminarea unui substrat sau a unor
elemente de mediu, a căror condiţie microbiologicǎ trebuie respectatǎ.
Antisepsie distrugerea sau îndepărtarea formelor vegetative ale microorganismelor, dar nu
în mod necesar şi a sporilor bacterieni, de pe suprafeţe vii.
Antiseptic substanţǎ antimicrobianǎ pentru aplicǎri pe suprafeţe vii (tegumente, mucoase,
plăgi).
Dezinfecţie distrugerea sau îndepărtarea formelor vegetative ale microorganismelor, dar nu
obligatoriu a sporilor bacterieni, de pe suprafeţe inerte
Dezinfectant substanţǎ antimicrobianǎ pentru aplicǎri pe materiale inerte
Steril lipsit total de microorganisme viabile
Sterilizarea distrugerea sau îndepărtarea tuturor microorganismelor, de pe o suprafaţă sau
dintr-un obiect, inclusiv a sporilor bacterieni
Prezervare prevenirea multiplicării unor microorganisme în produse farmaceutice,
alimentare.

Alegerea metodelor de sterilizare sau dezinfecţie

Selecţionarea metodei se realizează în funcţie de riscul pe care îl prezintă contaminarea într-o

condiţie concretă (Condiţii de risc)
1. Critice (cu risc înalt de contaminare)
o Sterilizarea este obligatorie
o Materiale sau instrumentare ce realizează contact direct cu ţesuturile şi cu mediul
intern: intrumentar chirurgical, materiale de sutură, seringi, catetere, soluţii
injectabile
7
 o Recipiente, medii de cultură şi instrumentar (examene microbiologice)
2. Semicritice (cu risc intermediar de contaminare)
o Dezinfecţie de nivel înalt
o Instrumentar care vine în contact cu mucoasele: endoscoape, sonde, termometre,
apăsătoare de limbă
o Sticlărie şi materiale care au venit în contact cu sânge sau alte produse biologice.
3. Necritice (cu risc minim de contaminare)
o Dezinfecţie de nivel mediu sau scăzută
o Instrumentar care vine ăn contact cu tegumentul intact
o Veselă, lenjerie
o Mâinile personalului medical

Nivele de eficienţă a decontaminării

 Înalt = sterilizare; indicat în condiţii critice

 Mediu = dezinfecţie eficientă; indicat în condiţii semicritice
 Jos = dezinfecţie, antiseptizare, decontaminare mecanică; indicat în condiţii necritice

Factori ce influenţează eficienţa decontaminării

1. Intensitatea şi timpul de acţiune al agentului decontaminant – timpul de omorâre variază
invers proporţional cu intensitatea agenţilor antimicribieni
2. Mediul în care acţionează (substanţele organice, turbiditatea mediului, duritatea apei, pH-
ul pot diminua acţiunea decontaminantului)
3. Concentraţia microorganismelor (pentru aceeaşi intensitate a unui agent antimicrobian,
timpul de omorâre creşte proporţional cu concentraţia acestora = efect populaţional)
4. Rezistenţa microorganismelor (unele specii de BGN prezintă rezistenţă faţă de multe
antiseptice şi dezinfectante; bacteriile metabolic active sunt mai sensibile decât cele în
stare dormandă)

Rezistenţa la agenţi antibacterieni a diferitelor tipuri de microorganisme

Cele mai rezistente - Spori bacterieni

Micobacterii
Virusuri nude
Bacterii gram-negative
Fungi
Bacterii gram pozitive
Cele mai puţin rezistente - Virusuri învelite

AGENŢI DE DECONTAMINARE

 Mecanici: spălare cu apă şi săpun

8
  Fizici:
o căldura uscată/umedă;
o temperatura scazuta;
o radiaţii (neionizante / ionizante);
o ultrasunete;
o filtrare.
 Chimici: substanţe antimicrobiene

DECONTAMINAREA MECANICĂ – Spălarea mâinilor

În funcţie de nivelul de asepsie cerut de manevra ce urmează a fi efectuată, există 3 proceduri de

spălare a mâinilor, cu menţiunea că orice manevră (umezire, săpunire, clătire, frecare) începe din
zone curate şi se termină cu cele murdare, degetele fiind orientate în sus, după ce au fost
îndepărtate toate inelele şi brăţările de la mână.

1. Spălarea igienică (simplă) include:

 Umezire cu apă a mâinilor, pumnilor şi antebraţelor care vor fi ţinute vertical cu degetele
orientate în sus, astfel ca apa să curgă spre coate.
 Săpunire în aceeşi ordine şi poziţie:
o Frecare de câte 5 ori a:
 Palmelor între ele
 Palma dreaptă peste mâna stângă
 Palma stângă peste mâna dreaptă
 Palmele între ele cu degetele flectate şi încrucişate
 Deget mare drept prin rotaţie cu mâna stângă
 Deget mare stâng prin rotaţie cu mâna dreaptă
 Palma stângă prin rotaţie cu mâna dreaptă cu degetele flectate
 Palma dreaptă prin rotaţie cu mâna stângă cu degetele flectate
o Se săpunesc cu atenţie prin frecare extremităţile degetelor, spaţiile periunghiale,
spaţiile interdigitale, articulaţia pumnului şi antebraţul pentru fiecare parte, ţinând
degetele orientate în sus.
 Clătirea cu apă dinspre zone spălate spre cele nespalate, degetele fiind orientate în sus
astfel ca apă să se scurgă spre coate.
 Durata etapelor descrise este în medie de 30 secunde.
 Uscare prin ştergere cu prosop de unică folosinţă steril sau nesteril (din hârtie)
 Închiderea robinetului cu mâna în care se păstrează prosopul deja folosit
 Aruncarea prosopului în recipienţi speciali
În situaţii de urgenţă ca înlocuitor al spălatului se practică aplicarea de soluţie antiseptică pe
tegumentele mâinilor şi frecarea acestora timp de 15-30 secunde. După mai multe utilizări
mâinile trebuie spălate conform procedurii standard.

2. Spălarea aseptică

Pe lângă procedura standard, include după umezire, săpunire şi clătire de aproximativ 1 minut,
uscare în aer prin ţinerea mâinilor cu degetele în sus şi în plus dezinfecţie cu soluţie antiseptică
(betadine, clorexidină şi soluţie hidroalcoolică) prin aplicare pe tegumentul uscat şi frecare până
9
la pătrunderea integrală a acesteia în tegument (aproximativ 30 secunde). Procedura se încheie
prin aşteptarea (1-2 minute) până la uscarea tegumentelor.
Când cele 2’30” -3’30”, necesare acestei procedurii nu sunt disponibile, în urgenţă, se poate
folosi metoda rapidă prin aplicarea numai a antisepticului pe tegument, ceea ce necesită aprox.
30 secunde.

3. Spălarea chirurgicală
Pe lângă procedura standard, include după umezire cu apă sterilă, săpunire şi clătire, o frecare
cu perie sterilă şi săpun lichid antiseptic, a unghiilor timp de 30 secunde pentru fiecare mână
urmată din nou de clătire. Se continuă cu o nouă săpunire, clătire şi antiseptizare prin aplicare şi
frecare până la pătrunderea completă în tegument. Uscarea finală a mâinilor se face prin ştergere
cu prosop steril începând cu degetele şi terminând cu coatele sau prin expunerea la aer cu
ţinerea mâinilor în sus. Abia apoi se pot pune mănuşile necesare procedurilor sterile.
În situaţii de urgenţă (procedura fiind de lungă durată - aproximativ 5-10 minute, greoaie) s-a
propus o variantă scurtă care include săpunire, clătire, uscare şi antiseptizare cu 2 tipuri de
soluţie, urmată de punerea mănuşilor sterile.

DECONTAMINAREA FIZICĂ

A. CĂLDURA

 Sterilizarea prin căldură este cea mai folosită în practica medicală

 Avantaje: nu este costisitoare, este uşor de realizat şi controloat
 Dezavantaje: nu toate produsele supuse sterilizării prin căldură rezistă la temperature
înalte
 Căldura umedă este mai nocivă decât caldura uscată
 Căldura uscată deshidratează celulele, iar desicaţia face ca unele cellule să intre într-o
stare inactive – necesar utilizarea unor temperature mai înalte pentru a obţine efectul –cid;

CĂLDURA USCATĂ

 Sterilizarea prin ardere în flacără

o Încălzirea la roşu – firul drept, ansa şi spatula de însămânţare
o Flambarea – gura eprubetelor şi flacoanelor, tija ansei de însămânţare
o Incinerarea – materiale dispozabile contaminate, reziduuri organice

 Sterilizarea prin aer cald (etuvă)

Etuva = cutie metalică cu pereţi dubli termoizolaţi, prevăzută cu rezistenţe electrice pentru
încălzirea aerului, un termostat ce permite menţinerea constantă a temperaturii la valoarea
programată şi un ventilator ce asigură uniformizarea temperaturii aerului în incintă
o Principiu: căldura uscată omoară microorganismele printr-un proces de oxidare
o Indicaţii:
 obiecte din sticlǎ (eprubete, pipete, baloane);
 obiecte din porţelan (mojar);
 instrumentar chirurgical metalic (pense, bisturie, foarfece);
 pulberi inerte higroscopice (talc);
10
  uleiuri minerale.
o Contraindicaţii:
 soluţii apoase;
 obiecte din cauciuc sau cu garnituri din cauciuc;
 seringi din sticlă cu metal;
 ţesături şi vată din bumbac sau fibră sintetică;
 materiale contaminate din laborator.
o Parametri:
 temperatura = 170 - 180 ° C;
 timpul = 60 minute.

timpul de sterilizare = t egalizare a temperaturii + t omorâre a microbilor.

≈ natura, forma, = constant
volumul materialelor

o Etape de lucru:
 constituirea lotului de sterilizare
 aşezarea obiectelor ambalate şi a martorilor în etuvă
 programarea temperaturii de sterilizare şi conectarea la sursa de curent
 sterilizarea (timpul de sterilizare se măsoară din momentul atingerii
temperaturii de sterilizare)
 răcirea materialelor
 controlul martorilor

o Controlul de calitate/martori:
 martori fizici: temperatura
 martori chimici: benzi adezive a căror culoare virează corespunzător
numai când sunt respectaţi cei doi parametri ai sterilizării.
 martori biologici: benzi de hârtie de filtru impregnate cu 10 6 spori de
Bacillus subtilis; după sterilizare sunt aseptic transferate în eprubete cu
mediu de cultură (10ml), menţinute la 37oC, 48 h; cultura negativă =
steriliare eficientă.
 Martorii fizici şi chimici trebuie verificaţi la fiecare ciclu al sterilizării, iar
martorii biologici trebuie verificaţi săptămânal

CĂLDURA UMEDĂ

Temperaturi mai mici de 100oC

Pasteurizarea

 Foloseşte acţiunea combinată a caldurii umede şi a frigului

 Încălzirea lichidelor alimentare la temperaturi între 63oC şi 135oC distruge formele
vegetative, dar nu si sporii bacterieni.
 Refrigerarea imediată la 4oC completează, prin şoc termic, efectul micrbiocid al cşldurii
şi împiedică multiplicarea microorganismelor
Tip de pasteurizare Temperatură Timp
11
 Joasă 63 oC 30 minute
Medie 72 oC 15 secunde
Înaltă (UHT) 135 oC 1 secundă

Tyndallizarea (sterilizarea fracţionată)

 Indicaţii: substanţe termolabile (medii de cultură, alimente).

 Parametri: 30-60 min., 3-8 zile consecutiv, la 56-100ºC
 Principiu: în intervalul dintre expuneri, produsele sunt menţinute la temperatura camerei,
ceea ce permite germinarea sporilor, formele vegetative care rezultă fiind distruse la al
doilea sau urmatoarele tratamente termice.

Temperatura de 100oC
Fierberea

 Omoară formele vegetative ale bacteriilor, aproape toate virusurile şi fungii în cca. 10
minute, virusul hepatitei B în cca. 30 minute, iar unii endospori bacterieni în peste 20 de
ore.
 Indicaţii: decontaminarea apei de băut, lenjeriei, instrumentarului de mică chirurgie în
urgenţe (în absenţa celui steril); fierul de călcat cu aburi distruge formele vegetative
bacetriene în 5-10 secunde.
 Parametri: 30 min., 100ºC
 Instrumentele se aşează pe un grătar ce se ridică aseptic la sfârşitul fierberii;
instrumentele fierbinţi se usucă pe fierbătorul fierbinte.

Temperaturi peste 100oC

Sterilizarea prin vapori de apă sub presiune (autoclav)

Autoclavul = incintă cu axul vertical sau orizontal, cu pereţi metalici rezistenţi şi un sistem de
închidere ermetică, în care vaporii de apă se comprimă la presiunea necesară sterilizării.
o Principiu: căldura umedă omoară microorganismele prin coagularea
proteinelor; căldura umedă este mai nocivă decât cea uscată.
o Indicaţii:
 soluţii (medii de cultură);
 sticlărie de laborator cu destinaţii speciale (pentru culturi de celule);
 bioreziduuri (culturi microbiene, produse biologice);
 material chirurgical din bumbac;
 obiecte şi instrumente din cauciuc;
 instrumentar metalic
o Parametri:
 presiune 0,5 atm 1 atm 2 atm
 temperatură 115ºC 121ºC 134ºC
 timp (formulă de calcul)

timpul de sterilizare = t egalizare a temperaturii + t omorâre a microbilor.

≈ natura, forma, = constant
12
 volumul materialelor
o Etape de lucru:
 constituirea lotului de sterilizare,
 verificarea nivelului apei din interiorul autoclavului,
 introducerea materialelor ambalate şi a martorilor,
 închiderea autoclavului,
 evacuarea aerului (se cufundă într-un vas cu apă un tub de cauciuc adaptat
la robinetul de vapori; aerul este complet evacuat din incinta de sterilizare,
când încetează a mai barbota în apă)
 închiderea robinetului de evacuare a aerului
 ridicarea presiunii,
 sterilizarea (se urmăreşte realizarea temperaturii de sterilizare şi a timpului
corespunzător de menţinere a acesteia),
 coborârea presiunii,
 deschiderea aparatului (imediat ce presiunea a ajuns la 0; lichidele fierbinţi
vor fierbe exploziv şi pot sparge flacoanele dacă presiunea este mai mare
de 0)
 uscarea materialelor (în autoclav, cu capacul deschis – vaporii de apă vor
împiedica depunerea pulberilor),
 verificarea martorilor,
 marcarea şi sigilarea materialelor.
o Controlul de calitate/martori:
 martori fizici: temperatură, presiune
 martori chimici: benzi adezive a căror culoare virează corespunzător
numai când sunt respectaţi parametrii sterilizării (temperatură şi timp).
 martori biologici: 106 spori de Bacillus geostearothermophilus în fiole cu
medii de cultură. după sterilizare, distrugerea sporilor este atestată prin
absenţa cultivării, la 57oC, 48 h;
 martorii fizici şi chimici trebuie verificaţi la fiecare ciclu al sterilizării, iar
martorii biologici trebuie verificaţi săptămânal

B. FRIGUL
Refrigerarea (0oC – 7oC)
 efect bacteriostatic
 modalitate de conservare a culturilor microbiene, produse biologice, alimente

Congelarea
 peste -20 oC are efect microbiocid
 rapidă la peste -80 într-un mediu protector (bulion glicerinat) poate asigura
indefinit menţinerea viabilă a microorganismelor

C. DESICAREA
 Este folosită în microbiologie pentru conservarea îndelungată a tulpinilor unor
bacterii sporulate

D. PRESIUNEA OSMOTICĂ

13
  Mediul hipertonic determină plasmoliza celulelor, blocând multiplicarea lor; în
final determină moartea acestora
 Prezervare alimente (saramurare sau concentraţii crescute de zaharoză)

E. RADIAŢIILE
Radiaţiile neionizante (UV)
 Afectează replicarea ADN-ului celular
 Efect intens microbiocid la o lungime de undă de 260 nm
 Slabă penetrabilitate (dezavantaj)
 Lămpi UV- săli de operaţie, boxe pentru lucru aseptic, suprafeţe de lucru în
laborator
Radiaţiile ionizante (razele X şi gamma)
 Determină ionizarea apei cu formare de radicali toxici hidroxil ce acţionează
asupra componentelor celulare.
 Efect microbiocid la lungimi de unde mai mici de 1 nm
 Importantă penetrabilitate
 Radiaţiile gamma – sterilizarea în condiţii industriale a seringilor de unică
folosinţă, mănuşilor chirurgicale, materialelor de sutură
 Control sterilizare – benzi impregnate cu 106 spori de Bacillus pumilus

F. FILTRAREA
 Filtrarea este o metodă de decontaminare a aerului sau a unor soluţii degradabile
prin căldură
 Filtrele cu pori de 0,01µm pot reţine inclusiv virusurile mici, având efect
sterilizant
 Filtrele HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters) – folosite pentru
sterilizarea aerului în boxele de siguranţă antiepidemică, sălile de operaţie, în
saloanele pacienţilor cu boli cu transmitere aeriană, pacienţi imunocompromişi,
arşi.

AGENŢI CHIMICI

Clasificare:
 Agenţi de denaturare a stării coloidale a proteinelor (acizi, alcooli)
 Agenţi blocanţi ai grupărilor chimice libere a enzimelor (peroxizi, metale grele,
formaldehidă, oxid de etilen)
 Agenţi care lezează membranele celulare (fenoli, detergenţi)
 Agenţi care alterează acizii nucleici (derivaţi de anilină, acridină)

Există diferenţe în ce priveşte eficienţa antimicrobiană, activitatea în prezenţa substanţelor

organice, toxicitate; curat/murdar; necesitatea penetrării agentului dezinfectant.

FENOLUL ŞI DERIVATII FENOLICI

 Acţiune: denaturează proteinele şi lezează membrana celulară

 Nivel de eficienţă: intermediar spre scăzut
14
  Spectru: bacterii Gram pozitive;
 Utilizare: dezinfectant şi antiseptic
 Exemple: fenolul, compuşii fenolici

ALCOOLII
 Acţiune: denaturează proteinele şi lezează membrana celulară
 Nivel de eficienţă: intermediar
 Spectru: bactericid (inclusiv pe Mycobacterium), fungicid, virucid (virusuri cu anvelopa);
cu toate acestea, ele NU sunt eficiente împotriva endosporilor bacterieni
 Utilizare: dezinfectant, antiseptic şi dizolvant în tincturi
 Exemple: soluţii de alcool 70% - 90%
o Etanolul
o Izopropanolul - are o activitate bactericidă mult mai bună

HALOGENI
 Acţiune: denaturarea proteinelor, inclusiv a enzimelor.
 Nivel de eficienţă – Intermediar
 Spectru: forme bacteriene vegetative, fungi, unii endospori bacterieni şi numeroase
virusuri
 Utilizare: antiseptic, dezinfectant
 Exemple: iod, clor, brom, fluor.

AGENŢII OXIDANŢI
 Acţiune: denaturarea proteinelor prin oxidare
 Nivel de eficienţă – înalt
 Spectru: deosebit de eficienţi împotriva microorganismelor anaerobe
 Utilizat: dezinfectant, antiseptic pentru leziuni profunde, sterilizarea echipamentului
medical
 Exemple: Peroxizii, ozonul şi acidul peracetic
AGENŢI TENSIOACTIVI
 Acţiune: reduc tensiunea superficială a apei şi lezează membrana celulară
 Nivel de eficienţă: scăzut
 Spectru: bactericide, în special împotriva bacteriilor Gram-pozitive, fungi, virusuri cu
anvelopa
 Utilizat: dezinfectant, antiseptic pentru leziuni profunde, sterilizarea echipamentului
medical
 Reprezentanţi: săpunurile şi detergenţii.

METALE GRELE
 Acţiune: denaturează proteinele
 Nivel de eficienţă: scăzut
 Reprezentanţi: argintul, mercurul, cromul

ALDEHIDELE
 Acţiune: denaturează proteinele şi inactivează acidul nucleic
 Nivel de eficienţă: înalt
 Spectru: bactericid, fungicid şi virulicid
15
  Reprezentanţi: glutaraldehida 2% şi formaldehida (soluţie de 37%)

AGENŢII GAZOŞI
 Acţiune: denaturează proteinele
 Nivel de eficienţă: înalt
 Reprezentanţi: oxidul de etilena, oxid de propilenă şi beta-propiolactona

ENZIMELE
 Acţiune: denaturează proteinele
 Nivel de eficienţă: înalt împotriva substratului ţintă (prioni)
 Reprezentant: Prionzyme

Reguli privind utilizarea corectă a dezinfectantelor:

1. Soluţiile se prepară în momentul folosirii
2. În alegerea concentraţiilor se va ţine seama de condiţia curat/murdar a obiectelor supuse
acţiunii dezinfectantelor
3. Pentru decontaminarea mâinilor, întotdeauna soluţia antiseptică se toarnă pe mâini
(introducerea acestora în soluţie conduce la inactivarea rapidă a efectului antimicrobian)
4. Nu supraîncărca, pentru a evita scurgeri contaminante la mobilizarea borcanului
5. Nu introduce obiecte care plutesc decât dacă pot fi umplute şi imersate complet sau dacă
borcanul are capac şi poate fi înclinat repetat.
6. Nu introduce materiale cu conţinut proteic mare, ci colectează-le separat pentru
autoclavare directă.
7. Nu dilua dezinfectantul prin scurgeri de lichide. Pentru supernatantul din tuburile de
centrifugă foloseşte un container separat cu soluţie mai concentrată de dezinfectare şi
prevăzut cu pâlnie pentru reţinerea aerosolilor contaminanţi.
8. Nu lăsa mai mult de 24 de ore materialele în soluţia dezinfectantă şi nu refolosi soluţia
pentru că se pot selecta şi înmulţi bacterii de contaminare rezistente
9. Soluţiile dezinfectante nefolosite 24 de ore se aruncă.

Bibliografie : Cap 7.2. pag 120-129

16
 LP 4
Examenul microscopic în diagnosticul bacteriologic. Coloraţii utilizate în bacteriologie

Obiective: La sfârşitul acestei lucrări practice studenţii trebuie:

1. Să identifice părţile unui microscop optic şi să il manipuleze corect în scopul efectuării
unui examen microscopic.
2. Să cunoască etapele efectuării unui preparat microscopic în laboratorul de
microbiologie (preparat umed, frotiu).
3. Sa cunoască tipurile de coloratii utilizate în microbiologie.
4. Să cunoască etapele coloraţiei Gram şi să interpreteze rezultatele controlului de calitate
al acesteia.
5. Să cunoască importanţa medicală a coloraţiei Gram.
6. Să descrie corect caracterele morfo-tinctoriale ale bacteriilor observate la examenul
microscopic al unui frotiu colorat.
7. Sa cunoască avantajele şi dezavantajele examenului microscopic

Microscopul optic este format din:

 o parte mecanică (talpa, corpul ansamblului mişcărilor: braţul microscopului, suportul
condensorilor, masa port obiect);
 sistemul optic (obiective, oculare);
 sistem de iluminare.

Puterea de mărire a unui microscop = produsul dintre puterea de mărire a obiectivului, a

ocularului şi a capului binocular (pentru microscoapele binoculare).

Preparate microscopice

a. Preparate microscopice umede

Metoda este indicată pentru observarea rapidă a:

 motilităţii microorganismelor
 spirochetelor (microscopia pe fond întunecat)
 fungilor
 protozoarelor
 elementelor celulare şi necelulare (în produse patologice).

Tehnica:
 Se pune o picatură din produsul de examinat pe o lamă curată şi degresată
 Se acoperă picătura cu o lamelă
 Se aşează preparatul pe masa port-obiect a microscopului

17
  Se alege obiectivul adecvat: scrutarea preparatului cu obiectiv de 10X, observarea
detaliilor cu obiectivul de 20X sau 40X (NU se utilizeaza obiective cu imersie)
 Se reglează iluminarea cu închiderea diafragmei de apertură până la obţinerea celui
mai bun constrast.
 După examinare se depune preparatul într-un recipient cu soluţie dezinfectantă.

Interpretare:
 Un organism este mobil când îşi modifică poziţia faţă de un reper din vecinătate

b. Preparate microscopice colorate

Principiu:
 Fixarea coloranţilor pe structura protoplastului permite observarea detaliilor
morfologice;
Indicaţii:
 Evidenţierea caracterelor morfologie ale bacteriilor (mărime, formă, aşezarea, unele
structuri speciale)
 Evidenţierea afinităţii tinctoriale (în coloraţiile diferenţiale).

Frotiul

Definiţie:
 Frotiul este materialul microbian (produs patologic, cultură microbiană) etalat în strat cât
mai subţire şi uniform pe suprafaţa unei lame de microscop.

Etapele efectuării frotiului.

1. Etalarea.
 Cultură bacteriană în mediu lichid – se prelevă aseptic cu ansa o picătură şi se
etalează în centrul lamei, în strat cât mai subţire, prin mişcări circulare,
excentrice, pe o suprafaţa de 1-2 cm2 , fără a atinge marginile lamei
 Cultură bacteriană de pe mediu solid – se prelevă cu ansa o secţiune din colonie şi
se pune în centrul lamei lângă o picătură de apă distilată sterilă. Se omogenizează
progresiv cultura depusă în picătura de apă şi se etalează.
2. Uscarea.
 Uscare spontană la temperatura camerei
 Uscare rapidă a frotiului în aer cald deasupra unui bec de gaz
3. Fixarea
 Se trece lama, cu frotiul în sus, câteva secunde prin flacăra unui bec de gaz; dosul
mâinii trebuie să suporte atingerea lamei astfel încălzite.

După realizarea frotiului, acesta se colorează și se examinează la microscop după uscare.

Tipuri de coloraţii:
 simple: albastru de metilen- evidenţiază morfologia bacteriilor, aşezarea, prezenţa în PP
a celulelor inflamatorii
 diferenţiale: Gram şi Ziehl Neelsen – evidenţiază morfologia bacteriilor şi afinitatea
tinctorială
18
  speciale (flageli, spori, incluzii)

Coloraţia Gram

Principiu: Peretele bacterian nu este colorabil, dar prin structura sa chimică condiţionează
colorabilitatea protoplastului în coloraţiile diferenţiale.
Bacteriile Gram pozitive rezistă la decolorarea cu amestecul alcool-acetonă şi rămân colorate
violet, cele Gram negative se decolorează si, pentru a fi observate, trebuie recolorate în roşu.

Etapele coloraţiei diferenţiale Gram:

Nr. Etapa Descrierea etapei Bacterii Bacterii

crt gram gram
pozitive negative
1 Colorarea violet de metil, un minut, se spală Violet Violet
2 Mordanţarea Lugol, două minute, se varsă . Violet Violet
Nu se spală!
3 Diferenţierea amestec alcool acetonă, 5-10 secunde, spală. Violet Incolor
4 Recolorarea soluţie de fucsină fenicată Ziehl diluată Violet Roşu
1/10, 30 secunde, se spală.

Rezultat:
 bacterii gram pozitive = violet
 bacterii gram negative = roşii

Controlul de calitate
Frotiu martor - suspensie care conţine un amestec de bacterii gram pozitive şi bacterii
gram negative (ex: coci gram pozitivi şi bacili gram negativi)
Pe frotiurile efectuate din produs patologic, leucocitele sunt întotdeauna roşii.
 Leucocite roşii şi bacterii gram pozitive = coloraţie Gram bine efectuată
 Leucocite roşii şi bacterii gram negative= trebuie să examinăm frotiul martor
Surse de eroare:
subdecolorarea – bacteriile Gram negative apar violet
supradecolorarea – bacteriile Gram pozitive apar roşii

Importanţa medicală a coloraţiei Gram

 Prima etapă în identificarea bacteriilor

 Orientează antibioterapia de primă intenţie
 Permite alegerea celui mai adecvat mediu de cultură pentru însămânţare

19
Microscopia cu imersie şi descrierea unui frotiu

Examinarea :
Se pune o picătură de ulei de cedru pe regiunea de examinat a frotiului. Se roteşte capul
revolverului şi se aduce în axul microscopului obiectivul cu imersie. Privind din lateral, se
coboară atent tubul microscopului, manipulând macroviza până la contactul lentilei frontale a
obiectivului cu picătura de ulei de cedru, cât mai aproape de lamă. Ulterior, privind prin ocular,
se ridică lent tubul microscopului cu ajutorul macrovizei, până la obţinerea imaginii. Se
focalizează imaginea cu ajutorul microvizei.

Descrierea caracterelor microscopice ale bacteriilor:

-forma – coci
- bacili, etc

-variaţia formei- coci rotunzi ( stafilococi, streptococi), ovali (streptococi), lanceolaţi

(pneumococi), în boabă de cafea (neisserii).
- bacili cu capetele rotunde, cu capetele tăiate drept (Bacillus spp.),
cu capetele măciucate (bacilii difterici)

-aşezarea: în grămezi (stafilococii), în lanţuri (streptococii), în diplo (pneumococii,

neisserii), în litere chinezeşti (bacilii difterici)

-mărime relativă: mic, mare

-afinitatea tinctorială (în coloraţiile diferenţiale): gram pozitiv, gram negativ

-prezenţa capsulei (nu se colorează în coloraţia Gram şi apare ca un halou incolor în jurul
bacteriei): capsula pneumococilor
- prezenţa sporului: forma: oval (Bacillus spp., Clostridium spp.), sferic (C.tetani)
aşezare: central (Bacillus spp), terminal (C. tetani), subterminal
(Clostridium spp)
dimensiune: mai mare decât bacteria care l-a format (deformează
bacteria - Clostridium spp), mai mic decât / egal cu bacteria care l-a format (nu deformează
bacteria - Bacillus spp).
Avantajele examenului microscopic:
 Permite o depistare rapida a microorganismelor;
 Are un cost redus;
 Este uşor de efectuat;
 Orientează următoarele etape de diagnostic microbiologic;
 Se pot evidenţia bacterii necultivabile sau care cresc lent;
 Ofera informaţii semicantitative (1 bacterie/câmp ~ 105 UFC/ ml)
Dezavantajele examenului microscopic:
 Sensibilitatea redusă.
 Nu permite întotdeauna identificarea până la nivel de specie.

20
Bibliografie: pag. 32-38
LP 5. Cultivarea bacteriilor
OBIECTIVE: La sfârşitul lucrării practice studenţii trebuie:

1. Să cunoască principalele tipuri de medii de cultură utilizate în bacteriologie (clasificarea acestora şi

exemple).
2. Să cunoască situaţiile în care este indicată utilizarea fiecărui tip de mediu.
3. Să cunoască tehnica însămânţării în 4 cadrane în scopul obţinerii culturii pure.
4. Să poată descrie caracterele de cultură ale bacteriilor pe diferite medii de cultură.

1. Scopurile cultivării:
 Medical - identificarea agentului etiologic al unei infecţii bacteriene
- testarea sensibilităţii la antibiotice
Pentru realizarea acestui scop este necesară izolarea bacteriei în cultură pură (cultură constituită din
bacterii de acelaşi fel)
 Industrial - obţinerea de vaccinuri, antibiotice, vitamine, etc..

2. Condiţiile fizico-chimice necesare cultivării bacteriilor:

- presiunea osmotică
- pH
- temperatura
- atmosfera de incubare

3. Mediile de cultură

Definiţie
= soluţii apoase ale unor substanţe nutritive (nutrienţi, factori de creştere).

Condiţii pe care trebuie să le îndeplinească un mediu de cultură:

- să fie steril - pentru a cultiva exclusiv microorganismele din produsul investigat
- să fie nutritiv
- să asigure presiunea osmotică (în general, medii izotone) şi pH (în general, 7-7,5)
- să fie transparent - pentru a facilita urmărirea culturii

Clasificarea mediilor de cultură (criterii, repartizarea mediilor, exemple)

Criterii de clasificare
a. după provenienţa nutrienţilor:
- empirice - conţin ingrediente de origine animală sau vegetală
- compoziţia în nutrienţi este dificil de controlat
- sintetice - conţin ingrediente chimic pure
- utilizate pentru studiul necesităţilor nutritive ale bacteriilor
- Ex. mediul Simmons cu citrat Na

b. după consistenţă:
- lichide (bulioane) – repartizate în eprubete sau baloane
- nu permit separarea bacteriilor dintr-un amestec
- utilizate pentru însămânţarea produselor patologice monobacteriene (LCR, sânge)
- Ex. bulion nutritiv

21
 - solide - repartizate în plăci Petri sau eprubete (în pantă)
- permit separarea bacteriilor dintr-un amestec – obţinerea de colonii izolate (cultură
pură)
- obţinute prin - adaos de agar (Ex. agar nutritiv)
- coagularea proteinelor din ou (Ex. Lowenstein Jensen)
- utilizate pentru însămânţarea produselor patologice pluribacteriene (exsudat faringian,
materii fecale)
- semisolide – repartizate în eprubete (în coloană)
- conţin o concentraţie mai redusă de agar
- utilizate pentru - studiul mobilităţii bacteriilor
- conservarea tulpinilor bacteriene
- Ex. geloza moale

c. în raport de valoarea nutritivă:

-simple - conţin numai ingrediente de bază (extract de carne, peptonă, NaCl)
- permit cultivarea bacteriilor nepretenţioase nutritiv
- agar nutritiv (geloza simplă), bulion nutritiv
- îmbogăţite - cu adaos de sânge, ser, ou, etc.
- asigură cultivarea bacteriilor pretenţioase nutritiv (necesită factori de creştere)
- Ex. geloza-sânge (agar sânge)

d. după scopul utilizării:

- de izolare
 uzuale - satisfac exigenţele nutritive pentru o gamă largă de specii bacteriene
- Ex. geloza - sânge

 diferenţiale - conţin substratul pentru anumite enzime bacteriene şi un indicator care atestă atacarea
acestui substrat  un caracter metabolic diferenţiază între ele bacterii cu aspect al culturii identic pe
mediile simple.
- Ex. CLED, Drigalski - medii cu lactoză şi indicator de pH pentru diferenţierea bacteriilor
lactozo-pozitive de cele lactozo-negative

 selective - medii solide

-conţin ingrediente care inhibă dezvoltarea bacteriilor de contaminare a prelevatelor
- frecvent au şi caracter diferenţial
- utilizate pentru izolarea preferenţială a anumitor specii dintr-un produs plurimicrobian
- Ex. agar Hektoen, agar MacConkey

 de îmbogăţire - medii lichide

- favorizează multiplicarea bacteriilor a căror izolare o urmărim
- inhibă selectiv flora de asociaţie (pentru un interval de timp limitat)
- utilizate pentru izolarea unor bacterii patogene care se găsesc în număr redus în produse
patologice
- Ex. bulion selenit acid de Na

- de identificare - conţin substratul pentru enzime bacteriene şi indicatori ai activităţii enzimatice

(schimbare de pH, produşi de metabolism – indol, etc.)
- utilizate pentru studiul activităţii biochimice a bacteriilor în scopul încadrării
într-un gen/specie
- Ex. MIU, TSI

22
 - de conservare

4. Cultivarea şi izolarea bacteriilor în cultură pură

Însămânţare = depunerea în mediul de cultură a materialului bacterian, inoculum.

Cultură = totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare

Colonie = masă de cultură, vizibilă cu ochiul liber pe suprafaţa unui mediu de cultură solid, rezultată prin
multiplicarea unei singure celule bacteriene sau a unui grup de celule, numit unitate formatoare de
colonii / UFC.

Colonie = clonă bacteriană, DECI cultură pură

Tehnicile uzuale de cultivare a bacteriilor: însămânţarea bacteriilor pentru obţinerea culturii pure – se
efectuează demonstrativ însămânţarea prin epuizare în 4 cadrane, pe geloză simplă .

5. Descrierea caracterelor de cultură:

 condiţii optime de cultivare:
- bacterii cultivabile vs. necultivabile;
- exigenţe nutritive: bacterii pretenţioase vs. nepretenţioase nutritiv;
- temperatura optimă de cultivare: psihrotrofe / psihrofile / mezofile / termofile;
- atmosfera optimă de cultivare: strict aerobe / strict anaerobe / facultativ anaerobe / microaerofile /
carboxifile;
- pH: neutru / bacterii acidofile / bacterii bazofile;
- presiune osmotică: bacterii care cultivă pe medii izotone/ bacterii halofile.

 aspectul culturii pe medii lichide / solide:

- forma de cultură S şi forma de cultură R pe mediu lichid / solid:

Forma de Mediu lichid Mediu solid

cultură
S - tulbură omogen mediile lichide - suprafaţa netedă, lucioasă
- contur circular
R - cultivă sub formă de grunji, lăsând mediul - suprafaţa uscată, rugoasă
supernatant clar - margini neregulate

- aspectul coloniilor: diametru, circumferinţa, relief, suprafaţă, culoare, transparenţa, consistenţă,

aderenţa la mediu;

 modificări ale mediilor de cultură induse de cultivare:

- hemoliza pe agar-sânge: alfa / beta / gamma
- producerea de pigment difuzibil în mediu
- reacţii pe medii diferenţiale zaharate

Bibliografie:
Buiuc D, Microbiologie medicală, ed. a VI-a, Editura “Gr. T. Popa” Iasi, 2003, cap3, pag.39-42, 46-
51.

23
 Lp 6: Cultivarea virusurilor, rickettsiilor si chlamydiilor

Obiective:
1. Definirea virusurilor - particularităţile de cultivare a acestora.
2. Prezentarea regulilor de prelevare a produselor patologice.
3. Izolarea virusurilor în culturi de celule, pe ouă embrionate sau pe animale de laborator
(etape, urmărirea replicării/prezentei virusurilor, cuantificarea încărcăturii virale)
4. Cultivarea rickettsiilor
5. Cultivarea chlamydiilor

1. Virusuri = particule infecţioase acelulare, formate dintr-un singur tip de acid nucleic
(ARN/ADN), metabolic inerte, lipsite de orice mecanisme necesare producerii şi stocării de
energie.

Parazite intracelulare absolute

nu cresc

nu se divid
=

2. Reguli de prelevare a produselor patologice

- Alegerea produsului patologic → în funcţie de sindromul investigat putem examina:

 aspirate (exsudate, secreţii, excrete)
 lichid de spălătura nazală sau/şi faringiană
 materii fecale
 secreţii prelevate cu tamponul de pe mucoase şi din leziuni cutanate
 fragmente de ţesuturi
 sânge
 LCR, etc

- Alegerea metodei de recoltare şi a momentului prelevării

→ probele pentru diagnosticul virusologic direct trebuie examinate cât mai precoce, în
faza acută a bolii (primele 2-3 zile de boală) Explicaţie: depistarea virusului la poarta
de intrare

- Asigurarea condiţiilor optime de transport şi conservare:

→ menţinerea viabilităţii virusurilor
→ împiedicarea dezvoltării altor microorganisme

Necesitatea mediilor de transport (la care se adaugă antibiotice şi antifungice)

Refrigerarea probelor (cu unele excepţii)
24
3. IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA VIRUSURILOR

Sisteme de diagnostic:
- culturi de organ sau culturi de celule;
- cultivarea pe embrioni, în dezvoltare;
- izolarea pe animale de laborator susceptibile;

I. Izolarea virusurilor în culturi de celule

Tipuri de culturi de celule:

obţinute din ţesuturi adulte
Culturi primare 
supravieţuiesc 5-6 cicluri de subcultivare

obţinute din ţesuturi embrionare

Linii de celule diploide 
au morfologie şi cariotip normal

Linii permanente  provin din tumori canceroase sau din celule normale transformate
malign

Etape:

Pregătirea suspensiei virale

Inocularea filmului celular

Incubarea

Depistarea şi cuantificarea virusului replicat:

a. efectul citopatic – rotunjirea şi desprinderea celulelor de pe suport, apariţia de sinciţii,

etc
→ cuantificarea virusurilor prin metoda plajelor  unităţi formatoare de plaje

b. apariţia în supernatant a unor proteine codificate de virus (e.g., hemaglutinine)

c. adsorbţia eritrocitelor pe membrana modificată a celulelor care au replicat virus

25
 d. incluziuni virale = acumulări de virioni sau componente virale în aria celulară de
replicare şi asamblare a unor virusuri (citoplasmă, nucleu) ; ex.: formaţiuni rotunde sau
ovalare, bazofile sau acidofile, IC sau/şi IN.

e. interferenţa virală = replicarea virusurilor care cultivă fără efect citopatic este depistată
indirect prin incapacitatea celulelor infectate de a replica un virus cunoscut citopatogen.

f. Depistarea antigenelor prin IF (reactii antigen-anticorp car efolosesc marcajul cu

fluoresceină)

g. transformarea celulelor normale în celule canceroase printr-un virus oncogen.

II. Izolarea pe ouă embrionate în dezvoltare

Indicată pentru izolarea virusurilor gripale, paragripale, herpetice, poxvirusurilor.
Etape:
În cavitatea amniotică (adaptare)
Inocularea embrionilor

(în vârstă de 6-14 zile) Pe membrana corioalantoidă

Incubare la 35 ºC, 3-5 zile

Depistarea virusului replicat:

 moartea embrionului (viabilitatea embrionilor a fost verificată anterior la ovoscop)
 apariţia de pustule pe membrana corioalantoidă (MCA) - poxvirusuri
 acumularea de virus (hemaglutinine) în lichidul amniotic / alantoidian – RH
(evidenţiere şi titrare de antigen hemaglutinant) – virusuri gripale, unele
paramyxovirusuri

Cuantificarea virusului replicat:

- titrarea antigenului viral (H) în lichidul alantoidian (prin RH)
- numărul de pustule formate pe MCA

Identificarea virusului = prin reacţia de inhibare a hemaglutinării (RIH) sau, in cazul unei
tulpini noi: vizualizarea prin ME (ex. SARS – un nou coronavirus)

III. Izolarea pe animale de laborator de mici dimensiuni (şoarece alb, hamsteri, etc sau gazde
unice: maimuţe, cimpanzei); rar utilizate (vezi dezavantaje)

Produsul patologic recoltat in funcţie de sindromul clinic, prelucrat, se inoculează utilizând

diferite căi de inoculare (de regulă, la fel ca poarta naturală de intrare): ic, sc, im, etc
Urmărirea replicării virusului:
26
  Moartea animalului
 Reproducerea bolii la animal (ex.: paralizii, tremor determinat de enterovirusuri)
 Evidenţierea de leziuni histopatologice caracteristice la nivelul organelor ţintă; in
lichidele sau pp recoltate de la animal se evidenţiază prezenţa virusului prin reacţii Ag-Ac,
ME (pentru virusurile nou izolate, cercetare, etc)

Cuantificarea virusului replicat → măsurarea dozei infectante sau letale 50% pentru animale
(DI50 / DL50)= reciproca diluţiei de suspensie virală care determină efectul urmărit
(infecţie/moarte) la 50% din animalele inoculate.

Identificarea = prin reacţii Ag-Ac (RN, RIH, RFC)

Dezavantaje:
- Costuri ridicate (infrastructură specială, personal, hrană, etc)
- Timp îndelungat pentru rezultatul final
- Infecţii virale latente cu propriile virusuri
- Reactivităţi diferite
- Producerea de Ac care împiedică expresia clinică

4. Cultivarea rickettsiilor
o sunt bacterii pleomorfe (bacili, cocobacili) cu perete de tip gram-negativ, care se
înmulţesc prin diviziune, obligat intracelular, la vertebrate sau artropode;
o cultivă numai în gazde vii: animale de laborator, sacul vitelin al embrionului de găină,
culturi de celule;
o temperatura optimă de cultivare în sacul vitelin este de 32⁰ C;
o odată cu creşterea temperaturii, rata multiplicării scade;
o gazdele mai sensibile pentru izolare sunt, în funcţie de specie, cobaiul şi şoarecele.
Diagnostic:
- microscopie: coloraţii speciale (pe amprente sau secţiuni histologice din
probe bioptice sau necroptice, rickettsiile apar ca fini bacili sau
cocobacili, intracelulari, albaştri-purpurii în coloraţia Giemsa sau roşii
(pe fondul albastru al citoplasmei) în coloraţia Macchiavello.
- IF - biopsia tegumentară sau valve cardiace la decedaţi
Izolarea şi identificarea:
- inocularea intraperitoneală, la animalele receptive, a prelevatelor
necontaminate;
- inocularea se face la patul bolnavului;
- dacă intervalul de timp se prelungeşte peste o oră, se congelează proba la
- 25° C.
- probele contaminate (spută, urină, lapte, suspensii de placentă) se
inoculează după tratarea cu penicilină;

Concluzie: datorită dificultăţilor diagnosticului direct şi al infecţiozităţii crescute, se preferă

diagnosticul serologic (indirect)

5. Cultivarea chlamydiilor
o bacterii cocoide, imobile, adaptate la parazitismul intracelular, au devenit total
dependente energetic de gazdă;
27
 o sunt paraziţi energetici;
o ciclul reproductiv particular (vezi curs)
o cultivă numai în sacul vitelin al embrionului de găină sau în culturi de celule;
o cele mai multe chlamydii cultivă în culturi de celule numai în condiţii speciale, care
facilitează iniţierea infecţiei şi înmulţirea:

Chlamydia trachomatis
i. diagnosticul este în special direct: microscopic, izolare pe culturi de
celule, metode moleculare;
Chlamydophila pneumoniae
ii. diagnosticul direct presupune recoltarea ca PP a exsudatului faringian.
iii. izolare în sacul vitelin (OE) sau pe CC (HeLa, culturi de celule de
maimuţă -cultiva dificil); dupa incubare 3 zile la 35˚C se identifica prin IF
(cu Ac monoclonali specific de grup sau specie).
iv. Micro – IF – mai sensibilă
v. diagnosticul, în principal indirect

Chlamydophila psittaci
• PP: spută (de regulă după stimulare), exsudat nasofaringian, sânge, ţesut pulmonar
(deces).
• Transportul probelor se face în mediu protector adiţionat cu antibiotice şi antifungice
• Microscopia directa si cultivarea: dificile.
• Identificare: ELISA cu sensibilitate relative redusă, 70-80%; specificitate foarte bună.
• PCR: foarte utilă.
. – diagnosticul serologic (indirect) mai util

28
 LP. 7 Reacţiile antigen-anticorp şi tehnicile de biologie moleculară în laboratorul de
microbiologie.

Obiective:
1. De a defini noţiunile de antigen şi anticorp, zona de echivalenţă, fenomen de prozonă şi
de a prezenta aplicaţiile practice ale reacţiilor antigen-anticorp.
2. Cunoaşterea principalelor tipuri de reacţii antigen-anticorp utilizate în laboratorul de
microbiologie (clasificare, principiu, indicaţii, exemple) în vederea aplicării lor în
practică
3. Familiarizarea cu tehnicile de biologie moleculară, ca instrument modern de diagnostic

1. Antigen  substanţă străină care, pătrunsă într-un organism competent, determină

răspuns imun (imunogenitate) şi reacţionează specific cu efectorii imunitari apăruţi ca rezultat al
acestui răspuns (specificitate).
Anticorp  imunoglobulină produsă în organism sub acţiunea unui antigen şi care are
proprietatea de a reacţiona specific cu antigenul corespondent.
Legarea antigen-anticorp:
- necesită complementaritatea situsurilor de legare Ag-Ac
- este specifică şi reversibilă
- este stabilă în zona de echivalenţă (cantităţile celor doi reactivi sunt aproximativ
egale).
Fenomen de prozonă = absenţa reacţiei în prezenţa unui exces de anticorpi  rezultat fals
negativ.
Aplicaţiile practice ale reacţiei antigen-anticorp
- identificarea unui antigen necunoscut (în produse patologice sau tulpini izolate în
laborator) prin anticorpul omolog prezent în seruri imune de referinţă );
- identificarea unui anticorp necunoscut (în serul pacientului) prin antigenul
omolog (diagnostic serologic).
 Se pot obţine:
- relaţii calitative  simpla identificare a unui reactiv
- relaţii cantitative  determinarea titrului reactivului cercetat
Titru  inversul diluţiei maxime a unui reactiv, la care mai este vizibilă reacţia, dacă se
utilizează cantităţi constante şi definite ale reactivului omolog.
Pentru titrul Ac-lor din ser, prin reactiv se înţelege, ser, iar prin reactiv omolog, antigenul
cunoscut.

2. Principalele tipuri de reacţii antigen-anticorp:

A. Reacţiile de precipitare
Principiu: un antigen solubil formează cu anticorpul omolog un complex insolubil (precipitat).
Clasificare după mediul în care se desfăşoară reacţia:
a. Reacţii în mediu lichid: reacţia de precipitare inelară la interfaţa reactivilor (calitative); reacţia
de floculare în amestecul reactivilor
b. Reacţii în mediu gelificat:
29
  Imunodifuzia radială simplă (tehnica Mancini): antigenul din godeu migrează în
gelul care conţine anticorpi specifici şi apare un cerc de precipitare cu diametrul
direct proporţional cu concentraţia antigenului
 Imunodifuzia dublă radială (tehnica Ouchterlony): ambii reactivi migrează în gel
rezultând linii şi arcuri de precipitare; ex. testul Eleck → demonstrarea
toxigenezei bacilului difteric
 Imunoelectroforeza: utilizează ser polivalent pentru analiza calitativă a
amestecurilor de Ag. Ac migrează perpendicular pe direcţia de migrare a Ag.
 Contraimunoelectroforeza: Ag şi Ac migrează în câmp electric în direcţii diferite
şi formează benzi de precipitare dacă au structuri complementare.

B. Reacţiile de aglutinare
Principiu  cuplarea unui antigen în suspensie cu anticorpul omolog determină apariţia unui
aglutinat sub formă de mase vizibile, care se depun şi lasă supernatantul limpede
Clasificare după modul de prezentare a antigenului în reacţie
a. Reacţii de aglutinare directă
 Calitative  reacţii de aglutinare pe lamă → identificarea unui antigen bacterian
 Cantitative  reacţii de aglutinare în tuburi → confirmarea rezultatelor aglutinării pe lamă
→ cuantificarea anticorpilor în serul
pacienţilor (reacţia Widal pentru diagnosticul febrelor enterice)
b. Testul Coombs: utilizat pentru evidenţierea Ac anti-eritrocitari
c. Reacţii de aglutinare pasivă  se utilizează particule pe suprafaţa cărora a fost adsorbit un
antigen bacterian (hematii  reacţia de hemaglutinare)
d. Reacţia de latexaglutinare = anticorpi specifici fixaţi pe suprafaţa particulelor de latex
→ identificarea antigenelor direct în prelevate patologice.
e. Reacţia de coaglutinare  anticorpul este fixat prin fragmentul Fc pe proteina A a S.
aureus.

C. Reacţia de fixare a complementului

Principiu  este o reacţie Ag-Ac, în două etape două, în care două complexe Ag-Ac îşi dispută
aceeaşi cantitate de complement. Cel de-al doilea complex Ag-Ac este sistem indicator pentru
vizualizarea formării primului complex.
- Utilizată pentru evidenţierea anticorpilor antivirus gripal
D. Reacţiile de neutralizare
Principiu = sunt implicate antigene virale sau toxine a căror legare de receptori celulari este
urmată de efecte definite
= după reacţia cu anticorpii omologi, aceste antigene nu se mai pot fixa pe receptorii
celulari, deci sunt neutralizate.
Clasificare:
 Neutralizări = supravieţuirea animalelor receptive după injectarea amestecului
imunoser-virus / toxină.
 Reacţii de inhibare a hemaglutinării → identificarea virusurilor hemaglutinante
→ serodiagnosticul infecţiilor determinate de virusuri
hemaglutinante

hemaglutinine  hematii  hemaglutinare (reacţie ) 30

hemaglutinine  Ac omologi  hematii  sedimentare (reacţie )

 E. Reacţiile cu anticorpi marcaţi:
 Radio-immunologie (Radioimmunoassay-RIA) – utilizează molecule radiomarcate (I125) şi
constă in măsurarea radioactivităţii generate de complexele Ag-Ac.
 Imunocromatografia – utilizează conjugate marcate cu aur coloidal şi este o metodă
calitativă de evidenţiere fie a antigenelor, fie a anticorpilor prezenţi în proba care migrează
prin capilaritate pe o membrană de nitroceluloză.
 Imunofluorescenţa - utilizează molecule marcate cu fluorocromi (fluoresceină, rodamină)
- tehnica directă = foloseşte anticorpi marcaţi cu fluorocromi, specifici pentru
detecţia antigen
- tehnica indirectă = foloseşte anticorpi anti-imunoglobuline umane marcaţi
fluorescent
-identifică anticorpi şi antigene
- reacţia vizualizată la microscop cu fluorescenţă sau prin flow-citometrie.
 Reacţiile imunoenzimatice (Enzyme Immunoassay-EIA)
Principiu: sunt reacţii Ag-Ac care folosesc pentru vizualizarea complexului marcajul enzimatic,
cuplat la un element (Ac sau Ag) cunsocut, respectiv care formează conjugatul. După formarea
complexului Ag-Ac şi îndepărtarea reactivului necuplat, pentru estimarea activităţii enzimatice,
se adaugă substratul cromogen al enzimei → reacţia de culoare dezvoltată este apreciată vizual
sau spectrofotometric.

A. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

a. pentru detectarea antigenului – direct

Ac specific adsorbit pe suport insolubil  proba în care urmărim Ag  Ac marcat cu enzimă

b. pentru detectarea anticorpului – indirect

Ag adsorbit pe suport insolubil  ser în care urmărim Ac anti-Ag  Ac anti-Ig marcat cu enzimă

c. competitiv – Ag adsorbit pe suport + ser în care urmărim Ac anti-Ag introdus în

reacţie în acelaşi timp cu Ac de referinţă marcat cu enzimă

B. Immunoblotting (Western blot) – confirmarea infecţiei HIV

antigene diferite fixate pe benzi de nitroceluloză


proba de ser testată (Ac)
spălare


Ac anti-Ig umană marcat enzimatic

31
 spălare

Reacţie colorimetrică

C. RIBA (Recombinant immunobinding assay) – principial asemănător cu WB, dar

utilizează antigene obţinute prin recombinare; pentru evidenţierea anticorpilor
antivirus hepatită C;

4. Tehnicile de biologie moleculară

- studiază genomul independent de cultivare
- utilizate pentru: - identificarea rapidă a microorganismelor direct în produsul
patologic
-detecţia genelor de rezistenţă
-genotipare
- reprezentate de:
A) Hibridizarea cu sonde ADN complementare secvenţei nucleotidice cercetate (Southern blot)
B) Reacţia de polimerizare în lanţ (polymerase chain reaction-PCR) - constă în amplificarea
unei secvenţe de ADN ţintă cu ajutorul unei polimeraze şi a unor amorse care delimitează
regiunea genică ţintită. Ampliconul rezultat este apoi evidenţiat prin electroforeză în gel.
PCR poate evidenţia şi ARN dar necesită o etapă intermediară de revers transcriere a ARN în
ADN înainte de ampificare (Reverse Transcriptase – PCR sau RT-PCR).
PCR în timp real (qRT–PCR sau Real Time PCR) permite evidenţierea şi cuantificarea acidului
nucleic amplificat pe măsură ce are loc amplificarea.
C) Secvenţierea ADN – determină ordinea în care sunt aşezate bazele azotate în secvenţa
nucleotidică. Tehnica utilizează enzime de restricţie şi detecţie prin electroforeză capilară a
fragmentelor sintetizate.

http://www.microbiologybook.org/French-immuno/immchapter7.htm

Lp 8: DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIEI

Obiective:
1. însuşirea regulilor generale de prelevare a produselor patologice;
2. însuşirea metodelor microbiologiei clinice; avantaje şi dezavantaje.

Metodele microbiologiei clinice

a. metode directe – evidenţiază prezenţa agentului etiologic

Calitatea prelevatelor pentru examenul microbiologic

32
 prelevate de bună calitate – rezultate utile posibile;
prelevate de calitate proastă – rezultate proste, periculoase pentru bolnavi, bani risipiţi
a. alegerea prelevatelor şi momentul prelevării;
b. prelevarea probelor înainte de instituirea tratamentului antimicrobian;
c. prelevatele patologice trebuie să fie în cantitate suficientă;
d. prelevările trebuie făcute aseptic;
e. recipientele şi instrumentele indicate pentru prelevări;
f. transportul şi conservarea probelor;
g. buletinul de analiză – cererea de analiză.

 tehnici rapide:
I. examen microscopic direct:
1. controlul microscopic al calităţii prelevatelor contaminate (calcularea scorului de
calitate);
2. tipul reacţiei inflamatorii (frotiu din produs patologic colorat cu albastru de metilen);
3. bacterioscopia (informaţii cantitative şi calitative).
II. reacţii Ag-Ac pentru depistarea antigenelor microbiene în produsul patologic;
III. metode ale biologiei moleculare pentru detecţia acizilor nucleici.

 izolarea microorganismului infectant: semnificaţia clinică a izolatelor:

1. în cazul prelevatelor necontaminate, microorganismul izolat este cel care a
determinat boala;
2. în cazul prelevatelor contaminate pe traiectul de eliminare:
- microorganismul izolat nu aparţine microbiotei indigene a traiectului de
eliminare, atunci are semnificaţie clinică;
- microorganismul izolat aparţine microbiotei indigene a traiectului de
eliminare, atunci va avea semnificaţie clinică în funcţie de 2 criterii :
cantitate semnificativă şi asocierea semnificativă a prezenţei
microorganismului cu prezenţa celulelor inflamatorii;
3. în cazul prelevatelor din zone normal colonizate:
- se urmăresc numai microorganismele strict patogene care au întotdeauna
semnificatie clinică;
- pentru microorganismele condiţionat patogene implicarea etiologică se stabieşte
prin: - evidenţierea fenotipurilor patogene ale unor bacterii;
-autoserodiagnostic.

b. metode indirecte – evidenţiază prezenţa răspunsului imun

 nespecifice: leucograma, formula leucocitară, VSH, CRP;
 specifice:
Indicaţii: - agent etiologic în situs inaccesibil prelevării;
- agent etiologic necultivabil;
- izolare imposibilă prin lacune ale anchetei epidemiologice;
- îndoieli privind semnificaţia clinică a izolatelor.
Dezavantaje: - rezultatele sunt dependente de capacitatea pacientului de a dezvolta
răspuns imun;
-necesită un anumit timp pentru apariţia Ac;

33
 A. in vitro - diagnostic serologic - criterii de semnificaţie clinică a anticorpilor
izolaţi;
B. in vivo - intradermoreacţii.

A. Diagnosticul serologic  urmărirea răspunsului imun al pacienţilor la antigene ale

microorganismului infectant prin teste in vitro.
Criteriile de diagnostic serologic al unei infecţii acute:
a. pe două probe de ser prelevate în dinamică (serul I / acut şi serul II / de convalescent,
recoltate la interval de 10-14 zile)
 seroconversia  absenţa anticorpilor în prima probă şi apariţia lor în cea de a doua
 dinamica semnificativă  creşterea de cel puţin patru ori a titrului anticorpilor în a
doua probă de ser faţă de prima
b. pe o singură probă de ser
 titrul semnificativ
 dozarea anticorpilor IgM (anticorpii răspunsului imun primar)
- diagnosticul unei infecţii acute/ recente
- diagnosticul precoce al unor infecţii congenitale

B. Intradermoreacţiile
- Reacţii de sensibilizare;
- Reacţii de neutralizare.

Lp. 9: Testarea sensibilităţii la antibiotice. Metoda difuzimetrică.

Obiective:
1. Cunoaşterea şi înţelegerea relaţiei bacterie – antibiotic in vitro şi in vivo; importanţa
practică a acestor noţiuni
2. Însuşirea criteriilor utilizate în iniţierea şi conducerea antibioterapiei.
3. Cunoaşterea şi utilitatea practică a antibiogramei difuzimetrice – principiu, indicaţii,
necesar, procedură, citirea şi interpretarea, control de calitate, avantaje şi dezavantaje.

1. Discutarea relaţiei bacterie – antibiotic in vivo şi in vitro

34
 In vitro:
- CMI (cantitatea minimă de antibiotic care inhibă cultivarea unei tulpini bacteriene);
- CMB (cantitatea cea mai mică de antibiotic care omoară 99,9% din bacteriile unei tulpini testate).

In vivo:
– bacterie sensibilă la un anumit antibiotic (folosit în doze uzuale asigură cu mare probabilitate
vindecarea infecţiei);
- bacterie rezistentă la un anumit antibiotic (există o probabilitate puternică de eşec terapeutic);
- bacterie intermediară (efectul terapeutic se poate obţine prin supradoze de antibiotic, administrare
locală, doze uzuale în cazul antibioticelor care realizează concentraţii urinare mai mari decât cele serice).

Relaţia CMI cu încadrarea tulpinilor bacteriene în una din cele 3 categorii (S, R, I):
 tulpinile sensibile (S) sunt cele care au valoarea CMI < decât nivelul mediu al
antibioticului din focarul de infecţie;
 tulpinile rezistente (R) au CMI > decât nivelul mediu al antibioticului în focarul de
infecţie;
 tulpini intermediare (I) au CMI apropiată de nivelul mediu al antibioticului din focarul
de infecţie.

2. Criterii în iniţierea şi conducerea antibioterapiei.

- oportunitatea tratamentului antibacterian;
- criterii în alegerea antibioticului adecvat:
 sensibilitatea agentului etiologic:
o terapie empirică bazată pe evaluarea probabilă a agentului etiologic în
funcţie de tabloul clinic (agenţi etiologici posibili) şi rezultatele
microscopiei;
o tratament ţintit, adaptat la sensibilitatea tulpinii izolate, determinată prin
antibiogramă.
 sediul infecţiei;
 particularităţi ale pacientului;
 criterii ecologice;
 criteriul economic.

3.a. Antibiograma difuzimetrică

Principiu: pe suprafaţa mediului Mueller-Hinton însămânţat în pânză cu tulpina de testat depunem

microcomprimate cu diferite antibiotice; antibioticul difuzează circular în mediu, realizând
concentraţii descrescătoare; cultura este inhibată în zona în care antibioticul realizează concentraţii ≥
CMI.

Indicaţii: testarea uzuală a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor cu creştere rapidă;

Necesar şi procedură:
- realizarea unei suspensii a tulpinii de testat (folosind cultura pură) cu densitatea de 108 UFC/ml,
apreciată cu standardul de 0,5 Mac Farland;
- impregnarea cu această suspensie a unui tampon de vată steril cu ajutorul căruia se însămânţează
în pânză suprafaţa mediului Mueller-Hinton;
35
 - depunerea microcomprimatelor cu antibiotice;
- incubare la 35ºC, timp de 18-24 ore;
- în cursul incubării, antibioticul difuzează circular în mediu, realizând concentraţii descrescătoare
în raport cu distanţa faţă de microcomprimat; cultura este inhibată în zona în care antibioticul
realizează concentraţii ≥ CMI.

Control de calitate: în paralel procedăm asemănător cu o tulpină de referinţă (ATCC – American

Type Culture Collection) care si-a păstrat sensibilitatea naturală la antibioticele testate, cu ajutorul
căreia verificăm respectarea condiţiilor standardizate de lucru.

Citire şi interpretare: diametrul zonei de inhibiţie a creşterii, în mm, se compară cu cele două
diametre critice stabilite de experţi:
– când această valoare este ≥ diametrul critic superior (D), tulpina este considerată sensibilă
(S)
– când valoarea găsită este ≤ diametrul critic inferior (d), tulpina este considerată rezistentă
(R)
– când diametrul măsurat este situat între valorile celor două diametre critice considerăm
tulpina ca intermediară (I).

≥D ≤d

sensibil intermediar rezistent

Avantaje: posibilitatea testării simultane a sensibilităţii faţă de mai multe antibiotice

Dezavantaje: lipsa de concordanţă a rezultatelor obţinute in vitro cu rezultatele terapiei in vivo.

Lp 10: Testarea sensibilitatii la antibiotice. Tehnici cantitative

Obiective:
1. Cunoaşterea şi utilitatea practică a metodelor cantitative de testare a sensibilităţii
bacteriilor la antibiotice:
a) metoda diluţiilor în mediu lichid– principiu, indicaţii, necesar, procedură,
citirea şi interpretarea, control de calitate, avantaje şi dezavantaje;
b) metoda diluţiilor în mediu solid;
36
 c) testul E.
2. Aprecierea eficienţei terapiei cu antibiotice.

1. Metode cantitative

Principiu: un inocul standardizat al tulpinii testate este însămânţat într-un gradient discontinuu de
concentraţii de antibiotic; după incubare este urmărită CMI.

Indicaţii:
- precizarea categoriei de sensibilitate a unei tulpini clasificate intermediară prin
antibiograma difuzimetrică;
- determinarea sensibilităţii bacteriilor fastidioase;
- testarea sensibilităţii la penicilină a tulpinilor de S. pneumoniae izolate din sânge sau
LCR;
- testarea rezistenţei S. aureus faţă de vancomicină;
- testarea sensibilităţii la penicilină a tulpinilor de streptococi viridans izolate din
endocardite.

a. Metoda diluţiilor în mediu lichid

Necesar şi procedură:
- realizarea de diluţii duble succesive de antibiotic în bulion Mueller-Hinton;
- se adaugă câte 0,1ml din suspensia de 105UFC/ml a tulpinii de testat;
- se utilizează un martor cultivare şi a unui martor sterilitate mediu;
- incubarea mediilor la 35ºC timp de 18-24 ore.

Control de calitate: în paralel procedăm asemănător cu o tulpină de referinţă (ATCC), cu ajutorul

căreia verificăm respectarea condiţiilor standardizate de lucru

Citire şi interpretare:
 CMI corespunde celei mai mici concentraţii de antibiotic, în µg/mL, care determină inhibarea
vizibilă a creşterii, comparativ cu martorii pentru cultivarea tulpinii şi sterilitatea mediului;
 raportăm această valoare la cele două concentraţii critice, maximă (C) şi minimă (c) pentru
definirea tulpinii ca S, R sau I.
Rezultatul este formulat după ce am verificat dacă, CMI a tulpinii de referinţă se încadrează între
valorile recunoscute de standard.

≤c ≥C

37
 sensibil intermediar rezistent

Avantaje: determinarea cu exactitate a CMI

Dezavantaje: realizarea testării faţă de un singur antibiotic folosind o cantitate mare de materiale şi
medii.

b. Testul E
 îmbină acuratețea testării cantitative și simplitatea testării difuzimetrice cu
mare economie de timp;
 pe o suprafață a unei langhete de 5mm / 50 mm din plastic inert, neporos este
fixat un gradient exponențial de antibiotic, desicat și stabilizat, cu 15 diluții între 0,016 și
256 ml/L sau 0,002 și 32 ml/L, iar pe cealaltă suprafață este marcată scala de lectură în
µg/ml corespunzătoare CMI;
 pe suprafața unei plăci cu mediu agarizat preînsămânțată cu tulpina testată în
condiții standardizate, langhetele cu antibiotic sunt depuse radiar. După incubarea
corespunzătoare, CMI este indicată de intersecția dintre zona elipitică de inhibiție a culturii
și scala de gradiente a langhetei;
 testul este fiabil, reproductibil și permite determinarea concomitentă, pe aceeași
placă, a CMI ale mai multor antibiotice pentru bacterii aerobe sau anaerobe, supravegherea
pacienților pe parcursul terapiei antimicrobiene pentru a surprinde selectarea de clone
rezistente, testarea pneumococilor față de beta-lactamine, a enterococilor față de
aminoglicozide cu depistarea rezistenței de nivel înalt, a enterobacteriaceelor producătoare
de beta-lactamaze cu spectru extins.
2. Aprecierea eficientei terapiei cu antibiotice.
Criterii clinice:
- scăderea febrei;
- ameliorarea stării generale.
Criterii paraclinice:
- scădere / normalizarea valorilor:
o CRP (detalii);
o Procalcitoninei;
o VSH.
- normalizarea leucogramei

Criterii bacteriologice:
- negativarea examenelor bacteriologice

În sală se găsesc:
 antibiograma difuzimetrică pentru o tulpină de E. coli izolată de la un pacient cu infecţie
urinară şi antibiograma pentru tulpina martor E. coli ATCC 25922;
38
 antibiograma difuzimetrică pentru o tulpină de S. aureus izolată din hemocultură şi
antibiograma pentru tulpina martor S. aureus ATCC 25923;
 antibiograma prin metoda diluţiilor în bulion pentru o tulpină de S. aureus, cu
determinarea CMI a penicilinei.
 e-test, benzi de cefotaxim

Identificarea stafilococilor. Examenul bacteriologic al puroiului

Obiective. La sfârşitul lucrării practice studenţii vor fi capabili să:

1) descrie testele utilizate pentru identificarea stafilococilor.

2) definească termenii: puroi, supuraţie.
3) precizeze care sunt agenţii etiologici implicaţi în producerea supuraţiilor.
39
 4) prezinte modalităţile de prelevare a puroiului.
5) prezinte etapele examenului bacteriologic al puroiului.

Identificarea stafilococilor

Caractere microscopice:
- coci Gram-pozitivi,
- dispuşi izolat, în perechi, scurte lanţuri şi predominant în grămezi,
- nesporulaţi.

Caractere de cultivare:
- sunt nepretenţioşi nutritiv
- aerobi facultativ anaerobi
- tolerează concentraţii de peste 5% NaCl
- formează colonii de tip S, pigmentate diferit (portocaliu, galben, alb)
- pe geloză-sânge – pot determina hemoliză.

Testul catalazei – pozitiv pentru genul Staphylococcus

Principiu: catalaza descompune peroxidul de hidrogen în apă şi oxigen.
Interpretare: pozitiv - apariţia bulelor de gaz până la efervescenţă
negativ - absenţa bulelor

Testul coagulazei – pozitiv pentru Staphylococcus aureus

Principiul testului în tub pentru coagulaza liberă: cultura de S. aureus suspensionată în 1 ml
de plasmă citratată şi incubată pentru câteva ore la 37°C determină coagularea plasmei.

Interpretare:
pozitiv – coagulare
negativ - absenţa cheagului

Frotiu colorat Gram

Coci Gram pozitivi

Testul catalazei

(+) Genul Staphylococcus Genul Streptococcus (-)

40
 Testul coagulazei

(+) S. aureus (-) Stafilococi coagulază negativi (SCN)

Sensibilitatea la novobiocină

S - alti SCN (e.g. S. epidermidis) R - S . saprophyticus

Examenul bacteriologic al puroiului

Puroi = exsudat fibrinos care conţine leucocite şi microorganismul implicat.

Supuraţie = formarea puroiului.

Agenţi etiologici implicaţi în producerea supuraţiilor:

Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes
Escherichia coli
Klebsiella spp.
Enterobacter spp.
Pseudomonas aeruginosa
bacterii anaerobe

Prelevarea puroiului din colecţii purulente

- se recoltează prin puncţie aspiraţie cu un ac suficient de gros adaptat unei seringi etanşe.
- puroiul se transportă la laborator în maximum 1-2 ore.
- pentru a asigura supravietuirea bacteriilor anaerobe transportul se face in containere speciale, in
anaerobioza.

Prelevarea din supuraţii superficiale

- se face toaleta plăgii: se îndepărtează ţesutul necrotic şi se spală cu ser fiziologic pentru
îndepărtarea exsudatului stagnant sau a eventualelor urme de antibiotic;
- se roteşte tamponul umezit cu soluţie Ringer pe o arie de 1 cm2 până la sângerare uşoară (pentru
a avea certitudinea că prelevăm din ţesutul viabil; se poate preleva din mai multe puncte ale
leziunii);
- se introduce tamponul în 1 mL bulion tioglicolat şi se transportă imediat la laborator.

Prelevări biopsice

A. Examenul macroscopic (pentru puroiul prelevat în seringă):

- consistenţa
41
- culoare
- miros

B. Examenul microscopic al frotiului colorat Gram:

În cazul prelevării cu tamponul, efectuarea frotiului se face de către persoana care a recoltat
proba: pe o lamă de microscop se rulează tamponul pentru a obţine un frotiu subţire şi uniform.
Frotiurile şi tamponul sunt trimise împreună la laborator.

Examenul citologic:
- prezenţa şi tipul leucocitelor
Examenul bacterioscopic :
- categoria microscopică a bacteriilor observate
- se apreciază semicantitativ prezenţa bacteriilor (foarte rare, rare, numeroase).

C. Cultivarea probelor
Medii utilizate:
- geloză-sânge
- mediu cu selectivitate joasă pentru bacili Gram-negativi (MacConkey)
- bulion tioglicolat (în cazul probelor necontaminate)

Incubare:
- temperatură 37 °C,
- atmosferă cu 5-10% CO2,
- timp de 24-48 ore.

D. Identificarea agentului etiologic

E. Antibiograma

In sala se gasesc:
- frotiuri din puroi cu stafilococ
- frotiuri din cultura cu stafilococ
- cultura pe geloza sange si geloza simpla
- testul coagulazei la tub
- apa oxigenata
- anse plastic
- lame microscop
- testul sensibilitatii la novobiocina
- antibiograma difuzimetrica pentru S.aureus

42
 LP 12. Identificarea streptococilor β hemolitici.
Examenul bacteriologic al exsudatului faringian

Obiective. La sfârşitul lucrării practice studenţii vor fi capabili să:

6) descrie etapele de identificarea a streptococilor β hemolitici;

7) prezinte modalităţile de prelevare al exsudatului faringian;
8) precizeze care sunt agenţii etiologici implicaţi în producerea anginelor;
9) prezinte etapele examenului bacteriologic al exsudatului faringian

43
 Identificarea streptococilor β hemolitici

9.a.i. Identificarea prezumptivă

1. Caractere microscopice

 coci Gram-pozitivi, sferici

 dispuşi predominant în lanțuri lungi, izolat sau în perechi (în special în cazul
frotiurilor din mediile lichide și produse patologice)

2. Caractere de cultură
 pretențioși nutritiv, facultativ anaerobi
 colonii mari înconjurate de o zonă clară de β hemoliză aparțin grupelor A, C, G
 tulpinile care nu produc streptolizină S formează colonii α-hemolitice în
aerobioză și β hemolitice în anaerobioză.

3. Teste biochimice

1.Testul catalazei –diferențiază streptococii de stafilococi.

2. S.pyogenes și S agalactiae pot fi diferențiați între ei și de steptococii nonA- nonB prin

2.1 Testul de sensibilitate la bacitracină şi la asociația sulfametoxazol trimetoprim

Testarea sensibilitatii Grup A Grup B Non grup A si B

la ( C,G,F)
Bacitracină sensibil rezistent rezistent
sulfametoxazol rezistent rezistent sensibil
trimetoprim

2.2 Testul CAMP- pentru identificarea S.agalacitae, S canis, S porcinus

Principiu - majoritatea streptococilor de grup B produc o proteină difuzibilă (factorul CAMP)
care acționează sinergic cu B lizina stafilococică și determină liza completă a hematiilor din
mediul de cultură.

9.a.ii. Identificarea definitivă

1. Identificare antigenică (depistarea polizaharidului C parietal, prin teste de aglutinare:

coaglutinare sau latexaglutinare) folosind cultura.

Examenul bacteriologic al exsudatului faringian

(examenul de rutină al exsudatului faringian vizează
44
 evidenţierea streptococilor beta hemolitici)

1.Microbiota indigenă a căilor aeriene superioare :

- orofaringele cuprinde mai mult de 200 de specii diferite; dintre facultativii anaerobi cei mai
frecvenţi sunt streptococii viridans.

3. Etiologia anginelor:
 Virală în 70% din cazuri
 Bacteriană (30%): S. pyogenes,
Streptococi grup C si G,
C. diphtheriae,
Arcanobacterium haemolyticum,
Neisseria gonorrhoeae.

4. Recoltarea exsudatelor faringiene:

-Materiale necesare: tampon steril, apăsător de limbă, sursă de lumină, mască.

-Indicaţii: diagnosticul faringitelor streptococice, diagnosticul altor angine bacteriene,

confirmarea suspiciunii de difterie, depistarea portajului S. pyogenes, C. diphtheriae.

-Transportul şi conservarea: tamponul faringian trebuie prelucrat în maxim 3 ore de la prelevare.

Dacă se temporizează prelucrarea este necesară folosirea unui mediu de transport.

5. Metode rapide- înlocuiesc cultura doar când rezultatul este pozitiv;

-depistare antigenului parietal de grup A direct în produs patologic (pentru S. pyogenes direct în
tamponul faringian)

6. Cultivarea:
Se descarcă tamponul pe geloză sânge şi se epuizează cu ansa în cele 4 cadrane apoi se
secţionează mediul pentru a crea condiţii microaerofile.
Incubare: 24 ore la 37 °C
Citirea culturilor: se urmăresc coloniile β hemolitice (colonii mici înconjurate de o zonă largă de
hemoliză clară).

7. Identificarea streptococilor β hemolitici ( A, C, G)

8. Antibiograma :
S. pyogenes şi-a pǎstrat nemodificatǎ sensibilitatea la penicilinǎ. Antibiograma se face
pentru testarea sensibilității la macrolide și clindamicină doar pentru pacienţii cu sensibilizare la
penicilină.

Comunicarea rezultatului:
 prezent streptococ β hemolitic grup A sau C sau G
 absent streptococ β hemolitic.

45
În sală se găsesc:
1. Cultura steptococ beta hemolitic pe geloză sânge
2. Testul de sensibilitate la Bacitracina şi Biseptol.
3. Frotiuri cultură streptococ
4. Testul catalazei: apa oxigenată, lame, beţişoare, pipetă

46
 LP. 13 - 14: IDENTIFICAREA STREPTOCOCILOR ALFA-HEMOLITICI
IDENTIFICAREA PNEUMOCOCILOR ŞI ENTEROCOCILOR.
EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL SPUTEI ÎN INFECŢII CU
MICROORGANISME OPORTUNISTE.

Obiective: La sfârşitul lucrării practice studenţii vor fi capabili să:

1. descrie etapele de identificare a pneumococilor;
2. descrie etapele de identificare a enterococilor;
3. descrie condiţia microbiologică a etajului infraglotic al căilor respiratorii;
4. enumere cei mai frecvenţi agenţi etiologici ai pneumoniei lobare acute;
5. enumere produsele patologice recoltate în infecţiile tractului respirator inferior;
6. prezinte etapele examenului bacteriologic al unei probe de spută şi să aprecieze
semnificaţia clinică a pneumococului izolat din spută.

1. Identificarea Streptococcus pneumoniae (pneumococ)

1. Caractere microscopice: diplococi gram pozitivi ovali/lanceolaţi, cu axul
longitudinal în prelungire, capsulaţi
2. Caractere de cultivare: pretenţioşi nutritiv, facultativ anaerobi, carboxifili, α-
hemolitici, cu autoliză centrală (colonii crateriforme)
3. Testul de sensibilitate la optochin (sensibili=pneumococi; rezistenţi=streptococii
viridans, streptococii de grup D, enterococii)
4. Testul de bilioliză (coloniile solubile în bilă=pneumococi)
5. Test de patogenitate pentru şoarece (pozitiv)
6. Identificare antigenică (latex aglutinare pentru evidenţierea antigenului capsular)

2. Identificarea enterococilor
1. Caractere microscopice: coci sferici/ovali, gram pozitivi, în perechi/scurte lanţuri
2. Caractere de cultivare: puţin exigenţi nutritiv, facultativ anaerobi, α/
β/nehemolitici, cresc la pH de 9,6 şi la temperaturi între 10-45°C, cresc în bulion
cu 6,5% NaCl, cresc în prezenţa a 40% bilă şi hidrolizează esculina (test bilă-
esculină)
3. Rezistenţi la optochin

3. Condiţia microbiologică a etajului infraglotic al căilor respiratorii: practic steril.

Infecţiile tractusului respirator inferior interesează:
 traheea şi bronşiile: traheobronşite, bronşite;
 parenchimul pulmonar: bronşiolite, pneumonii lobare acute, bronhopneumonii,
pneumonii interstiţiale, abcese.

4. Principalii agenţi etiologici ai pneumoniilor lobare acute:

 Streptococcus pneumoniae
- Haemophilus influenzae
- Moraxella catarrhalis
- Bacili Gram negativi

5. Produse patologice:
a) Probe contaminate pe traiectul de eliminare: sputa; aspirat
hipofaringian; lichid de spălătură bronho-alveolară;
b) Probe necontaminate (şuntează contaminarea orofaringiană): aspirat
bronho-alveolar pe cateter protejat (prin bronhoscopie); aspirat
transtraheal.

47
 Alte produse patologice: aspirat pleural, sânge (hemoculturi), urină (detecţia
antigenului capsular al pneumococului).

SPUTA este recoltată după toaleta cavităţii bucale, prin tuse spontană, profundă şi
supravegheată. Probele de spută, prelevate într-un recipient steril, cu gura largă şi capac
ermetic, sunt expediate imediat laboratorului pentru a fi examinate în cel mult o oră de la
prelevare. Este interzisă refrigerarea probelor.

6. Examenul bacteriologic al sputei în infecţii cu microorganisme oportuniste

 Examen macroscopic:
- probele cu aspect spumos, apoase sunt calitativ necorespunzatoare sunt respinse de
la examinarea microbiologică.
 Decontaminarea probei de spută:
- fragmente mucopurulente - spălare în 3 băi succesive de ser fiziologic steril
 Examen microscopic al frotiului colorat Gram.
a. cu mărire 100 X – triaj citologic de calitate:

Număr celule/câmp Calificative pentru Calificative pentru

(media pe 5-10 CI CES
câmpuri)
1-9 0 0
10-24 +1 -1
≥ 25 +2 -2

Scorul de calitate Q = suma algebrică a calificativelor pentru CI şi CES la care se

adaugă calificativul + 1 pentru prezenţa fibrinei
 Q ≥ 1→ produs cu scor de calitate corespunzător (permite diagnosticul
prezumtiv rapid al agentului etiologic)
 Q < 1→ produs cu scor de calitate necorespunzător
b. cu mărire 1000X - numai pentru produsele cu scor Q ≥ 1 :
i. se urmăresc câmpuri la distanţă de cel puţin 3 diametre de CES,
ii. ≥ 10 bacterii din aceeaşi categorie microscopică asociate cu ≥ 3 CI
/câmp ►criteriul asociaţiei semnificative a bacteriilor cu celule
inflamatorii;
iii. ≥ 10 bacterii din aceeaşi categorie microscopică / câmp semnifică ≥
106 bacterii/ml probă ( corespunzător concentraţiei din focarul de
infecţie) ► criteriul cantitativ.
 Cultivarea probelor
- izolare semicantitativă pe agar-sânge cu striu de S. aureus (satelitism H. influenzae)
- au semnificaţie clinică izolatele predominante şi în cantitate mare (ajung până în
cadranul 3/4).
 Identificarea bacteriei cu semnificaţie clinică (vezi schema de identificare a
streptococilor α-hemolitici)
 Antibiograma
- testare difuzimetrică pe agar Mueller-Hinton cu 5% sânge de berbec a
sensibilităţii pneumococului faţă de: Penicilină (utilizăm disc de Oxacilină de 1 μg),
aminopeniciline (Amoxicilină), cefalosporine de generaţia a-II-a (Cefuroxima) şi a-III-a
(Ceftriaxona, Cefotaxima), macrolide (Eritromicină), carbapeneme, fluorochinolone
(Levofloxacin), Cloramfenicol, trimetoprim-sulfametoxazol, glicopeptide
(Vancomicină).

48
 - Pentru tulpinile de pneumococ cu rezistenţă la Penicilină se determină CMI
pentru a stabili nivelul de rezistenţă: - rezistenţă joasă: tratament cu doze mari de
Penicilină
- rezistenţă înaltă: exclude Penicilina şi tratamentul include
cefalosporine de generaţia a-II-a sau a-III-a, carbapeneme, macrolide sau glicopeptide.

SCHEMA DE IDENTIFICARE A STREPTOCOCILOR ALFA-HEMOLITICI

Streptococ α-hemolitic

Testul bilă – esculină Optochin

(+) (-) Sensibil Rezistent

Enterococi,
Streptococi grup D streptococi viridans, pneumococ streptococi viridans,
pneumococ streptococi grup D,
enterococi
test de bilioliză
Bulion sare (6,5%)

Prezenţa creşterii absenţa creşterii

Enterococi streptococi grup D

În sală se găsesc:
1. Cultura pneumococ pe geloză sânge
2. Testul catalazei: apa oxigenată, lame, beţişoare, pipetă
3. Testul de sensibilitate la Optochin.
4. Frotiuri de spută colorate Gram
5. Frotiuri de cultură colorate Gram
6. Antibiograme difuzimetrice pentru pneumococ
7. E-test la Penicilină pentru pneumococ

49
 LP 15. Identificarea neisseriilor şi a cocobacililor gram-negativi.
Examenul bacteriologic al lichidului cefalo-rahidian.

Obiective - la sfârşitul lucrării practice studenţii vor fi capabili să:

1. enumere principalele caractere utilizate pentru identificarea neisseriilor
2. enumere principalele caractere utilizate pentru identificarea cocobacililor gram-negativi
3. enumere principalele etape ale examenului bacteriologic al lichidului cefalo-rahidian şi să
cunoască avantajele si dezanvantajele acestora şi informaţiile oferite clinicianului după
fiecare etapă

1. Identificarea neisseriilor
a. Caractere microscopice :
- diplococi gram-negativi cu feţele adiacente aplatizate (aspectul boabelor de cafea)

b. Caractere de cultivare :
- strict aerobe
- in functie de exigentele nutritive pot fi:
neisserii nepretenţioase nutritiv
neisserii pretenţioase nutritiv: meningococi, gonococi
Meningococii – mai puţin pretenţioşi decât gonococii
- cultivă pe agar-chocolat şi agar-sânge
- formează colonii S, translucide, nepigmentate, uneori mucoide (izolate capsulate)
- carboxifili

c. Caractere biochimice:
- catalază - pozitive
- oxidază-pozitive
- spectrul de fermentare al zaharurilor diferenţiază meningococii de gonococi

d. Caractere antigenice: antigenele capsulare permit diferenţierea meningococilor în serogrupe

2. Identificarea cocobacililor gram-negativi

Genul Haemophilus
a. Caractere microscopice:
- cocobacili gram-negativi, polimorfi.

b. Caractere de cultivare :
- facultativi anaerobi
- carboxifili
- H. influenzae - dependent de factorii X (hemina) si V (NAD)
- cultivă pe agar-chocolat / agar-sânge cu striu de S.aureus (fenomen de
satelitism)
- formează colonii S, mici, rotunde, convexe, translucide
- H. parainfluenzae - dependent doar de factorul V (NAD)

c. Caractere biochimice: permit identificarea definitivă

d. Caractere antigenice: antigenele capsulare permit diferenţierea H. influenzae în tipuri
antigenice, dintre care tipul b este invaziv.

3. Examenul bacteriologic al lichidului cefalo-rahidian:

50
  Indicaţii:
 meningite purulente – cauzate cel mai frecvent de bacterii, ocazional de protozoare
 meningite cu lichid clar = virale (meningite “aseptice”)
tuberculoase
fungice
meningite “decapitate”

 Agenţi etiologici ai meningitelor/meningoencefalitelor, în funcţie de vârstă:

Nou – născut şi sugar (< 2 luni)

 E.coli K1
 Streptococcus agalactiae
 Listeria monocytogenes
 Staphylococcus aureus

Copil (< 5 ani)

 Meningococi
 Pneumococi
 Mycobacterium tuberculosis
 Haemophilus influenzae tip b

Adult
 Pneumococi
 Meningococi
 Staphylococcus aureus
 Bacili gram negativi
 Mycobacterium tuberculosis
 Listeria monocytogenes

Virusuri:
o enterovirusuri
o virusul urlian
o virusul rujeolic
o arbovirusuri (ex. West-Nile)
o virusul meningitei choriolimfocitare
o v. herpes-simplex
o v. varicela-zoster

Fungi (rar, la gazda imunocompromisă)

o Cryptococcus neoformans
o Candida albicans

 Prelevarea şi transportul probelor

 prin puncţie lombară
 volum 5 – 10 ml
 2 tuburi de centrifugă cu capac înşurubat
 transport imediat şi fără refrigerare.

 Examenul macroscopic:
 transparenţa;
 culoarea;
 fluiditatea.

 Examenul microscopic:

51
 - examenul citologic cantitativ:
 în camera de numărat Fuchs – Rosenthal
 din LCR necentrifugat
 determinarea numărului de leucocite (“elemente celulare nucleate”)/mmc.

- examenul citologic calitativ

 frotiu din LCR colorat cu albastru de metilen:
 aprecierea reacţiei inflamatorii: PMN = meningita bacteriană acută
limfocite = meningita virală sau tuberculoasă
sau fungica
- examenul bacterioscopic
 frotiu din LCR colorat Gram, cu albastru de metilen +/- Ziehl – Neelsen (frotiu de
rezervă)
 cea mai accesibilă metodă rapidă

 Examenul biochimic:
 proteinorahia,
 glicorahia,
 clorurorahia.

Testul Valori normale Tipul de meningită

Bacteriană Tuberculoasă Virală
Aspectul LCR clar Tulbure / purulent Clar Clar
Nr leucocite-mmc ≤ 3/mmc sute–mii/mmc 50-500/mmc 50–1000/mmc
Tip predominant de PMN Limfocite Limfocite
limfocite
leucocite
Glicorahie 50 – 70 mg / dl 5-20 mg/dl 20-40 mg/dl 50 – 70 mg / dl
Proteinorahie 15 – 40 mg/dl 100-500 mg/dl 100-200 mg/dl 15- 100 mg/dl
Clorurorahie 680–730 mg/dl 680–730 mg/dl < 600 mg/dl 680–730 mg/dl

 Detectarea de antigene solubile (din supernatant) – prin latexaglutinare = metodă

rapidă şi specifică

Examenul bacterioscopic şi detectarea de antigene solubile sunt examene rapide, care pot
orienta rapid iniţierea antibioticoterapiei. Rezultatele negative nu exclud diagnosticul
pozitiv (sensibilitate redusă!!!)

 Cultivare
- pe agar-sânge şi agar-chocolat, din sediment → urmărire 3 zile
- pe medii lichide (din LCR necentrifugat) → urmărire 5 zile
- pe medii adecvate în suspiciune de meningită tuberculoasă (Löwenstein-Jensen) sau
leptospirotică (Korthof)

Identificarea agentului etiologic izolat

Antibiograma se poate face pe cultură primară şi se confirmă prin antibiogramă
standardizată.
 Tehnici de biologie moleculara: Detectia genomului (viral, bacterian etc.) direct din
LCR prin tehnici de biologie moleculara (e.g. PCR)
Avantaje:
1. rezultat rapid, inaintea culturii;
2. utilitate mai ales in cazul meningitelor decapitate.
Dezavantaj: nu ofera informații despre sensibilitatea la antibiotice

În sală se găsesc:
- Frotiuri LCR cu limfocite
52
 - Frotiuri LCR cu PMN și meningococi
- Frotiuri LCR cu PMN și pneumococi
- Frotiuri din cultură cu meningococi
- Testul catalazei
- Testul oxidazei
- Trusa latex aglutinare pt depistare de Ag capsulare în LCR
- Cultura Haemophilus influenzae pe agar sânge cu striu de S. aureus
- Cultura Haemophilus pe agar-chocolat
- Cultura Haemophilus în prezența factorilor X, V, XV
- Galerie api NH
- Cultura meningococi pe agar-sânge

Lp. 16: Identificarea bacililor gram-negativi non-fermentativi: Pseudomonas aeruginosa.

Examenul citobacteriologic al urinii

OBIECTIVE:
- Cunoaşterea etapelor identificării unui bacil gram-negativ non-fermentativ ;
- Însuşirea etapelor examenului citobacteriologic al urinii în infecţii produse de
agenţi oportunişti.

Identificarea bacililor gram-negativi non-fermentativi: Pseudomonas aeruginosa

53
1. Caractere microscopice: bacili gram-negativi, drepţi sau uşor încurbaţi, fini, dispuşi
izolat, în perechi sau scurte lanţuri, nesporulaţi.
2. Caractere de cultivare: nepretenţioşi nutritiv, strict aerobi, cresc la temperaturi între 5-
42ºC, cu miros caracteristic (flori de tei sau iasomie), produc pigmenţi difuzibili în mediu
(piocianină, pioverdină, piorubrină, piomelanină). Culturile au luciu metalic. Pe geloză-sânge,
coloniile sunt hemolitice.
3. Caractere biochimice: catalazo-pozitivi, oxidazo-pozitivi, metabolism oxidativ al glucozei,
reduc nitraţii, alcalinizează coloana şi panta de agar TSI, lactozo-negativi, indol-negativi.

Examenul citobacteriologic al urinii

Indicatie: - suspiciunea de infecţie de tractus urinar
Condiţia microbiologicǎ a tractului urinar:
- rinichii + ureterele + vezica urinară= normal sterile;
- uretra distală = normal colonizată (stafilococi coagulazo-negativi, enterococi,
difterimorfi, enterobacteriacee).
Etiologia bacteriană a infecţiilor tractusului urinar (ITU):
1) bacterii condiţionat patogene
Bacili gram negativi:
o Escherichia coli;
o Proteus mirabilis;
o Enterobacter cloacae
o Klebsiella pneumoniae
o Pseudomonas aeruginosa.
Coci gram pozitivi:
o Enterococcus faecalis;
o Staphylococcus saprophyticus
o Staphylococcus aureus;
o Streptococcus agalactiae;
Bacili gram pozitivi:
o Corynebacterium urealyticum
2) bacterii patogene primare:
o Mycobacterium tuberculosis.

Etapele examenului citobacteriologic al urinii în ITU determinate de bacterii condiţionat

patogene:
1) Prelevarea urinii pentru examen cito-bacteriologic:
 Prelevǎri uzuale: proba curatǎ, prinsǎ în zbor din jetul mijlociu;
 Prelevǎri speciale: aspiraţia suprapubianǎ, prelevǎri prin cateter.
 Proba curatǎ prinsǎ în zbor din jetul mijlociu:
o Toaleta localǎ cu apǎ şi sǎpun, urmatǎ de uscarea zonei decontaminate;
o Momentul prelevǎrii: prima urinǎ de dimineaţǎ sau dupǎ cel puţin 3 ore de la
micţiunea anterioarǎ;
o Volumul prelevat: 20 ml pentru izolarea cantitativǎ a microorganismelor condiţionat
patogene.
Transportul probelor la laborator pentru examinare în maxim o orǎ de la prelevare.
Refrigerarea urinii dacă se temporizează examinarea.
Alte prelevate utile diagnosticului de ITU
- urină (sumar de urinǎ);
- sânge (hemoculturǎ) la pacienţii cu suspiciune de pielonefritǎ.
2) Examen microscopic
– aprecierea calităţii probei - celule epiteliale scuamoase sunt markerii contaminǎrii vaginale
- aprecierea piuriei - camera Fuchs Rosenthal > 10 leucocite / mm3 = PIURIE
< 3 leucocite / mm3 = piurie absentă
54
 3 - 10 leucocite / mm3 – este necesară proba Addis
care stabileşte prezenţa sau absenţa piuriei
-frotiu de urină colorat Gram > 1 leucocit / câmp microscopic = PIURIE
- aprecierea bacteriuriei (frotiu din urină colorat Gram) – prezenţa a > 1 – 2 bacterii cu aceleaşi
caractere microscopice/câmp = BACTERIURIE SEMNIFICATIVǍ (se corelează cu > 105 UFC/ml
urină în urocultura cantitativă)
3) Urocultura cantitativă = însǎmânţarea pe gelozǎ sânge şi pe agar MacConkey a câte 0,1
ml din diluţia 10-2 a urinii omogenizate urmată de incubare la 37ºC şi numărarea coloniilor
dezvoltate. Calculăm bacteriuria după formula :
Nr. UFC/mL = N×D×1/volumul însămânţat
N = nr. colonii dezvoltate pe mediu
D = inversul diluţiei
Interpretarea rezultatelor :
a) O singură specie de bacili gram-negativi izolată în concentraţie de 104-5 UFC/ml, de
stafilococi ≥ 5x104 UFC/ml sau levuri ≥ 104 UFC/mL: - în prezenţa piuriei = ITU;
-în absenţa piuriei = colonizare abortivă / probă examinată
tardiv fără refrigerare imediată.
b) Două tipuri de izolate care depăşesc fiecare 105 UFC/mL: - pe o singură probă = cel mai
frecvent contaminare
-în 2 probe succesive = infecţie mixtă
c) Mai multe tipuri de bacterii care depăşesc fiecare 105 UFC/mL = contaminare/ probă
examinată tardiv fără refrigerare imediată.
4) Identificarea bacteriei cu semnificaţie clinică
5) Antibiograma
Pentru Pseudomonas aeruginosa
- Metoda difuzimetrică
- Agar Mueller-Hinton
- Antibiotice: peniciline anti-Pseudomonas (ticarcilina, piperacilina), aminoglicozide
(gentamicina, tobramicina, amikacina), fluorochinolone (ciprofloxacina, moxifloxacina),
cefalosporine (cefoperazona, ceftazidima, cefepim), carbapeneme (meropenem, imipenem)
În sală se găsesc:
- frotiuri de urină colorate Gram
- frotiuri de cultură colorate Gram
- urocultura cantitativă (geloză sânge, agar MacConkey)
- testul catalazei
- testul oxidazei
- antibiograma difuzimetrică pentru Pseudomonas aeruginosa
Lp 17. Identificarea Enterobacteriaceae-lor. Coprocultura

Obiective:
I. Cunoașterea etapelor identificării bacililor dizenterici
II. Discutarea etiologiei sindromului diareic infecţios: parazitară, bacteriană, virală
III. Însuşirea etapelor diagnosticului bacteriologic în boala diareică acută.

I. Identificarea Enterobacteriaceae-lor

1. Caractere microscopice: bacili gram-negativi, fără așezare particulară; speciile de

Yersinia sunt mai frecvent cocobacilare, colorate bipolar, iar speciile Proteus sunt
uneori extrem de polimorfe. Tulpini de Klebsiella, sau, mai rar, E. coli pot prezenta
55
 în frotiuri colorate Gram din produse patologice, o capsulă care apare sub forma unui
halou clar în jurul bacteriilor.
2. Caractere de cultivare: cultivă pe geloză sau în bulion nutritiv. Cel mai frecvent, pe
medii agarizate coloniile sunt de tip S, cu diametrul de 2-3 mm după 18 ore de
incubare, iar la 37º C în bulion are aspect tulbure omogen. Izolarea poate fi realizată
pe medii diferențiale și selective, cu lactoza și indicator de pH: pe medii cu
selectivitate redusă (mediul MacConkey) bacteriile gram-pozitive sunt inhibate iar în
raport cu virarea indicatorului, bacilii gram-negativi se diferențiază în lactozo-
pozitivi și lactozo-negativi; pe medii cu selectivitate mai mare (mediul Hektoen),
sunt inhibați bacilii coliformi (lactozo-pozitivi), lactozo-negativii putând fi
diferentiați după cum produc sau nu H2S - tulpinile care dezvoltă colonii H2S dau
colonii cu centrul de culoare neagră, “în ochi de pisică”
3. Caractere biochimice: triajul biochimic se realizează pe două medii multitest, MIU
(mobilitate-indol-ureză) și TSI (triple sugar iron), urmat de o baterie extinsă de teste
biochimice.

II. Etiologia sindromului diareic infecţios

Definiţie BDA: peste 3 scaune/ zi, semiconsistente sau apoase, determinând pierderi
lichidiene, ce pot duce la dezechilibre hidroelectrolitice însoţite de colaps cardio-
vascular. episodul are debut cu cel mult 2 săptămâni anterior.

Agenţi etiologici bacterieni:

 Sindrom holeriform: gastroenterită acută cu scaune apoase, abundente, febră
absentă, absenţa tenesmelor şi a durerilor abdominale, absenţa leucocitelor în
scaun.
o Vibrioni holerigeni
o Vibrioni NAG
o ECET, ECEP, ECAD, ECEAg
 Sindrom dizenteriform: colită acută cu scaune mucosanguinolent-purulente,
febră, tenesme şi dureri abdominale prezente, reacţie inflamatorie acută intensă în
scaun.
o Shigella spp.
o ECEI
o Campylobacter
o Unele tulpini de Salmonella netifoidice
o Yersinia enterocolitica
Agenţi etiologici virali: rotavirusuri, enterovirusuri, adenovirusuri, coronavirusuri,
astrovirusuri, calicivirusuri.
Agenţi etiologici parazitari: Giardia duodenalis, Cryptosporidium parvum,
Entamoeba.

III. Diagnostic de laborator BDA, sdr dizenteriform

56
Scop: Izolarea şi identificarea Salmonella, Shigella, Yersinia (lactozo negativi)
Prima zi:

A.Prelevare
 din scaun emis spontan
 cât mai aproape de debut şi înaintea antibioticoterapiei
 în coprocultor cu mediu de transport Cary-Blair
 fragmente de mucus, sânge, puroi sau din 4-5 locuri, aproximativ 1 g

B.Transport în 1-2 ore; eventual refrigerare (max 24-48 ore)

C.Examen macroscopic
 miros
 culoare
 aspect

D.Examen microscopic direct

 Frotiu colorat cu albastru de metilen

-Celule inflamatorii, hematii, enterocite
PMN> 50/câmp alături de macrofage şi hematii în shigeloze
PMN<20/câmp în salmoneloze
Polimorfonucleare şi hematii în campilobacterioze.
-Agenţi etiologici cu morfologii particulare (Campylobacter, stafilococ)

E.Coprocultura este examenul de bază în diagnosticul sindromului diareic infecţios.

Scop: Izolarea şi identificarea Salmonella, Shigella, Yersinia (lactozo negativi)

 Se însămânţează pe medii cu selectivitate slabă şi medie (MacConkey şi Hektoen)

şi mediu de îmbogăţire pentru Salmonella (bulion selenit acid de sodiu).

A doua zi:
 Repicăm din mediul de îmbogăţire pe mediu cu selectivitate medie
 Coloniile lactozo-negative cu/fără H2S le repicăm pe mediile TSI, MIU şi pe un
mediu diferenţial lactozat pentru verificarea purităţii culturii (minim 3 colonii L-).

A treia zi:
 Urmărim repicajul din mediul de îmbogăţire - prezenţa coloniilor lactozo
negative ± hidrogen sulfurat.
 Citire triaj şi identificare antigenică pentru coloniile suspecte de
Salmonella, Shigella, Yersinia;
 Identificare biochimică extinsă
 Antibiogramă (NU pt Salmonella; prelungeşte starea de portaj)

57
A patra zi:
 Rezultat

În sală se găsesc:
-coprocultură Hektoen –prezent Shigella
-coprocultură MacConkey –prezent Shigella
-bulion selenit
-triaj biochimic: TSI, MIU, Simmons
-repicaj pentru verificarea purităţii culturii pe AABTL
-tabel de interpretare al triajului biochimic
-frotiu bacili gram negativi, cultură, colorat Gram
-reacţie de aglutinare pe lamă: Ser polivalent anti Shigella – pozitiv
Ser anti S. flexneri- pozitiv
Ser anti S. boydii -negativ

Lp. 18. Identificarea Enterobacteriaceae-lor. Hemocultura in diagnosticul infectiei.

Diagnosticul de laborator al febrelor enterice.

Obiective:
1. Definirea şi clasificarea bacteriemiei.
2. Discutarea speciilor bacteriene izolate frecvent din hemocultură.
3. Discutarea particularităţilor hemoculturii
4. Hemocultura: definiţie, indicaţii, momentul, numărul şi volumul prelevărilor, incubarea
şi urmărirea hemoculturilor, interpretarea rezultatelor.
5. Definiţia febrelor enterice;
6. Patogenie;
7. Diagnosticul bacteriologic direct corelat cu fazele evolutive ale bolii.

1. Bacteriemia = prezenţa efemeră a bacteriilor în sânge, urmare a unui pasaj / descărcări unice
fără gravitate particulară.
o tranzitorie – translocare de la nivelul mucoaselor normal colonizate
- după intervenţii terapeutice / exploratorii invazive la nivelul
mucoaselor
o intermitentă – descărcare de la nivelul unor focare infecţioase
o continuă – torentul circulator scaldă focarul infecţios (endocardită)

58
2. Specii bacteriene izolate frecvent şi cu semnificaţie clinică din hemocultură:

Staphylococcus aureus
Bacili gram-negativi fermentativi
(Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp.)
Streptococi α şi β-hemolitici
Pneumococi
Enterococi
Haemophilus influenzae tip b
Pseudomonas aeruginosa
Bacterii anaerobe

3. Particularităţile hemoculturii:
- numărul mic de bacterii prezente în sânge (efectul bactericid al sângelui)→ ce volum de
sânge trebuie să recoltăm?
- descărcările bacteriene în sânge sunt intermitente → câte probe trebuie să recoltăm?
când şi cum ?
4. Definiţia hemoculturii = însămânţarea şi incubarea într-un mediu de cultură adecvat a unei
probe de sânge, în scopul izolării şi identificării bacteriilor pe care le conţine.
Indicaţiile hemoculturii:
- bacteriemii cu mai multe posibile etiologii
- sepsis
- endocardită infecţioasă
- sindrom sugestiv pentru o infecţie sistemică cu bacterii strict patogene: salmonele
tifoidice, Leptospira, Brucella
- sindrom febril de origine neprecizată
- stări febrile după cateterism venos prelungit, dializă peritoneală, etc.
Tehnica hemoculturii:
- prelevarea hemoculturii:
o medii de cultură:
 medii lichide cu valoare nutritivă mare, adecvate pentru creşterea unei game largi de
bacterii
 pentru anaerobi: flacoane cu atmosferă anaerobă
 medii difazice: pantă de mediu solid + mediu lichid
 medii pentru sistemele automate de urmărire a hemoculturilor
o volumul prelevărilor
 la adult - 20 ml per probă
 nou-născuţi, sugari şi copii mici – 1-3 ml (concentraţia bacteriilor în sânge este mai mare
decât la adult)
o numărul prelevărilor
 în bacteriemii continue – 2 prelevări
 în bacteriemii intermitente – 3 prelevări în 24 ore, în caz de urgenţă la interval de 30-60
minute
o momentul prelevării
 înaintea instituirii antibioticoterapiei
 cât mai aproape de debutul bolii
 în momentul apariţiei frisoanelor sau în cursul evoluţiei ascendente a curbei febrile
 în bacteriemii continue (endocardita infecţioasă) – oricând în cursul zilei
o tehnica prelevării
 cele 2-3 prelevări trebuie făcute din vene diferite şi de fiecare dată în cel puţin 2
flacoane diferite

59
 decontaminarea zonei de puncţie → 3 etape: 1) apă şi săpun, 2) alcool iodat, 3) eter –
importanţa uscării tegumentului.
 pregătirea flacoanelor cu medii de cultură – medii preîncălzite la 37ºC ; dezinfecţia
membranei de cauciuc
 recoltăm până la indicatorul de pe flacon / realizăm o diluţie a sângelui în mediul de
cultură de aprox. 1/10 pentru a reduce efectul bactericid al sângelui
 agitarea blândă a flaconului
 transportul cât mai rapid la laborator
- incubarea hemoculturilor şi urmărirea lor
o un flacon va fi incubat aerob, iar celălalt anaerob
o urmărire timp de 7 zile cu examinare macroscopică, microscopică şi prin subcultivare
o endocardite infecţioase, pacienţi trataţi cu antibiotice, suspectarea unor
microorganisme pretenţioase nutritiv – urmărire timp de 14-21 de zile
o examenul macroscopic - de 2 ori pe zi în primele 3 zile, apoi zilnic, cu aprecierea
semnelor creşterii:
 prezenţa coloniilor sau a unui depozit pe stratul de hematii
 tulburarea mediului
 hemoliza
 coagularea mediului
 prezenţa bulelor de gaz
 colonii pe stratul de geloză al mediilor difazice
o examenul microscopic - frotiuri Gram efectuate din flacoane.
o subcultivarea
 hemocultură cu creştere evidentă – subcultivare pe medii adecvate bacteriei observate
la examenul microscopic, în atmosferă adecvată în funcţie de flaconul în care a apărut creşterea.
• se pot efectua teste de identificare pe cultură primară şi antibiogramă pe cultură
primară, ce va trebui confirmată prin antibiograma standardizată a subculturii.
o identificarea bacteriei izolate
o testarea sensibilităţii la antibiotice

- interpretarea rezultatelor → argumentarea semnificaţiei clinice a bacteriei izolate:

o argumentele bacteriologului:
 izolarea aceleiaşi bacterii în mai multe flacoane ale unui set de hemocultură sau în
hemoculturi repetate din sedii venoase diferite  semnificaţie clinică
 izolarea unor bacterii diferite din flacoanele hemoculturilor de la acelaşi pacient 
contaminare
 izolarea a ≥ 2 specii bacteriene din aceeaşi hemocultură de cel puţin 2 ori în 24 ore 
bacteriemie polimicrobiană
o argumentele clinicianului
 vârsta şi statusul imun al pacientului
 particularităţile focarului septic primar

5. Febre enterice = infecţii sistemice cu poartă de intrare digestivă determinate de S. Typhi

( febra tifoidă), mai rar de S. Paratyphi A, B şi C ( febrele paratifoide)

6. Patogenie
- S. Typhi este influienţată de bariera acida gastrică: doza infectantă 105–106UFC la
persoanele cu normoaciditate;
- incubaţie: din intestinul subţire bacteriile penetrează ganglionii mezenterici, se
multiplică => bacteriemie tranzitorie (macrofage din splină, ficat, maduva osoasă);
- debut boală: a doua bacteriemie – bacteriile pot fi izolate din sânge până la apariţia
anticorpilor specifici;

60
- la sfârşitul primei saptămâni de boală bacilii pot fi evidenţiati în probele de scaun, iar din
a doua saptămână sunt eliminaţi prin urină;
- leziuni inflamatorii cu necroză şi si hemoragii - pot apare la nivelul plăcilor Peyer.

7. Diagnosticul bacteriologic direct corelat cu fazele evolutive ale bolii

săpt. I săpt. II săpt. III săpt. IV convalescenţă purtător

hemocultură + + +/- +/- - -
coprocultură - + ++ ++ +/- +/-
urocultură - - + ++ +/- +/-
bilicultură +/- +/-
medulocultură + + - - - -

i. prima saptămână: hemoculturi pe medii uzuale – pozititvitate > 90%;

ii. a doua saptămână: coproculturi pe medii îmbogăţite (bulion selenit de Na) şi selective
(mediu Hektoen / ADCL şi MacConkey);
iii. a treia saptămână: uroculturi din sediment urinar;
iv. în convalescenţă starea de purtător poate fi urmarită prin: coproculturi, uroculturi,
biliculturi.

 Diagnosticul serologic este util când izolarea agentului etiologic nu a fost posibilă.
Reacţia Widal permite evaluarea titrului aglutininelor anti-O şi anti-H faţă de S. Typhi , S.
Paratyphi A, B şi C.
b. Anticorpii anti-O apar din a 8-a zi de boală, ating valori peste 1/200 în perioada de stare
şi dispar după 2-3 luni, fiind un marker al infecţiei recente;
c. Anticorpii anti-H apar în ziua 10-12, ating valori ridicate, peste 1/800 şi persistă mai
mulţi ani; au o specificitate mai mare;
d. Anticorpii anti-Vi apar tardiv şi la titruri mici, fiind fără valoare diagnostică.

În sală se găsesc:
1. 2 seturi de hemoculturi: din ambele flacoane ale unui set am izolat S. Typhi / al doilea
set = hemocultură negativă
2. set de transfer
3. frotiuri din hemocultura pozitivă (bacili gran negativi)
4. subcultura pe agar-sânge, din hemocultura pozitivă
5. subcultura pe agar-nutritiv
6. coproculturi, triaj biochimic, identificare antigenica.

61
 Lp. 19 Identificarea micobacteriilor
Diagnosticul de laborator al tuberculozei pulmonare

Obiective: La sfârşitul lucrării practice studenţii trebuie să cunoască:

1. Etapele identificării micobacteriilor
2. Etapele efectuării coloraţiei Ziehl Neelsen
3. Etapele diagnosticului de laborator al tuberculozei pulmonare.
4. Etapele diagnosticului de laborator al tuberculozei renale şi al meningitei tuberculoase.
5. Particularităţile testării sensibilităţii la antituberculoase.

1. Identificarea micobacteriilor: Mycobacterium tuberculosis

 Identificare preliminară
- Caractere microscopice: bacili fini, granulaţi, uneori ramificaţi, aşezaţi în litere
unghiulare, acido-alcoolo-rezistenţi (BAAR), imobili, nesporulaţi, necapsulaţi. Pe frotiul
de cultură pe mediul lichid pot fi dispuşi paralel sau în corzi flexuoase.
- Caractere de cultură: sunt bacterii pretenţioase nutritiv (cultivă pe mediul Lőwenstein
Jensen, mediul Middlebrook), cu creştere lentă (primocultura apare după 2-4 săptămâni),
aerobi sau microaerofili. Forma de cultură R: coloniile sunt conopidiforme, rugoase,
uscate, grunjoase, de culoare crem bej.
 Identificare de certitudine:
- Identificare biochimică: produce catalază inactivată la 68°C, produce niacină,
reduce nitraţii, degradează zaharurile oxidativ, rezistent la hidrazida acidului
thiofen-2-carboxilic

62
 - Identificare antigenică: detecţie prin imuncromatografie a antigenului proteic
MPT64, detecţia ESAT-6 (early secreted antigenic target protein 6)
- Identificarea acizilor graşi din peretele bacterian prin gaz cromatografie
- Identificare genotipică – tehnici de biologie moleculară (sonde de acizi
nucleici/PCR)

2. Coloraţia Ziehl Neelsen (coloraţie diferenţială: împarte bacteriile în acido-alcoolo-

rezistente şi ne-acido-alcoolo-rezistente)
 Etape:
1.Colorarea - fucsină fenicată Ziehl; se încălzeşte lama până la emiterea de vapori. Se
repetă încălzirea cu intermitenţă timp de 3-5 minute; după răcire se spală cu apă.
2. Diferenţierea: soluţie alcool etilic - acid clorhidric; se decolorează până când frotiul
rămâne alburiu după spălare cu apă.
3. Recolorare: albastru de metilen, 30 secunde, apoi se spală.
 Rezultate: BAAR sunt roşii iar bacteriile neacido-alcoolo-rezistente şi leucocitele
sunt albastre.
 Controlul de calitate: se colorează Ziehl Neelsen şi se examinează două frotiuri:
unul dintr-o suspensie de bacili neacido-alcoolo-rezistenţi iar celălalt dintr-o
suspensie de bacili acido-alcoolo-rezistenţi. Pe primul frotiu vedem numai bacili
albaştri iar pe al doilea numai bacili roşii.

3. Etapele diagnosticului de laborator al tuberculozei pulmonare

A .Prelevarea şi transportul produselor patologice.
- Se prelevă, de regulă, spută (3 probe consecutive, recoltate la 8-24 ore interval, cel puţin
una fiind prima proba matinală).
Alternative: aspirat traheo-bronşic, lichid de spălătură bronşică sau spălătură gastrică,
lichid pleural (pleurezie tuberculoasă).
- Se transportă la laborator în mai puţin de o oră.
- Refrigerarea probelor care nu sunt examinate într-o oră.
B. Decontaminarea chimică a sputei se face cu o soluţie de NaOH 4%.
C. Examenul microscopic:
 Examinarea unui frotiu de spută colorat Ziehl Neelsen (se examinează 100
câmpuri, obiectiv 100X).
Rolul examenului microscopic:
- Identifică genul bacteriilor dar nu şi specia;
- Depistează rapid bacilii tuberculozei;
- Depistează BAAR care nu cultivă în condiţiile oferite.
Interpretare:
- Bacterioscopia pozitivă are întotdeauna semnificaţie clinică;
- Bacterioscopia negativă nu exclude diagnosticul de tuberculoză dată fiind
sensibilitatea redusă a microscopiei.

Număr de bacili/câmp Rezultat

0/100 câmpuri Absenţi BAAR
1-3/100 câmpuri Se examinează 300 câmpuri
4-9/100 câmpuri Se comunică numărul
10-99/100 câmpuri Slab pozitiv (+)
1-9/câmp Moderat pozitiv (++)
>10 câmp Intens pozitiv(+++)

63
D. Izolarea pe medii de cultură: Lőwenstein Jensen, agar Middlebrook - incubare la 37ºC
şi urmărire săptămânal timp de 3 luni.
- sisteme automate de cultivare de tip BACTEC (detecţie radiometrică a izotopului 14C) şi
MB/BacT (detecţie colorimetrică a CO2) scurtează timpul de detecţie a culturii.
Interpretare
Prezenţa culturii -confirmă diagnosticul.
Absenţa culturii - nu exclude diagnosticul deoarece pot exista leziuni închise care elimină
intermitent cantităţi mici de bacili (de aceea se fac culturi repetate) sau tulpinile sunt mai
pretenţioase nutritiv.
E. Identificarea M. tuberculosis.
F.Testarea sensibilităţii la antituberculoase

4. Etapele diagnosticului de laborator al tuberculozei renale şi al meningitei

tuberculoase
Tuberculoza renală
- Prelevare: 3 probe de urinǎ (probă curată, prinsă în zbor, din jet mijlociu),
prelevate dimineaţa, în zile consecutive, în volum de 50 ml fiecare.
- Transport şi conservare: aceleaşi precauţii ca şi pentru urocultura cantitativǎ.
- Examen citobacterioscopic al urinei: piurie prezentă, bacteriurie cu bacterii
condiţionat patogene absentă
- Concentrarea probelor prin centrifugare.
- Decontaminarea chimicǎ a sedimentului urinar cu o soluţie NaOH 4%.
- Examen microscopic al frotiului din sediment urinar colorat Ziehl – Neelsen.
Prezenţa BAAR nu pune diagnosticul de tuberculoză renală deoarece în proba
recoltatǎ pot fi prezente şi micobacterii saprofite (M. smegmatis, M. phley)
- Izolarea bacteriei prin însămânţarea sedimentului urinar pe mediul Löwenstein –
Jensen.
- Identificarea bacteriei izolate în cultură.
- Antibiograma
Meningita tuberculoasă
- prelevăm LCR în tub de centrifugă steril, cu capac
- transport imediat la laborator
- examen macroscopic: LCR clar
- examen citologic cantitativ: 50-500 ecn/mm3
- examen citologic calitativ: limfocite
- examen bacterioscopic frotiul sediment LCR colorat Ziehl – Neelsen: prezenţi
BAAR
- examen biochimic supernatant LCR: glicorahia (20-40 mg/dl), proteinorahia (100-
200 mg/dl), clorurorahia (< 600 mg/dl)
- însămânţare sediment LCR pe mediul Löwenstein – Jensen cu urmărirea apariţiei
culturii până la 3 luni de incubare
- identificarea bacteriei izolate
- antibiograma

5. Particularităţile testării sensibilităţii la antituberculoase

- antibiograma - variantă a metodei diluţiilor (metoda concentraţiilor absolute, metoda
proporţiilor, metoda punctelor de ruptură)
- mediul Lőwenstein Jensen suplimentat cu antituberculoase
- antituberculoase de linia I: izoniazidă, rifampicină, etambutol, streptomicina,
pirazinamida

64
- antituberculoase de linia a-II-a: etionamida, cicloserina, capreomicina, fluorochinolone
(ofloxacina), aminoglicozide (kanamicina), rifabutin, viomicina, acid para-aminosalicilic
(PAS).
- metoda automatizată BACTEC (radiometrică)

În sală se găsesc:
- frotiuri de spută colorate Ziehl-Neelsen
- sputocultură pe mediul Löwenstein – Jensen
- antibiogramă pentru M. tuberculosis
- frotiuri de spută fixate, necolorate
- baterie coloraţie Ziehl-Neelsen

LP 20 Diagnosticul de laborator al leptospirozelor.

Obiective:
1. Prezentarea metodelor de diagnostic direct (microscopie, cultivare, tehnici de
biologie moleculară)
2. Prezentarea metodelor de diagnostic serologic

Tulpinile patogene sunt reunite în specia Leptospira interrogans

Tulpinile nepatogene au fost plasate în specia Leptospira biflexa

A. Diagnostic direct:

1. Produse patologice:
- sânge
- LCR
- urină
- postmortem: microfragmente de ficat, corticală renală, plămâni, suprarenale.

2. Examen microscopic:
Leptospirele sunt spirochete fine, cu 10-30 spire regulate, strânse, puţin adânci şi cu unul
sau ambele capete îndoite în cârlig.
Sunt la limita de rezoluţie a microscopului optic; coloraţia Gram şi impregnaţia argentică
nu sunt adecvate depistării leptospirelor.

a. Microscopia pe fond întunecat:

→ indicată pentru sedimentul urinar şi LCR
65
→ în sânge expansiunile fibrilare ale hematiilor pot fi confundate cu leptospirele
→ leptospirele = filamente regulat spiralate, luminiscente, foarte mobile, descriind
mişcări de „sfredel”
→ metodă lipsită de sensibilitate şi nespecifică

b. Imunofluorescenţa directă = metodă specifică

3. Cultivarea:
→ Izolare din sânge sau LCR în primele 10 zile de boală;
→ Izolare din urină după prima săptămână de boală, timp de 3 luni;
→ Sunt necesare mai multe probe deoarece concentraţia leptospirelor poate fi scăzută;
→ Cultivă optim la 28-30 ºC, în aerobioză, pe mediu de cultură lichid Korthof îmbogăţit
cu ser de iepure;
→ Culturile se urmăresc până la 30 de zile prin microscopie pe fond întunecat la
intervale de 5 zile.

4. Tehnici de biologie moleculară

- PCR
- Metode de hibridizare directă

B. Examen serologic

Reacţia de aglutinare microscopică = metoda de referinţă

- măsoară capacitatea serului pacientului de a aglutina leptospire vii;
- utilizează antigene specifice de tip preparate din tulpini patogene;
- practicată doar în laboratoarele de referinţă.
Aglutininele apar în a doua săptămână de boală.
Titrul la pacienţii infectaţi este > 100

Teste alternative:
- hemaglutinarea indirectă
- aglutinarea pe lamă
- ELISA
→ mai puţin sensibile sau specifice
→ folosesc antigene preparate din tulpini saprofite

În sală se găsesc:
- microscop cu fond întunecat, ulei de cedru;
- suspensie de leptospire vii nepatogene;
- pipetă, vârfuri;
- lame de microscop şi lamele;
- cristalizor cu soluţie dezinfectantă.

66
 LP 21: Examenul de laborator al ulceraţiilor şi exsudatelor genitale.
Identificarea gonococului si diagnosticul de laborator al sifilisului

Obiective: cunoastrea de catre studenti a

1. condiţiei microbiologice a tractusului genital masculin şi feminin
2. agenţilor etiologici din infecţiilor tractusului genital masculin şi feminin
3. a diagnosticului microbiologic in:
- uretrite acute;
- vaginoza;
- endocervicita acuta;
- sifilis.

Condiţia microbiologică a tractusului genital masculin:

- uretra distală - normal colonizată cu bacterii de pe tegument şi colon: stafilococi
coagulază negativi, difterimorfi, enterobacteriaceae, neisserii nepretenţioase,
anaerobi, stafilococi coagulază pozitivi
- uretra proximală - necolonizată, ocazional contaminată
- prostata, canalele ejaculatoare, veziculele seminale, canalele deferente, epididim -
normal sterile.

Infecţiile tractusului genital masculin:

- la vârstă tânară - exogene
- peste 35 ani - endogene

1. Infecţii ale organelor genitale externe:

 Leziuni ulcerative: Treponema pallidum
Virusul Herpes simplex 2
- în zone tropicale şi subtropicale Haemophilus ducreyi
Chlamydia trachomatis (L1-L3)
67
  Leziuni verucoase: Papillomavirus
T. pallidum
2. Uretrite acute:
 Gonococice (incubaţie aprox. 4 zile): Neisseria gonorrhoeae
 Non-gonococice (incubatie 7-14 zile): C. trachomatis
U. urealyticum
M. genitalium
v. Herpes simplex
 Post-gonococice: infecţie dublă, eşec terapeutic, reinfecţie
3. Prostatite: reprezentanţi ai familiei Enterobacteriaceae
C. trachomatis
U. urealyticum
4. Epididimite, epididimo-orhite:
 la tineri: Neisseria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis
 peste 35 ani: bacili gram negativi coliformi, pseudomonade, S. aureus
4. Orhite: virusul urlian, rar Coxsackie B

Diagnosticul de laborator al uretritelor acute

Se investighează, cu predilecţie, uretrita gonococică (diagnosticul de uretrită

nongonococică se pune prin excluderea celei gonococice).
1. Prelevare şi transport:
 secreţie uretrală
 dimineaţa sau la minim 4 ore de la ultima micţiune
 după toaleta locală
 3 tampoane ( realizate din dacron sau vată atoxică)
 primul tampon: 2 frotiuri realizate extemporaneu
 al 2-lea tampon: însămânţare imediată sau includere în mediu de transport Amies sau
Stuart
 al 3-lea tampon (facultativ): pentru izolarea agenţilor etiologici nongonococici
2. Examen microscopic: frotiuri colorate cu albastru de metilen şi Gram
 celule epiteliale scuamoase
 ≥ 5 PMN /câmp = uretrita acută
 diplococi gram negativi „în boabă de cafea” asezaţi predominant intracelular = aspect
caracteristic pentru uretrita acută gonococică la bărbat (în infecţia cronică dispoziţia
este extracelulară, situaţie în care nu-i putem diferenţia de neisseriile nepretenţioase).
3. Cultivarea:
 se realizează în infecţia cronică şi în caz de eşec terapeutic
 pe mediul Thayer-Martin sau pe mediu cu extract HYL, neselective şi selective prin
adaos de antibiotice
 după 24 - 48 ore la 37°C, în atmosferă cu CO 2, se observă colonii de tip S,
translucide, mici, stralucitoare, nepigmentate
5. Identificare:
 biochimică
 antigenică
68
 6. Decelarea rapidă a tulpinilor producătoare de beta lactamaze şi antibiogramă.

Diagnosticarea uretritei gonococice este urmată de diagnosticarea altor boli cu

transmitere sexuală: sifilis, HIV/SIDA, infectiile cu virusurile hepatitice B, C, etc.

Diagnosticul prostatitelor
 se recoltează trei probe seriate de urină
 prelevăm primii 5-10 ml urină (proba1)
 lăsăm să se evacueze 100-200 ml urină (pentruc „spălarea” uretrei)
 recoltăm alţi 5-10 ml (proba 2)
 masăm rectal prostata
 recoltăm următorii 5-10 ml care conţin secreţia prostatică (proba 3)
 se apreciază numărul de leucocite:
- un nr. important de leucocite în prima probă, în celelalte nr. fiind mai
redus sau absent, este sugestiv pentru diagnosticul de uretrită
- un număr de leucocite aproximativ egal în cele trei probe este semnificativ
pentru o infecţie urinară
- în prostatite, numărul de leucocite în proba 3 este de cel puţin 10 ori mai
mare decât în primele două probe
 se apreciază tipul şi numărul bacteriilor prezente în proba 2 şi 3
- examen microscopic – frotiu colorat Gram
- urocultura cantitativă pe geloză sânge şi MacConkey – în prostatite,
numărul de bacterii din proba 3 este de cel puţin 10 ori mai mare faţă de proba 2
 sunt recomandate în paralel hemoculturi
-
Conditia microbiologica a tractusului genital feminin:

- vulva, vagin, exocol- normal colonizate

1. primele saptămâni de viaţă: lactobacili
2. prepubertar: bacterii de pe tegumentul perineal
a. stafilococi coagulază negativi
b. difterimorfi
c. enterobacteriaceae
d. neisserii nepretenţioase
e. anaerobi
3. de la pubertate şi până la menopauză: lactobacili predomoiant, anaerobi,
stafilococi coagulază egativi, streptococi, Gardnerella vaginalis, Candida
4. postmenopauza: bacterii de pe tegumentul perineal
- uter, trompe – sterile

Infecţile tractusului genital feminin:

1. Vaginite
 la fetiţe: Neisseria gonorrhoeae
Streptococcus pyogenes
Enterobius vermicularis
 la femeie: Candida albicans
Trichomonas vaginalis

2. Leziuni ulcerative ( vulvă, vagin, exocol): Treponema pallidum

69
 v. Herpes simplex 2
Haemophilus ducreyi
Chlamydia trachomatis(L1-L3)

3. Leziuni verucoase ( vulvă, vagin, exocol): Papillomavirus

T. pallidum

4. Endocervicite: Neisseria gonorrhoeae

Chlamydia trachomatis ( serotipurile D-K )
v. Herpes simplex 2

5. Endometrite acute: bacterii din microbiota vaginală

S. pyogenes
C. perfringens

6. Endometrite cronice: Chlamydia trachomatis

M. tuberculosis

7. Boala inflamatorie pelvină: Neisseria gonorrhoeae

Chlamydia trachomatis
bacterii din microbiota vaginala

Diagnosticul de laborator al vaginitelor

1. Prelevare şi transport
 Se prelevă 3 tampoane din secreţia vaginală
 primul tampon: se descarcă în ser fiziologic (preparat umed lamă-lamelă pentru
Trichomonas vaginalis)
 al 2-lea tampon: 2 frotiuri realizate extemporaneu
 al 3-lea tampon: însămânţare pe medii de cultură
2. Examen microscopic:
 reacţie inflamatorie (raportul PMN/CES >1)
 evidenţierea Candida, T. vaginalis
3. Cultivare pe medii speciale pentru specii Candida (mediu Saboureau)

Diagnosticul de laborator al vaginozelor

Vaginoza = disbioză (modificare a ecosistemului normal vaginal)
! Nu este o infecţie
– flora lactobacilară este inlocuită de Gardnerella vaginalis şi anaerobi
(Mobiluncus, Bacteroides) şi micoplasme genitale
Diagnostic
 În cabinet
– pH-ul secreţiei vaginale > 4,5
– la adăugarea KOH 10% se degajă miros de peşte alterat (testul aminelor
volatile)
 În laborator
– frotiu – lipsesc celulele inflamatorii şi flora lactobacilară
– numeroase celule epiteliale vaginale superficiale în placarde; peste 20% dintre
ele au pe suprafaţa lor o abundentă floră cocobacilară care le maschează conturul
(„clue cells”)
– însămânţarea este fără valoare diagnostică

70
 Diagnosticul de laborator al endocervicitelor (se vizează de predilecţie etiologia
gonococică)
1. Prelevare şi transport
 se şterge suprafaţa exocolului cu 2-3 comprese sterile
 se introduc succesiv 3 tampoane în endocol, rotind uţor
 primul tampon: 2 frotiuri realizate extemporaneu
 al 2-lea tampon: însămânţare imediată sau includere în mediu de transport Amies sau
Stuart
 al 3-lea tampon (facultativ): pentru izolarea altor agenţi etiologici ( C. trachomatis,
VHS)
2. Examen microscopic: frotiuri colorate cu albastru de metilen şi Gram
 reactie inflamatorie ( peste 10 PMN/camp)
 diplococi gram negativi „în boabă de cafea” predominant extracelulari ( aceeasi
morfologie o pot avea şi alte bacterii din microbiota indigenă)
3. Cultivare
4. Identificare
5. Antibiograma
Diagnosticul de laborator al endometritelor
1. Prelevare şi transport
 exsudat inflamator de la nivelul cavităţii uterine
 se introduce un cateter sau o sondă prin canalul cervical
 se adaptează o seringă şi se aspiră lichid endometrial; se evacuează aerul
2. Examen microscopic
3. Cultivare

Diagnostic de laborator in suspiciunea de sifilis

1. Microscopie optică pe fond întunecat

-serozitate exprimată prin comprimarea bazei şancrului
-aspirat din puncţia ganglionilor afectaţi
-raclat din elemente eruptive cutanate sau mucoase
-preparat umed lamă – lamelă
-treponeme strălucitoare, subţiri, spiralate, cu capete efilate, mobile
2. IFD – specificitate mare
3. Impregnare argentică- pe secţiuni histologice
4. Teste serologice nespecifice (de triaj):
– VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) şi RPR (Rapid Plasma Reagin)
– depisteaza Ac tip reagine faţă de Ag cardiolipinic
– sunt rapide şi ieftine
– utilizate pentru urmărirea eficienţei terapiei
– reacţii fals pozitive: boli acute febrile, vaccinare recentă, sarcină, boli autoimune
sau de colagen, infecţii hepatice cu distrucţie tisulară, pacienţi în vârstă
– testele pozitive se confirmă prin teste specifice
– numai VDRL poate fi utilizat pentru testarea LCR la pacienţi suspectaţi de
neurosifilis

5. Teste serologice specifice:

- evidenţiază anticorpi specifici (specificitate 97-99%)
- se pozitivează înaintea celor nespecifice şi rămân pozitive cand cele
nespecifice sunt negative (sifilis tertiar)
- sunt mai puţin influienţate de terapie
71
 - FTA-ABS (Fluorescent treponemal antibody absorption)
– IF indirectă cu seruri adsorbite cu suspensii de T. Reitter;
– departajează Ac IgM de cei IgG
- TPHA (Treponema pallidum hemagglutation) – hemaglutinare pasivă;
este o reacţie calitativă; testele pozitive persistă uneori după vindecare
- Western blot
Diagnosticul sifilisului congenital
- titrarea în dinamică la interval de 6 luni a Ac
- depistarea Ac tip IgM
- IFD
În sală sunt:
- frotiuri din puroi uretral colorate Gram şi cu albastru de metilen;
- frotiuri din cultură de gonococ – Gram;
- TPHA.
LP 22. Identificarea bacililor gram pozitivi

Obiective. La sfârşitul lucrării practice studenţii vor fi capabili să:

- descrie etapele de identificare a principalelor specii din genul Bacillus şi să
diferenţieze B. anthracis / bacili antracoizi;
- descrie etapele de identificare a principalelor specii din genul Clostridium;
- descrie etapele de identificare a speciei Corynebacterium diphtheriae şi să
cunoască etapele diagnosticului de laborator al anginei difterice.

Bacili gram pozitivi:

- sporulaţi: Bacillus spp., Clostridium spp.
- nesporulaţi: Corynebacterium spp., Listeria spp., Erysipelothrix spp.

Genul Bacillus

Reprezentanţi: - specie înalt patogenă : Bacillus anthracis

- specii oportuniste (bacili antracoizi) ex. B. cereus
- alte specii ex. B.subtilis
Caractere microscopice:
- bacili gram-pozitivi mari cu extremităţile tăiate drept
- în frotiuri din cultură incubată în aerobioza (nu pot fi diferenţiate speciile de
Bacillus)
 sunt aşezaţi în lanţuri lungi
 prezintă spori ovali, centrali, cu dimensiuni mai mici sau egale cu diametrul
bacilului (nu deformează corpul bacilului)
- în frotiuri din produs patologic
 sunt aşezaţi în perechi sau scurte lanţuri
 B. anthracis prezintă capsulă
 în coloraţia Gram apare ca un halou incolor în jurul bacteriilor
 în coloraţia cu albastru de metilen policrom capsula se colorează
metacromatic în roz
Caractere de cultivare:
- aerobi, facultativ anaerobi
- nepretenţioşi nutritiv,
- se dezvoltă la temperaturi între 12-40ºC
- formă de cultură R

72
 → pe medii agarizate – colonii cenuşii, aplatizate, rugoase, cu aspect de sticlă pisată
şi contur neregulat
→ în bulion nutritiv cresc sub aspectul unui depozit floconos, fără a tulbura mediul
- B. cereus (produce lecitinază) formează colonii înconjurate de precipitat alb pe
mediul Nagler (mediu cu gălbenuş de ou)

Caractere de diferenţiere B. anthracis / bacili antracoizi

Bacillus anthracis bacili antracoizi (B. cereus)

- imobil - mobili
- colonii nehemolitice pe geloză-sânge - colonii β-hemolitice pe geloză-sânge
- sensibil la penicilină - rezistenţi la penicilină
- patogen pentru şoarecele alb - nepatogeni pentru şoarece

Genul Clostridium

Reprezentanţi: Clostridium botulinum, C. difficile, C. septicum, C. perfringens, C. tetani

Caractere microscopice
- bacili gram-pozitivi sporulaţi
- sporii au diametrul mai mare decât corpul bacilului, pe care il deformează
 C. tetani – spor sferic terminal, cu aspect de „băţ de tobă”
 C. perfringens – nu sporulează în cultură – îi observăm pe frotiuri din cultură
ca bacili gram-pozitivi mari, nesporulaţi
 Clostridium spp. – spori ovalari, centrali, paracentrali sau subterminali, cu
aspect de „suveică”, „rachetă de tenis”
Caractere de cultură
- bacterii anaerobe (atmosferă de hidrogen sau azot cu 10% CO2)
- nepretenţioşi nutritiv
- pe geloză-sânge majoritatea clostridiilor produc colonii hemolitice
- cele mai multe clostridii coagulează şi acidifică laptele turnesolat
C. perfringens
→ pe geloză-sânge: detemină o dublă hemoliză – o zonă internă, îngustă, β-
hemolitică şi o zonă externă, largă, α-hemolitică
→ pe mediu cu gălbenuş de ou: cultura este înconjurată de o arie albă de
precipitare = producerea de lecitinază
→ testul de neutralizare a lecitinazei evidenţiază absenţa precipitatului alb in
jumătatea de mediu Nagler inundată cu ser ce conţine anticorpi anti- lecitinază

Identificarea Corynebacterium diphtheriae

 Caractere microscopice: bacilli gram pozitivi, fini, granulari, mǎciucaţi (în

frotiul din produs patologic sau de pe mediul de cultură Löeffler), aşezaţi izolat
sau în perechi, sub forma literelor unghiulare, litere chinezeşti si palisade
 Caractere de cultivare:
- pretenţios nutritiv;
- izolare din produsul patologic pe medii cu sânge sau ser
 mediul Tinsdale (mediu selectiv prin adaos de telurit de potasiu):
colonii negre înconjurate de un halou brun;

73
  mediul Löeffler (mediu electiv pentru bacilul difteric): creştere
caracteristică în 10 – 18 ore de la însǎmânţare - colonii albe, lucioase,
bombate (“picǎturi de spermanţet”).
 Identificarea biochimicǎ: - diferenţierea C. diphtheriae de alte specii
Corynebacterium;
 Demonstrarea toxigenezei:
1. in vitro testul Elek
2. in vivo: testul de neutralizare
3. toxicitatea pe culturi de celule;
4. PCR pentru gena tox.

Diagnosticul de laborator al anginei difterice

I. Prelevare:
- 3 tampoane cu exsudat faringian (TF);
- un tampon cu exsudat nasofaringian.
II. Examen microscopic
 TF – 1: frotiu colorat Gram sau cu albastru de metilen alcalin Löeffler
III. Cultivare:
 TF – 2: însămânţare pe:
- mediu Tinsdale - după 24 ore coloniile negre se repică pe mediul Löeffler (mediu
electiv pentru bacil difteric) pentru a obtine cultura pură
- geloză sânge: - evidenţiază calitatea prelevării
- prezenţa de colonii β-hemolitice de S. pyogenes (uneori angina
streptococică poate evolua cu false membrane mimând angina difterică sau poate fi
asociată acesteia).
 TF – 3: însămânţare pe:
- mediul Löeffler (mediu neselectiv care favorizează cultivarea bacilului difteric cu
morfologia caracteristică),
- mediul de îmbogăţire O.S.T. (ou – ser – telurit);
 tamponul nasofaringian se descarcă pe O.S.T.- dupa 24 ore se repică pe
Tinsdale iar coloniile negre se vor repica pe mediul Löeffler
IV. Identificarea bacteriei izolată în cultură pură pe mediul Löeffler (frotiu
colorat Gram şi identificare biochimică)
V. Demonstrarea toxigenezei

În sală se găsesc:
- frotiuri din cultură Bacillus spp., Clostridium spp., C. tetani, C. perfringens, C.
diphtheriae colorate Gram
- frotiuri din produs patologic cu B. anthracis colorate Gram şi albastru de metilen
policrom
- cultură de B. cereus pe geloză nutritivă, geloză sânge, mediu Nagler şi în bulion
- tuburi Weinberg inoculate cu C. histolyticum şi C. sporogenes
- test de neutralizare a lecitinazei in vitro (C. perfringens)
- foto cu testul Elek

74
 LP.23Diagnosticul de laborator al hepatitelor virale.

Obiective:
1. Cunoasterea principalelor virusuri cu tropism hepatic şi prezentarea metodelor
specifice şi nespecifice de diagnostic.
2. Cunoasterea diagnosticului specific al hepatitelor cu transmitere predominant enterală:
VHA, VHE (metode directe, indirecte, semnificaţia markerilor virali).
3. Cunoasterea diagnosticului specific al hepatitelor virale cu transmitere predominant
parenterală: VHB, VHD, VHC (metode directe, indirecte, semnificaţia markerilor virali,
algoritm de diagnostic).

1. Hepatite virale = boli sistemice care afectează ficatul

Virusurile hepatitei → hepatotropism obligatoriu
 VHA, VHE = nude, ARNm.c. (+), încadrate însă în familii diferite
→ transmitere predominant pe cale digestivă
→ cauzează hepatite acute autolimitate, care nu se
cronicizează niciodată
 VHB, VHC = învelite (cu genom ADN, parţial dublu catenar,
respectiv ARN mc (+)
→ transmitere predominant parenterală, dar şi pe cale
sexuală, şi de la mamă la copil;
→ infecţii persistente → evoluţie spre hepatită cronică,
ciroză, cancer hepatic
 VHD = mic virus ARN
→ defectiv (infectează numai asociat VHB, de la car
eîmprumută AgHBs)
 VHG (GB virus C) – virus ARN cu transmitere parenterală, probabil
implicat în cronicizare
 Alte virusuri: F (determină hepatite grave, fulminante), TTV (virus
ADN transmis prin transfuzii, probabil implicat în cronicizare).
Alte virusuri cu tropism hepatic (ocazional): VEB, VCM, VHS, v. febrei galbene
→ afectarea hepatică este secundară

Diagnosticul de laborator – teste nespecifice (ALAT, ASAT, bilirubină, fosfatază

alcalină, etc..)
– teste specifice
 directe – detectare antigene/genom/ evidenţiere virioni (ME)/izolare
 indirecte – detectare Ac IgM/IgG

2. Diagnosticul specific al hepatitelor cu transmitere predominant digestică

75
 Diagnosticul hepatitei determinate de VHA:
 Direct = disponibil in cercetare
Virusul este prezent în sânge şi materii fecale cu 2 săptămâni anterior debutului bolii şi 1-
2 săptămâni după apariţia icterului;
- izolarea VHA: dificilă, cu producerea unor cantităţi reduse de virus
- evidenţierea virionilor în materii fecale prin ME şi identificarea prin IME.
 Serologic = depistarea Ac anti-VHA prin ELISA
- IgM – persistă 2-4 luni
- IgG – persistă toată viaţa
Semnificaţie Ac anti-VHA/IgM Ac anti-VHA/totali (IgM+IgG)

infecţie acută/recentă + +

trecere prin boală cu – +

imunizare

Diagnosticul hepatitei determinate de VHE:

 Direct = inaccesibil pentru practica de rutină

- evidenţierea ARN/VHE prin RT-PCR (în ser, MF) – sensibilitate scăzută (50%)
- evidenţierea virionilor în MF prin IME – cercetare
- identificare de Ag virale în probe de ţesut hepatic prin IF (nu este indicată în faza acută)
 Indirect = evidenţiere Ac anti-VHE/IgM sau IgG prin ELISA sau WB (IgM, dificil de interpretat,
pot persista mai multe luni).

3. Diagnosticul specific al hepatitelor cu transmitere predominant parenterală

Diagnosticul hepatitei determinate de VHB:

 Direct
- evidenţiere antigenelor VHB în ser prin ELISA: Ag HBs, Ag HBe
- evidenţiere ADN/VHB prin PCR, cu teste suplimentare
* genotipare - prin Real Time PCR (s-au descris 8 genotipuri; A-H, importante pentru
diagnostic, deoarece există diferenţe evolutive şi de răspuns la tratament); în România
predomină genotipul D;

* secvenţiere pentru detectarea mutaţiilor, care explică fenotipuri evolutive diferite,

comparativ cu tulpinile sălbatice;

- evidenţiere Ag HBc şi AgHBs în hepatocite, prin teste de imunohistochimie

 Indirect = evidenţiere Ac anti-HBs, anti-HBe, anti-HBc – prin ELISA
Semnificaţia markerilor în HVB:
76
AgHBs = infecţiozitatea sângelui în

- infecţie acută (poate lipsi, când există mutaţii în regiunea S a genomului)

- infectie cronică, ciroză, cancer heptatic
- coinfectie/suprainfectie cu VHD
- purtător inactiv de AgHBs (purtator de AgHBs, de regulă cu niveluri moderate ale
acestuia, fără a prezenta leziuni hepatice sau teste biochimice anormale)
- uneori, rezultat fals pozitiv
Ag HBe = contagiozitate crescută prin sânge şi secreţii

Ac anti-HBc → IgM = infecţie acută/recentă

reapar în acutizările formelor cronice

→ IgG = rol anamnestic (în practică există truse pentru anti-HBc totali (IgM şi IgG)

Ac anti-HBs = imunitate la reinfecţie

Ac anti-HBe = potenţial infecţios redus al sângelui → evoluţie favorabila (excepţie tulpinile

„mediteraneene” – prezinta mutaţii la nivelul segmentului genomic C şi preC, avand drept
consecinţă absenţa sintezei AgHBe, fără a fi afectată expresia AgHBc şi replicarea virală)

ADN/VHB = replicare activă/infectivitate

Tabel: interpretarea markerilor serici în HVB

AgHBs Ag anti- anti-HBc/ anti- anti- Diagnostic

HBe HBc/IgM totali HBs HBe

+ + Incubaţie

+ + + + Hepatită acută cu VHB

+ + Purtător inactiv

(>6 (>6 luni) (+ transaminaze normale, viremie

luni) scăzută sau absentă)

+ + + Hepatopatie cronică

(>6 (>6 (>6 luni) (+ creşterea ALAT > 2,5 ori)

luni) luni)

+ + + Trecere prin boala cu imunizare

77
+ Status post-vaccinare

78
Diagnosticul hepatitei determinate de VHD

! doar la pacienţii Ag HBs (+): „purtători sănătoşi” (noul termen, purtător inactiv),
infecţii acute sau cronice determinate de VHB
Coinfecţia = infectarea simultană cu VHB+VHD
→ evoluţie severă în faza acută
→ de regulă nu se cronicizează
Suprainfecţia = suprapunerea VHD pe un teren AgHBs (+)
→ evoluţie fulminantă frecventă
→ forme cronice foarte frecvente (75%)
• Diagnostic direct: pe lângă prezenţa AgHBs
- detectare antigenului delta (ELISA; prezenţă f scurtă, 1-2 săptămâni)
- detectare ARN genomic (RT-PCR)
• Diagnostic serologic = detectare, prin ELISA, a Ac anti-VHD/IgM, IgG sau totali

Diagnosticul hepatitei determinate de VHC

• Direct
 evidenţiere ARN/VHC prin tehnici de biologie moleculară (RT-PCR)
- teste calitative → confirmă boala în cazul rezultatelor serologice echivoce
→ evidenţiază infecţia cu VHC precoce, la 1-2 săptămâni de la
contactul infectant
→ certifică debarasarea de virus (sunt mai sensibile decât testele cantitative)
- teste cantitative → măsoară încărcătura virală
→ monitorizarea terapiei
Teste de genotipare (s-au descris 6 genotipuri; 1-6, cu mai multe subtipuri: 1a, 1b, 2a, 2b,
etc.) importante pentru diagnostic, deoarece există diferenţe evolutive şi de răspuns la
tratament; în România predomină genotipul 1b (de regulă, neresponsiv la tratament).

 evidenţiere Ag de miez, prin ELISA

- testul se pozitivează la 2 zile după PCR
- util pentru a surprinde perioada „ferestrei imunologice”

79
- util în centrele de transfuzii pentru a decela persoanele aflate în perioada anterioară
seroconvesiei sau a cazurilor rare, la care Ac anti-VHC apar tardiv sau niciodată.

 Indirect = evidenţierea de Ac prin:

 teste tip screening (ELISA)

 teste de confirmare (RIBA - Recombinant Immunobinding Assay)

- similar WB, dar antigenele sunt obţinute prin recombinare şi sunt fixate la egală distanţă
pe banda de nitroceluloză
- poate specifica tipurile de Ac (anti C-100-3, C 22-3, C 33c; ultimele 2 tipuri de Ac apar cel mai
precoce în infecţia acută, fiind util în aprecierea prognosticului)
- Interpretare:

 prezenţa a cel puţin două categorii de Ac – test pozitiv

 nicio bandă (Ac absenţi) – rezultat negativ
 o bandă (o categorie de Ac) – rezultat „indeterminat” (se apelează la IF sau
RT-PCR sau/şi se repetă testarea după 2-3 luni)

Algoritm de diagnostic

ELISA

Ser reactiv

Teste de confirmare

RIBA

indeterminat
negativ pozitiv
(o singură categorie de Ac)

ELISA peste 2-3 luni RT-PCR

Lp 24: Diagnosticul de laborator al infecțiilor respiratorii virale

80
Obiective:
1. Prezentarea diagnosticului de laborator în gripă;
2. Prezentarea diagnosticul serologic în pneumonii atipice primare.

Diagnosticul de laborator în gripă

O mica introducere: importanta diagnosticului direct (variabilitatea antigenica,
cunoasterea tulpinilor circulante, stabilirea formulei vaccinale la nivel mondial)
Diagnostic direct:
 Produs patologic: tampon faringian, nasal sau spălătură nasală. Sensibilitatea
diagnosticului creşte dacă recoltarea este cât mai precoce (primele 3 – 4 zile
de boală) şi dacă probele sunt examinate imediat, sau conservate la 4° C.
 Metode rapide (permit diferenţierea tipurilor):
 Detecţie antigenelor prin ELISA sau IF;
 Detecţia ARN viral prin PCR.
 Metode clasice (permit caracterizarea subtipurilor
şi a tulpinilor circulante, în scop epidemiologic sau al preparării de
vaccinuri):
 izolarea pe ouă embrionate;
 izolarea pe culturi de celule.
RH (reacţia de hemaglutinare):
- evidenţiază prezenţa virusului în produsul patologic, graţie capacităţii
virusului de a aglutina hematii;
- titrează cantitatea de virus hemaglutinant.
Necesar:
- suspensie hematii de cocoş;
- antigen gripal:
o pentru stabilirea apariţiei şi multiplicării virusului se va folosi lichid
amniotic şi alantoidian din ouă embrionate;
o pentru titrarea antigenelor hemaglutinante se folosesc antigene
standard, preparate pe oul embrionat.
Interpretarea reacţiei:
- reacţie negativă = hematiile sedimentează sub forma unui disc roşu cu margini
perfect regulate;
- reacţie pozitivă = depozit granulos / depunere a hematiilor sub formă de
umbrelă cu margini neregulate; supernatantul este incolor.

Introducere: limitele diagnosticului direct prin metode clasice (avantajele lui – pentru
tulpini complet noi) si de aici necesitatea diagnsoticului indirect.

Diagnostic serologic:
 ELISA (Ac specifici de tip)
 RIH (reacţia de inhibare a
hemaglutinării) - reacţia Hirst.

Principiu RIH: unele virusuri posedă capacitatea de a aglutina hematii (RH).

Reacţia este împiedicată de prezenţa Ac prezenţi în serul de testat (post-infecţie sau
post-vaccinare), în prezenţa antigenului omolog.
RIH:
81
 - oferă posibilitatea identificării unui virus hemaglutinant (diagnostic direct);
- permite stabilirea diagnosticului unei viroze, prin evidenţierea anticorpilor
specifici inhibitori ai hemaglutinării în serurile testate (seruri perechi: acut si
de convalescent); dezavantajul legat de timp (scop epidemiologic si mai
putinpentru pacienti)
- permite aprecierea eficientei vaccinarii si studierea Ac-lor anamnestici, dupa
trecerea prin infectie, pentru populatii largi (serograme) – seroarheologie
(istoria circulatiei virusurilor gripale, de-a lungul timpul, prin determinarea
Ac-lor in seruri obtinute de la varstnici)
Necesar:
- seruri pacient (serul I şi serul II, recoltate la 10-14 zile interval);
- antigene hemaglutinante;
- hematii.
Martori RIH:
 martor hematii;
 martor antigen (titrat anterior reacţiei prin RH);
 martori seruri de referinţă.
Interpretare: - reacţie pozitivă (sedimentarea hematiilor -buton);
- reacţie negativă (hemaglutinare).

1/7 1/14 1/28 1/56 1/112 1/224

1/448
A/Beijing/262/95 (A/H1N1) 2000
Ser I + + - - - -
-
Ser II + + + + + +
-
A/Sydney / 15 / 97 (A/H3N2) (1999)
Ser I - - - - - -
-
Ser II - - - - - -
-
B/Shandong
Ser I + - - - - -
-
Ser II + - - - - -
-

Diagnostic: infectie cu virusul gripal A/H1N1 (dinamica semnificativa)

Diagnosticul serologic în pneumonii atipice primare

Pneumonie atipică primară / pneumonie interstiţială:

- pneumonie care evoluează cu leziuni inflamatorii în interstiţiul
pulmonar;
- este atipică deoarece nu induce semnele stetacustice şi radiologice
descrise clasic (tipic) în pneumonia lobară;
- este primară pentru că este determinată de microorganisme primar
patogene.

82
Agenţi etiologici: virusuri (gripal A, B; VRS, adenovirusuri, virusuri paragripale,
etc), Mycoplasma pneumoniae, rickettsii, chlamydii.

RFC (reacţia de fixare a complementului)

Principiu: 2 complexe Ag – Ac îşi dispută aceeaşi cantitate de complement (C):

o Primul complex = Ag de referinţă şi Ac prezenţi în ser;
o Al doilea complex = Cuplul hemolitic sau sistemul indicator al reacţiei
(hematii de oaie şi ser anti-hematii de oaie).
Complexul Ag – Ac format în prima reacţie, fixează C, astfel încât a doua
reacţie nu mai are loc iar hematiile rămân intacte (buton). Dacă prima reacţie
nu are loc (Ac specifici absenţi), complementul rămâne la dispoziţia cuplului
hemolitic şi determină hemoliză.

Reacţie pozitivă = lipsa hemolizei (sedimentarea hematiilor - buton).

Reacţie negativă = hemoliză.

Pacient A. G., 14 ani, prezintă la internare frisoane, cefalee, tuse uscată. Ulterior apar
dureri musculare generalizate, stare de rău, anorexie, astenie. Rezultatele diagnosticului
serologic sunt:

Agent etiologic Titru Ac ser I Titru Ac ser II

Virus gripal A < 1/8 1/32

Virus gripal B < 1/8 < 1/8
Virus Paragripal 3 < 1/8 < 1/8
Adenovirus 1/16 1/16
Virus respirator sincitial < 1/8 < 1/8
Mycoplasma < 1/8 < 1/8
Chlamydia < 1/8 < 1/8
Coxiella < 1/8 < 1/8

Diagnostic etiologic: infectie cu virus gripal A (seroconversie);

pentru adenovirus – Ac anamnestici

Pacient R. S., sugar de 4 luni, prezintă dispnee, febră, cianoză, secreţii nazale care sunt
antrenate spre căile respiratorii inferioare. Ipoteză diagnostic clinic: bronşiolită.
Serodiagnosticul este următorul:

Agent etiologic Titru Ac ser I Titru Ac ser II

Virus gripal A < 1/8 < 1/8

Virus gripal B 1/16 1/128
Virus Paragripal 3 < 1/8 < 1/8
Adenovirus < 1/8 < 1/8
83
Virus respirator sincitial 1/16 1/16
Mycoplasma < 1/8 < 1/8
Chlamydia < 1/8 < 1/8
Coxiella < 1/8 < 1/8

Diagnostic etiologic: infectie cu virus gripal B (dinamica semnificativa)

Pentru VRS – Ac anamnestici (pot fi si de la mama; intervalul de timp dintre 2 prelevari,
prea mic, nu a permis o scadere semnificativa)

Tehnici actuale de diagnostic a pneumoniilor atipice primare:

- ELISA (IgM, IgG)
- IF
- tehnici moleculare.

Lp25 Diagnosticul de laborator al infectiei HIV/SIDA

Obiective:
1. Precizarea etiologiei virale a bolilor cu transmitere sexuală (pentru cele mai frecvente
virusuri).
2. Precizarea etapelor diagnosticului de laborator al infecţiei HIV/SIDA.

84
3. Descrierea metodelor de diagnostic ale infecţiei HIV/SIDA si a criteriilor de
diferentiere HIV versus SIDA
4. Precizarea metodelor diagnosticului de laborator al infectiei cu VHS si HPV

1. Etiologie:
- HIV
- Herpes simplex tip 2
- HPV
- VHB,VHC

Diagnosticul de laboralor al infecţiei HIV/SIDA

2. Etape de diagnostic :
a) Depistarea infecţiei HIV –teste de triaj
b) Confirmarea infecţiei HIV –teste de confirmare (WB, IF)
c) Stadializarea clinico-epidemiologică a pacientului seropozitiv (numărul
limfocitelor CD4/mmc)
d) Monitorizarea eficienţei terapiei antiretrovirale ( CD4/mmc, ARN/HIV)

3. Diagnosticul direct

!Se vor face precizări legate de structura HIV.

Colectarea şi transportul probelor
-sânge (atât pentru diagnosticul direct cât şi pentru cel indirect)
-LCR, salivă, lacrimi, urină, secreţii vaginale, produse de biopsie (intestin)
Probele se stochează la -20-70º C.

Diagnosticul direct propriu-zis:

-izolarea virusului pe culturi de limfocite – în cercetare
- evidentierea Ag p24 în ser (ELISA)
-evidenţierea ADN proviral în limfocite (PCR)
-evidentierea sau si cuantificarea ARN HIV (RT-PCR)

4. Diagnosticul indirect
a) Teste tip screening
-Teste rapide tip immunodot
Avantaje : sunt rapide, nu necesită personal calificat sau aparatură electronică
Dezavantaje: trebuie confirmate (specificitate redusa)
-Latexaglutinarea
-ELISA- (indirect sau competitiv)
Rezultate fals (+) –contaminarea preparatului obţinut pe culturi cu material faţă de care
apar Ac non HIV); posibilitate practic inexistenta (nu se mai obtin antigenele prin
cultivarea HIV pe culturi de limfocite – se obtin prin recombinare)
Rezultate fals (-) – când testul se efectuează înaintea seroconversiei
- la pacienţii imunosupresaţi
- tardiv, în stadiul SIDA

b)Teste de confirmare
-Western Blot –evidenţiază categoria Ac prezenţi
Interpretare : prezenta a cel putin doua benzi

85
Pozitiv- prezenţa a cel puţin 2 din cele 3 benzi majore: env (gp 160/120,gp 41), +/- gag
(p24) +/- pol (p 55)
Negativ : absenţa benzilor
Indeterminat : benzi prezente, dar nu se întruneşte criteriul de pozitivitate.
Teste imunologice
-nr limfocitelor CD4/mmc – parametru pentru stadializare, prognostic, monitorizarea
terapiei antiretrovirale
N: 500-1400/mmc
Pentru aprecierea eficienţei terapiei se folosesc: nr limfocitelor CD4, evaluarea Ag p24,
nivelul viremiei plasmatice.

Diagnosticul SIDA - infectii cu oportunisti, sarcoame, leucemii, impun demonstrarea

urmatoarelor criterii de laborator:
-dispariţia Ac anti p24
-reapariţia Ag p24
-scăderea CD4 < 200/µL

Diagnosticul de laborator al infecţiei cu VHS tip 2

Produse patologice: lichid din secreţiile veziculare, frotiu cito vaginal,

Diagnostic direct :
- izolarea virusului în culturi de fibroblaşti sau celule epiteliale
- evidenţierea –efect citopatic ( rotunjirea şi balonizarea celulelor, incluzii Cowdry)
- identificarea – reacţii de neutralizare, imunofluorescenta (IF)
Metode rapide : detectarea de antigene virale in proba prin IF sau detectarea genomului
prin PCR

Diagnosticul indirect: nu este util pentru diagnosticul propriu-zis ci pentru studii

seroepidemiologice
Metode: ELISA sau RN, RFC cind se foloseasc criteriile pe doua probe de ser
(seroconversia sau dinamica semnificativă)

Diagnosticul de laborator al infecţiei cu HPV

Produs patologic: celule cervicale, biopsie col;

-screening: testul Papanicolau - identificarea celulelor anormale (ASCUS, ASCH, LSIL,
HSIL);
- identificarea prin PCR a tipurilor HPV cu risc oncogen înalt (genotipare tip specifica –
Linear Array Genotyping Test sau detectia simultana a genotipurilor HPV inalt oncogene,
fara diferentierea intre genotipuri – Hybrid Capture II)
- determinarea incarcaturii virale (Real Time PCR) – corelarea încărcăturii virale cu
gradul leziunii intraepiteliale.

86
 Lp. 26 Diagnosticul de laborator al enterovirozelor

Obiective:
1. Cunoaşterea clasificării enterovirusurilor.
2. Cunoaşterea noţiunilor de sedii permisive/sedii nepermisive.
3. Cunoaşterea etapelor diagnosticului etiologic al enterovirozelor.

1. Clasificarea enterovirusurilor ca : -virus poliomielitic/ virus non poliomielitic

-virus poliomielitic tulpina vaccinală/ sălbatică

87
2. Sedii permisive : nasofaringele şi tractul digestiv. Evidenţierea enterovirusurilor în
aceste sedii trebuie interpretată cu prudenţă.
Sedii nepermisive: LCR, sânge, tractul genito-urinar. Evidenţierea enterovirusurilor
în aceste sedii este sinonimă cu infecţia.

3. Diagnosticul etiologic al enterovirozelor

Diagnostic direct:
 izolarea (inocularea produselor patologice la gazde receptive de laborator) şi
identificarea enterovirusurilor
Diagnostic indirect
 diagnostic serologic care vizează acordarea semnificaţiei de agent etiologic pentru
un enterovirus faţă de care s-au detectat anticorpi al caror titru evidenţiază
dinamica semnificativă sau seroconversia.
Diagnostic direct
Cultivarea este cea mai utilă metodă de diagnostic.
 Produse patologice:
- materii fecale
- lichid de spălătură faringiană
- LCR pentru diagnosticul meningitei (dar nu şi pentru diagnosticul poliomielitei)
- exudat conjunctival
- raclat corneean
Deoarece eliminarea de virus este intermitentă se preferă recoltarea a cel puţin 2 probe, 2
zile consecutiv, de preferat în primele 5 zile de boală.
- la pacienţii decedaţi suspecţi de poliomielită se examinează probe din segmentul lombar
şi cervical al măduvei spinării şi conţinutul colonului.
 Izolarea virusului:
1. Culturi de celule
- culturile primare (rinichi de maimuţă)
- linii permanente HeLa
Evidenţierea replicării virale: efectul citopatic (rotunjirea şi desprinderea celulelor de pe
suport, creşterea refringenţei)
2. Şoricei nou-născuţi (Virusurile Coxsackie)
- cale de inoculare : intraperitoneală, subcutanat, intracerebral
Evidenţierea replicării virale: apar semne caracteristice de boală:
- paralizii de tip flasc ale membrelor care se generalizează şi duc la moartea şoricelului în
cazul tulpinilor de virus Coxsackie A
- tremor, spasm muscular generalizat, paralizii de tip spastic, ataxie, semne de encefalită
determinate de tulpinile de virus Coxsackie B.
 Identificarea virusului
- Reacţia de neutralizare pe culturi de celule şi animale de laborator (sunt puse în
contact in vitro tulpina de virus cu seruri specifice de tip după care se inoculează la gazde
receptive)
- RIH - se aplică doar pentru acele tipuri de virusuri ECHO sau Coxsackie care au
capacităţi hemaglutinante.
- Latexaglutinarea – determină rezultate similare cu RIH
- RFC: puţin utilizată datorită reacţiilor heterologe şi a dificultăţilor de preparare a
serurilor pe animale de laborator.

Diagnosticul serologic:
- se recoltează serul I şi II
- se aplică criteriile de semnificatie clinică a anticorpilor izolaţi
88
Concluzii:
- Enterovirusurile izolate din LCR au semnificaţie clinică.
- Având în vedere larga răspândire a enterovirusurilor în rândul populaţiei aparent
sănătoase şi eliminarea lor uneori, timp de mai multe săptămâni, pentru enterovirusurile
izolatele din materii fecale, conţinut intestinal sau lichid de spălătură faringiană
precizarea semnificaţiei lor clinice se realizează cu ajutorul
AUTOSERODIAGNOSTICULUI.
Autoserodiagnosticul:
- se recoltează produsul patologic de la pacient, din care se izolează tulpina de
enterovirus
- se recoltează serul I şi II
- se realizează o reacţie antigen-anticorp folosind ca antigen virusul izolat de la pacient
- dacă se evidenţiază seroconversie sau dinamică semnificativă - tulpina infectantă este
responsabilă de episodul acut investigat; în caz contrar semnifică eliminare îndelungată
după un episod anterior.
Reacţii fals negative: - tulpini de virus slab antigenice
- apariţia tardivă a anticorpilor
Reacţii fals pozitive – reacţii heterologe, deoarece apariţia Ac anti enterovirusuri poate
induce creşterea Ac anamnestici faţă de alte virusuri.

Metode rapide de diagnostic:

- ME-în cercetare
- IF de tip indirect pentru evidenţierea Virusului Coxsackie B1
- ELISA pentru identificarea Ig G sau Ig M anti Coxsakie B
- PCR- permite identificarea tulpinii infectante şi încadrarea ei (tip salbatic /tip vaccinal)

Diagnosticul de laborator in rabie

Obiective:
1. Cunoaşterea metodelor de diagnostic direct
2. Cunoaşterea indicaţiilor diagnosticului indirect

1.Diagnosticul direct
La animal: examinăm- fragmente de biopsie creier, măduva spinării, glandele salivare,
cornee.
Secţiunile din creier (cornul lui Amon, hipocamp, cerebel) sunt utilizate pentru:
- MO - corpusculii Babeş Negri
- IF - permite aprecieri semicantitative privind încărcătura antigenică
- PCR - în centrele de referinţă pentru Lyssavirusuri.

La om, pre-mortem
Produse recoltate: - raclat corneean
- biopsie cutanată ( se recoltează 10 foliculi piloşi de la nivelul cefei)
- biopsie de la nivelul mucoasei bucale
- salivă
Cultivarea se face pe - culturi de celule

89
 - şoricei: apar paralizii spastice în trei săptămâni
Identificarea:
IF: pe preparate de creier de la animale cu boala experimentală
RN: pe soarece cu seruri specifice mono şi policlonale
ELISA - identificarea antigenelor

Post mortem- se recoltează orice produs din zonele de elecţie

3. Diagnosticul serologic
- NU este util datorită evoluţiei rapide şi fatale a bolii
- evaluarea eficienţei vaccinării; la toate personele investigate pentru demonstrarea
prezentei Ac după vaccinările ante- sau postexpunere s-a demonstrat creşterea titrului
anticorpilor
- Serologia - utilă la cei care trebuie revaccinaţi.

90