2.4. Lucrare de laborator.

Clorofila şi proprietăţile ei

Din cele prezentate putem afirma că, fotosinteza este un proces complex în care Natura transformă
molecule cu energie joasă în molecule cu energii mai ridicate (zaharuri) datorită aportului de energie solară
conform reacţiei:

Clorofila Ch1, substanţă verde care absoarbe lumina roşie acţionează ca un captator al energiei
solare. Clorofila este un complex al Mg(II) cu o porfirină în care una din dublele legături a grupărilor pirol a
fost redusă, formând o ciclopentanonă de care este fixată o grupare filtil (figura 2.10).

Figura 2.10. Structura clorofilelor a şi b.

Fig. 2.11. Spectrele de absorbţie în domeniul vizibil ale clorofilelor a şi b.

Există două forme de clorofilă care absorb la 680 nm (P-680) şi la 700 nm (P-700) (figura 2.11). Se
poate presupune că forma activă se prezintă ca un dimer. De altfel, sistemul conţine grupări carotenoide
(vitamina A) care absorb lumina ultravioletă (UV).
 Figura 2.12. Transferul electronic în
sistemele fotochimice PSI şi PSII. Axa
verticală indică potenţialul redox standard
pentru specia redus (jos) şi oxidată (sus).

Cyt = citocrom (proteină hemică, care

conţine Fe(II); Fe-S = proteină nehemică (de
ex. Rubredoxina); Plast = plastocianina; Fe
red = ferredoxină (proteină nehemică); ADP
= adenozindifoafat; ATP = adenozintrifosfat;
NADPH = forma redusă a fosfatului de
nicotinamidăadenindinucleotidă; NADP+ =
forma oxidată a aceluiaşi fosfat.

Figura 2.13. Stările de oxidare ale manganului în sistemul PSII.

Aceste grupări au două roluri: ele îşi transferă energia clorofilei şi o protejează pe aceasta de
deteriorările fotochimice. Fotonii absorbiţi cedează energie pentru efectuarea unei serii de reacţii de oxido-
reducere într-un sens opus sensului natural al acestor reacţii. Fluxul de electroni implică două sisteme
fotochimice notate PS I şi PS II (figura 2.12).
În sistemul PSII, rolul manganului este mai complex decât cel din sistemul PS1; acesta apare în
stările de oxidare II, III şi IV, fiind implicate şi anumite forme dimere după cum se observă din figura 2.13:
Clorofilele se găsesc în plante sub formă de compuşi de coordinaţie cromoproteici numiţi
cloroglobine, localizaţi în cloroplaste. În plantele superioare se găsesc în principal două clorofile: clorofila a
şi clorofila b.
Clorofila a este cel mai important pigment de pe planeta nostră deoarece poate să transforme energia
luminoasă în energie chimică, care apoi se va putea transforma în energie mecanică, energie calorică etc,
care se înmagazinează în substanţele care se sintetizează. Datorită prezenţei clorofilei a în frunze, acestea
reprezintă laboratorul natural în care se sintetizează substanţe anorganice, cu ajutorul energiei luminoase.
Clorofila b se deosebeşte de clorofila a prin aceea că are la C-3 din inelul pirolic II o grupare
funcţională aldehidică HCO. Ea însoţeşte clorofila a în numeroase plante. Lipseşte din algele albastre, roşii
şi brune, diatomee, precum şi la algele verzi din genul vaucheria. Clorofila b are un rol secundar în
fotosinteză deoarece nu poate transforma energia luminoasă în energie chimică. Ea transferă clorofilei a
energia luminosă absorbită sub formă de cuante.
 În stare pură ambele clorofile sunt substanţe solide, cristaline, insolubile în apă, solubile în solvenţi
organici (acetonă, alcool, eter etilic). În soluţie alcoolică au fluorescenţă: clorofila a roşiatică, iar clorofila b
roşie-brună). Conţinutul în clorofile al frunzelor verzi este de 0,1-0,3%, iar al celor uscate de 0,3-1,2%.
Raportul dintre conţinutul clorofilei a şi b în frunze este cuprins între 3:1 şi 5:1.
În unele alge şi diatomee s-au identificat clorofila c şi clorofila d, iar în bacteriile verzi
bacterioclorofila. Ele au o structură asemănătoare clorofilei a. Clorofila c nu conţine fitol, iar clorofila d are
la C-2 un radical formil. Bacterioclorofilele au la C-2 un radical acetil CH3-COO-, iar pe inelul pirolic II
conţin o singură dublă legătură. Se utilizează ca pigmenţi naturali la colorarea unor produse alimentare,
farmaceutice şi cosmetice (pastă de dinţi etc).

2.4.1. Proprietăţi coordinative ale magneziului în clorofilă.

Toate clorofilele active în fotosinteză sunt compuşi chelaţi ai magneziului. În timp ce porfirinele care
constitue grupări prostetice ale unor compuşi importanţi din punct de vedere biologic (hemoglobina,
citocromii etc) sunt combinaţii complexe ale ionilor metalelor tranziţionale, clorofilele conţin un ion al unui
metal reprezentativ, Mg(II).
Ionul Mg(II) din clorofilă poate fi uşor înlocuit cu doi ioni de hidrogen la tratare cu acizi slabi, sau cu
ionii de Fe(II), Co(II), Ni(II), Cu(II) şi Zn(II). Specia Zn(II) reproduce comportarea clorofilei până la o
anumită limită; particularităţile coordinative ale Mg(II) din clorofilă sunt totuşi un factor crucial în
comportarea acesteia şi nici un alt metal care poate fi inserat în clorofilă nu poate reproduce proprietăţile
coordinative ale Mg(II).
Au fost efectuate studii cristalografice cu raze X asupra unui număr de compuşi asemănători
clorofilei care au indicat că ciclul dihidroporfirinic este aproape plan, dar devierile de la planaritate sunt
semnificative; astfel, ciclul IV nu este plan, iar faţă de planul celor 4 atomi de azot pirolici, ciclurile I şi II
sunt situate deasupra în timp ce ciclurile III, IV şi V sunt situate dedesubt. Ionul Mg(II) este deplasat cu
0,30,5 Å deasupra planului celor 4 atomi de azot; această deplasare conduce la ideea posibilităţii existenţei
pentacoordinării Mg(II) într-o stereochimie de piramidă pătrată. Formula structurală prezentată în figura
2.10 atribuie Mg(II) numărul de coordinaţie 4; în cei mai mulţi compuşi coordinativi Mg(II) prezintă acest
număr de coordinaţie, cu streochimie tetraedrică. Din datele structurale asupra clorofilei reiese posibilitatea
numărului de coordinaţie 5; acest lucru nu a fost acceptat până în anul 1968, când s-au explicat proprietăţile
spectrale neobişnuite ale clorofilei.

2.4.2. Proprietăţi optice ale clorofilei; clorofila ca donor-acceptor.

Clorofila din plante are caracteristici spectrale neobişnuite: în acetonă şi alţi solvenţi organici,
clorofila a este albastră, cu o absorbţie maximă în regiunea roşu a spectrului, la 662 nm şi soluţiile sunt
puternic fosforescente. În soluţie apoasă, maximul absorbţiei clorofilei a este deplasat spre roşu (740 nm),
aceasta fiind nefluorescentă. Din caracteristicile maximului de absorbţie în domeniul roşu s-a desprins
concluzia că în plante există 26 forme diferite de clorofilă.
În interpretarea spectrelor electronice ale clorofilei, s-a recurs la proprietăţile coordinative ale Mg(II),
de o importanţă deosebită. Dependenţa de solvent a spectrului se bazează pe premiza că Mg(II) în clorofilă
prezintă un număr de coordinaţie 4 şi este nesaturat coordinativ, cel puţin una dintre poziţiile axiale trebuind
să fie ocupată cu o grupare donoare de electroni. În solvenţi polari, molecule solventului acţionează ca donor
de electroni, iar clorofila există ca momomer ChlL sau ChlL2; în solvenţi nepolari, în absenţa unor
molecule donoare de electroni, nesaturarea coordinativă a Mg(II) poate fi îndepărtată numai cu altă moleculă
de Chl, care acţionează ca donor de electroni. Funcţia cetonică C=O din ciclul V poate servi ca donor faţă de
un ion Mg(II) dintr-o altă moleculă de Chl, generând dimeri sau oligomeri prin interacţie C=O...Mg.
 Prin urmare, clorofila se distinge prin capacitatea sa de a forma compuşi de coordinaţie de tipul
donor-acceptor, fie prin autointeracţie, fie prin interacţie cu liganzi sau donori externi.
Molecula Chl are un centru acceptor al ionului Mg(II) şi un centru donor la funcţia cetonică din
ciclul V. De aceea, molecula Chl apare ca având proprietăţi unice donor-acceptor şi nu a mai fost descrisă o
altă combinaţie analoagă ei din acest punct de vedere. S-a convenit ca autointeracţia clorofilei să se
denumească endogamă şi cea de interacţie cu nucleofilii, exogamă.

2.4.3. Interacţiunea clorofilă-apă.

Această problemă a fost elucidată cu ajutorul cromatografiei în stare de vapori. Apa pare a fi un
nucleofil unic pentru clorofilă, prin proprietăţile sale, respectiv moleculă cu volum mic, capacitate de a dona
electroni (prin oxigen) şi de a forma simultan două legături de hidrogen.
Specia hidratată Chl prezintă în spectrul IR maxime le 32403590 cm-1, care indică legarea
moleculei de apă la cea de clorofilă. Dacă oligomerii clorofilei sunt hidrataţi, interacţiile endogame C=O...
Mg se rup complet şi o moleculă de apă coordinează la Mg(II):
(Chl2)n + 2nH2O 2(Chl•H2O)n
O moleculă de apă se poate lega simultan prin două punţi de hidrogen la două grupări carbonil;
interacţia generală poate fi formulată astfel:

ester-C=O...H-O-H...O=C-ceto

Mg

Analizele indică un raport Chl : H2O = 1 : 1.

Este clar că nu există nici un fel de impediment pentru repetarea unităţilor Chl•H2O şi ca rezultat, pot
fi clădiţi aducţi cu mase moleculare foarte mari, (Chl•H2O)n. În hidrocarburi alifatice ca solvent, aceste
specii apar ca entităţi cu dimensiuni coloidale. Soluţiile, dispersiile şi filmele de (Chl•H2O)n sunt de culoare
galben-verzuie, cu maxim  740 nm, fiind speciile cu spectrul deplasat cel mai mult spre domeniul roşu.

2.4.4. Extracţia clorofilei din frunze şi determinarea calitativă a componentelor acesteia.

Parte experimentală.

Se iau 2-3 g frunze verzi, se taie în fâşii fine şi se zdrobesc într-un mojar cu nisip (spălat). Nisipul are
un rol mecanic ajutând la zdrobirea celulelor din frunze. După aceasta amestecul obţinut se tratează cu
câţiva mililitri de alcool etilic, acetonă, benzen sau sulfură de carbon. După filtrarea soluţiei se va obţine un
lichid de culoare verde închis (amestec de clorofile a şi b). Se toarnă o parte din soluţia obţinută într-o
eprubetă din sticlă Pyrex sau altă sticlă de bună calitate. Privind soluţia prin transparenţă, se va observa
culoarea verde, dar dacă se priveşte soluţia perpendicular pe suprafaţa lichidului, în lumină reflectată,
culoarea va fi galben-roşcat.
În vederea diferenţierii calitative a componenelor clorofilei, se picură cu ajutorul unei pipete câteva
picături de extras pe o bucată curată de hârtie de filtru (figura 2.15). Picăturile trebuie să cadă rar şi exact în
acelaşi loc. Încetul cu încetul, se va forma o pată circulară cu diametrul de 5 cm. În centru pata va fi verde,
datorită clorofilelor a şi b. Marginile cercului vor fi colorate în schimb în galben-roşcat, culoare rezultată din
combinarea efectului carotinei şi xantofilei. Cromatografia se bazează în principiu pe fenomenul de
adsorbţie, adică pe fenomenul care constă în aderarea moleculelor unui gaz sau ale unui corp dizolvat, sub
formă de pojghiţe foarte subţiri, la suprafaţa unui corp solid.
 Figura 2.15. Reacţii pe sugativă.

O altă metodă de diferenţierea componentelor clorofilei are la bază solubilitatea lor selectivă în
anumiţi solvenţi : se iau câteva frunze verzi şi se fierb în alcool etilic pe baie marină. După răcirea soluţiei se
pun într-o eprubetă 1-2 ml din soluţia alcoolică. Peste ea se toarnă o cantitate dublă de 2-4 ml de benzină şi
se agită bine amestecul pentru omogenizare. După această operaţie se fixează eprubeta într-un stativ. Se
observă că în timp amestecul separă în două straturi: cel de deasupra, de culoare verde, conţine clorofilă a,
clorofilă b şi carotenul dizolvate în benzen, iar cel de dedesubt, de culoare galbenă, conţine xantofila
dizolvată în alcool.
Pentru a obţine separat cei trei pigmenţi dizolvaţi în benzen , se aspiră soluţia din stratul superior cu
ajutorul unei pipete şi se filtrează printr-o coloană de talc sau carbonat de calciu. După ce s-a turnat
conţinutul pipetei peste coloana de talc sau carbonat, se lasă să se scurgă prin coloniţă soluţia în benzină,
care va fi colectată într-un pahar Berzelius. În soluţia astfel obţinută a rămas carotenul dizolvat în benzină,
care nu a fost absorbit de filtru. Dacă se priveşte coloana de talc sau carbonat din coloniţă se vor distinge
două zone de culori diferite: zona superioară de culoare verde-gălbuie, în care a fost reţinută clorofila b, şi
zona inferioară de culoare verde-albăstruie, în care a fost reţinută clorofila a.
Prin intermediul clorofilei frunzele produc amidon şi zahăr din dioxid de carbon şi apă în prezenţa
luminii. Dovada că o frunză verde conţine amidon se poate face destul de uşor cu ajutorul reacţiei iod-
amidon. Frecaţi o frunză verde între degete timp de câteva minute în benzină. Faceţi apoi acestei frunze o
baie de alcool etilic, la cald. Prin acest tratament clorofila este îndepătată şi frunza rămâne fără culoare.
Spălaţi frunza în puţină apă şi apoi ungeţii suprafaţa cu tinctură de iod. Culoarea albastră care apare ne
dovedeşte cu certitudine prezenţa amidonului.

Figura 2.16. Analiza cromatografică a clorofilei.

 De multe ori amidonul preparat în frunze este trimis în alte părţi ale plantei, unde este în magazinat.
De pildă, cartoful care creşte sub pământ, cuprinde, după cum am arătat, foarte mult amidon. Se toarnă o
picătură de tinctură de iod pe suprafaţa unui cartof tăiat în două şi imediat se va forma o pată albastră, care
dovedeşte prezenţa amidonului.

Figura 2.17. ,,Imprimeuri’’ pe frunze.

Un experiment simplu şi foarte sugestiv poate fi realizat utilându-se negativul unui film fotografic.
Se foloseşte o plantă oarecare cu frunze mari, care este ţinută la întuneric timp de 2-3 zile. Se confecţionează
pentru această experineţă câteva şabloane din carton, care pot fi decupate cu diferite imagini sau litere. După
scurgerea celor 2-3 zile, se fixează cu două ace, pe una din frunzele plantei, pe amândouă feţele, şabloanele
de carton având grijă să se aranjeze pe suprafaţa superioară a frunzei discul decupat (figura 2.17).
După fixarea şabloanelor, planta este dusă la lumină şi după un interval de timp de 6-8 ore, se rupe
frunza, se fierbe în alcool la baie marină până la decolorare, apoi se tratează cu puţină soluţie diluată de iod.
Se observă că sub influenţa iodului, se vor colora numai părţile din frunză care nu fost acoperite de carton.
Pe frunză va apărea clar litera decupată. În locul cartonului decupat se poate folosi un clişeu fotografic
(figura 2.18).

Figura 2.18. Fotografie pe frunze.

După, developarea cu iod, pe frunză va apărea ,,pozitivul clişeului, e drept nu prea clar, dar totuşi
suficient de vizibil.
Toate aceste experimente demonstrează că plantele verzi nu-şi pot fabrica subtanţele nutritive decât
cu ajutorul luminii.

2.4.4.1. Analiza spectrală a clorofilelor.

 Se ia circa 1 ml soluţie de clorofilă, se diluează (până la o cloraţie verde transparent) şi se
înregistrează spectrul pe domeniul vizibil (350-750 nm). Acesta se interpretează, în baza celor prezentate în
partea teoretică a lucrării.

2.4.4.2. Identificarea magneziului.

Descompunerea clorofilei în feofitină şi MgCl2: se amestecă 10 ml extract de clorofilă cu 10 ml HCl

0,01 N şi se încălzeşte pe o baie de apă.
Magneziul din clorofilă poate fi extras şi prin precipitare cu o soluţie de NaOH când se formează un
precipitat alb-gelatinos. Se prepară o soluţie de MgCl2 de concentraţie 0,1 M. Se identifică Mg2+ atât în
extractul de clorofilă cât şi din soluţia de MgCl2 preparată, după următoarele metode:
a) Eriocrom Negru T reacţionează cu Mg2+ la un pH = 10 şi formează un complex roşu-violet.
b) 8-hidroxichinolina (oxina) precipită ionul de Mg2+ din soluţii amoniacale
( pH = 10,5), sub formă de oxichinolatul de magneziu, Mg(C9H6NO)2.2H2O, un precipitat galben-verzui
solubil în acizi minerali şi acid acetic.
c) Na2HPO4 10% în prezenţă de NH4OH în exces şi NH4Cl formează cu ionul Mg2+ un precipitat alb
cristalin, caracteristic MgNH4PO4, solubil în acizi.
d) Soluţia alcoolică de difenilcarbazidă în prezenţa ionilor Mg2+, în mediu bazic, conduce la formarea
unui compus roşu-violet.
Să se scrie ecuaţiile reacţiilor care au loc.

2.4.4.3. Dozarea magneziului.

a) Se prepară o serie de soluţii de MgCl2 sau MgSO4 care să conţină între 1,0 şi 10,0 g/25 ml soluţie
Mg . Se tratează cu Eriocrom Negru T şi se determină absorbanţa la  = 530 nm. Cu datele obţinute se
2+

trasează o curbă de etlonare ce poate determina conţinutul de Mg2+ din diferite probe.
b) Se construieşte o curbă de etalonare a magneziului cu 8-hidroxichinolină. Se lucrează la  = 380
nm.

2.4.4.4. Substituţia ionilor Mg2+ cu ionii Zn2+ şi Cu2+.

a) Se tratează 5 ml soluţie feofitină obţinută după indicaţiile anterioare cu 1 ml soluţie concentrată de

CuSO4, respectiv o altă probă de feofitină cu 1 ml soluţie concentrată de ZnSO4. Soluţiile astfel obţinute
M(II)-feofitină, se încălzesc pe o baie de apă (în eprubete închise) timp de un minut. Se înregistrează
spectrele electronice în domeniul 350-750 şi se determină max pentru benzile de absorbţie din vizibil.
b) Studiul stabilităţii sistemelor M(II)-clorofilă  M(II) = Cu(II) şi Zn(II): se tratează în eprubete
separate sistemele: Cu(II)-clorofilă şi Zn(II)-clorofilă, cu HCl de concentraţii 3 M, 6 M şi 9 M.
Se înregistrează spectrele electronice ale acestor sisteme de reacţie şi se analizeazţ prin modificarea
max şi absorbanţei specifice feofitinei, gradul de descompunere al compuşilor de coordinaţie în sistemele 1
şi 2.