MICROBIOLOGIE

ALIMENTARA

LUCRAREA PRACTICA – 2
Ce am invatat in laboratorul 1
Ce este mediul de cultura?
 Un mediu de cultura trebuie sa asigure
substratul nutritiv pentru cresterea si
multiplicarea microbilor, sa aibe un pH care sa
permita desfasurarea normala a proceselor
metabolice microbiene (in general 7,2—7,4),
sa asigure condiţiile de aerobioza sau
anaerobioza, sa fie pastrate in recipiente care
sa impiedice contaminarea cu alti microbi si sa
fie usor de manevrat.
 CLASIFICAREA MEDIILOR DE
CULTURA
Mediile de cultura se pot imparti in doua categorii:

- medii uzuale (obişnuite) - pe care se dezvolta

majoritatea germenilor patogeni.
○ Ele pot fi: pentru bacterii aerobe; pentru bacterii anaerobe;
- medii speciale, destinate izolarii, cultivarii si
cercetarii insusirilor biologice ale anumitor specii
de germeni.
o Ele mai pot fi sistematizate în medii: de izolare, de imbogatire,
selective, diferentiale;

 Dupa starea lor fizica (consistenţă) mediile se pot

imparti in: solide (geloza dreaptă, înclinată, în placă), semisolide
(în eprubete), lichide (repartizate în eprubete).

 Dupa compozitie pot fi: medii simple si complexe.

 MEDII DE CULTURA

Mediile de cultura folosite in laboratorul de microbiologie reprezinta substrate

pentru cresterea, dezvoltarea, inmultirea si mentinerea microorganismelor. Mediile de
cultura pot fi lichide sau solide, pot fi preparate din reactivi ind ividuali sau se pot obtine
prin rehidratarea unei pulberi (medii deshidratate), care contine toti ingredientii necesari
cresterii microorganismelor prezente in alimente. Dupa scopul utilizarii, mediile se pot
imparti in medii simple sau de izolare si medii speciale (medii de imbogatire, medii
elective, medii selective, medii diferentiale, medii de conservare sau de mentinere).

PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURA

Cantarirea ingredientelor sau a mediului deshidratat (mediu complet)

I
Dizolvarea si omogenizarea pulberii prin incalzire pana la fierbere

I
Corectarea pH-ului, in functie de specia care urmeaza a fi cultivata

I
Repartizarea mediului in baloane de sticla, eprubete sterile cu dop

I
Sterilizare la 1200C, 30 min

I
Depozitare la 40C
CLASIFICAREA MEDIILOR
DE CULTURA

Geloză simplă în coloană înclinată

Geloză simplă
 Definiţii
 Cultivarea bacteriilor - creşterea bacteriilor pe
medii de cultură în condiţii “in vitro”.

 Însămânţare - punerea în contact a unei culturi

bacteriene sau a unui produs patologic cu mediile
de cultură.

 Colonie bacteriana - aglomerare de bacterii

vizibilă cu ochiul liber, formată din multiplicarea
unei singure bacterii de pe mediul de cultură.

 Izolare - repicarea unei singure colonii pe alte

medii de cultură cu scopul de a obţine cultură
pură.
Cercetarea şi identificarea
bacteriilor pe medii de cultură
 Identificarea unei bacterii nu se poate face
decât după ce este cultivată pe diferite medii
nutritive - solide şi lichide şi este izolată în
cultură pură.
 Pentru izolarea diferiţilor germeni patogeni se
fac însămânţări pe medii de cultura, precum
si transplantari de germeni in stare pura - cu
scopul menţinerii lor in timp, in conditii de
laborator (tulpini de colectie).
Reguli generale
In timpul insamântarilor de orice natura, este necesar sa se aiba in vedere
câteva reguli general valabile:
 însămânţările se execută în boxe sterile sau în hote speciale care permit
sterilizarea periodică şi nu permit formarea de curenţi de aer în timpul
lucrului;
 în timpul operaţiunilor de însămânţare se evită pe cât posibil conversaţia
şi orice mişcare de prisos în jurul operatorului;
 ansa cu care se execută însămânţarea nu trebuie să fie atinsă de nici un
obiect nesteril (mână, halat, masă de lucru, etc.);
 însămânţările se vor executa cât mai repede, cu scopul de a reduce la
minim contactul materialului de însămânţat cu atmosfera ambiantă;
 în timpul cât recipientele sau tuburile de cultură, sterile sau însămânţate
sunt deschise, vor fi ţinute în poziţie înclinată cât mai aproape de flacără
pentru a evita contaminarea cu germeni sau spori din atmosferă;
 imediat după însămânţare se face notarea tuburilor cu creioane speciale
fără a se omite data însămânţării.
Tehnica însamânţarii
Ca tehnici de insamintare pot fi aplicate mai multe procedee:
 Cu pipeta Pasteur. Se cauterizeaza suprafafa probei cu o spatula incalzita,
se extrage cu ajutorul unei pipete Pasteur, flambata si ea si racita, o cantitate
de lichid organic din profunzime si se insaminteaza întâi pe mediul lichid
(bulion), iar apoi pe mediul solid (agar inclinat, agar cu singe, agar ou ser
etc.). La inchiderea si deschiderea tuburilor se iau toate masurile de asigurare
a sterilitatii, flambând gura lor imediat dupa deschidere si inainte de inchidere.
 Cu ajutorul acului de insamintare drept. Se cauterizeaza suprafaţa
produsului alimentar si se sterilizeaza acul prin incalzire la rosu (tija se trece
si ea de 3 ori prin flacara), iar dupa racire se inteapa prin suprafaţa
cauterizata, facând câteva miscari spre interior. Se scoate acul din si se face
insamântarea prin clatirea acestuia in mediul lichid.
Fara a se flamba, acul se introduce apoi in tubul cu mediul solid,
facându-se pe suprafaţa acestuia miscari in zig-zag, incepând de la baza
mediului spre partea superioara, sau se clateste acul in lichidul de
condensare, dupa care se umecteaza intreaga suprafaţa a mediului cu acest
lichid, prin inclinari repetate. Dupa fiecare proba, acul se sterilizeaza prin
inrosire la flacara.
Tehnica însamânţarii
 Cu porţiuni de aliment. Când alimentul a fost recoltat in conditii de
sterilitate (mai ales in cazul animalelor mici) se poate recurge la
secţionarea unor bucaţi cu ajutorul unor instrumente sterile, iar cu una
din suprafeţele sectiunii se disperseaza materialul patologic pe
suprafaţa unei placi cu mediu. In unele laboratoare aceasta tehnica
este folosita aproape
in exclusivitate.
 Prin introducerea direct, in mediu a portiunilor de aliment. Metoda
se foloseste mai rar, in special cind se banuieste saracia in germeni a
materialului patologic. Recoltarea si manipularea acestuia trebuie sa
se faca in conditii de sterilitate perfecte.

Ca principiu general, se va evita deschiderea probelor alimentare sau

secţionarea tesuturilor inainte de recoltarea materialului pentru examenul
bacteriologic.
Tehnica transplantarilor
Are ca scop fie izolarea din culturile mixte a diferitilor
germeni in stare pura, fie menţinerea lor in timp, in conditii
de laborator (tulpini de colectie).
Din culturile pe medii lichide, transplantarea se face cu
pipeta Pasteur sau cu ansa de insamintare. In primul caz, se
recolteaza o cantitate arbitrara (câteva picaturi) din cultura
veche, care apoi se insamânteaza in mediul proaspat. In cel
de al doilea, se introduce ansa flambata si racita in cultura
veche, dupa care se face insamântarea pe mediile
proaspete (intâi in mediul lichid si apoi in mediul solid, daca
este cazul).
Din culturile pe medii solide, transplantarea se face cu
ansa, raclând o cantitate foarte redusa de cultura, care apoi
se depune pe mediile proaspete.
 Metode de însămânţare
Pe medii solide
- însămânţare prin epuizare (se obţin colonii izolate)
- însămânţare în sector (se obţin colonii confluente)
- însămânţare prin înţepare
Pe medii lichide
- omogenizarea unei colonii în mediu lichid

Însămânţarea prin epuizare

Obţinerea culturii primare
· Se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs patologic.
· Se descarcă ansa pe mediu de cultură:
- se însămânţează un prim sector [1];
- din primul sector însămânțat se trasează câteva
striuri paralele în sensul acelor de ceasornic [2];
- se continuă însămânțarea prin striuri paralele
[3], terminându-se printr-un striu în zig-zag [4].
 Metode de însămânţare
În ultimul sector bacteriile sunt dispersate, astfel încât după incubare se vor
forma colonii izolate.
Metode de însămânţare
 Metode de însămânţare
Obţinerea culturii pure
· Se replică o singură colonie din cultura primară pe un mediu de
cultură proaspăt, fie prin epuizare, fie prin însămânţare în sector.

Însămânţarea în sector
Pe o placă pot fi însămânţate
mai multe specii bacteriene.
Prin însămânţare în sector nu se
obţin colonii izolate!
Se încarcă ansa de platină
sterilizată cu produs patologic.
Se descarcă ansa pe mediu de
cultură sub forma unui sector de
cerc.
 Metode de însămânţare
Însămânţarea pe medii în coloană înclinată
 - Se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs.
 - Se descarcă ansa pe partea înclinată a mediului de
cultură sub forma unui striu.
NU se obţin colonii izolate, bacteriile cresc sub diferite modele.
Metode de însămânţare

Însămânţarea prin înţepare

Se practică pentru însămânţarea mediilor solide
turnate în coloană dreaptă.
· Se încarcă acul de inoculare cu produs.
· Se înţeapă mediul în direcţie verticală pe
o distanţă de ¾ din înălţimea coloanei.

Însămânţarea în mediu lichid

· Se încarcă ansa de platină sterilizată cu
produs.
· Se omogenizează produsul recoltat în
mediul de cultură lichid.
 Morfologia coloniilor
bacteriene
 După însămânţare, prin tehnică adecvată,
pe mediu nutritiv solidificat în vase
Petri sau lichid în tuburi, se asigură
incubarea la termostat.

 După incubare, pe baza observaţiilor zilnice, se

notează: momentul apariţiei coloniilor, gradul de
uniformitate, forma coloniilor, aspectul suprafeţei,
aspectul marginii, profilul, culoarea, mărimea etc.

Informaţiile despre caracterele

coloniilor bacteriene obţinute pe medii
nutritive permit identificarea speciei
cercetate.
Va
multumesc!