Diagnostic de laborator în RABIE

Turbarea este o boală infecţioasă virotică, sporadico-

enzootică, întâlnită la toate speciile de animale
homeoterme, transmisibilă la om, caracterizată prin
evoluţie acută cu manifestări nervoase exprimate prin
hiperexcitabilitate şi agresivitate, urmate de paralizii şi
moarte.

Familia Rhabdoviridae,
Genul Lyssavirus, ARN
aspect cilindru cu vârf alungit (profil de glonte)
120 - 180 nm lungime / 60 - 80 nm lăţime
Conform Programului strategic , rabia se supravegheaza pe
teritoriul Ro
Scop: pentru apararea sanatatii publice si a sanatatii animale,
scaderea raspândirii rabiei în populatiile de animale domestice si
salbatice care va duce treptat la eradicarea rabiei in România.
Grupa de animale tinta: toate animalele susceptibile la infectia cu
virusul rabiei în regiunile de risc din mediul urban, silvatic, rural
Supraveghere:
• Prin examinare clinica obligatorie si punerea sub observatie timp
de 14 zile
a animalelor care au muscat sau zgâriat persoane si animale.
• Prin examene de laborator la animalele moarte/ suspecte si
ucise, care au manifestat tulburari de comportament ce pot fi
atribuite rabiei.
Suspiciunea de rabie se impune dacă se constată următoarele aspecte epidemiologice şi
clinice:
Date epidemiologice
Receptivitate: toate mamiferele sălbatice şi domestice
Surse de infecţie: animale bolnave; rezervor urban, rezervor silvatic.
Căi de transmitere: muşcătură sau zgârietură; contact mucoasele sau pielea, inhalare,
ingestie.
Mod de evoluţie: sporadico-enzootic.
Date clinice – 2 forme clinice principale:
Forma furioasă: debut cu modificări de comportament, hipersalivaţie, dromomanie,
hiperexcitabilitate psihică şi motorie, agresivitate, în final intervin paraze şi paralizii şi moarte.
Forma paralitică: paraze şi paralizii şi moarte
 Diagnostic in RABIE
! la animale doar postmortem
Aspecte epidemiologice
Suspiciune de rabie
Semne clinice

Prelevare probe: SNC

Confirmare

Confirmarea suspiciunii de rabie se bazeaza pe rezultatele urmatoarelor teste de laborator:

IMUNOFLUORESCENTA DIRECTA = IFD (detectarea antigenului viral prin intermediul unui ser

specific antirabic marcat fuorescent)

Examen histopatologic (evidentierea corpusculilor Babes-Negri = leziune patognomonica, incluzii

oxifile localizate in citoplasma neuronilor)

Bioproba (inocularea intracerebrala la soricei)

Inoculare pe culturi celulare (conform Programului strategic 2011)

 Prelevare probe

de la animalele de talie mare extremitatea cefalica si coloana vertebrala, encefal, cerebel de la bovine, iar de la animale
de talie mica se trimite cadavrul in totalitate.
Persoanele care recolteaza probele sunt expuse riscului de contaminare si vor respecta masuri de protectia a muncii:
manusi de cauciuc, ochelari.
OIE: Talamus, cerebel (! bovine), hippocamp (cornul lui Ammon)
RO: cerebel (! bovine), hippocamp (cornul lui Ammon), vermix

Probele se trimit catre laborator refrigerate sau in formol sau glicerol pt a evita degradarea tesuturilor. Pentru
examen histopatologic se trimite encefal formolizat, pentru bioproba organele se trimit refrigerate sau imersate in ser
fiziologic glicerinat 5%.
Recoltarea cornului lui Ammon: se practica doua sectiuni la nivelul emisferelor cerebrale pentru a se deschide
ventriculii laterali, apoi se sectioneaza transversal la limita dintre treimea mijlocie si cea posterioara si apoi o noua
sectiune longitudinala perpendiculara pe prima (se evidentiaza cornul lui Ammon, cu forma caracteristica si
culoare sidefie).
 Imunofluorescenta directa (IFd)

Scop: detectarea Ag rabic in sectiuni/amprente de SNC prin intermediul unui ser specific antirabic marcat
fluorescent
Principiu: detectia de Ag rabic in tesuturile infectate se produce in urma cuplarii specifice a acestui antigen de catre
anticorpii specifici antirabici din serul marcat fluorescent; pentru vizualizarea complexelor imune fluorescente se
examineaza la microscop in lumina UV.
Materiale si metoda: se fac amprente din SNC (cornul lui Ammon, cerebel, scoarta cerebrala, trunchi cerebral) pe
lame degresate si dupa uscare la temperatura camerei se expun la lumina UV pentru inactivarea virusului; ulterior
se fixeaza in acetona si dupa uscare se aplica o picatura de ser specific antirabic fluorescent. Preparatele se
introduc in camera umeda la termostat (37C°) timp de 30 minute, dupa care se spala cu tampon fosfat salin, se
usuca si se examineaza la microscop cu UV.
Rezultat + cand amprenta prezinta fluorescenta evidenta, cu aspect de incluzii colorate galben-verzui (mar verde)
si Rezultat – cand este absenta fluorescenta.
Valoare de diagnostic: este testul cu sensibilitatea si specificitatea cele mai mari pentru diagnosticul rabiei, test
oficial in Romania, test recomandat de OIE. Se practică în mod curent, fiind specific şi rapid. Asigurând un
diagnostic de certitudine până la 98 - 100 % din cazuri, în 24 de ore, putându-se folosi şi ca metodă unică de
diagnostic.
IF directa
 Examen histopatologic
!!!!! Corpusculi Babes-Negri - (leziune patognomică)
 incluzii oxifile, formă rotundă sau ovalară, 0,25 - 30 microni diametrul (în medie de 4 - 5 microni),
unic/ multiplii în aceeaşi celulă
 situate în citoplasma neuronilor şi în prelungirile acestora, mai ales în neuronii din cornul lui
Ammon, în celulele piramidale din scoarţa cerebrală şi în celulele Purkinje din cerebel (la bovine)
dar pot fi întâlniţi şi în alte zone ale sistemului nervos central sau periferic, chiar în unele organe şi
glande.
Mărimea, numărul şi prezenţa incluziilor sunt în relaţie directă cu durata bolii clinice, cu specia
animală şi tulpina de virus.
Metode de evidentiere: Mann, Giemsa, Sellers

!!!!!! Neuron cu corpuscului Babes-Negri

Neuron fara incluzii

!!!!! câine în 90 - 96 % din cazuri, la bovine în 64 %, la porcine în 53 %, la cabaline în 21 %.

!!!!!!! Prezenta incluziilor CONFIRMA RABIA, absenta lor NU EXCLUDE RABIA!!!!!!!!
Rabie - Corpusculi Negri în interiorul
celulelor Purkinje

Corpusculi Negri - cerebel

Corpusculi Babes-Negri
 Corpusculi Babes-Negri –metoda Sellers

Others staining methods: Mann, Lentz

 Corpusculi Babes-Negri

Infiltrat celular mononuclear

Rabie - Corpusculi Babes-Negri în
interiorul celulelor Purkinje
Rabie - Corpusculi Babes-Negri - imunohistochimie
 Celule gliale – noduli Babeș Perivascularită limfocitară

Leziunile nespecifice: encefalită virală (nesupurată) - infiltraţii de tip limfohistiocitar în jurul neuronilor (satelitoză şi
neuronofagie) şi al vaselor de sânge (perivascularită), cu fenomene alterative neuronale (degenerare hidropică,
tigroliză, picnoză şi cariorexă)
distrucţii neuronale (proces distrofico-necrotic)
se dezvoltă un proces reparator cu celule gliale → apar noduli Babeş.
 la nivelul encefalului → meningoencefalită limfocitară nepurulentă ≡ infiltraţie limfocitară difuză în SNC.
perivascularită limfocitară
în ganglionii senzitivi – proces de proliferare glială – noduli (fenomen evidenţiat de van Gehuchten – Nellis)
 Bioproba

 soareci sugari de 48 de ore sau şoareci de 3 - 4 săptămâni (i.c.)

 iepuri (i.m. musculatura cefei sau intra-ocular)
 cobai (i.c. sau i.m.)
Soarecii si iepurii - forma paralitica, iar cobaii - forma nervoasa.
Raspunsul la infectia experimentala apare in 6-10 zile la soareci si 14-30 de zile la iepure.
- inoculare 6-8 animale/ proba.
animalele care mor in primele 4 zile nu se vor lua in considerare, moartea datorandu-se lezarii unor regiuni
intinse de la nivelul SNC.
dupa 6-10 zile apar manifestarile clinice (abatere, tremuraturi musculare, horipilatie, pareze si paralizii la
nivelul trenului posterior), iar animalele mor dupa cateva zile proba + daca
- examenul histopatologic + (corpusculi Babes-Negri) sau
- daca acestia nu se evidentiaza, dar infectia se transmite in serie si determina moartea animalelor inoculate
(cei inoculati cu material preparat de la animalele anterior inoculate experimental).
- Nu se exclude insa boala daca animalele mor cu semne clinice, dar nu se evidentiaza corpusculii
patognomonici si infectia nu se transmite in serie (neuroinfectie mortala autosterilizanta) sau daca animalele nu mor
(indivizi rezistenti la infectie).
Se afirma ca un animal nu a fost sau nu este turbat cand simptomele se remit si animalul supravietuieste,
aceasta avand in vedere ca vindecarile in turbare sunt exceptional de rare, practic inexistente.
 Examen virusologic

Virusul rabic este încadrat în familia Rhabdoviridae, genul Lyssavirus, are aspect de cilindru cu vârf alungit
(profil de glonte), 120 - 180 nm lungime / 60 - 80 nm lăţime.
Cultivarea virusului in vitro este dificilă, necesitând perioade variabile de adaptare. Unele tulpini de virus au
putut fi cultivate în ouă embrionate de găină şi raţă prin inoculare pe cale corioalantoidiană, alantoidiană,
intravitelină sau în creierul embrionilor. În toate cazurile virusul se găseşte în cantităţi mari în sistemul nervos
central al embrionilor. S-a reuşit cultivarea pe celule tumorale de şoarece, celule embrionare de găină, celule
renale de hamster, de porc, de câine, liniile celulare KB, BHK 21, Vero, celule diploide umane, fără a produce
efect citopatic.
Pentru confirmarea prezentei virusului - IFd

Examene serologice
ELISA, SN se utilizeaza cand se are in vedere evaluarea capacitatii imunogene a unui vaccin sau verificarea
statusului imun postvaccinal (titrul de anticorpi specifici antirabici)
IFd → pe amprenta de SNC cu ser antirabic marcat cu substanţe fluorescente; limitele metodei - ţin de metoda şi de
stadiul evolutiv al bolii în momentul recoltării materialului patologic; reacţii fals pozitive (captarea de către antigen
fluorescent a celulelor moarte). Avantaj → rapiditate (maxim 3 ore).

Examen histopatologic → necesită minimum trei zile

→ rezultat pozitiv: incluziile intracitoplasmatice oxifile Babeş-Negri (absenţa lor nu exclude boala) → unele tulpini nu
produc incluzii; la unele specii există localizare mai frecventă în anumite regiuni (rumegătoare – cerebel; câine →
strat poliedric Ammon).

Bioproba → inoculare de triturat de SNC aseptizat intracerebral la şoriceii sugari sau în limbul sclerocorneean la
iepure;
- şoriceii se ţin sub observaţie 21 zile → cei care au murit după a 5-a zi se examinează prin IFd şi histopatologic.