UNIVERSITATEA „OVIDIUS“ DIN CONSTANȚA

FACULTATEA DE MEDICINĂ DENTARĂ

PROGRAMUL DE STUDII MEDICINĂ
DENTARĂ

LUCRARE DE LICENȚĂ

Coordonator ştiințific
Prof. univ. dr. Victoria Badea

Absolvent
Ardeleanu Sorin-Dumitru

2019
 UNIVERSITATEA „OVIDIUS“ DIN CONSTANȚA
FACULTATEA DE MEDICINĂ DENTARĂ
PROGRAMUL DE STUDII MEDICINĂ
DENTARĂ

METODE DE IDENTIFICARE A
STAFILOCOCULUI AURIU ÎN
CAVITATEA BUCALĂ ȘI
NAZO-FARINGIANĂ

Coordonator ştiințific
Prof. univ. dr. Victoria Badea

Absolvent
Ardeleanu Sorin-Dumitru

2019

2
Cuprins
PARTEA GENERALĂ.......................................................................................................................4
CAPITOLUL 1.........................................................................................................................................5
1. Genul Staphylococcus. Generalități..................................................................................................5
1.1 Particularități microscopice...................................................................................................6
1.2 Caractere de cultură....................................................................................................................9
1.3 Habitat și implicații în patologia infecțioasă a cavității buco-nazale.........................................14
CAPITOLUL 2.......................................................................................................................................21
2. Rezistența la antibiotice..................................................................................................................21
2.1 Mecanisme de instalare a rezistenței la modul general............................................................21
2.2 Evoluția rezistenței la antibiotice in Europa..............................................................................23
CAPITOLUL 3.......................................................................................................................................27
3. Modalități de instalare a rezistenței germenilor genului Staphylococcus la antibiotice.................27
PARTEA PERSONALĂ...................................................................................................................35
CAPITOLUL 1...................................................................................................................................36
1. Motivația temei alese......................................................................................................................36
CAPITOLUL 2.......................................................................................................................................38
2. Material și metodă.........................................................................................................................38
2.1 Recoltarea exudatului faringian..........................................................................................38
2.2 Recoltarea exudatului nazal................................................................................................38
2.3 Recoltarea de produse patologice din cavitatea bucală......................................................39
2.4 Examenul microscopic.........................................................................................................40
2.5 Însămânțarea pe medii de cultură.......................................................................................41
2.6 Identificarea tulpinilor de stafilococ prin metada API.........................................................46
2.8 Identificarea meticilinorezistenței.......................................................................................48
CAPITOLUL 3.......................................................................................................................................58
3. Rezultate obținute..........................................................................................................................58
3.1 Prezentarea lotului de studiu..............................................................................................58
3.2 Sensibilitatea la antibiotic...................................................................................................65
3.3 Rezistența la meticilină........................................................................................................66
Concluzii..............................................................................................................................................67
Bibliografie:.........................................................................................................................................68

3
PARTEA GENERALĂ

4
CAPITOLUL 1

1. Genul Staphylococcus. Generalități

Bacteriile din Genul Staphylococcus sunt germeni de forma rotundă, gram-pozitivi
dispuși în grămezi neregulate cu aspect de ciorchine [gr. staphylos], cu variații în dimensiuni
[0,5-1,5 µm] cu tropism marcat pentru țesutul dermic și anexele pielii, dar cu posibilitatea de
a invada orice alt țesut, cu o largă răspândire în mediul extern, imobili și nesporulați. Cele
mai multe specii sunt catalazo-pozitive și facultativ anaerobe, dar cresc mai bine aerob; S.

sacharolyticus și S. aureus subsp.anaerobius sunt excepții care preferă anaerobioza.

Nepretețioși nutritiv, cultivă pe majoritatea mediilor de cultură uzuale și tolerează

concentrații de peste 5% NaCl, iar unele specii sunt chiar halofile [tolerează concentrații de
10-15% NaCl].

Theodor Billroth (1829–1894; chirurg austriac, unul dintre fondatorii chirurgiei

abdominale) a făcut primele semnalări ale stafilococilor în 1874 după ce i-a observat în
colecții purulente de origine animală, iar Louis Pasteur (1822 – 1895), în 1880 a realizat
izolarea în cultură pură. În 1880, chirurgul scoțian Sir Alexander Ogston a descris
stafilococii din puroiul unui abces chirurgical într-o articulație a genunchiului: "masele arătau
ca ciorchini de struguri"

Patru ani mai târziu, Anton J. Rosenbach (1842-1923) introduce termenul de

stafilococ. În 1884, chirurgul german a izolat două tulpini de stafilococi, pe care le-a denumit
pentru aspectul pigmentat al coloniilor lor: Staphylococcus aureus, din aurum latin pentru
aur, și Staphylococcus albus. (1, 2, 3, 4)

Studii mai recente au stabilit criterii și mai exacte de diferențiere care se bazează pe
compoziția chimică a peretelui celular, pe existența citocromilor, pe felul și proporția acizilor
grași, pe hibridarea ADN, ARN. Studiile foarte amănunțite realizate pe tulpinile de
stafilococi de origine animală au fost inteprinse de Marsalec si Hajek. (2, 3, 4)

5
Există cinci specii de stafilococi asociate frecvent cu infecții clinice: Staphylococcus aureus,
S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis și S. saprophyticus.

Staphylococcus aureus este cea mai patogenă specie și este implicată într-o varietate de
infecții. Este, cu frecvență, descoperită ca floră umană normală în narele anterioare (nările).
Se poate găsi și în gât, axilă, în zonele inghinale și perineale. Aproximativ 30% dintre adulți
și cei mai mulți copii sunt purtători periodici sănătoși nazofaringieni ai S. aureus.
Aproximativ 15% dintre adulții sănătoși sunt purtători nazofaringieni persistenți. Ratele de
colonizare în rândul lucrătorilor din domeniul sănătății, al pacienților aflați în dializă și al
persoanelor cu diabet sunt mai mari decât în populația generală.

1.1 Particularități microscopice

Celulele S. aureus sunt gram-pozitive și apar în formă sferică. Acestea sunt adesea în
grupuri care seamănă cu ciorchine de struguri atunci când se observă sub microscop de
lumină după colorarea Gram. Numele "Staphylococcus" a fost derivat din greacă, adică
ciorchine de struguri (staphyl) și boabe (kokkos). Observarea microscopică electronică prin
scanare relevă celule cu formă sferică aproximativă cu suprafață netedă. Diametrul celulelor
variază de la 0,5 la 1,0 μM. Microscopia cu transmisie electronică a celulelor prezintă pereți
de celule groase, membrană citoplasmică distinctivă și citoplasmă amorfă.

Fig. 1 A și B). S. aureus sunt cocci gram pozitivi, care apar adesea în clustere neregulate (10)

6
 Pe frotiul colorat cu albastru de metilen sau Gram, realizat din culturi pe mediu solid,
stafilococii apar de formă perfect rotundă, dispuși în grămezi neregulate, asemănându-se
chircinilor de struguri. Pe cele efectuate pe culturi in mediul lichid pot apărea izolați, în
pereche, tetrade sau lanțuri scurte de 3-4 celule.

Stafilococii sunt, de regulă, gram-pozitivi, dar in condiții de stress metabolic (pH,

temperatură, factori antimicrobieni, presiune osmotică, etc.) se pot schimba in gram-variabili,
adică în aceeași grămadă, alături de coci gram-pozitivi apar și coci-negativi, mai mulți sau
mai puțini. Odată cu modificarile tinctoriale apar și modificări morfologice: forme ușor
alungite, marginile imperfecte.

Fig. 2: Staphylococcus aureus văzut sub microscop după colorația lui Gram (13)

Peptidoglicanul, principalele componente ale peretelui celular de S. aureus, este

cunoscut a fi ținta unor antibiotice importante(12). Printre aceștia, beta-lactamele (de exemplu,
penicilinele) își exercită activitatea antimicrobiană prin interferarea cu enzimele (proteinele
de legare a penicilinei) implicate în mod specific în sinteza peptidoglicanului, în timp ce
glicopeptidele (de exemplu vancomicina) se leagă cu afinitate și specificitate ridicată la
precursorii peptidoglicanului încorporarea lor în peretele celular bacterian. În prezent, există

7
o nevoie constantă de noi medicamente antistafilococice datorită dezvoltării tulpinilor
(17)
rezistente la antibiotice . Un exemplu al unui astfel de medicament nou este lizostafina, o
enzimă secretată de Staphylococcus simulans care scindează în mod specific peptidoglicanul
care reticulează punțile de pentaglicină din S. aureus, hidrolizând astfel peretele celular și
(7)
lizând bacteriile . Datorită specificității sale unice, lizostafina ar putea avea un potențial
ridicat în tratamentul infecțiilor stafilococice rezistente la antibiotice. De exemplu,
lizostafina, administrată singură sau în combinație cu vancomicina, sa dovedit a fi mai
eficientă în tratamentul endocarditei aortice a valvei aortice experimentale cu meticilină
decât în cazul vancomicinei în monoterapie. Lizostafina a fost de asemenea raportată ca
fiind eficace în tratamentul infecțiilor oculare cauzate de S. Aureus. (8,9)

FIG.3 C) Staphylococcu aureus vizualizat microscopic alături de E. coli D) Staphylococcus

aureaus colorație gram (10)

Cunoașterea mecanismelor moleculare care stau la baza digestiei peptidoglicanului de

către lizostaphină este o cheie a utilizării sale eficiente în terapiile antistafilococice.
Investigațiile structurale precoce utilizând microscopia electronică au arătat că celulele S.
aureus expuse la lizostafină au prezentat perforări și deteriorări mai extinse, incluzând
separarea pereților de membranele plasmatice și dezintegrarea secțiunilor mari ale pereților).
Ca o consecință, majoritatea celulelor expuse la enzimă au fost transformate osmotic fragile.
Printre acestea, celulele care păstrează capacitatea de a reveni la stafilococi normali au fost
desemnate sferoplaste, spre deosebire de protoplaste, în care întregul perete celular a fost

8
digerat. Deși tehnicile puternice de microscopie electronică nu sunt potrivite pentru urmărirea
proceselor dinamice, dependente de timp pe celule individuale și nu pot sonda proprietățile
mecanice ale peretelui celular.

Recent, microscopia forței atomice (AFM) a oferit noi oportunități pentru studierea
pereților celulelor microbiene la niveluri unice și monomoleculare. Tehnica este deosebit de
potrivită pentru vizualizarea suprafețelor celulelor vii unice în timp ce cresc, oferind
informații despre asamblarea peretelui celular și despre dinamica ce nu poate fi obținută cu
ajutorul microscopiilor tradiționale. De exemplu, Touhami și colab. au fost capabili să
monitorizeze creșterea celulelor și evenimentele de divizare în S. aureus utilizând AFM
combinată cu microscopia cu transmisie electronică cu secțiune subțire. Au fost observate
gauri în ganglionare în jurul inelului septal la începutul divizării și au fost atribuite
structurilor peretelui celular care au o activitate autolitice ridicată. După separarea celulară,
se observă inele concentrice pe suprafața noului perete celular și se sugerau să reflecte
peptidoglicanul nou format. AFM poate fi, de asemenea, utilizat pentru a studia efectul
medicamentelor asupra pereților celulelor microbiene. Într-un astfel de studiu,
microbacteriile au fost observate înainte și după incubare cu izoniazidă, etionamidă,
etambutol sau streptomicină. După tratamentul medicamentos, s-au observat modificări
structurale majore sub formă de structuri stratificate, striatii și morfologii poroase, sugerând
că acestea reflectă inhibarea sintezei a trei constituenți principali ai pereților celulari, adică
acizii micoli, arabinani și proteine. (11)

1.2 Caractere de cultură

Stafilococii se dezvoltă cu ușurință, în 18-24 de ore, pe medii nutritive simple în

aerobioză. Vitamina B1 și acidul nicotinic sunt indispensabile creșterii stafilococului.

Staphylococcus auricularis crește în timp mai îndelungat, 24-36 ore, în aerobioză și

pe aceleași medii nutritive. Există și unele specii rare de S. aureus care se dezvoltă numai în
prezența CO2 sau a altor metaboliți precum hemină, menadionă, etc.

9
Temperatura optimă de creștere a stafilococilor este de 37 ℃, iar pH-ul optim este de 7.5, dar
poate tolera variații mari.

În mod obișnuit, coloniile de 24 de ore pe mediu solid au aspectul neted (S – smooth);

se prezintă cremoase, rotunde, cu diametrul între 2-3 mm, margini perfect conturate,
suprafață netedă, lucioasă și bombată. În cazul mediilor lichide, sunt tulburate omogen, cu
depozit moderat la fundul tubului însămânțat.

Tulpinile de stafilococi cu diverse deficiențe ale peretelui celular pot da naștere unor
colonii de tip lucios (G – glossy) pitice sau de tip rugos (G-R – rough), mici, granulate, fără
hemoliză și cu margini imperfecte.

Coloniile individuale pe agar sunt rotunde, convexe și de 1-4 mm în diametru, cu o margine

ascuțită. Pe plăcile agar cu 5-8% sânge defibrinat, coloniile de Staphylococcus aureus sunt
frecvent înconjurate de zone de beta-hemoliză limpede.

Tulpinile de Staphylococcus aureus rezistentă la meticilină (adică MRSA) au adesea

beta-hemoliză slabă sau deloc și se utilizează medii de cultivare speciale cu oxacilină,
manitol și NaCI pentru izolarea lor. MRSA este capabil să crească pe acest mediu și să
producă colonii de o anumită culoare, în funcție de indicatorul pH utilizat.

Fig. 4 – Staphylococcus epidermidis, cultură pe agar-sânge (13)

10
Hemoliza α a Staphylococcus aureus determină hemoliză totală cu clarificarea completă a
mediului. β-Hemolizina tulpinilor animale de Staphylococcus aureus, ce se întâlnește
ocazional și la tulpini umane, determină hemoliză de tip cald-rece (zone incomplete de
hemoliză la 37℃, care devine completă, asemenea celei produse de α-hemolizina, după
expunerea la 4℃ a tulpinii, timp de câteva ore.

Fig.5: Staphylococcus aureus pe agar de sânge Columbia. (10)

Fig. 6 - Cultura de S. aureus, maită pozitiv (stânga) și S. epidermidis s.s., manită negativ
(dreapta), pe mediul hiperclorurat solid cu manitol și roșu fenol după 24ore. (13)

11
Pigmentarea coloniilor pe medii nutritive simple sau cu sânge defibrinat adăugat poate să nu
apară imediat ci după 24-48 de ore în cazul tulpinilor de Staphylococcus aureus supuse unui
tratament nefavorabil pentru dezvoltarea lor. Mediile ce conțin suplimente organice sunt
favorabile procesului de pigmentogeneză.

Aspectul coloniilor de stafilococi este influențat și de vârsta culturii; unele caracteristici

precum diametrul, pigmentul, hemoliza, sunt clar definite după 72-120 ore de creștere.

Fig. 7 Staphylococcus saprophyticus pe agar Mueller-Hinton care prezintă rezistență la

caracteristica de novobiocină pentru identificarea speciilor (13)

Pe mediul Baird-Parker, coloniile de Staphylococcus aureus au 1-1,5 mm diametru, sunt

convexe, cu o margine albă îngustă și corp negru strălucitor, înconjurate de un halou clar de
diametru 2-5cm. Alți stafilococi formează colonii negre, fără halou, în timp ce unele tulpini
de stafilococ determina un halou larg, opac, mărginit de o zonă clară îngustă. (12, 13)

12
 Aspectul coloniilor pe
Specia Aspectul Diametrul Pigment mediul solid
coloniilor pe agar coloniilor hiperclorurat
sange

(a) neted, cremos Auriu/citrin/ Colonii galbene,

fara pigment manitol pozitive,
S. aureus (b) var. pitice, 5-10mm îngălbenesc mediul
transparente

(c) var. mucoase

Fara Colonii nepigmentate,

pigment/ rar mediul ramane roz
S. epidermidis Opac 2.5-6mm gri-galbui

S. hominis Neted, cremos Fara Colonii nepigmentate,

3-5mm pigment mediul ramane roz

S. haemolyticus Neted, cremos, Pot fi Variabil (64% manitol-

opac 5-9mm pigmentate pozitiv)

Fara Variabil (70% manitol-

S. warneri Neted, lucios, pigment pozitiv)
centrul acuminat 3-5mm

Gălbui/ Colonii nepigmentate,

portocaliu/ mediul rămâne roz
S. lugadunesis Neted, lucios, usor 4-7mm Fara
convex pigment

S. Saprophyticus Lucios, cremos, Pot fi Colonii galbene,

foarte convexe 5-9mm pigmentate manitol-pozitiv

S simulan Neted, cremos Pot fi Colonii galbene,

3-5mm pigmentate manitol-pozitiv

S. schleiferi Neted, cremos, Fără Colonii nepigmentate,

usor convex 3-5mm pigment mediul ramane roz

Tabel 1. Caractere de cultivare pe agar sânge și pe mediul hiperclorurat solid cu manitol și

roșu fenol ale speciilor de stafilococi cu importanță clinică (3 zile de incubare la 37 ℃ + 2
zile la temperatura camerei) (13)

13
1.3 Habitat și implicații în patologia infecțioasă a cavității buco-nazale

Staphyl ococcus aureus colonizează nările și colonul, colonizând, de aici, frecvent

’

tegumentul. Prop orția purtătorilor sănătoși variază între 10-40% în colectivitatea generală și
’

între 40-70% în mediul de spital. În 1996, Bilbie și 1986, Kloos afirmau că speciile umane de
stafilococi coagulază-negativi co lonizează narile și tegumentul. Înafară de St aphylococcus
’ ’

epidermidis, prezent în habitatul tegumentar, celelalte specii au tropisme pentru anumite

biotopuri precum scalp, față, conduct a uditiv extern, etc.
’ ’

O mică minoritate (<5%) de nou-născuți este colonizată de S. aureus la naștere. În

primele 2 săptămâni de viață, colonizarea cu tulpini materne, în principal, apare rapid la
jumătate dintre sugari, dar aceasta se încadrează la dozele adulte cu vârsta de 6 luni și
coincide cu dezvoltarea imunității dobândite . Un sfert din nou-nascuți nu sunt colonizați de
S. aureus deloc în primii 2 ani de viață și ceea ce determină această rezistență la achiziție nu
este cunoscută.

Poarta de intrare este de obicei pielea. S. aureus produce leziuni inflamatorii pline de
puroi, cunoscute sub numele de abcese. În funcție de localizarea și amploarea implicării
țesuturilor, abcesul poate fi numit:

 Impetigo;
Aceasta boala cu eruptii contagioase se poate dezvolta la orice varsta (dar estefoarte intalnita
mai ales la copiii mici si sugari). Tipurile de impetigo cauzate de stafilococi aucaracteristice
prezenta unor vezicule mari care pot contine lichid si care formeaza o crustacolorata,
maronie. Aceste leziuni de cele mai multe ori sunt localizate in jurul nasului si gurii;

 Celulita stafilococica;
Este o infectie subcutanata care determina inrosirea si inflamareapielii, ducand la crearea
unor adancituri similare cu coaja de portocala.Celulitase dezvolta, decele mai multe ori, in
partea superioara a membrelor inferioare, la persoanele adulte sau la celein varsta;

 Pustulă;

14
O pustulă este un folicul de păr infectat, în care baza foliculului de păr apare roșie și este
crescută cu o acumulare de puroi chiar sub epidermă. Foliculii de păr infectați sunt de
asemenea menționați ca foliculită.
 Furuncul;
Furunclele apar ca noduli mari, crescuți, plini de puroi, dureroși, având o acumulare de țesut
mort, necrotic la bază. Bacteriile s-au răspândit de la foliculul de păr la țesutul subcutanat
adiacent. Este cel mai frecvent tip de infectie stafilococica. Sunt afectate zonele din
profunzimea foliculului pilos sau a glandei sebacee. Pielea care acopera zona infectata,
devinerosie si este inflamata, de obicei. Dacafuruncululse sparge, poate fi colectat puroi,
sange sauun lichid de culoarea chihlimbarului. Acesta apare cel mai adesea in zona axilei, in
jurulorganelor genitale sau pe fese;
 Furuncul antracoid;
Furunculul antracoid apare atunci când furunculi se coagulează și se răspândesc în
țesutul conjunctiv subcutanat și mai profund. Pielea superficială perforează, îndepărtează și
eliberează puroi. (14)

Alte simptomele ale afectiunilor care au la baza infectii stafilococice sunt:

- mastita stafilococică; - umflaturi (noduli) dureroase, scurgeri mamelonare, febra,
mancarimiale sanilor, ale mameloanelor siganglionilor limfaticidin invecinatatea
axilelor,frisoane, senzatie de caldura la nivelul sanului;
- parotidită (oreion) de origine bacteriană; tumefiere dureroasa sub ureche, dificultati
indeschiderea gurii (mandibulei) si la inghitire, febra ridicata, frisoane;
- sinuzită bacteriană; dureri dentare,dureri de cap,tuse, nas infundat, scurgeri nazale
siretronazale, lipsa de concentrare, congestie a fetei;
- toxiinfecție alimentară stafilococică; simptomele se manifesta dupa 1-6 ore de la
ingestiade alimente contaminate. Bola poate sa dispara la fel de brusc cum s-a declansat si
cele maimulte persoane se refac intr-o zi sau doua, desi efectele pot fi mai grave si durabile la
copii si laadultii mai in varsta. Simptomele includ:greata,varsaturi,diaree, disconfort general
caredureaza 1-3 zile;
- vaginită stafilococică; scurgeri vaginale, urat mirositoare, mancarimi, urinare
dureroasa,dureri in timpul actului sexual;

15
- epiglotită bacteriană; dificultati la inghitire si in timpul respiratiei, febra, salivatie
excesiva;
- prostatita bacteriană; febra, dureri severe inghinale, testiculare, ale abdomenului inferior
simuschilor. Uneori este semnalata prezenta sangelui in sperma.In anumite cazuri, infectiile
stafilococice pot pune in pericol viata unei persoane. Iata care suntsimptomele asociate cu
diverse tipuri de boli cauzate de infectiile staficolocice care ar puteaameninta viata unui
individ:
- pneumonia stafilococică; simptomele bolii sunt similare cu cele ale pneumoniei
obisnuite:febra ridicata, frisoane, cresterea ritmului cardiac,tusesi dificultati respiratorii;
- endocardita stafilococică; paloare,oboseala,febra,dureri de articulatii,eruptii sub
formaunor puncte mici, rosiatice pe piele, care apar in mod special in jurul degetelor;
- meningita stafilococică; oboseala, dureri de cap, extenuare, febra moderata si
confuziegeneralizata;
- septicemie (sepsis) stafilococică; febra,hipotermie,cresterea ritmului
cardiac,hiperventilatie, slabiciune,diaree,varsaturi, diminuarea cantitatii de urina eliminata si
dificultatide respiratie. In unele cazuri au fost observate si aparitia tulburarilor de coagulare a
sangelui;
- fasceită necrozantă (infecție bacteriană a țesuturilor moi); papule roșii care se
evoluează în pustule care conțin puroi inchis la culoare. Alte simptome sunt asemanatoare cu
cele alesepticemieistafilococice;
- sindromul de soc toxic; aceasta afectiune, care ar putea fi fatala, a fost asociata cuutilizarea
anumitor tipuri de tampoane (produse pentru igiena intima a femeilor), in rare cazuri,

S. aureus exprimă câteva proteine extracelulare care sunt virulente pentru gazdă.
Pentru majoritatea bolilor cauzate de acest organism, patogeneza este multifactorială. Multe
dintre infecțiile cu S. aureus au caracterul unor izbucniri nosocomiale cu diverse localizări:
plagă chirurgicală, infecții de șunt ventricular, peritonită la pacienți cu dializă peritoneală
continuă, etc. Infecțiile cu S. aureus MRSA, ce prezintă rezistență multiplă la antibiotice,
sunt greu de stăpânit, mai ales când evoluează în mediul de spital. S. aureus este inclus în
cele 6 specii pentru care este supravegheată rezistența față de antibiotice la nivel
internațional, a tulpinilor izolate din infecții invazive.

16
 Amintim de asemenea, manifestările de tip toxiinfecții în care este implicat S. aureus:
toxiinfecțiile alimentare, „sindromul stafilococic al pielii opărite”, sindormul de șoc toxic
stafilococic.

Fig. 8 Cartarea speciilor de stafilococi coagulazo-negativi pe tegumentul uman (13)

Unii stafilococi coagulază negativi și-au dovedit capacitatea patogenă condiționată.

Acest nou aspect al ecologiei stafilococilor s-a conturat în special în ultimile trei decenii în
relație directă cu utilizarea pe scară largă a procedurilor medicale invazive și a inserțiilor

17
protetice. Dintre acești stafilococi coagulază-negativi, S.epidermidis sensu stricto detine cel
mai înalt potențial patogen. Este agentul cauzal major al infecțiilor nosocomiale în secții de
nou născuți si oncologie, fiind prima cauză a bacteriemiilor în acest tip de unități. Poate
cauza infecții în secții de chirurgie cardio-vasculară, infecții de pace-maker, infecții de grefă
vasculară, endocardită asocitată cu valve protetice etc. Poate fi patogen primar în infecțiile
asociate cu șunturile lichidului cefalorahidian, protezele articulare, dispozitivele ortopedice.
A fost semnalat ca agennt prima al peritonitei asociata cu dializă peritoneală ambulatorie
continuă și este frecvent izolat din infecții ale tractusului urinar cum sunt cistita, uretrita si
pielonefrita.
Staphylococcus haemolyticus a fost întâlnit în endocardită, chiar in absenta valvelor
protetice, septicemie, peritonită, infecții ale tractului urirnar, plăgilor chirurgicale, ale osului
și articulațiilor.
Dintre speciile descrise recent, S. lugdunensis și S. schleiferi par a fi patogeni
oportuniști semnificativi. Pot coloniza cateterele, drenurile, alte dispozitive introduse în
organism și pot cauza endocardite pe valve protettice sau native, septicemii, abcese cerebrale,
infecții profunde, osteite, osteoartrite cronice, infecții ale protezelor vasculare, infecții
cutanate și ale plăgilor, infecții ale lichidului peritoneal.
Staphylococcus saprophyticus constituie un agent etiologic frecvent implicat în infecțiile
tractului urinar la femeile tinere, cauzează unele uretrite negonococice și prostatite, infecții
ale plăgilor și septicemii. (13)

Pentru a iniția o infecție, bacteria trebuie să aibă acces la gazdă și să se atașeze

celulelor sau țesuturilor gazdă. S. aureus are numeroase proteine de suprafață care
promovează atașarea la proteinele gazdă, cum ar fi laminina și fibronectina care fac parte din
matricea extracelulară. Fibronectina este prezentă și pe suprafețele epiteliale și endoteliale și
este, de asemenea, o parte a cheagurilor de sânge. Bacteriile au o fibrinogen / fibrină legată
de proteine care îi ajută să se atașeze la cheagurile de sânge și țesutul traumatizat. Acesta este
motivul pentru care S. aureus este capabil să producă infecții la răni și infecții post-
chirurgicale.

S. aureus poate provoca daune grave gazdei. Ea face mai multe tipuri de toxine
proteice care sunt probabil responsabile pentru simptome în timpul infecțiilor. Aceste toxine
18
afectează membrana celulelor roșii și duc la defalcarea lor. De asemenea, ele produc
leucocidină care provoacă leucocitelor leziuni membranare. Relația dintre fiecare gazdă și
tulpina lor de colonizare este extrem de personalizată. Durata colonizării printre purtătorii
nazali a fost măsurată de la 70 de zile la 8 ani. Pare mai lungă în cazul transportatorilor
persistenți, deși metodele folosite pentru a dovedi izolarea rămân aceleași, au fost
suboptimale în comparație cu tehnicile contemporane.

Se pare că colonizarea nazală rezultă dintr-un singur organism fondator care se

înmulțește în timp cu evoluția variațiilor genetice minore limitate. Persoanele transportatoare
persistente pot dobândi secvențial o nouă tulpină care le înlocuiește organismul inițial de
colonizare. Inocularea experimentală a persistente și non-purtătoare stabilite cu tulpini
multiple a determinat ca majoritatea voluntarilor să se întoarcă la starea inițială de purtătoare
"naturală" și, uneori, chiar să se întoarcă la tulpina inițială de colonizare. Staphylococcus
aureus prezent permanent în nasul a aproximativ 20% din populație, reprezi ntă un factor de
’

risc semnific ativ pentru infecții.

’

Partea anterioară a cavității nazale (vestibulum nasi) este căptușită cu epiteliu

stratificat, keratinizat, scuamos. Mai mult de 60% din S. aureus din vestibulul nazal se
găsește aici. S-a arătat, de asemenea, că S. aureus se poate lega de celulele epiteliale nazale
ciliate din partea interioară a cavității nazale (nare interne) cu epiteliu cilindric cristalizat
pseudostratat.

Pielea din vestibulum nasi este formată din două straturi principale: epiderma și
dermul. Staphylococcus aureus aderă la celulele epiteliale scuamoase găsite în nas iar
proteinele exprim ate pe suprafața acestuia, inclusiv facto rul de aglomerare B (ClfB), sunt
’ ’

responsabile pentru această interacțiune. S-a dovedit anterior, în alte studii, că ClfB
promo vează colonizarea cu Staphylococcus aureus. Această cerc etare identifică acum
’ ’

mecanismul prin care ClfB facilit ează colonizarea. Interacțiunea dintre ClfB și loricrin s-a
’

dovedit a fi crucială pentru colonizarea cu succes a nasului la testele reali zate pe soareci. Un
’

șoarece care nu are loricrin in cel ulele pielii sale a dezvoltat mai puține celule bacteriene
’

decât un șoar ece obișnuit. Cand au fost utilizate tulpini de Staphyloc occus aureus care nu
’ ’

aveau ClfB, colonizarea nazală nu a avut loc. (15, 16)

19
 Rachel McLoughlin, autorul studiului, concluzionează: loricrinul este un factor
determinant al colonizarii cu Staphylococcus aureus. Această descoperire deschide noi căi
pentru dezvoltarea unor strategii terapeutice pentru a reduce infecțiile. Acest lucru este
deosebit de important, având în vedere dificultățile asociate cu tratarea infecțiilor cu MRSA,
o varietate recentă de bacterie de Staphylococcus aureus, caracterizată prin rezistența sa la
agenți antibiotici.

Cu toate astea, factorii gazdă care determină colonizarea nazală sunt incomplet
înțeleși. Polimorfismele în genele care codifică receptorul glucocorticoid, proteinele C
reactive, proteinele interleukinei-4 și inhibitorul de complement au fost asociate cu
colonizarea cailor nazale cu Staphylococcus aureus. Flora normală poate, de asemenea,
influența capacitatea S. aureus de a coloniza. (16)

20
CAPITOLUL 2

2. Rezistența la antibiotice
Antibioticele, reprezinta descoperirea revolu ţionară a secolului XX și sunt în
’

continuare principalul instrument în lupta îm potriva infecţiilor bacteriene. Din păcate,

’

utilizarea lor a fost înso ţită de apariţia rapidă a tulpinilor bacteriene reziste nte, astfel a
’ ’

devenit o importantă problemă de sănătate publică pe plan global. În anii 1930, la începutul
erei antibioticelor, sunt desc operite primele substanţe cu efect ant ibacterian – sulfonamidele
’ ’

şi penicilina.

În perioada 1940-1960 sunt descoperite cele mai multe dintre antibio ticele utilizate în
’

prezent. Urmează apoi pe rioada anilor 1980-1990, perioadă în care au fost realizate studii
’

genetice pentru cunoa şterea genomului bacterian, precum şi a mec anismelor de acţiune a
’ ’

antibi oticelor. Sunt caracterizate cele mai importante clase de antibiotice şi mecanismele lor
’

de acţiune. Imediat după descop erirea primelor antibiotice, este recunoscut fenomenul de
’

rezistenţă la antibiotice, una dintre primele trei cele mai impo rtante amenințări ale secolului
’

XX la adresa sănătăţii publice.

Apariţia şi izolarea tot mai frecventă a aşa-ziselor superbacterii, cu un nivel ridicat de

’

rezistenţă la majoritatea clas elor de antibiotice, pun probleme serioase de terapie a infecţiilor
’

bacteriene. Cunoaşterea mecanismelor şi bazelor geneti ce ale rezistenţei la princ ipalele clase
’ ’

de antibiotice ne poate da informaţii privind lu area de măsuri pentru prevenirea şi încetinirea

’

răspândirii rezistenţei. (17, 18)

’

2.1 Mecanisme de instalare a rezistenței la modul general

Rezistența stafilococică la penicilină este mediată de producția de penicilinază (o

formă de beta-lactamază): o enzimă care scindează inelul β-lactam al moleculei de penicilină,
ceea ce face ca antibioticul să fie ineficient. Antibioticele beta-lactamice rezistentă la
penicilinază, cum ar fi meticilina, nafcilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina și
flucloxacilina, sunt capabile să reziste la degradarea prin penicilinază stafilococică.

21
Rezistența se instalează prin următoarele mecanisme:
 producerea de beta-lactamaze, enzime care neutralizează antibioticele care au în
structura lor nucleul beta-lactaminic
 modificarea unor proteine ale peretelui celular, ceea ce duce la scăderea
permeabilității bacteriene și modificarea țintei antibioticului astfel încât acesta să nu
se mai poată lega de structurile bacteriene.

Aceste proprietăți conferă rezistență la toate antibioticele care au în structura lor beta-
lactamine (peniciline și cefalosporine). Testarea tulpinilor rezistente se face prin testarea
sensibilității la meticilină; dacă tulpinile sunt rezistente la meticilină înseamnă că sunt
rezistente la toate antibioticele beta-lactaminice. Acești stafilococi se numesc stafilococi
meticilino-rezistenti (Engleză: MRSA – Methicilin resistent Staphylococcus aureus).
Antibioticele de elecție pentru aceste tulpini sunt Vancomicina, Linezolid, Fosfomicina, care
sunt rezistente la acțiunea beta-lactamazelor secretate de către stafilococi.

Pentru tulpinile sensibile, antibioticul de elecție rămâne Oxacilina. Infecțiile grave

care necesită doze mari sau infecțiile asociate cu bacteriemie se vor trata cu antibiotice pe
cale paren terală (injectabilă),asociind doua sau mai multe antibiotice din clase diferite, în
’

timp ce infecțiile pielii, ale țesut urilor moi sau ale căilor respiratorii se pot trata prin
’

admin istrare orală. Durata tratamentului și calea de administrare diferă în funcție de

’

localizare, severitate, imunitatea gazdei și răsp unsul la tratament; bacteri emia necesită 2-4
’ ’

săptămâni de tratament cu antibiotic parent eral, osteomielita acută și endocardita acută 4-6
’

săptămâni, în timp ce osteo mielita cronică necesită până la 6-8 săpt ămâni de tratament
’ ’

parenteral. (17)

Inhibarea creşterii bacteriene de către un antib iotic are loc când antibioticul
. .

interacţionează eficient cu ţinta sa. Această intera cţiune depinde de două elemente relevante,
.

cum ar fi antibioticul trebuie să recunoască ţinta şi puterea trebuie să fie suficientă pentru o
inhibare eficientă a activităţii agentului microbian. De aceea, mecanismele de rezistenţă se
bazează pe modificarea ţintei sau diminuarea concentraţiei de antibiotic. Aceste mec anisme ,

pot fi considerate „mecanisme active de rezistenţă“. Pe de altă parte, sunt descrise

mecani sme care nu afectează antibioticul activ în sine şi pot fi considerate „mecanisme
’

22
pasive de rezistenţă“, precum mutaţiile la nivelul genelor care codifică transportorii, ţintele
sau proteinele care activează preant ibioticul. În plus faţă de aceşti determinanţi clasici ai
’

rezistenţei la antibiotice, lucrări recente au arătat că mai multe elem ente, implicate în
’

procesele de bază ale metabolismului bacterian, pot modula răspunsul la antimicrobiene, cum
ar fi, de exemplu, producerea de biofilm. (19)

Astfel, bacte riile au devenit rezistente la antibiotice prin diverse mecanisme, cum ar fi:
’

 Schimbarea permeabilităţii peretelui celulei bacteriene cu restricţionarea

accesului antibioticelor la nivelul situsurilor-ţintă.
 Eflux activ al antibioticelor din celula microbiană – bacteriile rezistente pot folosi
pom pele din pereţii celulelor lor pentru a elimina antib ioticele care intră în celulă..
’ ’

 Modificarea/inactivarea enzimatică a antibioticului – unele bacterii rezistente

utilizează enzime pentru a modifica antibioticele, astfel încât acestea să îşi piardă
eficacitatea..
 Degradarea agentului antimicrobian – unele bac terii rezistente utilizează enzime
’

pentru a descompune antibioticul şi a-l face ineficient.

 Achiziţionarea de căi metabolice alternative pentru a evita acţiunea inhibitorie a
antibioticului – unele bac terii rezistente au dezvoltat diferite şi noi procese pentru a
’

evita acţiunea antibioticului.

 Modificarea ţintelor specifice antibioticelor – bacteriile rezistente pot modifica
ţintele, astfel încât antibi oticul să nu le recunoască şi să nu se poată lega la acestea,
’

permiţând bacteriilor să supravieţuiască.

2.2 Evoluția rezistenței la antibiotice in Europa

Organizaţia Mondială a Sănătăţii a afirmat că rezistenţa la antibiotice este una dintre

cele mai importante trei ameninţări la adresa sănătăţii publice ale secolului XX. Amenințare
care, după cum se vede, este indusă în mare parte chiar de om.

Comisarul european pentru sănătate şi siguranţă alimentară, Vytenis Andriukaitis a

afirmat: „Este o problemă globală, care are nevoie de o soluţie la scară globală. Din păcate,

23
acumularea de factori – în special utilizarea excesivă şi inadecvată a antibioticelor şi
practicile slabe de control al infecţiilor – a transformat progresiv rezistenţa antimicrobiană
într-o ameninţare masivă pentru omenire. Creşterea rezistenţei şi lipsa măsurilor de
prevenire pot determina o revenire la era preantibiotică, când oamenii au murit din cauza
unor infecţii comune şi a unor leziuni minore. Acest lucru ar avea consecinţe majore asupra
sănătăţii oamenilor şi asupra economiei, nu numai în Europa, ci şi în întreaga lume”.
Creşterea rezistenţei la medicamentele antimicrobiene este cauza a aproximativ 25000 de
decese anual în UE. (20,21)

Fig. 9 Harta Europei cu răspândirea Stafilococului rezistent la meticilină (21)

Trebuie menţionat faptul că rezistenţa antimicrobiană e un fenomen natural, o

consecință a presiunii selective moderne a utilizării clinice de antibioticer. Înainte de a fi
folosite ca medicamente, antibioticele, erau produse naturale, ele fiind preparate de ciuperci,
alge şi bacterii pentru apărare. Însă, această lume microbiană şi-a dezvoltat şi gene care
împiedică acţiunea antibioticelor. Pe această temă, o analiză a bacteriilor vechi de
aproximativ 30000 de ani, arată că acestea au fost capabile să reziste la antibiotice,
dovedindu-se faptul că rezistenţa antibacteriană este un fenomen vechi, încă dinainte de
utilizarea antibioticelor în terapia infecţiilor. (22)

24
 La peste 70 de ani de la introducerea primelor antibiotice, producţia a fost
îmbunătăţită prin crearea unei mari varietăţi de compuşi din ce în ce mai puţin costisitori,
care au încurajat utilizarea fără prescripţie sau utilizarea pentru o altă stare patologică decât
cea pentru care a fost aprobată oficial. Acest fapt a contribuit semnificativ la selecţia
tulpinilor rezistente. Dezvoltarea generaţiilor de microbi rezistenţi la antibiotice şi distribuţia
lor în populaţiile microbiene din întreaga biosferă sunt rezultatele multor ani de presiune de
selecţie neîncetată de la introducerea antibioticelor, prin utilizare necorespunzătoare, exces
de utilizare şi abuz. Antibioticele sunt, de asemenea, utilizate în exces în agricultură – nu
doar pentru a combate nişte infecţii, ci şi pentru a stimula creşterea unor animale, cum ar fi
puii, porcii şi bovinele, pentru a produce mai multă carne. (23)

Un studiu realizat în Center for Outcomes Research and Evaluation in Charlotte,

North Carolina, a evidenţiat şi un alt aspect al prescrierii neadecvate a antibioticelor la
pacienţii din ambulatoriu cu afecţiuni uşoare ale tractului respirator superior: volumul
antibioticelor utilizate în ambulatoriu este mult mai mare decât la pacienţii internaţi în spital,
până la 30% dintre toate prescripţiile antibiotice ambulatorii fiind considerate inutile şi până
la 50%, inadecvate pentru condiţia patologică. (24)

Astfel, circulaţia crescută a antibioticelor, atât la oameni, cât şi la animale, a

determinat apariţia unor mutaţii la nivelul genomului bacterian, mutaţii care au dus la
câştigarea rezistenţei la antibiotice, pentru aceasta fiind responsabilă o gamă largă de
mecanisme biochimice şi fiziologice. De la introducerea în 1935 a primelor antimicrobiene –
şi, anume, sulfonamidele – dezvoltarea unor mecanisme specifice de rezistenţă a afectat
utilizarea lor terapeutică. Rezistenţa la sulfonamidă a fost raportată iniţial la sfârşitul anilor
1930, aceleaşi mecanisme funcţionând şi după 70 de ani. În 1940, câţiva ani înainte de
introducerea penicilinei ca agent terapeutic, doi membri ai echipei de descoperire a
penicilinei au identificat o penicilinază bacteriană. Odată cu utiliz area pe scară largă a
.

penicilinei, tulpinile bacteriene rezistente, capabile să inactiveze medicamentul, au devenit

prevalente. S-au efectuat studii pentru a modifica chimic penicilina în scopul prevenirii
scindării de către penicilinaze (β-lactamaze). (25)

Încă din anii 1960, s-a observat creşterea rezistenţei la antibiotice. Astfel, au fost
realizate cercetări farmacologice şi biochimice ale antibioticelor pentru cunoaşterea

25
mecanismelor de acţiune, dar şi a mecanismelor de rezistenţă ale acestora, în scopul
îmbunătăţirii utilizării antibioticelor prin dozare şi administrare.

Tot mai frecvent este utilizat termenul „superbugs“ („superbacterii“), care se referă la
agenţii microbieni care cauzează, ca urmare a mutaţiilor multiple, morbiditate şi mortalitate
crescute şi determină un nivel ridicat de rezistenţă la clasele de antibiotice recomandate în
mod special pentru tratamentul acestora.

Opţiunile terapeutice pentru aceşti microbi sunt reduse, cu perioade lungi de îngrijire
în spital şi foarte costisitoare. În unele cazuri, tulpinile superrezistente au obţinut, de
asemenea, o virulenţă crescută şi o transmisibilitate sporită, ceea ce poate permite ca
rezistenţa la antibiotice să fie considerată chiar un factor de virulenţă.

Fig. 10 Consumul comunitar de antibiotic pentru uz sistemic in 30 de țări UE, 2016

(DDD/1000 locuitori/zi) (21)

26
CAPITOLUL 3

3. Modalități de instalare a rezistenței

germenilor genului Staphylococcus la antibiotice
Gamma descurajatoare imunologică pentru colonizarea nazală bacteriană include
peptide antimicrobiene, lizozimă, lactoferină și IgA. Cu toate acestea, se știe puține despre
apărarea critică a gazdei împotriva colonizării S. aureus. Un studiu efectuat la șoareci a
identificat regulatorul de conductivitate transmembranar de fibroză chistică și receptorul 2
asemănător cu taxa, dar nu și receptorul 4 ca factori importanți care controlează transportul S.
aureus. (24)

Rezistența florii nazale prezintă o provocare la fel de formidabilă pentru S. aureus.

Studiile privind purtătorii de S. aureus și non-purtătorii au arătat că prezența anumitor
bacterii, cum ar fi corynebacterium, S.epidermidis sau S. pneumoniae, ar putea împiedica
transportul S. aureus. (25)

Introducerea vaccinului S. pneumoniae, de exemplu, a fost demonstrată în unele

studii dar nu și în altele, pentru a conduce la o creștere semnificativă a colonizării S. aureus,
determinându-i pe unii să speculeze că S. pneumoniae și S. aureus ar putea concura pentru
aceeași nișă. (26,27)

Mecanismul general al concurenței de nișă se propune a fi o competiție bacteriană

pentru aderarea la același receptor gazdă. În plus, anumiți concurenți, cum ar fi S.
pneumoniae, secretă peroxid de hidrogen care, la o concentrație ridicată, suprimă creșterea S.
aureus. (28)

S. aureus ar putea contracara secreția de catalază și probabil alți antioxidanți care

neutralizează peroxidul de hidrogen. (29)

După stabilirea colonizării, S. aureus este poziționat în imediata apropiere a gâtului,

urechilor, gurii și sinusului; totuși, în mod surprinzător, transportul nazal duce rareori la
infectarea acestor locuri. Studiile privind reglementarea S. aureus sugerează că în timpul

27
colonizării, multe gene de virulență S. aureus pot fi reglate în jos . Dintre genele care
controlează colonizarea și virulența S. aureus, cea mai cunoscută regulatoare globală este
reglajul gena adjuvant, care a fost descris în detaliu în multe recenzii excelente. (30)

Fagocitoza este mecanismul major pentru combaterea infecției cu stafilococi. Se

produc anticorpi care neutralizează toxinele și promovează opsonizarea. Cu toate acestea,
capsula bacteriană și proteina A pot interfera cu fagocitoza. Creșterea biofilmului pe
implanturi este, de asemenea, impermeabilă la fagocite. Stafilococii pot fi greu de ucis după
ce au fost absorbiți de fagocit, deoarece produc carotenoide și catalază care neutralizează
oxigenu, care e mecanismul principal de distrugere a fagocitului în fagolizozom.

Staphylococcus aureus este un organism excepțional adaptabil și a demonstrat în repetate

rânduri capacitatea sa de a rezista la noi agenți chimioterapeutici. La mai puțin de 20 de ani
după descoperirea penicilinei, organismul a dobândit gena β-lactamazei. În plus, rezistența la
meticilină sa răspândit rapid în ultimii ani , iar primele izolate cu rezistență totală la
vancomicină au apărut recent. (27, 28, 29, 30)

Pentru a complica lucrurile în continuare, majoritatea tulpinilor de S. aureus sunt

capabile să asume modul de creștere a biofilmului și când bacteriile cresc într-o stare de
biofilm, ele fiind rezistente la nivelurile de antibiotice de 10 până la 1000 ori mai mari decât
bacteriile planctonice identice genetic. În consecință, infecțiile stafilococice care implică
formarea de biofilm, care pot include endocardită la nivelul valvei native mitrală,
osteomielită cronică și infecții legate de dispozitivul medical, pot fi extrem de dificil de tratat
cu antibiotice, sunt adesea cronice sau recidivante și necesită frecvent proceduri invazive în
țesutul sau dispozitivul infectat. (31, 32)

Proprietățile biofilmelor care duc la rezistența la antibiotice pot include creșterea

lentă, eterogenitatea fenotipică, prezența celulelor persistente, inactivarea antibioticelor în
matricea de exopolizaharidă din biofilm și limitările privind penetrarea antibioticilor impuse
de matricea de biofilm. Contribuțiile relative ale acestor proprietăți la rezistență nu sunt bine
înțelese. În special, un rol pentru matricea de exopolizaharidă stafilococică, compus în
principal dintr-un polimer de N-acetilglucozamină (PNAG) legat la β-1-6 în S. aureus și
Staphylococcus epidermidis, ca o barieră de difuzie, nu a fost stabilit definitiv. (33, 34)

28
 Cele mai multe studii publicate despre difuzia în biofilme se concentrează asupra unui
efect după câteva ore și nu reușesc să abordeze rata cu care sunt transportate antibioticele.
Rata de transport este importantă deoarece amestecarea unui antibiotic într-o suspensie de
bacterii planctonice expune rapid toate celulele la doza completă de antibiotic. Dacă totuși,
viteza de penetrare a antibioticului prin intermediul unui biofilm este scăzută în raport cu
viteza de transport printr-un lichid, cum ar fi mediul sau sângele, atunci bacteriile pot fi
expuse la o doză crescătoare treptată de antibiotic și pot avea timp să montați un răspuns
defensiv la compus. În sprijinul acestei idei, s-a demonstrat că bacteriile cresc transcripția
genelor asociate stresului, cum ar fi omologii proteinei de șoc termic și genele de sinteză a
peretelui celular într-o oră de la expunerea la doze mici de antibiotice active pe peretele
celular. (35)

O problemă suplimentară, cu multe studii anterioare, este că ele demonstrează că

antibioticele se deplasează dintr-o parte a unui biofilm intact la celălalt, dar nu dovedește că
ating efectiv țintă celulară. Astfel, antibioticele pot traversa biofilmul prin matricea
exopolimerică și canalele de apă, astfel încât bacteriile nu sunt expuse efectiv la o doză
inhibitoare. (33)

Glicopeptida vancomicina își exercită activitatea bactericidă prin legarea la resturile

terminale d-Ala-d-Ala din peretele peptidoglican, blocând astfel transpeptidarea.
Vancomicina este un important medicament antistafilococic, dar eficacitatea sa împotriva
biofilmelor este deosebit de săracă. (36, 37)

S-a profitat de disponibilitatea unui derivat de vancomicină marcat cu fluorescență

activă biologic, pentru a analiza legarea antibioticului la țintă în peretele celular bacterian în
cadrul unui biofilm viabil.

Rezultatele demonstrează că vancomicina se leagă rapid la bacteriile planctonice și se

leagă rapid la suprafața biofilmului, dar că legarea la celulele din straturile cele mai profunde
necesită mai mult de o oră de expunere la antibiotic. Constatările studiului sugerează că
aceasta reprezintă o rată scăzută de penetrare a vancomicinei în biofilm, mai degrabă decât o
incapacitate a drogurilor să se lege de bacterii. De asemenea, se demonstrează că acest efect
nu depinde de elaborarea componentei exopolizaharidice din matricea biofilmului, PNAG. (38)

29
 Apariția rezistenței la antibiotice de către S. aureus poate fi vizualizată ca o serie de
valuri. Primul val a început la mijlocul anilor 1940 ca proporția infecțiilor cauzate de S.
aureus rezistente la penicilină ce a crescut în spitalele. Aceste tulpini au produs o penicilinază
codificată cu plasmidă care hidrolizează inelul beta-lactam al penicilinei esențial pentru
antimicrobianul său activ. În cazul tulpinilor rezistente la penicilină, s-a observat că acestea
cauzează infecții ale comunității; la începutul anilor 1950 și 1960 au devenit pandemii.
Aceste infecții, atât în spitale, cât și în comunitate, au fost cauzate în principal de o clonă S.
aureus cunoscută sub numele de fag-type 80/81. Pandemiile de tip fag 80/81 S. aureus au
dispărut în mare măsură după introducerea meticilinei, dar prevalența tulpinilor producătoare
de penicilinază ale altor linii de S. aureus a rămas ridicată încă de atunci.

Introducerea meticilinei marchează debutul celui de-al doilea val de rezistență.

Primele rapoarte ale unei tulpini S. aureus care a fost rezistentă la meticilină au fost publicate
în 1961. Deși gena specifică, mecA, determinantul de rezistență la meticilină care codifică
proteina de legare la penicilină cu afinitate scăzută, PBP2a (denumit și PBP 2 '), nu a fost
identificat mai mult de 20 de ani mai târziu, a fost apreciat de timpuriu că mecanismul de
rezistență a fost diferit de rezistența mediată de penicilinază, deoarece nu a existat inactivarea
medicamentului.

Spre deosebire de rezistența mediată de penicilinază, care este îngustă în spectrul

său, este rezistentă și la antibiotice beta-lactamice, peniciline, cefalosporine și carbapeneme.
Printre cele mai timpurii dintre izolatele clinice ale MRSA se numără tulpina arhetipală COL,
un membru al clonei "arhaice" a MRSA și probabil cea mai studiată tulpină MRSA, izolată
de la un pacient din Colindale, Marea Britanie în 1960. COL este un membru al celor mai de
succes dintre toate linii MRSA, care include atât spitale, cât și tulpini asociate comunității.

Aceste clone arhaice ale tulpinilor MRSA au circulat în spitalele din întreaga Europă
până în anii 1970. Au existat rapoarte izolate de MRSA din spitalele din Statele Unite, dar
restul lumii a fost în mare parte cruțată și aceste MRSA nu au ajuns niciodată în comunitate.
Până în anii 1980, din motive neclare, tulpinile arhaice ale MRSA au dispărut în mare parte
din spitalele europene, marcând sfârșitul celui de-al doilea și începutul celui de-al treilea val
de antibiotice.

30
 Au apărut descendenții clonei arhaice MRSA (de exemplu clonele Iberiene și Roma)
și alte linii de succes MRSA, constituind al treilea val de rezistență la antibiotice. Focarele de
infecții cauzate de tulpinile de MRSA au fost raportate în spitalele din Statele Unite la
sfârșitul anilor 1970 și până la mijlocul anilor 1980 au fost endemice. Aceste tulpini au
măturat globul care a dus la pandemia mondială a MRSA în spitale, care continuă până în
prezent.

Deși la nivel mondial în distribuție și impact, SAMR a fost încă limitat în principal la
spitale și alte instituții medicale instituționale, cum ar fi facilități de îngrijire pe termen lung.
Povara tot mai mare a infecțiilor cu SAMR în spitale a dus la o mai mare utilizare a
vancomicinei, ultimul antibiotic rămas la care tulpinile MRSA au fost susceptibile de
fiabilitate și sub această presiune selectivă intensivă de vancomicină S. aureus intermediar
(VISA, care nu este inhibată in vitro la vancomicină concentrații sub 4 până la 8 μg / ml) și S.
aureus rezistente la vancomicină (VRSA, inhibat numai la concentrații de 16 μg / ml sau mai
mult) au apărut 53 de tulpini de MRSA.

Invazia MRSA a comunității constituie al patrulea și ultimul val de rezistență la

antibiotice. Unele dintre cele mai vechi cazuri de infecții asociate cu MRSA asociate
comunității (CA-MRSA) au apărut în populațiile indigene din Australia de Vest la începutul
anilor 1990. Aceste tulpini de MRSA se deosebeau de clonele contemporane (de exemplu,
genotipurile) care circulă în spitalele australiene prin modelele de electroforeză pe bază de
puls și susceptibilitatea la cele mai multe antibiotice, altele decât beta-lactame, sugerând că
au fost descendenți îndepărtați, care au obținut mecA prin transfer de gene orizontal. În
Statele Unite, primele cazuri bine documentate de infecție cu MRSA care au fost cu adevărat
asociate cu comunitatea au avut loc la copii sănătoși în 1997-99. Acești copii nu aveau factori
de risc pentru MRSA și toți au murit cu infecție copleșitoare, sugerând că aceste tulpini
comunitare de MRSA au fost deosebit de virulente.

La fel ca omologii lor australieni, aceste izolate CA-MRSA nu au legătură cu clonele

spitalicești și au fost susceptibile la cele mai multe antibiotice. Epidemia CA-MRSA din
SUA poate fi urmărită la începutul anilor 1990, pe baza datelor retrospective din 1993-1995,
care arată o creștere dramatică a Infecțiile cu MRSA la Chicago în rândul copiilor care nu au
factori de risc pentru expunerea asociată cu MRSA asociată spitalelor. CA-MRSA a fost

31
raportată de atunci în numeroase populații, inclusiv indienii americani și nativii din Alaska;
Pacific Islanders; sportivi; deținuții; bărbații care fac sex cu bărbații; contactele pacienților cu
infecție CA-MRSA; personalul militar; adulți la pacienții de urgență; și copiii din centrele de
îngrijire de zi. Clonele CA-MRSA au dobândit, de asemenea, un punct de sprijin în spitale și
sunt din ce în ce mai identificate ca o cauză a infecțiilor asociate spitalizării și heathcare-ului.

Fig. 11 - O cronologie a celor patru „valuri” de rezistență la antibiotice la Staphylococcus

aureus (39)

Focarele și epidemiile CA-MRSA se produc în prezent la nivel mondial și cu o

epidemiologie similară, deși clonele specifice care au apărut variază în funcție de localizarea
geografică. CA-MRSA tulpinile nu sunt doar evadari din facilitatile de asistenta medicala;
genotipurile acestora indică faptul că acestea nu sunt strâns legate de clonele spitalicești
endemice și că aceste tulpini comunitare sunt susceptibile la numeroase antibiotice la care
tulpinile spitalelor sunt rezistentă în mod obișnuit. Doi markeri moleculari care nu se găsesc
în MRSA spitalicesc tipic sunt puternic asociate cu apariția CA-MRSA indiferent de originea

32
geografică: un element specific de casetă care codifică mecA și genele care codifică
leucocidina Panton-Valentine (PVL).

Infecțiile cutanate și ale țesuturilor moi sunt cel mai frecvent tip de infecție CA-
MRSA, reprezentând aproximativ 90% din cazuri, dintre care 90% sunt abcese și / sau
celulită cu drenaj purulent. Tulpinile CA-MRSA par să fie, de asemenea, în special virulente
cu capacitatea de a provoca infecții fulminante și copleșitoare, cum ar fi fasciita necrotizantă,
pneumonia necrotizantă, infecțiile osoase și articulare însoțite de boala tromboembolică
septică, purpura fulminan cu sau fără sindromul Waterhouse-Friderichsen, celulita orbitală și
endoftalmită, infecții ale sistemului nervos central și bacteremie și endocardită. (39)

Lista cu antibiotice ce pot fi utilizate pentru diferite specii bacteriene, precum și

nivelul de eficiență evaluată prin indicativele plus/minus se poate verifica în figura din
pagina următoare. În acest tabel este cuprins și MRSA și MSSA (Staphylococcus aureus
meticilin sensibil).

33
34
PARTEA PERSONALĂ

35
CAPITOLUL 1

1. Motivația temei alese

Cavitatea bucală, în comparaţie cu celelalte cavităţi naturale ale organismului

reprezintă un loc ideal pentru dezvoltarea microorganismelor; aici există temperatură
favorabilă, umiditate optimă şi mediu alcalin care scaldă limba şi mucoasele. Există de
asemenea atât condiţii de aerobioză pentru bacterii aerobe, cât şi spaţii anaerobe optime
pentru dezvoltarea bacteriilor anaerobe.

În prezent, infecţiile cu care se confruntă medicina modernă pornesc din surse

diversificate şi sunt determinate de agenţi microbieni care şi-au modificat mecanismele de
acţiune, căpătând rezistenţă la mijloacele chimice terapeutice folosite. Rezistența la
antibiotice nu a ocolit domeniul medicinei dentatare, cu atât mai mult cu cât rapoartele
anatomice de vecinătate cu fosele nazale creează posibilitatea colonizării diferitelor zone din
cavitatea oro-dentară cu specii ale genului Staphylococcus.

Speciile de stafilococ, atât cel patogen consacrat, respectiv varianta aureus, cât și
unele specii saprofite sunt implicate în patologia oro-dentară, dar și a cavităților de vecinătate
anatomică.

Această vecinătate anatomică presupune de cele mai multe ori identificarea unei flore
bacteriene foarte asemănătoare, existând posibilitatea de migrare a unor tulpini cu mare
potențial de patogenitate din cavitatea bucală spre faringe si fose nazale, sau invers, dinspre
faringe si fose nazale spre cavitatea bucală.

Luând în considerare faptul că tulpinile de stafilococ meticilino-rezistent ridică

probleme deosebite legate de tratament, fiind tulpini multirezistente la antibiotice, studiul de
față are ca obiective:

36
 1. Identificarea speciilor bacteriene in diferite produse patologice
prelevate din cavitatea bucală și cavități de vecinătate;

2. Identificarea ponderii tulpinilor de stafilococ printre alte specii

bacteriene în diferite produse patologice prelevate din cavitatea bucală și cavități de
vecinătate;

3. Cuantificarea meticilino-rezitenței tulpinilor de stafilococ identificate (

MRSA).

4. Identificarea rezistenței inductibile a stafilococilor la Macrolide,

Streptogramine, Lincosamide - MSL

Din toate aceste motive prezentate, consider că tema aleasă se pliaza perfect pe
problematica actuală.

Studiul a fost realizat pe un lot constituit din pacienți prezentați la două cabinete de
medicină dentară. Probele prelevate au fost examinate din punct de vedere microbiologic în
laboratorul de microbiologie al disciplinei Microbiologie şi Imunologie din cadrul Facultăţii
de Medicină Dentară.

Nu în ultimul rând, țin să mulţumesc pe această cale tuturor celor care mi-au înlesnit
realizarea şi finalizarea acestui studiu!

37
CAPITOLUL 2

2. Material și metodă

2.1 Recoltarea exudatului faringian

Recoltarea se face cu tamponul faringian steril. Timpul optim de recoltare este fie
dimineaţa pe nemâncate, înainte de toaleta cavităţii bucale, pentru a nu diminua flora
bacteriană prin acţiunea de curăţire mecanică a mucoaselor prin toaleta cavităţii bucale sau în
timpul alimentaţiei, fie la 3-4 ore după toaleta cavităţii bucale, gargarisme cu antiseptice sau
ingestia de alimente.
Tehnica de recoltare: pacientul este aşezat cu gâtul în uşoară extensie, cavitatea bucală
deschisă la maximum, faringele bine expus prin iluminare, baza limbii (faţa dorsală)
deprimată cu o spatulă (apăsător de limbă) sterilă. Bolnavul este invitat să pronunţe tare
vocala A. Tamponul se introduce fără a atinge limba şi palatul (pentru a nu contamina proba
cu flora bucală) şi mai ales lueta (pentru a nu declanşa reflexul de vomă). Se tamponează
ferm, printr-o mişcare circulară şi se şterge suprafaţa amigdalelor, peretele posterior al
faringelui precum şi orice zonă inflamată, ulcerată sau cu depozite purulente. Tamponul este
scos cu precauţie, se reintroduce în tubul protector şi se trimite imediat la laborator sau se
introduce în mediu de transport până la prelucrare.

2.2 Recoltarea exudatului nazal

Examenul microbiologic al exudatului nazal reprezintă metoda clinică de laborator

indicată în identificarea Staphylococcus aureus sau Streptococcus pyogenes.

Prin examenul bacteriologic al exudatului nazal se identifică mulți alți germeni precum:
Streptococcus pneumoniae, meningococ (5 – 30 %), Haemophilus influenzae, serotipul B,
Corynebacterium diphtheriae si chiar enterobacterii.

Recoltarea tamponului nazal se face diferit, în funcție de prezența, scopul urmărit și

locul leziunii.

38
 Astfel, se întroduce tamponul de uz general îmbibat cu soluție salină izotonică, în
fosele nazale pe cât posibil și se răsucește ușor pentru a face posibilă desprinderea secreției.

Atunci când se constată leziuni la nivelul vestibulului nazal se ridică lobul nazal cu
policele unei mâini, având restul palmei așezată pe fruntea bolnavului. În acest fel se
descoperă vestibulele nazale, se îndreaptă sursa de lumină în dreptul leziunii și se recoltează
cu tamponul.

2.3 Recoltarea de produse patologice din cavitatea bucală

Recoltarea produselor de la nivelul mucoasei bucale și a dinților necesită de asemenea

respectarea cu strictețe a regulilor de asepsie deoarece cavitatea bucală reprezintă, în condiții
fiziologice, un mediu intens contaminat cu o floră abundentă și variată.
a) Recoltarea produselor în infecții ale mucoasei bucale
Mucoasa bucală poate fi interesată în infecții de natură bacteriană, micotică sau virală.
Produsele patologice, reprezentate de secreții din ulcerații, lichid vezicular, false membrane,
puroi din pungi parodontale etc, vor fi recoltate, după caz, cu tamponul de vată sau pipeta
Pasteur.
b) Recoltarea produsului din caria dentară
După o prealabilă izolare a dintelui cariat cu rulouri de vată sterile sau cu o digă sterile și
folosind concomitant aspiratorul de salivă, se efectuează antiseptizarea externă a dintelui
respectiv, a dinților vecini și a mucoasei înconjurătoare cu apă oxigenată 3%, apoi cu alcool
etilic de 70°. Se îndepărtează mecanic resturile alimentare de la nivelul cariei și apoi se
prelevă cu excavatorul o cantitate de dentină pentru studio bacteriologic care se introduce
aseptic intr-o eprubetă sterilă.
c) Recoltarea produsului din canalele radiculare
Recoltarea produsului în infecțiile pulpare se efectuează în 2 etape:
1. Înainte de începerea tratamentului antimicrobian: după izolarea
și antiseptizarea dintelui se localizează canalele radiculare.
Prelevarea probei bacteriologice se face cu conuri din hârtie

39
 sau cu meșe de vată pe ace Miller, a căror mărime variază în
raport cu dimensiunile canalelor. Conurile sau meșele vor fi
introduse cât mai aproape de apexul dintelui și menținute în
canal 2-3 minute. Dacă există mai multe rădăcini, prelevarea se
face de la toate canalele. După recoltare, conurile/meșele vor fi
introduse în eprubete cu bulion glucozat 2ml unde se agită
pentru împrăștierea florei microbiene după care se
însămânțează 2-3 picături pe geloză-sânge.
2. Controlul sterilității canalelor radiculare se face respectând
aceleași reguli de asepsie și antisepsie locală; se îndepartează
obturația provizorie, se spală abundent canalul cu 10ml ser
fiziologic steril. După spălare, canalul este uscat cu meșe
sterile pe ace Miller. Pentru recoltare se introduc, din nou, în
canal meșe sau conuri unde se mențin 2-3 minute și sunt
însămânțate ulterior pe medii de cultură adecvate.
d) Recoltarea produsului din granulomul dentar
Recoltarea din granuloamele dentare se poate face la dinții extrași sau „în situ” la
dinții de pe arcadă.
În primul caz, după extracția dintelui cu granulom apical, se dezinseră steril granulomul cu
ajutorul foarfecelui și se introduce într-o cutie Petri. După termocauterizarea peretelui
granulomului, se pătrunde cu vârful unei pipete Pasteur sterile și se aspiră conținutul,
făcându-se apoi însămânțarea în condiții propice.
În cazul în care dinții sunt păstrați, puncția granulomului se va face în timpul rezecției
apicale.

2.4 Examenul microscopic

Examenul microscopic are un rol fundamental în microbiologie, fiind o etapă

importantă în examinarea produselor biologice. Examenul microscopic direct restrânge aria
de investigaţii, indicând modalităţile ulterioare de diagnostic microbiologic. El se poate
efectua la:

40
 1) microscopul cu câmp luminos - la care se examinează preparatele colorate sau
preparate native,
2) microscopul cu fond întunecat - la care se examinează preparatele native, între lamă
şi lamelă, efectuate direct dintr-un produs în care se caută bacterii a căror lăţime nu
depăşeşte 0,1-0,2 µm (ca, de exemplu, evidenţierea treponemelor din şancrul
sifilitic),
3) microscopul cu contrast de fază - se foloseşte la examinarea preparatelor native în
care microorganismele şi celulele au aspect tridimensional,
4) microscopul cu lumină UV se utilizează pentru examinarea preparatelor colorate cu
substanţe fluorescente.

Prin microscopie se examinează:

1. preparate native între lamă,

2. frotiuri fixate, colorate,
3. preparate colorate cu substanţe fluorescente la microscopul cu lumină UV.

2.5 Însămânțarea pe medii de cultură

Însămânțarea produselor patologice reprezintă introducerea acestora pe medii de cultură

potrivite, pe suprafață sau în profunzime, cu scopul de a obține culturi microbiene pure.
Însămânțarea se face în mod steril, cu ansa, tamponul de exudat sau pipeta, se folosesc medii
de cultură sterile și de compoziție adecvată.
Se recomandă însămânțarea imediată a probelor; iar dacă nu există posibilități imediate
acestea se vor păstra la 4°C.
Pentru obținerea unor rezultate corecte trebuie să se țina seama de anumite reguli:
- folosirea de instrumentar steril: ansa bacteriologică, pipeta Pasteur sau gradată;
- flambarea orificiilor recipientelor (baloane, eprubete) ce conțin mediile de cultură,
dopurile flacoanelor se vor ține între degetul mic și podul palmei drepte);
- nu se vorbește sau tușește, ușile și ferestrele trebuie să fie închise (se preferă boxe sau
camere separate) pentru a se împiedica contaminarea cu flora din aer sau cavitatea bucală a
manipulatorului.

41
 Însămânțarea se face pe medii lichide și solide, primele favorizând o primă înmulțire
numerică a bacteriilor. Dezavantajul lor este posibilitatea însămânțării la început
(însămânțare primară) din materialul patologic al unui amestec bacterian nedorit. De aceea
este obligatoriu in toate cazurile ca insamantarile pe mediile lichide să fie urmate ulterior de
însămânțări pe medii solide pentru a obține colonii izolate.
Însămânțarea prelevatelor patologice, în funcție de natura lor, o facem direct sau după
o prealabilă prelucrare: concentrare, decontaminare, omogenizare, inactivarea unor substanțe
animicrobiene.
Prelevatele omogene, fluide, sau emulsionabile, le putem insămânța direct.
Concentrăm prin centrifugare probele fluide sau omogenizate (spută).
Decontaminarea prin spălare în soluție salină izotonă este utilă pentru sputa mucopurulentă,
pentru porțiunile muco-sanguinolente din scaun. Tratarea cu hidroxid de sodiu
decontamineaza probele pentru izolarea microbacteriilor; concomitent fluidifica și
omogenizează sputa.
Omogenizarea sputei pentru izolarea bacteriilor neacido-rezistente o facem cu N-acelit-
cisteină, iar a țesuturilor prin mojarare în tub Griffith.
A. Epuizarea inoculului cu ansa pe plăci cu mediu agarizat și obținerea culturilor pure
necesare identificării.
Inițial evaporăm condensul de pe suprafața mediului prin menținearea plăcilor cca. 30 minute
la 37℃ cu capacul întredeschis: „uscarea plăcilor”.
Pe plăcile cu medii agarizare neselective, uzuală este izolarea prin epuizare semicantitativă a
inoculului în 4 cadrane, cu arderea ansei când schimbăm direcția striurilor de epuizare.
Metoda permite aproximarea relativă a creșterii.

42
 Fig. 17 – Epuizareaa inoculului cu ansa în patru cadrane pe placă cu mediu agarizat (13)

Pentru izolări pe medii selective, cantitatea de inoculum trebuie sa fie mai mare, iar epuizarea
mai puțin drastică. Inițial, conform schemei din figura 13, etalăm în aria A una sau mai
multe anse cu onocul ori inocul prelevat pe tampon. Epuizăm apoi inoculul, fără sterilizări
intermediare ale ansei, prin 3 serii de striuri: B, C și D. Cantitatea de fluid prelevată în ansă
diferă cu poziția de scufundare și retragere a ansei: cantitate minimă și constantă la
scufundarea și retragerea verticală, cantiate maximă la scufundare cât mai oblică și retragerea
ansei prin „smulgere” din fluid.
Pură poate fi considerată acea cultură formată din descendenții unei singure colonii
rezultate după o epuizare a materialului microbian, care duce la creșterea sub formă de
colonii bine izolate pe mediu de cultură neselectiv. Ideal ar fi ca asemenea creștere să
pornească de la indivizi izolați. Practic ea pornește de la unități formatoare de colonii.
În microbiologia clinică, o singură epuizare optimă pe un mediu neselectiv poate fi
suficientă, dar o reepuizare este de dorit. Când cultura primară rezultă după epuizare pe un
mediu selectiv, reepuizarea pe un mediu diferential este obligatorie. Coloniile
microorganismului urmărit pe mediul selectiv pot conține un număr de contaminanți inhibați,
care la repicarea directă în mediul de identificare își reiau activitatea. Bacteriile inhibate
rămân în profunzimea coloniilor, în apropierea suprafeței însămânțate. De aceea, la
purificarea izolatelor de pe mediile selective, pentru repicarea prin reepuizarea acestor
colonii prelevăm inoculul numai prin atingerea suprafeței coloniei; niciodată nu trebuie să
sectionăm colonia cu ansa.

43
Izolarea bacteriilor din prelevate contaminate cu Proteus este posibilă pe medii care inhibă
caracterul invaziv al acetor specii: agar cu săruri biliare, agar cu eritrocite de cal și cărbune
activ, agar-sânge cu alcool feniletilic, un agar deficient în electroliți.
B. Însămânțarea în medii lichide o facem direct cu seringa de prelevare (hemoculturi),
cu pipeta (sedimentul LCR), cu ansa încărcată cu prelevat patologic monomicrobian
ori cultură pură
(A) Înclinăm tubul și descărcăm ansa pe peretele tubului precum în imagine. (B) Readucem
tubul in poziție verticală, inoculul ajunge submers și difuzează în mediu.

Fig. 18 – tehnica însămânțării pe mediul solid înclinat (13)

C. Izolarea bacteriilor sporulate de cele nesporulate pe baza termorezistenței sporurilor.

Menține în baia de apă la 80℃, timp de 10 minute, produsul microbian suspensionat în
soluție salină izotonă, apoi epuizează suspenia pe o placă cu mediu agarizat.
D. Însămânțarea cu ansa a mediilor solidificate în pantă este indicată pentru:
- Menținerea pe durată limitată, de la câteva zile până la 1-2 săptămâni, a
culturilor pure.
- Izolarea în cultură pură a tulpinilor de Proteus din prelevate contaminate.
44
E. Însămânțarea cu firul drept a coloanei de agar nutritiv moale este indicată pentru
testarea mobilității bacteriilor sau pentru conservarea pe durate mai lungi, de una
până la 6 luni, a tulpinilor bacteriene. Se încarcă firul cu inocul din cultură pură și
înțeapă central coloana de agar nutritiv până aproape de fundul tubului.
F. Însămânțarea cu firul drept a mediilor solidificate în coloană și pantă este indicată
pentru testarea unor activități biochimice. Se încarcă firul cu inocul din cultură pură și
se însămânțează întâi prin înțepare a coloanei, apoi se retrage acul prin mișcări în „S”.

45
 2.6 Identificarea tulpinilor de stafilococ prin metada API

Metoda presupune identificarea bacteriană utilizând medii miniaturizate și

deshidratate pe care se inoculează suspensii din cultura de testat, rezultatele fiind evaluate in
urma unor reacții de culoare. Schema unei identificari API este prezentată în figura
următoare:

46
 2.7 Testarea sensibilității la antibiotice prin metoda
difuzimetrică
Testarea sensibilităţii la antibiotice am realizat-o în parte prin metoda clasică –
antibiograma difuzimetrică prin metoda Kirby-Bauer

Metoda clasică Kirby-Bauer se bazează pe fenomenul de difuziune al antibioticului în

mediu de cultură însămânţat cu o suspensie bacteriană din tulpina de testat.

În funcţie de diametrul ariei de inhibiţie a dezvoltării germenilor în jurul

comprimatului de antibiotic se face aprecierea rezistent, sensibil, intermediar.

În figura următoare sunt prezentate etapele tehnice ale antibiogramei clasice:

47
În următoarele două figuri sunt prezentate, spre exemplificare, două antibiograme după
metoda Kirby-Bauer pentru două tulpini de stafilococ auriu identificate din produsele
patologice luate în studiu.

48
 2.8 Identificarea meticilinorezistenței

MRSA a fost detectat pentru prima dată în Marea Britanie în 1961 și este acum
"destul de comun" în spitale. MRSA este definită ca o tulpină de S. aureus care este
rezistentă la un grup mare de antibiotice numite β-lactame, care include peniciline și
cefalosporine.

MRSA este un patogen major nosocomial la nivel mondial, care a apărut în ultimii 30
de ani ca o cauză principală a infecțiilor nosocomiale și comunitare. Rezistența la meticilină
este cauzată de prezența genei mecA, care codifică 78 kDa, proteina de legare la penicilină
(PBP) -2a sau PBP2 'care are o afinitate scăzută pentru antibioticele β-lactamice. Într-o meta-
analiză a 31 de studii, Cosgrove și colab. a raportat că bacteremia MRSA este asociată cu o
mortalitate crescută în comparație cu bacteriemia sensibilă la meticilină S. aureus (MSSA).

Tratamentul infecțiilor cu MRSA este complet diferit de cel al infecțiilor cu MSSA.

Detectarea rapidă a MRSA permite implementarea în timp util a terapiei antimicrobiene
eficiente, strategii preventive de control al infecției cum ar fi izolarea imediată a pacientului
(închiderea ocazională a bolii), screening-ul contactelor și personalului pacientului și măsuri
adecvate de dezinfecție care, la rândul său, reduc costurile. O preocupare suplimentară este
apariția vancomicinei-intermediar S. aureus (VISA) și, mai recent, S. aureus rezistent la
vancomicină (VRSA), unul dintre principalele motive care se presupune că se datorează
utilizarea inofensivă a vancomicinei pentru MRSA diagnosticat (MRSA fals pozitiv).

Diagnosticul de laborator și testarea sensibilității sunt pași importanți în tratarea,

controlul și prevenirea infecțiilor cu SAMR. Discrepanțele în detectare au un efect negativ
asupra managementului pacientului, evidențiind astfel importanța acurateței în detectare. Prin
urmare, metodele utilizate pentru a detecta MRSA în probele clinice ar trebui să aibă o
sensibilitate și o specificitate ridicată și, cel mai important, rezultatul ar trebui să fie
disponibil într-un timp scurt.

Diferite metode au evoluat pentru detectarea rapidă a stafilococilor rezistenți la

meticilină, dar metoda optimă pentru detectare rămâne controversată. Metoda cea mai
frecvent utilizată în laboratoare este testul de cultură și sensibilitate la antibiotice (AST)

49
[difuzia discului cu oxacilină (ODD)]. Alte metode disponibile pentru diagnosticarea MRSA
includ agar de sare de manitol (MSA) cu oxacilină (metoda de screening de agar), teste de
concentrație minimă de inhibare (MIC), teste de diluare a agarului etc. Toate aceste teste sunt
metodele fenotipice convenționale de identificare a SAMR. Metoda genotipică (moleculară)
este metoda bazată pe reacția în lanț a polimerazei (PCR) pentru detectarea genei mecA, care
rămâne "standardul de aur" pentru diagnosticarea MRSA.

Din punct de vedere tehnic, demonstrarea prezenței/absenței rezistenței la Meticilină se

face similar cu antibiograma clasică, cu diferența că discurile de antibiotic sunt înlocuite cu
benzile impregnate cu Meticilină, așa cum se poate vedea in figurile următoare:

50
51
52
53
54
55
56
57
58
CAPITOLUL 3

3. Rezultate obținute

3.1 Prezentarea lotului de studiu

Studiul a fost realizat în intervalul 1 ianuarie 2018 – 1 ianuarie 2019 pe un lot de 30
de pacienți cu vârste cuprinse între 35 și 50 de ani, examinați în cadrul disciplinei de
reabilitare orală a Facultății de Medicină Dentară.

A. repartiția pe grupe de vârstă

Pacienții în studiu au putut fi sistematizați după vârstă astfel:

 35-40 ani: 10 pacienți
 41-45 ani: 15 pacienți
 46-50 ani: 5 pacienți

Total 35-40 41-45 46-50

30 10 15 5

% 33,3% 50% 16,7%

Tabel 1 – Repartiția pe grupe de vârstă a pacienților luați în studiu

16 15
14
12
10
10
8
5
6
4
2
0
35-40ani 41-45ani 46-50ani

Grafic 1 - Repartiția pe grupe de vârstă a pacienților luați în studiu

59
 B. repartiția pe sexe

Repartizarea în funcție de cele două sexe a fost apropiată:

 18 femei
 12 bărbați

Sexe Femei Bărbați

18 12

% 60% 40%

Tabel 2 – Repartiția pe sexe a pacienților luați în studiu

Repartiția pe sexe

Bărbați
18; 60% 12; 40% Femei

Grafic 2 – Repartiția pe sexe a pacienților luați în studiu

60
 C. produse patologice examinate

În cadrul acestui studiu au fost examinate produsele patologice după cum urmează:

a. exudat faringian: 30 probe

b. exudat nazal: 50 probe
c. puroi parodontal: 55 probe
d. abces dentar: 5 probe

Produse
Exudat faringian Exudat nazal Puroi parodontal Abces dentar
patologice

Total probe 30 50 55 5

Tabelul 3 – produsele patologice examinate in total

60
55

50
50

40

30
30

20

10 5

0
Exudat faringian Exudat nazal Puroi parodontal Abces dentar

Graficul 3 – produse patologice examinate in total

61
 D. Tipuri de specii bacteriene identificate pentru fiecare tip de produs patologic
examinat

Din cele patru tipuri de produse patologice examinate au fost identificate specii bacteriene
după cum urmează:

a) specii bacteriene identificate în exudatul faringian:

- stafilococ auriu hemolitic: 4 tulpini

- stafilococ coagulază negativ: 6 tulpini
- streptococ betahemolitic grup A: 2 tulpini

Streptococ
Stafilococ auriur Stafilococ
Total probe betahemolitic grup
hemolitic coagulază negativ
A

30 4 6 2

% 13,3% 20% 6,67%

Tabelul 4 - specii bacteriene identificare în examen faringian

6
6

4
4

0
Stafilococ auriur hemolitic Stafilococ coagulază negativ Streptococ betahemolitic grup A

Grafic 4 - specii bacteriene identificare în examen faringian

62
b) specii bacteriene identificate în exudatul nazal; din cele 30 de probe au fost identificați:

- stafilococ auriu hemolitic: 6 tulpini

- stafilococ coagulază negativ: 24 tulpini
- streptococ beta-hemolitic: 0 tulpini

Total probe Stafilococ auriur Stafilococ coagulază Streptococ

hemolitic negativ betahemolitic

30 6 24 0

% 20% 80% 0%

Tabel 5 - specii bacteriene identificare în examen nazal

25
24

20

15

10
6

0
Stafilococ auriur hemolitic Stafilococ coagulază negativ Streptococ betahemolitic

Grafic 5 - specii bacteriene identificare în examen nazal

63
c) specii bacteriene identificate în puroi parodontal; din cele 55 de probe au fost identificate:

A. Prevotella oralis: 10 tulpini

B. Prevotella bivia: 6 tulpini
C. Spirochete: 5 tulpini
D. Peptostreptococcus: 10 tulpini
E. Phyromonas asacharolytica: 4 tulpini
F. Stafilococ anaerob: 3 tulpini

** Menționăm că diferența de 17 probe sunt constituite din puroi steril

Total A B C D E F G (puroi
probe steril)

55 10 6 5 10 4 3 17

% 18,18% 10,90% 9,09% 18,18% 7,27% 5,45% 30,93%

Tabel 6 - specii bacteriene identificare în puroi parodontal

18 17

16

14

12
10 10
10

8
6
6 5
4
4 3

0
A B C D E F G

Grafic 6 - specii bacteriene identificare în puroi parodontal

64
d) specii bacteriene identificate în abcese dentare: din cele 5 probe patologice au fost
identificate specii bacteriologice după cum urmează:

- stafilococ anaerob: 5 tulpini

- eubacterium: 2 tulpini
- fusobacterium mortiferum: 2 tulpini
- bacteroides: 4 tulpini

** Menționez că în cele 5 probe a fost prezent stafilococul anaerob asociat cu celelalte 3

specii.

Stafilococ Fusobacterium
Total probe Eubacterium Bacteroides
anaerob mortiferum

5 5 2 2 4

% 100% 40% 40% 80%

Tabel 7 - specii bacteriene identificare în abcese dentare

5
5

4.5
4
4

3.5

2.5
2 2
2

1.5

0.5

0
Stafilococ anaerob Eubacterium Fusobacterium mortiferum Bacteroides

Grafic 7 - specii bacteriene identificare în abcese dentare

65
 3.2 Sensibilitatea la antibiotice

În tabelul de mai jos sunt prezentate principalele fenotipuri de rezistență și ponderea

procentuală a acestora în grupul tulpinilor de stafilococ identificate din produsele patologice
luate în studiu.

Fenotipul Tulpini rezistente (%)

P, Te, Ox, E, S, K, CN 69,14

P, Te, Ox, E, S, K, CN, CIP 7,44

P, Te, S, K, GN 3,19

P, Te, S, K 3,19

P, Te, Ox, E, S, K, CN 2,12

P, Te, Ox, E, S, K, CN 2,12

P, E, S, K, CN 2,12

P, S, K, CN 2,12

Alte 8 fenotipuri (câte o tulpină) 8,48 (1,06%)

Tabelul 8. Proporţia relativă a principalelor fenotipuri de rezistenţă la S. aureus

66
 3.3 Rezistența la meticilină

Rezistența la Meticilină

- din totalul de 48 de tulpini de stafilococ identificate, 2 au fost rezistente la Meticilină,

respectiv un procent de 4,17%, procent ușor mai mic decât cel prezentat in literatura de
specialitate.

- cele 2 tulpini de stafilococ rezistente la Meticilină făceau parte din grupul S. aureus și au
fost izolate de la același pacient, în exudat faringian și în exudat nazal.

Rezistența la Macrolide, Streptogramin, Lincomicina

- 7 tulpini de S.aureus (7/10) recoltate din exudate faringian și nazal au fost rezistente la
MSL, respectiv un procent de 70% , procent similar cu cel din literatura de specialitate;

- 2 tulpini de S. aureus (2/3) au fost identificate in parodontita cronica, dar toate acestea au
fost sensibile MSL, respectiv un procent de 66,7% ;

- 5 tulpini de S. Coagulază Negativi (30) au fost rezistente la MSL, respectiv 16,7%,

procent similar cu cel din literatura de specialitate;

- 2 tulpini de S. coagulaza Negativi din cele 5 rezistente la MSL, respectiv 40%, au fost
identificate la același pacient în exudatul faringian și puroi parodontal, demonstrând
posibilitatea de colonizare cu specii bacteriene rezistente din aproape în aproape.

67
 Concluzii
1) Tulpinile de stafilococ rezistente la Meticilină au fost sensibile la Vancomicină,
această opțiune terapeutică fiind încă validă în cazul tulpinilor studiate.

2) Tulpinile de stafilococ sensibile la Meticilină au fost parțial rezistente la

Clindamicină (40 %), ceea ce face discutabilă alegerea acestui antibiotic în
tipurile de infecții studiate.

3) Cele mai multe tulpini de tafilococ auriu au fost izolate din exudatul nazal.

4) Cele mai rezistente tulpini de stafilococ au fost izolate din exudatul nazal și
faringian.

5) Cele mai sensibile tulpini de stafilococ au fost izolate din puroiul parodontal.

6) Identificarea stafilococului rezistent la Meticilină la același pacient

demonstreză clar că rezervorul este reprezentat de fosele nazale.

7) Nu există nici o legătură privind rata de identificare a diferitelor variante de

stafilococ pe sexe, studiul demontrând existența unei repartiții aproximativ
egale.

8) Rata mare de portaj al stafilococului explică necesitatea identificării tulpinilor

rezistente, în vederea limitării extinderii colonizării de vecinătate la aceeași
pacienți, precum și limitării transmiterii acestor tulpini la pacienți susceptibili.

68
 Bibliografie:

1. Rosenbach, AJ. Mikro-Qrganismen bei den Wund-Infections-Krankheiten

des Menschen. Wiesbaden, J.F. Bergmann, 1884. p. 18
2. Codiță, Irina, Buiuc, D. [2008]. Identificarea cocilor Gram pozitivi aerobi și
facultativ anaerobi, în Tratat de Microbiologie Clinică, sub redacția Buiuc și
Neguț ,Ed. a-II-a, Ed. Medicală, București
3. Euzeby, J.P. [2011]. List of Prokaryotic names with Standing in
Nomenclature Genus Staphylococcus,
http://www.bacterio.cict.fr/s/staphylococcus.ht ml ,
4. Răducănescu, H., Bica-Popii, V. [1986]. Bacteriologie veterinară, Ed. Ceres,
București.
5. Giesbrecht, P., T. Kersten, H. Maidhof, and J. Wecke. 1998. Staphylococcal cell
wall: morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin.
Microbiol. Mol. Biol. Rev. 621371-1414
6. Walsh, C. 2000. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug
resistance. Nature 406775-781
7. Schindler, C. A., and V. T. Schuhardt. 1964. Lysostaphin: a new bacteriolytic
agent for the Staphylococcus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51414-421.
8. Dajcs, J. J., B. A. Thibodeaux, E. B. Hume, X. Zheng, G. D. Sloop, and R. J.
O'Callaghan. 2001. Lysostaphin is effective in treating methicillin-resistant
Staphylococcus aureus endophthalmitis in the rabbit. Curr. Eye Res. 22451-
457.
9. Climo, M. W., R. L. Patron, B. P. Goldstein, and G. L. Archer. 1998.
Lysostaphin treatment of experimental methicillin-resistant Staphylococcus
aureus aortic valve endocarditis. Antimicrob. Agents Chemother. 421355-1360
10. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15140393
11. Muller, D. J., and Y. F. Dufrêne. 2008. Atomic force microscopy as a
multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat. Nanotechnol.
3261-269.

69
12. Ryan KJ, Ray CG, eds. (2004). Sherris Medical Microbiology (4th ed.).
McGraw Hill. ISBN 978-0-8385-8529-0.
13. Tratat de microbiologie clinica ed. 3 - Dumitru Buiuc, Marian Negut
14. Lab 15: Isolation and Identification of Staphylococci from
https://bio.libretexts.org/Ancillary_Materials/Laboratory_Experiments/
Microbiology_Labs/
15. Kluytmans J, van Belkum A, Verbrugh H (July 1997). "Nasal carriage
ofStaphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms, and
associated risks". Clinical Microbiology Reviews. 10 (3): 505–20.
doi:10.1128/CMR.10.3.505. PMC 172932. PMID 9227864.
16. Michelle E. Mulcahy, Joan A. Geoghegan, Rachel M. McLoughlin. “Nasal
Colonisation by Staphylococcus aureus Depends upon Clumping Factor B
Binding to the Squamous Epithelial Cell Envelope Protein Loricrin”
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003092
17. Khan, M. F. (2017). Brief History of Staphylococcus aureus: A Focus to
Antibiotic Resistance. EC Microbiology, 5, 36-39.
18. Jevons MP (1961). "Celbenin-resistant staphylococci". BMJ. 1 (5219): 124–5.
doi:10.1136/bmj.1.5219.124-a. PMC 1952878.
19. Davies J. Vicious circles: looking back on resistance plasmids. Genetics.
1995;139:1465-1468.
20. World Health Organization. Antimicrobial resistance: global report on
surveillance 2014. Downloaded from:
http://www.who.int/drugresistance/documents/surveillancereport/en/.
21. Popa MI. Infecţiile nosocomiale din nou în actualitate. (editorial) Infecţio.ro.
2015;44(4):3.
22. Vytenis A. Commissioner for Health and Food Safety, and Carlos Moedas,
Commissioner for Research, Science and Innovation – European Antibiotic
Awareness Day 2017, Brussels, 15 November 2017.
23. Walsh, C. 2000. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug
resistance. Nature 406775-781

70
24. McKenna M. Big Chicken: The Incredible Story of How Antibiotics Created
Modern Agriculture and Changed the Way the World Eats Hardcover. The
Amazon Book Review, September 12, 2017.
25. Schmidt ML, Spencer MD, Davidson LE. Patient, Provider, and Practice
Characteristics Associated with Inappropriate Antimicrobial Prescribing in
Ambulatory Practices. Infect Control Hosp Epidemiol. 2018;1-9.
26. Davies J. Vicious circles: looking back on resistance plasmids. Genetics.
1995;139:1465-1468.
27. Richet, H. M., M. Benbachir, D. E. Brown, H. Giamarellou, I. Gould, M. Gubina,
P. Heczko, S. Kalenic, M. Pana, D. Pittet, S. B. Redjeb, J. Schindler, C. Starling,
M. J. Struelens, W. R. Witte, and S. Jarvis. 2003. Are there regional variations
in the diagnosis, surveillance, and control of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus? Infect. Control Hosp. Epidemiol. 24:334-341.
28. Bartley, J. 2002. First case of VRSA identified in Michigan. Infect. Control
Hosp. Epidemiol.
29. Centers for Disease Control and Prevention. 2002. Vancomycin-resistant
Staphylococcus aureus—Pennsylvania, 2002. Morb. Mortal. Wkly. Rep.
51:902.
30. Centers for Disease and Prevention. 2004. Vancomycin-resistant
Staphylococcus aureus—New York, 2004. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 53:322-
323.
31. Costerton, J. W., P. S. Stewart, and E. P. Greenberg. 1999. Bacterial biofilms: a
common cause of persistent infections. Science 284:1318-1322.
32. Donlan, R. M. 2001. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological
process. Clin. Infect. Dis. 33:1387-1392.
33. Stewart, P. S. 2002. Mechanisms of antibiotic resistance in bacterial biofilms.
Int. J. Med. Microbiol. 292:107-113.
34. Maira-Litran, T., A. Kropec, C. Abeygunawardana, J. Joyce, G. Mark III, D. A.
Goldmann, and G. B. Pier. 2002. Immunochemical properties of the
staphylococcal poly-N-acetylglucosamine surface polysaccharide. Infect.
Immun

71
35. Utaida, S., P. M. Dunman, D. Macapagal, E. Murphy, S. J. Projan, V. K. Singh,
R. K. Jayaswal, and B. J. Wilkinson. 2003. Genome-wide transcriptional
profiling of the response of Staphylococcus aureus to cell-wall-active
antibiotics reveals a cell-wall-stress stimulon. Microbiology 149:2719-2732.
36. Reynolds, P. E., and E. A. Somner. 1990. Comparison of the target sites and
mechanisms of action of glycopeptide and lipoglycodepsipeptide antibiotics.
Drugs Exp. Clin. Res. 16:385-389
37. Monzon, M., C. Oteiza, J. Leiva, M. Lamata, and B. Amorena. 2002. Biofilm
testing of Staphylococcus epidermidis clinical isolates: low performance of
vancomycin in relation to other antibiotics. Diagn. Microbiol. Infect. Dis.
44:319-324
38. Daniel, R. A., and J. Errington. 2003. Control of cell morphogenesis in
bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell 113:767-776
39. Henry F. Chambers1 and Frank R. DeLeo2 Waves of Resistance:
Staphylococcus aureus in the Antibiotic Era

72