m
 

  
m
    

 

     

 
 
 
 

 
      

  

  

 




` Retrovirusurile
- lentivirusurile
- Mo-MLU (Murine Leukemia Virus)
` Adenovirusurile
- herpes virusurile
- adenovirusuri asociate
-fagi filamentosi (M13, f1, fd, Pf1)
- bacteriofagul ɉ.
m
   


 
 

Retrovirusul Fibroblastele, mioblastele,
celulele musculare netede, Nepatogene.
hepatocite, celule hematopoietice, Se integrează în genom. Relativ
celule stem. simplu de manipulat.
Biologia este bine studiată.
Adenovirusurile Hepatocitele Sunt disponibile linii mutante non-
epiteliul tractului respirator patogene.
superior, Oamenii - gazda naturală.
celule limfoide si hematopoietice Eficacitatea înaltă în infecţia în
vivo.
Infectează celulele ce se divid si ce
nu se divid, neinfectate de
retrovirusuri.
Biologia este bine studiată.
Sunt linii celulare de inpachetare.
Adenovirusurile asociate Celule hematopoietice Nepatogene, nu este citotoxic..
fibroblaste, Oamenii - gazda naturală.
celulele epiteliale. Site-ul preferat de integrare este pe
cromozomul 19.
Poate stabili o stare latentă. Relativ
simplu de construit a vectorului.
Capacitate limitată pentru
punerea în aplicare a transgenei
(10 KB).
Nu infectează celulele ce nu se
divid.
Expresia transgenei poate fi de
scurtă durata.
Nu este foarte util pentru
terapia în vivo.
Nu se integreze în genom.
Construcţia vectorului este mai
complicată decât cea a
retrovirusurilor.
Se poate recombina cu un
adenovirus natural.
Titruri relativ scăzut.
Capacitate mica (4KB).
Infectarea este relativ scăzută.
Necesită un adenovirus ca un
ajutor pentru infecţie.
Biologia nu este bine studiata.
 m
  
Vectori retrovirali pot fi capabili de replicare sau de replicare defect.

Vectorii de replicare defect sunt virusurile ce au regiunile de codare

pentru genele necesare pentru replicare a virionului şi ambalare
înlocuite cu alte gene, sau şterse. Aceste virusuri sunt capabile să
infecteze celulele ţintă şi sa furnizeze gena utilă, dar nu reuşesc
să-şi continue calea tipic litica.

Vectori capabili de replicare virală conţin toate genele necesare

pentru sinteza virionului, şi continuă să se propage odată cu
infectarea. Deoarece genomul viral pentru acesti vectori este mult
mai lung, lungimea genei de interes este limitată.

În funcţie de vectorul viral, lungimea maximă a unui fragment

ADN inserat este de obicei aproximativ 8-10 kB.
    
` ARN-ul viral:
- Conţine aşa-numitele repetari scurte terminale - STR (short terminal
repeats). Cifra acestea sunt notate cu R;
- Codifică trei polipeptide lungi: GAG, polipeptida combinata GAG-
POL, şi ENV, care este precursor ale proteinelor rvirale - ca capsida
(GAG) , anvelopa (ENV), şi de reglare (GAG-POL);
- Conţine la capatul 5' cap ARN-ul, iar la capatul 3' poli (A) "coada";
- conţine două site-uri splicing - donator SD şi acceptor SA;
- Conţine o secţiune specială, care indică faptul că ARN-ul poate fi
ambalat în interiorul proteinelor virale, care formează ca urmare o
particulă virală, virionul. Acest semnal de ambalare y (psi). Acest site
este situat între două site-uri de lipire.



  


 
` Din ADN-ul proviral se elimina o parte
din gene, lăsând doar LTR şi y-site-ul.
În locul genelor eliminate se inserează
fragmentul de ADN de interes.
` Transferul genelor virale intr-o linie
celulara ce v-a produce proteinele de
incapsidare.
` Transferul retrovirusului intr-o linie
celulara care il va multiplica.
î
 m
  
` Vectorii adenovirali sunt virusuri ADN la
care sa indepartat din genom cea mai
mare parte din regiunea E1 esentiala
replicarii virale si s-a introdus gena de
interes.
De asemenea se indeparteaza regiunea
E3, care poate declansa raspunsul
imunitar , dar nu influenteaza replicarea
virala.
     
` Regiunea C Ȃ genele ce codifica proteinele
capsidei
` Regiunile E1, E2, si NS1- genele ce
codifica proteinele anvelopei.
` Regiunile NS2, NS3, NS4- genele ce
codifica enzime ca helicazele, proteazele
etc.
` Regiunea NS5- genele ce codifica ARNpol.



  


 
` Subtituirea regiunilor E1A si E1B cu o
gena de interes.
` Transfectia unei linii de celule (293) de
origine embrionara ce contine regiunile
E1a si E1B virale integrate in genomul
acestora si producerea proteinelor
respective.
` Incapsidarea moleculelor de AND viral
recombinat .
m


m

 

 

` Genomul faguluiɉ, prezentînd dimensiuni mari, nu poate fi
utilizat ca atare ca vector de clonare. Cu atât mai mult cu cât
ADN-ul său conţine multe situsuri pentru enzime de restricţie în
gene esenţiale pentru ciclul litic al fagului. Pe de alta parte,
particulele fagice nu pot prelua o cantitate mult mai mare de
ADN decât propriul genom. Totuşi, toate aceste impedimente au
fost depăşite :
` 1. regiunea centrală a genomului viral (ce reprezintă
aproximativ 1/3 din genom) nu este esenţială pentru creşterea
litică şi, ca atare, poate fi înlocuită de ADN heterolog; această
regiune a fost denumită ƎstufferƎ
` 2. prin manipulare genetică situsurile de restricţie au fost
eliminate din regiunile esenţiale
` 3. mai mult decât atât, folosind oligonucleotide sintetice,
situsurile de restricţie au fost plasate exact în poziţiile cele mai
favorabile

 
 

 m
 m 

 

` Jagii filamentoşi (M13, f1, fd, Pf1) au
genomul format dintr-o moleculă ADN m.c.
circular închis, cu greutate moleculară medie
de 2 x 106 Da. După pătrunderea în celula
bacteriană, ADN fagic iniţiază ciclul de
replicare cu ajutorul unei forme
intermediare de replicare dublu catenare.
Replicarea se face dupa modelul cercului
rotativ şi are ca rezultat formarea unui mare
numar de catene ADN. Aceste cateneΫ vor
servi ca matriţa în transcrierea genelor
fagice.
  

   
 
` 0btinerea 0MG
` Terapia genica
` Biotehnologii moderne
` Clonarea genelor
` etc.