PROPRIETĂŢILE

FIZICO-CHIMICE
ŞI
BIOCHIMICE
ALE COLAGENULUI
 Principala caracteristică al edificiului chimic al
colagenului este aceea a unei construcţii
complexe, ierarhizate, realizată în etape.

Stabilitatea structurii pe etape şi în

ansamblul ei este obţinută, în mare parte,
prin numeroasele legături de hidrogen.

Acest aspect caracteristic scleroproteinelor face ca una dintre

cele mai importante relaţii ale colagenului cu mediul exterior
să fie reprezentată de relaţiile sale cu apa

Colagenul este solubil în soluţii diluate de acizi, baze şi săruri neutre.

Sub acţiunea acizilor şi bazelor colagenul se

denaturează.
1. Caracterul coloidal al colagenului
Colagenul poate exista atât în stare de gel cât şi în stare de sol.

În stare solvită nu difuzează prin membrane semipermeabile,

deoarece particulele sale au mărimi mai mici de 1mµ,
dimensiunile stării coloidale

Particula coloidală poate fi formată dintr-o macromoleculă

sau din agregate moleculare colagenice

Starea coloidală a colagenului, în soluţie, îi conferă toate proprietăţile fizico-

chimice caracteristice sistemelor coloidale şi anume: presiune osmotică mică,
putere de difuzie mică, prezenţa efectului Tyndall, tensioactivitate etc.

Datorită caracterului coloidal al colagenului, prezenţa sa va influenţa

repartiţia unor ioni din soluţiile separate prin membrane
semipermeabile.
În cazul a două soluţii de acid clorhidric de concentraţii diferite (C1<C2) care sunt
separate de o membrană semipermeabilă, după un interval de timp, datorită
difuziei ionilor din soluţia mai concentrată prin membrană în soluţia mai diluată,
concentraţiile celor două soluţii se vor egala (C1=C2).

A A
C1 <<< C2 C1 = C2
B B

Travaliul procesului de transfer al ionilor din compartimentul soluţiei C2 în

compartimentul soluţiei C1, în condiţii izoterme şi când soluţiile sunt destul
de diluate, poate fi exprimat din punct de vedere termodinamic prin:

în care,

C2 n = numărul de moli – ioni transferaţi din B în A;

A = nRT ln ( )
1 compartimente;
C1 C1 şi C2 = concentraţiile din cele două
R = cconstanta gazelor;
( 1 ) T = temperatura absolută.
 În momentul egalării concentraţiilor din cele două compartimente,
se instaurează starea de echilibru

modificările infinit de mici ale stării, la temperatură şi volum constant,

nu modifică energia liberă a sistemului

adică suma acţiunilor separate corespunzătoare

transferului celor doi ioni trebuie să fie egală cu zero

În cazul când: +
+ (H )C2
pentru H : A = nRT ln + ( 2)
(H )C1
_
_ (Cl_)C2
pentru Cl : A = nRT ln ( 3)
(Cl ) C1
vom avea :
+
_
(H )C2 (Cl )C2 (4 )
nRT ln + + nRT ln _ = 0
(H )C1 (Cl ) C1
în care : [H+] şi [Cl ] sunt concentraţiile ionilor în moli
rezultă că :
_ _
+
(H )C (Cl )C (Cl ) C1
ln + 2 = _ ln _ 2 = _ ( 5)
(H )C 1 (Cl ) C1 (Cl )C2

+
_ _
sau (H )C2 .(Cl ) C2 = (H )C1 . (Cl ) C1
+
( 6)

+
_
(H )C2 (Cl ) C1
sau = _ = ( 7)
+ (Cl )C2
(H )C1

La echilibru, produsele concentraţiilor ionilor de semn contrar din cele două

compartimente vor fi egale.

Studiind cazul repartiţiei ionilor din momentul echilibrului, dacă ionii nu sunt deopotrivă
de mobili, adică dacă nu toţi ionii sunt difuzibili prin membrana semipermeabilă datorită
caracterului lor coloidal, Donnan a constatat o inegalitate în repartiţia ionilor
difuzibili în momentul echilibrului.
 Teoria echilibrului de membrană
Donnan
http://www.geocities.com/bioelectrochemistry/donnan.htm
Studiază repartiţia ionilor între două soluţii
separate printr-o membrană semipermeabilă
Sistemul considerat 1. Produsele concentraţiilor ionilor de
Piele gelatină Soluţie HCl semn contrar din cele 2 compartimente
Faza I Faza II vor fi egale la echilibru

H 2. Colagenul îndeplineşte rolul de ion

+ Cl H
R NH3 Cl +
nedifuzabil prin membrane
R NH3
+ R NH3 Cl semipermeabile
Cl Cl H Cl Cl Cl
H H
R NH3
+
Cl R NH + H Cl Cl 3. În sistemul colagen – souţie de HCl
R NH3
+ 3 H colagenul joacă rol şi de membrană
Cl + Cl H
R NH3
+ R NH3 semipermeabilă
Cl H H
Cl Cl Cl Cl H
+
Cl + R NH3 Cl H 4. Dacă nu toţi ionii sunt la fel de mobili,
R NH3
+ R NH3 H
Cl Cl adică nu sunt difuzabili din cauza
Cl Cl
caracterului lor coloidal, se remarcă o
Ioni + inegalitate în repartiţia lor la echilibru
R NH3 Z Ioni
nedifuzibili 5. Când colagenul reacţionează cu un acid
Cl = Z difuzibili
sau o bază, există condiţii pentru stabilirea
unui echilibru de membrană Donnan
H =Y H =X între colagen şi soluţia externă, fiindcă în
colagen sunt ioni care nu difuzează, iar în
Cl =Y Cl = X soluţie, ioni care difuzează

X2 = Y ( Y + Z ) Ecuaţia echilibrului de membrană Donnan

 În urma repartiţiei inegale a ionilor capabili de a difuza, se naşte între pielea
gelatină şi soluţia înconjurătoare, la limita atingerii acestora, o diferenţă de
potenţial E, care poate fi exprimată prin relaţia lui Nernst:

în care:
RT R= constanta gazelor;
( 9)
E = ln  T = temperatura absolută;
F F = numărul lui Faraday (96 500);
 = raportul concentraţiilor conform ecuaţiei
(7).

În raport cu soluţia exterioară, colagenul este încărcat ca şi ionul fixat.

În toate cazurile în care x>y vom avea în mediul acid a > 1,

iar în mediu alcalin b < 1.
Dacă în expresia potenţialului E se înlocuieşte pe RT / F cu valoarea sa corespunzătoare la
temperatura de 18°C şi se trece de la logaritmii naturali la cei zecimali se obţine relaţia :

E = 58 log milivolţi (10)

 DIFUZIE + OSMOZĂ = PRESIUNE COLID-OSMOTICĂ

π
Dacă in sistem se gasesc ioni
nedifuzibili s-a constatat că
presiunea osmotică evoluază 2
după o relaţie diferită de aceea
a lui Van’t Hoff :
1
2
  AC  BC
Contribuţia proteinelor din organism la
C
presiunea osmotică totală, numită
presiune oncotică, este foarte mică.
1 – variaţie liniară conf. legii Van’t Hoff

2 – variaţie reală conform π =AC+BC2

2. Adsorbţia vaporilor de apă de către colagen

O funcţie împortantă a pielii este de a regla temperatura organismului şi

la aceasta contribuie esenţial asocierea apei cu pielea.

Evaporarea unui gram de apă provoacă o pierdere de căldură de 0,54 Kal şi

înlesneşte omului să suporte temperaturi mai mari de 60°C, dacă aerul înconjurător
are o umiditate destul de coborâtă încât să permită evaporarea transpiraţiei.

Pauling atribuie adsorbţia apei grupelor polare specifice

ale colagenului şi a proteinelor în general.

Bull arată că legăturile amidice din nylon nu exercită o atracţie deosebită faţă de apă.

Deosebirile dintre legătura pepetidică şi cea amidică

 În proteine există două tipuri principale de grupe
hidrofile: grupele lanţurilor laterale polare ale
aminoacizilor şi grupele carbonil şi amido ale legăturilor
peptidice (mult mai abundente).

Grupele lanţurilor laterale polare ale A.A. Grupele carbonil şi amido

acidul glutamic, asparagic, ale legăturilor peptidice
lizina, arginina, tirozina etc.

Grupele peptidice ar fi responsabile pentru aproximativ 45% din apa

adsorbită în fază de vapori de către cazeină şi de 70% de către zeină,
la umiditatea relativă de 60%.

Colagenul absoarbe din atmosfera înconjurătoare o cantitate de vapori de

apă, în funcţie de umiditatea relativă a aerului şi de temperatură, care poate
ajunge până la 50% din greutatea sa.
Apa adsorbită produce îndepărtarea elementelor micro-structurale ale colagenului, între ele.
 Al treilea segment panta curbei creşte
brusc indicând o adsorbţie puternică.
În această zonă poate avea loc
condensarea capilară sau, după
Brunauer, Emmet şi Teller, formarea
unor straturi de molecule de apă.
Apă adsorbită g/100g

Al doilea segment - este liniar şi are

o înclinare lină. El se extinde până la
umiditatea relativă de 65%.

Umiditatea relativă %
Primul segment - pentru tensiuni mici
de vapori procesul este tipic unei
adsorbţii Langmuir.
 Există o corelaţie între căldura totală degajată şi cantitatea de apa adsorbită.
Căldura degajată este direct proporţională cu cantitatea de apă care se combină
cu materialul.

Cu cât cantitatea de apă pe care o

Căldura de umezire, cal / g

conţine un material este mai mare,

cantitatea de căldură ce poate fi
degajată este mai mică.

Adsorbţia primelor cantităţi de vapori

apă se face cu cedare mare de căldură
în cazul tuturor materialelor prezentate.

În cazul colagenului complet uscat,

Apă adsorbită% la adsorbţia unui mol de apă se
eliberează 4530 cal.
Corelaţia între căldură şi umiditate, în %
de vapori de apă adsorbiţi la 65 %
umiditate relativă
 Mecanismul adsorbţiei apei de către piele

Pielea considerată ca un material biologic ideal de adsorbţie a apei

sistem eterogen

Reţea de ţesut
Un semigel continuu (interfibrilar)
conjunctiv, predominant
colagenic

+Produse de schimb metabolic

+ mucopolizaharidele

Acidul hialuronic - joacă un rol important

în controlarea conţinutului de apă a pielii

Comparativ cu alte organe, pielea conţine cea mai puţină apă pe

unitatea de greutate.
Apa este o componentă integrală a structurii colagenului şi prezenţa
unei oarecare cantităţi de apă este esenţială pentru menţinerea
structurii sale fibrilare.

Îndepărtarea apei duce la modificarea aranjamentul legăturilor

intra şi intermoleculare, un efect care este ireversibil.

Ţesutul conjunctiv al pielii poate să asimileze cantităţi mari de apă

“apă liberă” “apă legată”

acea parte din total care nu este

80% din apa din piele este apă “liberă” disponibilă pentru dizolvarea
neelectroliţilor solubili în apă

20% din apa din piele este apă “legată”

Apa interfibrilară nu se poate îndepărta prin centrifugare În cazul pielii gelatină, în stare
izoelectrică, este necesară o
La grupele polare ale colagenului are loc presiune de:
adsorbţia unui strat molecular de apă care • 600 at pentru ca să se
îndepărteze apa slab legată şi de
este puternic legat, de care sunt fixate alte
straturi, cu intensităţi descrescânde. • 2000 at pentru ca să se
îndepărteze apa puternic legată.
Gradientul de conductivitate al colagenului este influenţat de gradul său de hidratare
şi de temperatura mediului.

În mediul ambiant conductivitatea se schimbă de la 1015 (Ω cm)1 în stare uscată la

aproximativ 108 (Ω cm)1 când colagenul are 24% umiditate.

Alte mărimi
Entalpia colagenului creşte brusc când umiditatea se măreşte de la 0 la 28%,
atingând un maximum de 14,3cal/g .

Efectul adsorbţiei de apă asupra entalpiei se explică prin formarea punţilor de apă
în interiorul triplului helix al colagenului.

La un conţinut de apă de 30–60%, entalpia descreşte cu 2cal/g, datorită probabil

interacţiunii dintre structurile secundare ale apei şi apa din interiorul triplului helix.
 u l ui
ge n
c ol a
ne a le
c ţ i u az e Colagenul este un produs amfoter datorită
nt era i ş i b grupelor bazice şi acide ale catenelor
I ci z i
3 c u a laterale lanţurilor polipeptidice.

Grupele amidice din lanţurile polipeptidice şi grupele

hidroxilice ale catenelor laterale au o însemnătate redusă
asupra caracterului amfoter.

Prin introducerea colagenului în mediu acid sau alcalin, se constată o

tendinţă puternică de pătrundere a apei.

Are loc umflarea care este determinată de pH-ul sistemului şi de

capacitatea de combinare a colagenului cu acizii sau bazele.
Reprezentarea diagramică a diferenţelor dintre un fibril uscat (a), un fibril
umflat în apă la pH neutru (b) şi unul umflat acid (c).

Zonă polară

Legarea acizilor şi bazelor de către colagen este funcţie de numărul

grupelor polare capabile de a se salefia şi este determinată de
rapoartele stoechiometrice dintre proteină şi acizi sau baze.
 Echilibrul electrochimic sau capacitatea maximă a colagenului de a lega acizii sau
bazele, reprezintă cantitatea de proteină deshidratată, în grame, necesară pentru a se
combina cu un echivalent gram de acid sau bază şi care depinde de natura acestora.

Echilibrul electrochimic
Se poate determina pe cale titrimetrică sau potenţiometrică:

NH3+ NH3+Cl
| |
R + HCl  R
| |
COO COOH

NH3 NH 2
 
R + NaOH  R + H2O
 
COO COONa+
Ascensiunea bruscă a curbei de titrare Curba are o ascensiune bruscă, la valori
potenţiometrică pe intervalul de pH = 2 - 5 este de pH peste 8, datorită grupelor -aminice
dată de grupele carboxilice ale resturilor ale lizinei şi de grupele guanidinice ale
acizilor asparagic şi glutamic. argininei.
 Capacitatea de combinare a colagenului cu acizii este mai mare decât
capacitatea de combinare cu bazele : 0,99 miliechivalenţi/1 g proteină,
respectiv 0,88 miliechivalenţi/g proteină.

Compensarea internă a sarcinilor pozitive şi negative

corespunde unui anumit pH, denumit pH izoelectric (pHi). CARACTERISTICI

La pHi, colagenul are un minim de umflare, solubilitate,

presiune osmotică, vâscozitate, ionizare şi, de asemenea,
proprietăţile de legare acidă sau alcalină sunt minime.
Gelurile de colagen au la pHi o putere maximă de difuzie a luminii
(efectul Tyndall) şi un maxim de rezistenţă la forfecare.

Valoarea pHi a colagenului se modifică dacă se schimbă raportul cantitativ

dintre grupele sale bazice şi acide capabile de a ioniza.

Când pH pHi, colagenul va funcţiona ca bază

şi la pH  pHi se va comporta ca un acid.
 Se definesc 3 puncte de neutralitate diferite a
macroionilor amfoteri

punctul de neutralitate al punctul de neutralitate al

macroionilor puri, independenţi, macroionilor la neutralizarea cu un
numit punct de sarcină nulă acid sau cu o bază oarecare, numit
punct izoelectric (pHi = pH-ul
izoelectric)
punctul de neutralitate al macroionilor încărcaţi cu
ionii unui electrolit dat (macroioni + contraioni) ,
numit punct izoionic

Valoarea pHi al proteinelor este o consecinţă nemijlocită a

compoziţiei în aminoacizi pe care o posedă. Aceasta se manifestă
prin intermediul a două mărimi:

valoarea funcţionalităţii specifice valoarea constantei de ionizare a

unei categorii de grupări funcţionale, grupărilor funcţionale constituente,
exprimată în moli/g exprimată prin pK.
 Determinarea pHi

Metode indirecte
Metode directe

măsurarea gradului de umflare,

titrarea potenţiometrică,
determinarea combinării cu
cataforeza în soluţii tampon,
coloranţii bazici sau acizi,
electroforeza
măsurarea vâscozităţii

Folosind măsurarea gradului minim de umflare a colagenului sau

vâscozitatea minimă (în cazul soluţiilor de colagen sau a pastelor)
drept criterii de determinare a pHi se obţin valori aproximative.

pHi=2,9-12,5 la
proteine
 pH i = 4,85

pH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
H OOC NH + + _ _
3 H OOC NH 3 OOC NH 2 OOC NH
2
C C C C
_ + _ +
OOC NH 3 OOC NH 3

pK <pK  Lys Arg

Glu Asp pK NH2 < pK NH2 < pK NH
2

+ HX + BOH
C
_
OOC NH +
3

Variaţia caracterului ionic şi a solubilităţii colagenului în funcţie de pH, prin

adaos de acizi sau baze faţă de punctul de neutralitate .
pHi=4,85 este pH-ul izoelectric al proteinei.
 Interacţiuni ale colagenului cu acizii

Concentraţia >>>>> Umflarea acidă

În cazul concentraţiilor mici de acizi se
ajunge la o legare stoechiometrică a
cationilor la grupele carboxilice ale
moleculei de colagen, în timp ce anionii
acidului se combină cu grupele bazice.

Stabilitatea hidrotermică scade brusc, la

Se măreşte stabilitatea hidrotermică un moment dat, ca urmare a ruperii
a colagenului datorită apropierii legăturilor de hidrogen, ceea ce are
reciproce a catenelor polipeptidice. drept consecinţă modificarea
ireversibilă a stabilităţii triplului helix.
Sistemul colagen - soluţie de acid clorhidric, echilibrul
poate fi determinat cu ajutorul legii acţiunii maselor:
[R — NH3+] [Cl- ]
R — NH3+ + Cl  R — NH3Cl K = --------------------------

Valoarea constantei de echilibru K depinde de afinitatea anionului faţă de colagen.

[R — NH3Cl ]
Combinarea maximă prin legături ionice are loc la pH=1,0 - 1,5.
 Observaţii:
Greutatea dermului umflat în %
faţă de greutatea uscată

• Acidul clorhidric produce cea mai puternică umflare

• În soluţii concentrate de acizi acetic, lactic şi

formic umflarea nu prezintă un maxim.

• Sărurile neutre adăugate în soluţiile de acizi

schimbă echilibrul dintre acid şi colagen
(teoria echilibrului de membrană Donnan)
pH
Curbele de umflare ale colagenului
în soluţii acide: • Compuşii organici neionizabili ca formamida,
1. HCl metacrezolul, produc umflarea colagenului
2. H2SO4
3. acid -naftalensulfonic
• Acidul azotos produce dezaminarea colagenului acţionând
asupra amino-acizilor: lizina, arginina, tirozina, serina şi treonina.
 Acţiunea substanţelor bazice asupra colagenului
Colagenul tratat alcalin îşi modifică pHi până la valori de 5,0–5,5 din cauza
procesului de dezaminare şi de formare de noi grupe carboxilice libere.
Umflarea colagenului în mediu alcalin se explică în acelaşi mod ca şi umflarea acidă.

›
KOH  NaOH  NH4OH Ba(OH)2  Sn(OH)2  Ca(OH)2
Intensitatea umflării Intensitatea
umflării
Din cauza reducerii intensităţii factorului osmotic
Cantitatea de apă la 100g colagen, g

Curba umflării cu hidroxid de sodiu creşte vertiginos începând cu pH=9

până la pH  11, după care continuă cu o pantă lină până la pH  12,5–13,0
şi apoi umflarea creşte după o curbă aproape verticală.

La pH puternic alcalin hidroxidul de sodiu produce o hidroliză accentuată

asupra colagenului prin ruperea legăturilor de hidrogen şi a unor legături
covalente, care face ca structura fibroasă a colagenului să devină mai
laxă ceea ce favorizează continuarea hidratării suplimentare.

Umflarea colagenului în soluţii de: Umflarea alcalină scade puţin sau de

1. NaOH loc la adăugarea de sare neutră.
2. NH4OH
3. Ca(OH)2
MODIFICĂRILE PRODUSE DE ACIZI ŞI ALCALII ASUPRA COLAGENULUI

Modificările produse Modificările amino-acizilor

de acizi şi baze asupra
macromoleculeide colagen, (1
a fibrilelor şi fibrelor )
(2, 3)

Modificări fizico-chimice
ale colagenului

(4
) legăturilor
Modificări ale
intramoleculare

Modificările chimice ale colagenului, care se manifestă asupra aminoacizilor (1),

macromoleculelor de colagen (2) şi asupra structurilor fibroase (3), produc
afânarea microstructurii şi chiar pierderi de substanţă colagenică (4).
 Modificările aminoacizilor
Într-un lanţ polipeptidic, din macromolecula de colagen,
sunt 124 de resturi de acizi dicarboxilici, din care
25-30% au grupa carboxilică liberă amidificată.

Soluţiile diluate de alcalii duc la scăderea azotului

amidic din colagen cu formarea de amoniac liber.

Distrugerea acestor grupe amidice contribuie la

deplasarea pHi a colagenului nativ la valori de
5,0 - 5,5.
 Glutamina şi asparagina se transformă în
acid glutamic, acid asparagic şi amoniac:

H2N — CH — COOH H2O H2N — CH — COOH

|  | + NH 3
CH2 — CO — NH2 mediu CH2 — COOH
alcalin

Asparagină Acid asparagic

H2N—CH—COOH H2O H2N—CH—COOH

|  | + NH3

CH2—CH2—CO—NH2 mediu CH2—CH2—COOH

alcalin

Glutamină Acid glutamic

 Grupa guanidinică a argininei, în mediu alcalin,
se descompune cu formare de uree:

NH2 NH 2 NH2
| | |
CH—(CH2)3—NH—C—NH2  CH—(CH2)3—NH2 + CO
| || | |
COOH NH COOH NH2

Arginină Ornitină Uree

 Modificări ale legăturilor intramoleculare

!!
Legăturile intramoleculare se referă la legăturile de hidrogen şi la
legăturile covalente atât din helixurile minore 1 şi 2, cât din
macromolecula de colagen.

Valoarea energiei de legătură este mică,

Legăturile de hidrogen ruperea legăturilor de hidrogen se face cu
constituie cea mai
un consum mic de energie.
mare parte a
conectărilor dintre
lanţurile polipeptidice,
Legăturile de hidrogen se rup la denaturarea
în cadrul aceluiaşi lanţ
colagenului sub influenţa temperaturii, a alcaliilor,
sau între lanţuri diferite soluţiilor concentrate de acizi, a unor substanţe ca
uree, guanidină etc.
Acizii în soluţii diluate şi mai
ales acizii organici cu
constantă de ionizare mică, nu
rup legăturile de hidrogen Când cauza care a produs ruperea legăturilor de hidrogen
încetează, în colagen se formează noi legături de hidrogen.

Legăturile covalente ale colagenului sunt rezistente la acizi şi baze, în soluţii diluate şi se
rup la hidroliza în soluţii concentrate sau sub influenţa temperaturii.

Legăturile covalente care cedează mai întâi sunt cele esterice şi apoi legăturile peptidice.
 Atât timp cât nu se produc efecte de
Macromolecula de colagen are o hidroliză care să afecteze integritatea
rezistenţă bună faţă de acizi şi alcalii lanţurilor peptidice, mai ales în mediu
alcalin, se păstrează structura triplului helix

1
2

Modificările produse de acizi şi baze

asupra macromoleculei de colagen,
a fibrilelor şi fibrelor

3 5
4
Acizii şi bazele puternice, mai
ales sub formă de soluţii Prin umflare fibrilele îşi pierd O fibrilă cu capetele libere
concentrate, produc conturul neted şi capătă o dintr-o fibră izolată, prin
denaturarea macromoleculei răsucire sinusoidală iar umflare îşi modifică
de colagen, care îşi pierde subfibrilele se răsucesc, una lungimea, micşorându-se
proprietăţile caracteristice. în jurul celeilalte, ca într-o funie. cu 1/3.
 INFLUENŢA SĂRURILOR NEUTRE ASUPRA COLAGENULUI

Sărurile neutre au acţiune puternic liotropă la pHi al colagenului.

Sunt absorbite polar de colagen fără schimb ionic.

La concentraţii reduse de NaCl (până la

1,5–2,0 %), colagenului din soluţie îi cresc

Gradul de umflare,
vâscozitatea, %
vâscozitatea şi umflarea, fenomen numit de
„dizolvare salină”.

Cu creşterea, în continuare, a concentraţiei

în NaCl vâscozitatea şi umflarea scad,
fenomen denumit de „salifiere”, ajungându-
se până la precipitarea colagenului. NaCl, %
Variaţia vâscozităţii şi a gradului de umflare a
colagenului din soluţie în funcţie de
concentraţia în NaCl

Dizolvarea salină se produce pe seama ionilor de sare hidrataţi care se leagă de colagen
prin intermediul moleculelor de apă, prin legături de hidrogen şi van der Waals.

Proteinele precipitate prin salifiere îşi păstrează conformaţia lor nativă şi

pot fi redizolvate. !!!
 UMFLAREA COLAGENULUI
Prezenţa ionilor nedifuzibili duce la o distribuţie inegală a ionilor difuzibili,
între solid şi soluţia externă, care aduce un aflux de apă pentru egalarea
concentraţiei ionice din interiorul substratului şi soluţia externă.

Umflarea
OSMOTICĂ LIOTROPĂ
Pot avea loc simultan

La colagenul umflat osmotic, în mediu
acid, s-au observat unele modificări ale
modelelor de difracţie cu raxe X. Astfel,
fibrilii umflaţi în mediu acid prezintă o
distanţă axială de repetare scurtată
până la 540Å, comparativ cu 605Å la
colagenul normal, uscat.
Umflarea cea mai accentuată se
produce la valorile de pH de 2 si 12.
Procesul este reversibil.
Fibrele colagenice devin translucide.
Gradul de umflare liotropă este mult mai mic
în comparaţie cu umflarea osmotică, iar
modificările dimensiunilor fibrelor de
colagen sunt neînsemnate.
Poate fi observată la orice pH, numai dacă
concentraţia sării este suficient de mare
( 0,5M), iar în intervalul de pH=6-8.
Procesul nu este total reversibil.
La umflarea liotropă nu se constată nici o
alterare a aspectului opac, natural al
fibrelor de colagen.
 UMFLAREA OSMOTICĂ

Dacă o structură fibroasă de colagen, aşa cum ar fi de exemplu dermul,

aflat în echilibru cu apa pură, deci la pHi este imersată în într-o soluţie de
acid sau bază, se constătă că gradul de hidratare creşte, în raport cu cel
iniţial, deci are loc umflarea.

Modificarea gradului de umflare a dermului de bovine,

în funcţie de pH, sub acţiunea acizilor şi bazelor

NH3+ Umflarea este mai puternică în

cazul în care disocierea grupelor
COO¯
reactive este mai mare.
Umflarea la greutatea uscată
a dermei, %

La pH neutru umflarea este mică,

întrucât în domeniul polar al moleculei
de colagen se găsesc grupe
carboxilice negative şi grupe aminice
pozitive complet disociate.
pH
 La punctul izoelectric încărcarea este zero. !!!
Ridicând pH-ul la circa 9, se obţine mai
Prin scăderea pH-ului, tot mai multe grupe întâi o descărcare a grupelor
carboxilice sunt descărcate stricându-se aminice ale lizinei.
astfel compensarea forţelor de respingere,
ducând la umflarea colagenului.
Creşterea numărului de grupe carboxilice
încărcate negativ şi, deci, la o încărcare
negativă a moleculei
Umflarea la greutatea uscată

Apar respingeri între molecule, ceea ce

la aer a dermei, %

generează o uşoară umflare

Abia la pH=12–13, 50% din grupele guanidinice, pozitive,

sunt descărcare ducând în continuare la creşterea umflării.
Umflarea maximă în mediu acid este la pH=2,0–2,2,
mai mare decât în mediu alcalin, care este maximă la
pH=11–11,5.
pH
După neutralizarea acidului sau a bazei care a provocat umflarea, se constată că ţesutul colagenic revine aproximativ la gradul
de hidratare iniţial, fără însă ca reversibilitatea să fie completă, datorită unor modificări produse asupra structurii colagenului.
 Odată cu creşterea gradului de hidratare a ţesutului colagenic,
conţinutul în apă, raportat la dermul uscat, este de 200% la pHi
şi de 400–1000% la umflarea maximă acidă sau alcalină.

Suprafaţa relativă la umflarea maximă este de 0,8–0,9, faţă de umflarea

minimă la starea izoelectrică de 1,0, iar comportarea la deformaţie arată că
starea plastică trece în stare elastică.

La umflarea acidă sau alcalină fibrele colagenice cresc în secţiunea transversală şi

se scurtează în lungime.

Procter şi Wilson au elaborat teoria osmotică a umflării

bazându-se pe teoria lui Donnan.
Datorită excesului de ioni din interiorul dermului,
apa poate pătrunde deoarece presiunea osmotică creată,
în funcţie de pH,
este proporţională cu valoarea excesului de ioni.

Există o serie de alte fenomene care nu pot fi explicate prin teoria osmotică a umflării.
 La umflare se produce o scurtare şi o îngroşare a fibrelor colagenice.

Are loc deformarea catenelor polipeptidice ce alcătuiesc molecula de colagen,

prin suprimarea sarcinii grupelor carboxilice ale catenelor laterale ale lanţurilor
polipeptidice în mediu acid şi a sarcinii grupelor bazice în mediu alcalin.

Respingerea electrostatică
are loc în mediu apos, acid
sau bazic.

Prezentarea schematică a scurtării şi îngroşării fibrelor

colagenice în procesul de umflare datorită respingerii
electrostatice
Moleculele de apă, având caracter dipolar, intră în reacţie suplimentară cu catenele
încărcate din structura colagenului şi determină hidratarea suplimentară.
Se poate concluziona că umflarea în mediu acid sau alcalin este
o consecinţă a factorilor osmotic şi electrostatic care
acţionează în acelaşi sens.
 UMFLAREA LIOTROPĂ
Sărurile liotrope sunt electroliţi care ionizează în apă şi sunt adsorbite polar de colagen fără schimb
ionic.

La tratarea cu acizi, baze, săruri, are loc o perturbare a stabilităţii colagenului,

până la nivelul helixurilor, care se manifestă prin scăderea temperaturii de
contracţie, a solubilităţii şi prin creşterea cantităţii de apă adsorbită.

Fiecare tip de reactiv produce efectele sale liotrope caracteristice.

Umflarea osmotică şi cea liotropă pot avea loc simultan.

În contrast cu umflarea osmotică prin care fibrele colagenice pot deveni

translucide, la umflarea liotropă nu se constată nici o alterare a aspectului
opac natural al acestora.

Gradul de umflare liotropă este mult mai mic în comparaţie

cu umflarea osmotică, iar modificările dimensiunilor fibrelor
de colagen sunt neînsemnate.
 Alcoolii alifatici provoacă întotdeauna o reducere a gradului de umflare
în raport cu valoarea determinată în apă pură.
Umflare, %

Gradul de umflare a membranei de colagen

scade cu creșterea concentraţia în alcooli
în ordinea:
CH3OH > C2H5OH > C3H7OH

NA

Variaţia umflării membranei de colagen reticulat în funcţie

de concentraţia în alcool exprimată în fracţii molare N A ,
la 200 C şi pH  6.

1. CH3OH; 2. C2H5OH; 3. C3H7OH.

 Umflarea liotropă poate fi evidenţiată şi în soluţiile de săruri unde
forţele osmotice ale lui Donnan sunt neglijabile.

Aceasta poate fi observată la orice pH, numai dacă concentraţia sării

este suficient de mare (adică >0,5M), iar în intervalul neutru al pH-ului
(6–8) chiar la o concentraţie a sării relativ mică.

O caracteristică generală este că gradul de umflare întâi creşte şi

apoi descreşte la creşterea concentraţiei sării.

Ordinea anionilor şi a cationilor privind comportarea la umflare sau dezumflare este:

F  Cl  NO3¯  Br  SCN

K+ Na+  Cs+  Li+

La adsorbţia ionilor de acelaşi semn se stabileşte o ordine de

„tărie” a adsorbţiei numită serie liotropă.
 În soluţiile de colagen, în prezenţa sărurilor neutre provenite de la acizii tari
sau bazele tari, la pHi , vâscozitatea şi gradul de umflare al colagenului sunt
dependente de natura şi de concentraţia sării .

Sărurile neutre au acţiune puternic liotropă la pHi al colagenului.

Serii liotrope

Acţiunea de dizolvare salină cea mai puternică o au cationii

în ordinea inversă a seriei liotrope de salifiere.

Anioni : SO42 > CH3COO > tartrat > Cl > NO3 > I > CSN

Cationi : Li+ > Na+ > K+ > Mg2+ > Ca2+ > Sr2+ > Ba2+ > Al3+ > H+
 Seriile liotrope ale adsorbţiei cationilor şi anionilor sunt următoarele:

Th4+ > Al3+ > H+ > Na+ > K+ > Li+ > Ba2+ > Mg2+ > Sr2+ > Ca2+ > Rb2+
Citrat > tartrat < S2O32 > SO42 > CH3COO > Cl < NO3 < Br < I < CNS
Efectul liotrop al sărurilor neutre se manifestă mai ales la concentraţii ridicate
şi se datorează, în principal, moleculelor de sare şi nu ionilor.

Sărurile neutre, cu potenţial coordinativ, pot produce ruperea

legăturilor de hidrogen astfel:
   
RCH RCH RCH RCH
   
CO - - - - - - NH + CaCl2  OC - - - - - - CaCl2 + NH
   
NH - - - - - OC NH CO
   
RCH RCH RCH RCH
   
Colagen Fragment de colagen Colagen
solubilizat
 Ureea fiind un compus polar, rupe legăturile de hidrogen intracatenare,
de la grupele peptidice, ca urmare a interpunerii sale.

Efectul liotrop al acidului acetic, ca şi al altor acizi carboxilici,

este de natură moleculară, ca şi în cazul ureei.

Acidul acetic, ca şi alţi acizi carboxilici manifestă o tendinţă pronunţată de asociere.

Formarea de dimeri ai acizilor carboxilici este cauzată de legăturile puternice de hidrogen formate
de atomul de oxigen al grupării carboxilice.

Dimerul acidului acetic

are forma următoare :
O H O
H3C C C CH3
O H O

Ca şi în cazul altor agenţi liotropi, principala acţiune de degradare a colagenului la

tratarea cu acid acetic se referă la ruperea legăturilor de hidrogen.
 Tendinţa puternică a moleculelor de acid acetic de a forma legături de
hidrogen cu colagenul se reprezentă prin:

R R
N N
C C C CH
H H
O H O HO CO CH3
+ 2CH3 COOH CH3
H R H R
HOCO
O O
N C N C
C C
H H

Ruperea legăturilor de hidrogen de la grupările CO şi NH şi interpunerea

acidului acetic produc dezorganizarea structurii şi solubilizarea colagenului.

!!!
Interacţiunea fenolului cu colagenul constă în formarea de legături de hidrogen între
moleculele de fenol şi colagen la grupele sale peptidice, producându-se în acelaşi timp
dezorganizarea catenelor polipeptidice şi solubilizarea parţială a colagenului.

După A. Küntzel asocierea

După Pauling structurile
fenolului care dau atomului de fenolului cu colagenul are
oxigen o sarcină pozitivă sunt: loc conform formulei :
R
+
O H O H O H R
_ _ C CH
CH _ NH
O +
_ _
+
_
+ OH
_ +

Efectul liotrop a agenţilor tensioactivi asupra colagenului este puternic

dependent de pH.
Solvenţii organici pot avea acţiune de stabilizare sau de denaturare şi în unele
cazuri de degradare asupra colagenului.
 Când o soluţie de colagen este Tranziţia Tranziţia poate fi urmărită prin
încălzită, se produce tranziţia netă diferite metode cum ar fi rotaţia
a moleculelor din forma de helix helix-ghem optică şi vâscozitatea
în cea de ghem.
Poate fi asemănată cu “topirea” La răcirea soluţiei sub
structurii triplului helix temperatura de tranziţie,
proprietăţile caracteristice
ale colagenlui sunt mai
mult sau mai puţin
Curbele de echilibru recâştigate, cu o viteză
la tranziţia helix- care depinde de condiţiile
ghem depind de de lucru.
concentraţie. Se reformează numai
3
T 1/2, sec

parţial lungimea moleculei

de colagen, rămânâd mai
mică decât cea iniţială.

Cinetica de ansamblu a reacţiei intramoleculare prezintă

3 etape care explică dependenţa de temperatură în
concordanţă cu natura produşilor formaţi:
1 2 nucleaţia, creşterea şi stabilizarea.

Reformarea helixului este dominată de nucleaţie la

temperaturi mici şi de creştere la temperaturi mai mari.
 Dependenţa de temparatură a procesului, la concentraţii mici, urmează
relaţia propusă de Flory şi Weaver, conform teoriei nucleaţiei.

Cinetica de reacţie a formării helixurilor din soluţii de concentraţii mici este de ordinul I,
iar în cazul concentraţiilor mai mari este aproximativ de ordinul II

Procesul de nucleaţie, la concentraţie ridicată, ar trebui să prezinte o cinetică de ordinul

III. Piez şi Shermar au stabilit ordinul de reacţie în acest caz la valoarea de 2,8.

Peptidele mici au proprietatea, ()

neobservată la lanţurile lungi, de a forma
helixul într-o manieră complet
reversibilă.

Curbele de echilibru la
tranziţia helix-ghem sunt
dependente de
concentraţie. Curbele de echilibru pentru tranziţia helix-ghem a
lui 1CB2, în funcţie de concentraţia soluţiilor:
a = 1,44 mM; b = 0,80 mM; c = 0,43 mM.
 Denaturarea colagenului

Definiţie:
Sub influenţa temperaturii, a pH-ului, a unor substanţe, colagenul suferă
schimbări intra şi intermoleculare, care au drept consecinţă modificarea
structurii sale, de la o stare ordonată la una dezordonată,
fără a se produce ruperea legăturilor covalente.

Termenul de “denaturare a colagenului” Are loc ruperea legăturilor de hidrogen, a

include schimbarea proprietăţilor fizice şi forţelor van der Waals şi dezordonarea lanţurilor
în mai mică măsură a celor chimice, polipeptidice ale moleculelor de colagen, care
expresie a modificărilor conformaţionale trec din forma de bastonaş rigid, în
ale lanţurilor polipeptidice. forma de ghem.

Fiecare moleculă este parţial cristalină şi parţial amorfă.

Regiunile ordonate în formă de spirală Trecerea de la forma cristalină la cea

sunt considerate cristaline, iar cele amorfă implică ruperea legăturilor de
dezordonate sunt amorfe. hidrogen intracatenare şi intercatenare.
 La denaturarea termică, cu creşterea temperaturii peste 35°C,
energia termică devine mai insemnată decât energia legăturilor necovalente din
molecula de colagen nativ.

La încălzire, legăturile de hidrogen din structura moleculelor de colagen se rup şi

se reformează cu moleculele de apă din sistem.

Dacă denaturarea colagenului se face în mediu apos, întotdeauna este implicat şi pHul.

pH-ul izoelectric al
colagenului nu
!!!
O dată cu îndepărtarea de pHi spre valori mai influenţează procesul
acide sau mai alcaline, denaturarea colagenului de denaturare.
începe să se manifeste şi creşte cu mărirea
acidităţii sau a alcalinităţii.
Când cauzele care au
Denaturarea sub influenţa pH-ului se datoreşte tuturor produs denaturarea
factorilor care provoacă umflarea osmotică şi liotropă a colagenului încetează,
colagenului. există tendinţa de
reordonare a structurii
Denaturarea colagenului poate fi provocată de acizi, baze, sale, prin refacerea
săruri liotrope, care modifică gradul de ionizare a colagenului, legăturilor care s-au
solubilitatea sa, proprietăţile hidrodinamice şi comportarea rupt în timpul procesului
electroforetică. de denaturare.
 i t ui r ea
co nst Moleculele de colagen din soluţie, în anumite condiţii favorabile,
Re e n u lu i au tendinţa de a se reagrega pentru a reconstitui fibrilele de tip
colag nativ, deci de a se rearanja în forma cea mai stabilă.

În urma tratamentelor de solubilizare, trec în soluţie nu numai molecule de colagen întregi,

ci şi fracţiuni, lanţuri polipeptidice individuale.
Într-o primă fază, se vor reforma moleculele de colagen din lanţurile polipeptidice
individuale şi în continuare, se va realiza reagregarea moleculelor (structura cuaternară)
pentru a forma fibrilele de tip nativ, cu striaţiile caracteristice.

Reconstituirea colagenului are două faze distincte:

renaturarea şi agregarea.
Renaturarea şi
reagregarea pot fi Dacă în cursul renaturării, lanţurile polipeptidice nu-şi mai pot
relua poziţiile spaţiale corecte, unul faţă de celălalt, se
provocate de o serie
produce o largă agregare moleculară, care conţine regiuni cu
de agenţi fizici sau
structură de triplu helix, în alternanţă cu structuri nehelicoidale.
chimici (temperatura,
pH-ul, tăria ionică,
agenţi de reticulare, Formarea fibrilelor, prin recostituirea lor din soluţia de
substanţe tanante, colagen, este asemănătoare cu procesul de
săruri neutre etc.). recristalizare a sărurilor greu solubile
Moleculele de tropocolagen pot fi agregate în 6 tipuri principale de
structuri reconstituite, caracterizate, la microscopul electronic, prin
lungimea perioadei de repetare a benzilor transversale:

- segmente cu perioada alungită (S.L.S.) de 2800 Å;

- fibrile cu perioada alungită (F.L.S.) de 2800 Å;

- fibrile de tip nativ cu perioada de 650 - 700 Å;

- fibrile cu periodicitatea de 650 - 700 Å;

- fibrile cu periodicitate de 220 Å;

- fibrile cu striaţii neregulate.

La 25°C echilibrul este favorabil formării moleculelor native.

La aceeaşi valoare a temperaturii, forma, grosimea şi alte

caracteristici ale fibrilelor precipitate depind de pH, tărie ionică,
concentraţia soluţiei şi durata de formare.
Diagrama reprecipitării colagenului din soluţie, în variate forme de agregare fibrilară
a. fibrile de tip nativ 640Å;
b. fibrile cu striaţii de 210Å;
c. fibrile cu perioadă alungită (F.L.S.);
d. segmente cu perioadă alungită (S.L.S.).

COLAGEN FLS
COLAGEN TIP NATIV

Periodicitate 2800 Ao
1 %NaCl 0,05 % 0,1% 1 glicoproteinã
o HAc acidã+ dializã
Perodicitate A
640 0,05 %HAc

0,05 %HAc

2 %NaCl
o
Periodicitate 210 A _ , %ATP
5 %NaCl 0,05 % 0 05
_ Tripsinã
HAc _
Ultrasunete
0,05 %HAc

Fãrã periodicitate

COLAGEN SLS