Sunteți pe pagina 1din 4

SISTEME ENZIMATICE DE APARARE ANTI-STRES OXIDATIV

Enzimele cheie implicate in detoxifierea speciilor reactive de oxigen la toate organismele aerobe sunt: superoxid dismutaza (EC1.15.1.1), glutation peroxidaza (EC 1.11.1.9), peroxidaza (EC1.11.1.7), catalaza (EC 1.11.1.6), glutation S-tranferaza, toate fiind abundente in tesuturile pestilor (DiGiulio et al., 1989). La aceste enzime de adauga sistemul auxiliar care furnizeaza echivalentii de reducere necesari activitatii detoxifiante (glutation reductaza EC 1.6.4.2). Deoarece majoritatea activitatilor acestor enzime sunt induse de speciile reactive de oxigen, ele reprezinta indicatori ai stresului oxidativ.

CATALAZA
Majoritatea celulelor aerobe contin catalaza. La animale este prezenta in aproape toate organele, fiind concentrata in special in ficat. In celula, catalaza se gaseste in peroxizomi si, in cantitati mult mai mici, in mitocondrie si reticulul endoplasmatic. De aceea, H2O2 generat in vivo nu poate fi substrat la catalazei decat daca acesta difuzeaza in peroxizomi. Enzima este alcatuita din 4 subunitati proteice de cate 60 Kda, fiecare din ele continand o grupare hem lecata la centrul catalitic activ si o molecula de NADPH. Hemul este localizat intr-o cavitate nepolara care comunica cu suprafata prin canale inguste, limitandu-se astfel accesul moleculelor mai mari decat H2O2. Reactia in care este implicata catalaza este una de disproportionare, o molecula de H2O2 fiind redusa in timp ce o alta este oxidata.

Catalaza Fe (III) + H2O2 Compus I + + O2 2 H2O2

H2O2

Compus I + H2O Catalaza Fe (III) + H2O

2H2O + O2

Structura exacta a compusului I nu este cunoscuta cu exactitate. Catalaza este una din cele mai eficiente enzime cunoscute. Este atat de eficienta incat nu poate fi saturata de nici o concentratie de H2O2, oricat de mare ar fi aceasta. Enzima prezinta si activitate peroxidazica, limitarea acesteia datorandu-se accesibilitatii scazute a substratelor la hem. ROOH + AH2 H2O + ROH +A

Donorii de hidrogen pot fi metanolul, etanolul, acidul formic, fenolul. Chiar daca aceasta enzima nu este esentiala pentru anumite tipuri de celule in conditii normale, ea joaca un rol important in raspunsul adaptativ al celulelor la stresul oxidativ.

GLUTATION PEROXIDAZA
Grupul de enzime cuprins sub aceasta denumire este implicat in catalizarea reactiei de reducere a hidroperoxidului de hidrogen cuplata cu oxidarea glutationului:

H2O2

GSH

GSSG + 2 H2O

Glutation peroxidazele (GPx) sunt larg raspandite in tesuturile animale, GSH fiind donorul de hidrogen specific. Pot servi drept substrate pentru aceste enzime si alti peroxizi organici: ai purinelor, ai acizilor grasi polinesaturati, ai steroizilor. Gruparea peroxid a acestor substrate este redusa la gruparea hidroxil:

R-OOH

GSH

R-OH +GSSG

Enzimele sunt alcatuite din patru subunitati proteice, fiecare avand un atom de Se sub forma selenocisteinei. Acesta este motivul pentru care prezenta Se in dieta tuturor animalelor este impusa. Actiunea glutation peroxidazei si catalazei este concertata, glutation peroxidaza actionand la concentratii mici de H2O2 si la concentratii fiziologice de GSH, in timp ce catalaza actioneaza la concentratii crescute de H2O2. In timp ce catalaza se gaseste mai ales in peroxizomi, glutation peroxidaza este localizata in citosol si matrixul mitocondrial (cca 10% din GPx total). In organismele aerobe, rolul glutation peroxidazei in reducerea H2O2 poate fi considerat foarte mic comparativ cu eficienta catalazei. Dar produsii peroxidati ai lipidelor rezultati in urma atacului radicalilor liberi asupra lipidelor membranare pot provoca distrugeri ale membranei si chiar la nivelul DNA. Familia glutation peroxidazelor este alcatuita din mai multi membri. Un membru al familiei este fosfolipid hidroperoxid glutation peroxidaza (PHGPx), enzima ce foloseste drept substrat resturi ale acizilor grasi peroxidatece intra in constitutia unor structuri membranare. In intestin, un alt membru al acestei familii, GPx-GI metabolizeaza peroxizii lipidici din hrana, dar si pe cei formati in urma peroxidarii lipidelor din intestin. Reducerea hidroperoxizilor dependenta de GSH este considerata un mecanism major al apararii organismelor aerobe impotriva stresului oxidativ. Faptul ca mai multe proteine neinrudite genetic capabile sa reduca H2O2 si/sau lipidele hidroperoxidate exista in organismele aerobe prin intermediul GSH, atesta importanta fiziologica a activitatii lor. Prezenta acestor acestor proteine apartinand unor familii de gene diferite pare sa fi conferit un avantaj in selectia organismelor aerobe in cursul evolutiei.

GLUTATION S-TRANSFERAZA
Glutation S-transferazele (GST) reprezinta un grup mare de enzime intalnit la organisme incapand cu procariote si pana la mamifere. GST prezinta o functie esentiala in procesul de detoxificare prin indepartarea compusilor xenobiotici si joaca un rol important in protectia impotriva stresului oxidativ, cancer si alte maladii degenerative, inclusiv maladii asociate imbatranirii. GST a fost asociat cu un numar mare de compusi, inclusiv steroizi si carcinogeni, actionand ca o proteina reglatoare. Reactia catalizata de GST presupune atacul nucleofil al al glutationului redus (GSH) asupra substratului electrofil.

GS + R-X

GS-R + X

Rolul protectiv in celula deriva din faptul ca aceste conjugate cu glutationul sunt mult mai solubile decat compusii din care provin, acestea putand fi mult mai usor excretate din celula. In anumite organisme, procariote, de exemplu, enzimele din
2

superfamilia GST servesc producerii mai multor compusi de reactie asociati cu biodegradarea poluantilor persistenti ai mediului (de exemplu, compusi aromatici halogenati). Au fost determinate peste 400 de secvente GST diferite, incadrate in cca 25 de clase diferite. Toate structurile GST cunoscute prezinta 2 domenii: un domeniu N-terminal asociat cu tioredoxina si un domeniu C-terminal ce contine 4 secvente helicale diferite. Domeniul N-terminal contine si situsul de legare al GSH, in timp ce domeniul C-terminal asigura elementele structurale primare asociate cu specificitatea celui de al doilea substrat. Studii numeroase ce investigau peroxidarea lipidelor au examinat activitatea glutation S-transferazica asupra unor substrate de tipul hidroperoxidului de cumen sau de t-butil. Unele substrate fiziologic importante precum hidroperoxizii fosfolipidelor, au fost, de asemenea folosite pentru a masura activitatea anumitor GST-aze.

GLUTATION REDUCTAZA
Toate enzimele prezentate mai sus utilizau GSH si duceau la producerea de GSSG. Raportul dintre glutationul redus (GSH) si cel oxidat (GSSG) trebuie mentinut constant in celule. La acest lucru contribuie enzima glutation reductaza care catalizeaza reducerea formei disulfurice a glutationului, necesitand NADPH generat, in special, din suntul pentozofosfatilor:

GSSG + NADPH +

H+

2GSH + NADP+

Glutation reducatza este un dimer cu MMr=105KDa, fiecare din cele doua subunitati proteice avand cate o grupare FAD. Desi initial a fost propus un mecanism ping-pong pentru acesta enzima, inhibitia competitiva a NADP+ si proprietatile reactiei reversibile au condus la formularea unui mecanism branched in care enzima poate functiona atat dupa un mecanism ping-pong cat si dupa modelul secvential, in functie de concentratia de GSSG. Prin studii de cristalografie cu raze X s-a demonstrat existenta e doua situsuri diferite de legare pentru GSSG si NADPH. Aparent NADPH reduce FAD care transfera doi electroni la doi atomi de S dintr-o punte disulfurica formata intre doua resturi de cisteina din centru catalitic activ al enzimei. Cele doua grupari SH formate astfel interactioneaza cu GSSG pe care il reduce si reface puntea disulfurica initiala a enzimei.

LACTAT DEHIDROGENAZA
L-lactat: NAD+ oxidoreductaza (LDH) este implicata in fermentatiile lactice, catalizand urmatoarea reactie:

CH3-CHOH-COOH COOH + NADH +H+

NAD+

CH 3-CO-

Lactat dehidrogenaza este o enzima intalnita in aproximativ toate tesuturile pestilor, ficatul si muschii scheletici posedand cele mai mari activitati, muschiul cardiac avand mai putina enzima. LDH este prezenta si in eritrocite, rinichi, branhii, pancreas, creier, etc. In cazul lactat dehidrogeneazei s-a pus in evidenta existenta a 5 izoforme, proteine cu structura tetramera ce sunt constituite din legarea catenelor polipeptidice de tip M si H, codificate de gene distincte. Toate izoenzimele au aproximativ o MMr=130KDa, diferentele de migrare electroforetica fiind datorate structurii diferite rezultate prin combinarea celor doua tipuri de catene polipeptidice. Astfel, LDH1 are 4 catene de tip H (H4), LDH2 are 3 catene H si una M (H3M), LDH3 este un heterotetramer H2M2, LDH4 este constituit din 3 catene de tip M si una dip H (HM3), iar LDH5 este de tipul M4.
3

Izoenzime LDH LDH1, LDH2 LDH3 LDH4, LDH4

Tesuturi Muschi cardiac, eritrocite, celule glomerulare, renale, creier, cristalin Plaman, pancreas, splina, timus, glande suprarenale, tiroida, noduli limfatici, leucocite Muschi scheletic, ficat, celule tubulare renale, granulocite, tumori maligne.

SUPEROXID DISMUTAZA
Desi descoperita cu multi ani inainte in sangele bovinelor, ficatul cabalinelor sau creier, fiind considerata ca o forma de inmagazinare a cuprului, enzima a fost desemnata drept SOD in 1969 de catre Mc Cord si Fridovich. Exista doua tipuri de enzime, o Mn SOD prezenta in mitocondrie si o CuZnSOD ce se gaseste in citosol, lizozomi, peroxizomi, nucleu si spatiul intermembranar mitocondrial. FeSOD nu s-au identificat in tesuturile animale, ci doar la unele plante superioare, bacterii si alge. Activitatea superoxid dismutazei mitocondriale reprezinta pana la 60% din activiatea tisulara totala (Radi et al.). Concentratiile enzimei tind sa fie foarte mari datorita inaltei reactivitati radicalilor superoxid. Cu/Zn superoxid dismutazele sunt prezente in toate celulele eucariote. Ele sunt formate din doua subunitati proteice, fiecare dintre ele continand in centrul catalitic activ un ion de cupru si unul de zinc. Ionii de zinc participa la reactiile:

Enzima-Cu2+ + O2.Enzima Cu+ + O2.- + 2H+ 2 O2.- + 2H+

Enzima Cu+ + O2 Enzima-Cu2+ + H2O2

H2O2 + O2

MnSOD superoxid dismutazele sunt prezente atat la animale cat si la plante si la bacterii. In majoritatea tesuturilor animale ea este prezenta exclusiv in mitocondrie. In eritrocitele umane, care sunt lipsite de mitocondrii, nu se gaseste deloc Mn SOD, in timp ce in ficat 10% din activitatea SOD este datorata acestei enzime. Mn SOD la organismele superioare din patru subunitati proteice. Eliminarea ionului de mangan din centrul catalitic activ al enximei ar duce la pierderea activitatii enximatice. SOD actioneaza nu numai prin eliminarea excesului de radical superoxid, ci poate indeparta si oxigenul singlet, deci, indirect, peroxidarea lipidica. SOD este o enzima inductibila, efectul inductiv al O2.- asupra sintezei acesteia fiind demonstrat la bacterii anaerobe si facultativ aerobe, dar si la mamifere. In ficatul de peste au fost identificate cel putin 5 izoforme ale superoxid dismutazei care se modifica frecvent in pesti in ariile poluate (Pedrajas et al. 1993). Activitatea superoxid dismutazica creste foarte rapid in eritrocitele de crap, cand pestii sunt expusi la 10mg/l paraquat in apa, maximul inregistrandu-se la 12h (Matkovics et al.), urmat de scaderea sub nivelul control dupa 48-96h. Scaderea activitatii dupa expunerea prelungita pot fi explicate prin inhibarea enzimei de catre produsii sai, H2O2 sau prin .OH (Bray et al., 1974).