VALIDAREA METODELOR DE ANALIZ

Validarea unei metode analitice, conform Farmacopeei Statelor Unite ale Americii 28, este procesul prin care se stabilete prin studii de laborator, dac acea metod ndeplinete condiiile pentru aplicaiile analitice pentru care a fost pus la punct. Validarea este aadar, o etap important n determinarea reproductibilitii i siguranei metodei, deoarece poate confirma dac metoda este potrivit pentru a fi utilizat pentru un anumit sistem.

n laboratoarele de analiz, validarea are la baz standarde, cum ar fi: Bunele practici de producie (Good Manufacturing Practices GMP) Bunele practici de laborator (Good Laboratory Practices - GLP) Bunele practici clinice (Good Clinical Practices - GCP) etc. Alte reguli pentru validare sunt stabilite de: Organizaia Internaional a Standardelor (ISO) n seriile 9000 i 17025 Normele Europene (EN 45001) Farmacopeea Statelor Unite ale Americii (United States Pharmacopoeia - USP) Agenia Alimentelor i Medicamentului (Food and Drug Administration - FDA) Agenia pentru Protecia Mediului (Environmental Protection Agency - EPA).
3

Este important de precizat c la ora actual nu exist un consens n ceea ce privete diferitele documente de reglementare internaional (ISO, ICH, Afnor, Sanco, FDA, ANM, Conferina de la Washington) pentru definirea criteriilor care trebuie testate n faza de validare. De exemplu criteriul de liniaritate este prezentat diferit de la un document la altul, n cazul n care acesta apare printre criterii. Acelai lucru se ntmpl pentru exactitatea mediei care poate fi confundat cu exactitatea n unele documente. Ca o parantez, n limba romn confuzia este foarte uoar, datorit faptului c pentru termenii din limba englez i francez (trueness/justesse i accuracy/exactitude) exist un singur cuvnt romnesc - exactitate. De aceea s-a propus pentru trueness echivalentul exactitatea mediei pentru c se refer la exactitatea dintre media mai multor msurtori i o valoare convenional adevrat. 4

Criterii de validare dup Farmacopeea European

Determinarea Determinarea principiului activ impuritilor sau sau a produilor produilor de finii degradare Da Nu Nu Nu Da Da Da Da Da Nu Nu Da Da Da Da Da

Criterii Fidelitatea (precizia) Exactitatea (acurateea) Limita de detecie Limita de cuantificare Specificitatea Intervalul de validitate Liniaritatea Robusteea

Teste pentru limitele de impuriti Nu Da Da Nu Da Da Nu Da

Teste farmacotehnice Da Da Da Da Da Da Da Da
5

Criterii de validare dup Comunitatea Economic European (CEE)

METODA Identificarea/ detecia Determinarea coninutului de impuriti CRITERII DE VALIDARE specificitatea specificitatea limita de detecie limita de cuantificare specificitatea fidelitatea repetabilitatea reproductibilitatea exactitatea liniaritatea intervalul de liniaritate sensibilitatea
6

Determinarea coninutului (concentraiei) sau a activitii substanei active

Normele IUPAC menioneaz c validarea poate fi:

Validare

ntr-un singur laborator atunci cnd se verific viabilitatea metodei naintea unui studiu n colaborare (ntre mai multe laboratoare) i asigur faptul c metoda pus la punct este utilizat corect.

verificate de multiple laboratoare, n colaborare.

Validare complet caracteristicile metodei au fost

SPECIFICITATEA / SELECTIVITATEA
n limbajul comun, termenii de specificitate i selectivitate sunt deseori interschimbabili. O metod este specific dac este adecvat pentru un singur analit, n timp ce o metod este selectiv dac poate fi utilizat pentru mai muli analii care pot fi ns difereniai sau, cu alte cuvinte, reprezint capacitatea unei metode de a cuantifica cu acuratee i specific analitul sau analiii n prezena altor compui. Selectivitatea implic capacitatea de a separa analitul de produii de degradare, metabolii (n cazul medicamentelor) i ali compui prezeni n prob. n cazul medicamentelor, USP 28, definete specificitatea ca fiind capacitatea de a analiza analitul n prezena altor componeni cum ar fi impuriti, produi de 8 degradare i matricea.

IUPAC i AOAC (Asociaia Stiinific Dedicat Excelenei n Metode Analitice) utilizeaz termenul de selectivitate mai mult dect cel de specificitate pentru metodele care sunt complet selective, pe cnd USP, ICH (Conferina Internaional De Armonizare A Cerinelor Tehnice Pentru nregistrarea Produselor Farmaceutice de Uz Uman) i FDA folosesc termenul specificitate.

n tehnicile cromatografice, selectivitatea metodei poate fi dovedit printr-o bun separare ntre analit i alte componente (cum ar fi excipieni, impuriti, produi de degradare i metaboliii). Rezoluia de separare a analitului trebuie s fie de 1,5-2 ori mai mare dect a celorlalte componente. Pentru a mpiedica coeluia altor substane, trebuie s fie cercetat puritatea peak-ului analitului. De exemplu, pentru a determina puritatea peakului se apeleaz la spectrul UV-VIS .

10

Spectrul UV-VIS al analitului poate fi nregistrat la mijlocul peak-ului sau pe pantele peak-ului.

11

Pentru punerea la punct a unei metode de analiz ntr-un laborator de analiz al medicamentului, selectivitatea poate fi cercetat foarte simplu prin injectarea sau spotarea de etaloane sau martori (blank). Sistemul cromatografic studiat va trebui s realizeze separarea analitului, iar puritatea i identificarea peak-ului analitului se va realiza prin comparare cu peak-ul etalonului.

12

Peak-ul cromatografic poate fi considerat pur dac factorul de separare calculat la lungimi de und diferite este constant. Compararea semnalelor la diferite lungimi de und poate fi utilizat pentru demonstrarea puritii peak-urilor. S-a propus utilizarea limii peak-ului msurat la mijlocul nlimii, precum i simetria peak-ului. Chiar dac peak-urile analitului i a etalonului sunt identice, proba poate conine o impuritate cu spectru similar analitului. Cele mai selective metode de analiz aplicate la probe biologice sunt cele combinate: LCUV; LCMS; GCMS; 13 GCFTIR.

LINIARITATEA
Liniaritatea reprezint capacitatea metodei de a produce rezultate direct sau indirect proporionale cu concentraia analitului din prob pe un anumit interval de concentraii. De obicei, liniaritatea este reprezentat printr-o curb de regresie liniar a valorii msurate ca o funcie a creterii concentraiei analitului Pe de alt parte, liniaritatea rezultatelor unei proceduri de analiz reprezint capacitatea acesteia de a obine rezultate direct proporionale cu concentraia analitului din prob. Criteriul de liniaritate se aplic pentru rezultatele obinute, adic pentru relaia dintre concentraia calculat experimental pe baza funciei de rspuns i cea introdus (calculat teoretic). 14

Liniaritatea funciei de rspuns poate fi evaluat vizual de pe diagrama ce reprezint modificarea semnalului funcie de coninutul sau concentraia analitului. Dac exist o relaie liniar, testul trebuie s fie evaluat prin metode statistice, de exemplu prin calculul dreptei de regresie folosind metoda celor mai mici ptrate. n anumite cazuri, pentru a obine liniaritatea ntre rspuns i concentraia probei, datele experimentale trebuie supuse unei transformri matematice nainte de analiza lor prin regresie.
15

n urma analizei de regresie se vor calcula parametri cum sunt: coeficientul de corelaie (r), coeficientul de regresie (r2), interceptul cu ordonata, panta i deviaia standard a dreptei de regresie, suma rezidual a ptratelor etc. De asemenea, se va reprezenta grafic dependena semnalului de concentraia analitului din prob. Intervalul de linearitate ce trebuie cercetat depinde de scopul metodei analitice i se consider n general 20% fa de concentraia int, dar poate ajunge pn la 150% din concentraia int.

16

Pentru teste de puritate, intervalul n care metoda trebuie s fie liniar cuprinde limita de cuantificare i 30% peste concentraia int. Testele de stabilitate au un interval de 02% fa de concentraia int, iar cele de dizolvare 20% fa de concentraia int Pentru evaluarea liniaritii sunt necesar minim 5 valori ale concentraiei pentru cel puin trei serii de soluii de substane standard de diferite concentraii (de regul concentraia de interes 20 pn la 50% pentru valorile extreme de concentraie). Pentru metodele TLC, curba de calibrare trebuie obinut pentru fiecare plac ce va conine etaloanele i probele necunoscute.
17

Metoda statistic cea mai utilizat pentru a gsi cea mai bun corelare ntre curba de calibrare i date precum i tipul de curb de calibrare care ofer cea mai bun corelare, este regresia liniar sau metoda celor mai mici ptrate. Pentru a compara dou curbe de calibrare este necesar msurarea celei mai bune corelri a etalonului la linie, n care scop se utilizeaz parametrii coeficientul de corelaie i eroarea standard a regresiei. Coeficientul de corelaie, este o msur a asocierii liniare dintre dou variabile, cu alte cuvinte a gradului n care reprezentarea bivariat sub forma unei diagrame de mprtiere se apropie de o dreapt.

18

Coeficientul de corelaie ia valori intre -1 i +1 inclusiv, cu semnificaia de asociere pozitiv / negativ dup semnul coeficientului i de lipsa de asociere pentru rxy = 0. O valoare de +1 indic o relaie liniar perfect ntre semnalul analitic i concentraie cu semnalul n cretere, iar o valoare -1 indic o relaie liniar perfect cu semnalul analitic n scdere. Coeficientul de corelaie nu indic liniaritatea dac nu are o valoare ce depete r = 0,999. Pentru valori mai mici trebuie calculai i ali parametri, ca de exemplu testul ANOVA pentru regresie. Cea mai comun metod de calibrare const n prepararea unor soluii standard de concentraie cunoscut, ce acoper domeniul de concentraie n care se afl proba de analizat. 19

EXACTITATEA MEDIEI (BIAS = EROARE SISTEMATIC) Exactitatea mediei unei proceduri analitice exprim ngustimea acordului ntre valoarea medie obinut dintr-o serie de msurtori i o valoare care este acceptat fie ca valoare convenional adevrat, fie ca valoarea acceptat (de exemplu, standard internaional, standard al farmacopeei).

20

PRECIZIA Precizia exprim ngustimea acordului (gradul de dispersie, coeficientul de variaie) dintre o serie de msurtori care provine din mai multe serii ale aceleiai probe omogene (rezultate independente) n condiii identice de lucru. Precizia ofer date asupra erorilor ntmpltoare i nu are nici o legtur cu valoarea adevrat. Deoarece toate msurtorile conin erori ntmpltoare, rezultatul unei singure msurtori nu poate fi acceptat ca valoare adevrat. Pentru a prezice domeniul n care se gsete valoarea adevrat este necesar o estimare a acestei erori, acest lucru fcndu-se prin repetarea msurtorii de mai multe ori. Din acest proces se obin doi parametri importani i anume valoarea medie i variabilitatea msurtorilor.
21

Cea mai utilizat modalitate de msur a valorii medii este media aritmetic, calculat utiliznd formula:
x=
_

x
i =1

(suma valorilor msurtorilor raportat la numrul total de msurtori). Deoarece erorile ntmpltoare sunt distribuite normal, modul comun de msur a variabilitii (preciziei) este deviaia (abaterea) standard (). Valoarea deviaiei (abaterii) standard se calculeaz utiliznd relaia:
=
x
i =1 n

x n
_

22

Dac setul de date este limitat, valoarea medie este adesea aproximat ca valoare adevrat, fiind necesar estimarea abaterii standard. n acest caz, valoarea abaterii standard, notat cu SD, se calculeaz cu formula:
SD = x
i =1 n

x n 1
_ i

Odat ce numrul de valori din setul de date crete, valoarea SD se va apropia de valoarea .
23

Un alt termen comun utilizat pentru a msura variabilitatea este coeficientul de variaie (CV) sau deviaia standard relativ (RSD), care se exprim ca procent, conform formulei de mai jos:
RSD = SD
_

sau

% RSD =

SD
_

100

Criteriul acceptat pentru valoarea abaterii standard relative (RSD) n studiul preciziei metodei este RSD 2% (n 6). Precizia este important n mod particular atunci cnd n analiz este implicat i o etap de pregtire a probei.
24

Variabilitatea poate afecta exactitatea. Se cunoate faptul c reproductibilitatea unei analize descrete disproporional cu scderea concentraiei. Incertitudinea n analiza urmelor crete exponenial comparativ cu componenii majori i minori. De la acest fapt pot aprea abateri n situaiile n care exist etape de pregtire a probei. Pe de alt parte, modul de pregtire a probei rmne un proces riguros care influeneaz majoritatea variabilitilor.

25

Precizia caracterizeaz gradul de concordan a rezultatelor analitice ntre ele, la aplicarea repetat a metodei de analiz pe aceeai prob omogen sau eantion pregtit pentru analiz n condiii identice. Precizia arat ct de aproape se afl valorile msurate una fa de alta pentru un numr de msurtori n aceleai condiii. Normele elaborate de ICH (International Conference of Harmonization) definesc precizia ca fiind format din 3 componente: repetabilitatea, precizia intermediar i reproductibilitatea.
26

Repetabilitatea: rezultatele independente sunt obinute folosind aceeai procedur, pe probe identice, n acelai laborator, de ctre acelai operator, utiliznd acelai echipament i ntr-un interval scurt de timp. Repetabilitatea analizei (precizia intra prob) se studiaz utiliznd un minim de 9 determinri acoperind domeniul specific de concentraie (de exemplu 3 determinri la 3 valori ale concentraiei), sau un minim de 6 determinri la o valoare de 100% din concentraia soluiei ce urmeaz a fi testate.
27

Precizia intermediar: rezultatele independente sunt obinute folosind aceeai procedur, pe probe identice, n acelai laborator, de ctre diveri operatori, folosind echipamente diferite i ntr-un interval de timp dat. Reproductibilitatea: rezultatele independente sunt obinute folosind aceeai procedur, pe probe identice, n laboratoare diferite, de ctre diveri operatori i folosind echipamente diferite.

28

ACURATEEA (EXACTITATEA) Normele elaborate definesc acurateea (exactitatea) ca o caracteristic a apropierii rezultatelor analitice de valoarea adevrat. Exactitatea este o msur a deviaiei valorii medii gsit prin analiz, fa de valoarea adevrat. Acurateea se evalueaz prin aplicarea metodei de analiz studiat, la probe cu concentraii cunoscute. La efectuarea acestor analize probele se analizeaz fa de soluii etalon corespunztoare sau fa de martori, pentru a se nltura astfel efectul interferenelor.
29

O alt variant este constituit de compararea rezultatelor obinute prin metoda nou cu cele obinute printr-o metod deja cunoscut, despre care se tie c prezint acuratee. Pentru substane medicamentoase, testul de acuratee se efectueaz frecvent prin adugarea unei cantiti cunoscute din analit, prin cntrire sau prin msurarea unui volum de soluie (analit dizolvat n solvent), la soluia placebo, astfel nct s se obin concentraii cu valori n domeniul de detecie al analitului. Pentru forme farmaceutice cum sunt comprimatele, supozitoarele, cremele etc., acest fapt poate nsemna evaluarea potenialelor interaciuni ale substanei active cu excipienii n soluie.
30

Acest test evalueaz specificitatea metodei n prezena excipienilor n condiiile utilizate pentru analiza acelui compus activ. Se recomand ca studiile de exactitate pentru substane active sau diverse produse s se efectueze la nivele de 80%, 100% i 120% (un interval de 80 120% sau chiar 75 125% din concentraia real). Aceste soluii se utilizeaz pentru studiile de acuratee numite amestecuri sintetice sau preparate realizate n laborator. n cazul metodei de analiz prin adaos de standard, concentraia dispersat este n intervalul 50 150% din valoarea de interes i se realizeaz prin dispersarea concentraiilor cunoscute de analit n probe biologice (ser, plasm etc.).
31

La fiecare nivel de concentraie studiat se evalueaz probe replicate. Valoarea deviaiei standard relative (RSD) a rezultatelor obinute n urma calculului pe aceste probe replicate vor furniza variaia analizei sau precizia metodei. Valoarea medie reprezentat ca procent indic exactitatea metodei. Pentru evaluarea acurateii se calculeaz regsirea n procente, calcule ce se fac pe baza rezultatelor experimentale obinute. Intervalul n care se accept rezultatele testului de regsire este cuprins ntre 98 i 102% sau 95 i 32 105%.

Pentru probele biologice, regsirea poate fi 20% din concentraia real. n cazul determinrii unui analit aflat n urme, criteriile de acceptare sunt cuprinse ntre 80 120%, pentru mai mult de 100 ppb i 60 100%, sub 100 ppb 146. Pentru impuriti, criteriile acceptate sunt 20%, pentru o concentraie a impuritilor 0,5% i de 10% pentru o concentraie de impuriti 0,5% 146. Pentru a elimina posibilele erori ce pot apare pe parcursul determinrilor, se va calcula media valorilor obinute.
33

Valorile acceptate n studiul acurateii i preciziei pentru diferite concentraii de analit

Concentraia analitului(%)

uniti

regsirea medie

precizia (RSD %)

34

LIMITA DE DETECIE Limita de detecie (LD) reprezint cantitatea minim dintr-un anumit component ce se poate pune n eviden, fa de o prob martor, cu o anumit limit de ncredere (n general 1%). n metodele cromatografice estimarea LD se efectueaz pe baza evalurii raportului semnal/ zgomot de fond (linie de baz). Pentru estimarea limitei de detecie, n general se consider acceptabil un raport semnal / zgomot de 3/1 sau 2/1.

35

Estimarea LD se mai poate face i pe baza deviaiei standard i a pantei dreptei de regresie i se realizeaz utiliznd formula: 3
P unde reprezint deviaia standard a dreptei de regresie, iar P reprezint panta dreptei de regresie. Pentru estimarea deviaiei standard a dreptei de regresie se pot utiliza mai multe metode: pe baza deviaiei standard a probelor martor se msoar magnitudinea semnalului de fond pentru un numr mare de probe martor i se calculeaz deviaia standard a valorilor obinute; pe baza curbei de calibrare trebuie s se construiasc i s se studieze o curb de calibrare specific folosind probe ce conin analitul ntr-un domeniu de concentraie apropiat de limita de detecie.
36

LD =

LIMITA DE CUANTIFICARE (LQ) Limita de cuantificare (LQ) reprezint cantitatea minim dintr-un anumit component identificat ce se poate cuantifica cu certitudine.

Estimarea LQ pe baza evalurii raportului semnal /zgomot se realizeaz prin compararea semnalelor msurate pentru probe cu o concentraie sczut i cunoscut a analitului i probe martor urmat de stabilirea concentraiei minime la care analitul poate fi cuantificat cu fidelitate. Pentru estimarea limitei de cuantificare, n general se consider acceptabil un raport semnal / zgomot de 10/1.
37

Valoarea estimat trebuie s fie validat prin analize independente a unui numr adecvat de probe la care se cunoate faptul c sunt preparate astfel nct sa conin concentraii aproape de limita de cuantificare. n general, limita de cuantificare (LQ) se calculeaz prin multiplicarea cu 3 a limitei de detecie (LD): LQ = 3 x LD

38

ROBUSTEEA I STABILITATEA METODEI

Robusteea unei metode analitice se definete prin msurarea capacitii metodei de a rmne neafectat de variaii mici, deliberate, ale unor parametri. De aceea, parametrul ofer o indicaie a reabilitrii metodei pe parcursul utilizrii. Dac msurtorile sunt susceptibile de variaii n ceea ce privete condiiile analitice, aceste condiii trebuie s fie controlate sau trebuie luate anumite msuri de precauie. O consecin a robusteei este aceea c se stabilesc o serie de parametri de sistem pentru a ne asigura c validitatea procedeului analitic se menine ori de cte ori se utilizeaz. Stabilitatea unei metode analitice reprezint gradul de reproductibilitate a rezultatelor obinute pe aceeai prob, n condiii diferite, cum sunt: laboratoare diferite, analiti diferii, aparatur diferit, diferite loturi de reactivi, zile diferite de lucru etc. 39

n studiul robusteii metodelor cromatografice pe strat subire trebuie studiat influena pe care o manifest urmtorii factori: temperatura; umiditatea; metoda de aplicare a spoturilor; forma i mrimea spoturilor; compoziia fazei mobile; pH-ul; tipul de strat subire utilizat; volumul de prob aplicat; forma bacului; condiiile de uscare a placilor.
40

Pentru metodele HPLC trebuie studiat influena urmtorilor factori asupra robusteii metodei:
viteza de curgere a fazei mobile; temperatura n coloan; tipul de coloan cromatografic; volumul injectat; compoziia faze mobile; pH; lungimea de und de detecie.

41

Pentru studii pe lichide biologice, trebuie cercetat stabilitatea analitului n mediul biologic. Trebuie cercetat o eventual degradare n perioada dintre recoltarea probei i analiz. Instabilitatea analitului poate fi provocat de diveri factori, precum: interaciuni cu recipientul, aerul, descompunerea termic, evaporarea componenilor volatili sau fotoliz. Pentru a limita degradarea pot fi efectuate unele prelucrri ale probei precum rcirea sau chiar congelarea probei, pstrarea n loc ferit de lumin, adugarea unor ageni stabilizani, ajustarea pH-ului, derivatizarea, utilizarea inhibitorilor enzimatici.
42

Validarea metodelor analitice trebuie efectuat de ctre toate laboratoarele de analiz i urmrete testarea parametrilor principali ai validrii pentru a asigura acurateea, precizia, specificitatea, reproductibilitatea i robusteea metodei pentru intervalul de concentraie n care poate fi studiat analitul.

43