CRISTIANA FILIP

ENZTME$r COENZIME

't

Editurapf,ll

rAsr.2007

REFEnnrytt gTm,rT, rFrc r:

'

PROF.DR.COJOCARUDUMITRU - Uniuersitatea,Al.I.Cuza" Iasi PROF.DR. NASTASIA EORGHIIA_ U.M. F. " Gr. T.pop a" ragi -GH PORF.DR.MAGDA BADESCU - IJ.M.F."Gr.T.popa" Iagi

EDtruRAtrn
Soseaua Stefan celMarenr. 11 lasi-7OO49g f el. lfax:0232-212740 e-mail :editurapim@pimcopy.ro www.pimcopy.ro EDITURA ACREDITATA CNCSIS BUCURESTI 66/01.05.2006 Descrierea CIP a Bibliotecii Na{ionalea RomAniei FILIP, CRISTIANA .I Enzime9i coenzime / Filip Cristiana. - Iagi : pIM, 2007 Bibliogr. ISBN 978-973-7 16-798-9 577.15

Tehnoredactare computerizatd: Doina R6.$canu

Prefati Enzimele sunt componente esenliale ale vietii. Fdr5. ele reacliile chimice s-ar desfasura cu o viteza atAt de mici probabil, viala nu ar fi sesizabi15.. incAt, Mai mult, f5re capacitatea 1or de a discerne atat intre structuri diferite, cdt qi intre structuri asemdndtoare, in mod sigur hoasul ar fi regula. Surprinzdtor enzimele mai dau dovadd qi de capacitate de adaptare la modificirile ce intervin in mediul 1or, celular. De aceea putem, fard refinere, sI numim aceste molecule, primele molecule inteligente. Manualul de fali se doreqte a fi un material util in primul rdnd studentilor facultalii de medicinS. cAt qi celor ce studiazd biologia qi biochimia. Materialul pune accentul pe elementele de cinetic6 ertzirrraticS', a cSlor utilitate practici in proiectarea medicamentelor, este de necontestat. in p1us, cinetica enzimaticd sti la baza in{elegerii regiirii metabolismelor gi a coreldrii intermetabolice care fac posibild suslinerea vielii. Manualul face qi o prezentare a vitamineior care sunt componente coenzimatice esenlia1e. Rolul lor in activitatea enzimelor este evidenliat prin prezentared mecanismelor reacliilor la care acestea participd. Importanla cunoqterii metabolismului vitaminelor este justificatd de faptul cd deficitul lor duce la insta-larea unor afectiuni severe, caracteristice. Materialul se adreseaze deopotrivd specialigtilor ce lucreazd in laboratorul clinic, unde aproape toli parametrii biochimici sunt determinali prin metode enzimatice. Fere a avea pretenlia de a fi epuizat toate aspectele legate de tema abordati, autorul iqi exprimd speranla cd cei interesali vor gasi suficiente informalii gi rdspunsuri referitoare la acest capitol al biochimiei. in vederea exprimdrii pdrerilor critice qi a eventualeior completdri qi sugestii cu privire 1a conlinutul gi conceplia acestui la adresa de email: disponibil autorul este material, cfr1ip20OO@yahoo.com. Autor Cristiana Filip

CI'PRINS I. DNZIME INTRODUCERE I.1. DEFINITIE I.2. NOMENCI"{TURA I.2. 1. Oxidoreductaze I.2.2. Transleraze I.2.3. Hidrolaze I.2.4. Liaze l.2.5.Immeraze 1.2.6. Ligaze sau sintetaze I.3. STRUCTURA ENZIMELOR 1.3.1.lzoenzime I.4. SPECIFICITATE I,5. MECANISME DE CATALIZA I.6. CINETICA ENZIMATICA I.6. 1. Noliuni de cinetic+ generale I.6.2. Cineticd enzimaticd I.6.2.1. Cinetica de tip Michaelis-Menten I. 6.2.2. Ecualia Uneweaver-Burk I.6.2.3. Inhibilia activit6lii enzimelor 1.6.2.3.1. Inhibitia reversibild 1.6.2.3.7.7.Inhibitia competitivd I.6.2.3.1.2. Inhibifia necompetitivd 1.6.2 .3 .2 . Inhibitia ireversibil6 I.6.3. Medicamente - inhibitori competitivi L6.4. Cinetica de tip sinusoidal I.7. REGLAREA ACTIVITATN ENZIMELOR I.7. 1. Reglarea alostericd L7. 1. 1. Structura enzimelor alosterice I.7. 1.2. Funcfionarea enzimelor alosterice activitatea enzimelor alosterice I.7. 1.3. Factorii care regleazS.

9 11 13 74 t4 74 15 18 79 2T 26 26 29 40 42 42 44 46 48 52 53
J+

58

I.7.2. Reglarea cova.lenta I.7.3. Transformarea pro-enzimelor in enzime active I.7.4. Reglarea sintezei de enzime r.8. IMPORTANTA BTOMEDTCALA A ENZTMELOR I .8 . 1. Utilizarea enzimelor in stabilirea unui diagnostic I.8.2. Utilizarea enzimelor in scop terapeutic II. COENZIME VITAMINICE II. 1. VITAMINELE HIDROSOLUBILE [.1.1. Vitaminei Br $i coenzima tiaminpirofosfat II. 1.2. Vitamina Bz (riboflavina) 9i coenzimele flavinice II.1.3. Vitamina Ba (piridoxina) qi coenzimele derivate II.1.4. Biotina (vitamina H) qi rolul ei coenzimatic II.1.5. Vitamina pp (niacina) gi coenzimele nicotinamidice IL 1.6. Acidul pantotenic (vitamina Bx) gi coenzima A IL 1.7. Acidul derivate folic (acidul pteroifgtutamic) I qi coenzimele

60 60 oz
OJ

63 68 69 70 77 72 75 77 79 81 83 85 89 90 97 96 101 105 108

II.1.8 Vitamina Brz (cobalamina) qi rolul ei coenzimatic II. 1.9. Vitamina C (acidul ascorbic, factor antiscorbutic) II. 2. VITAMINE LIPOSOLUBILE II.2.1. Vitamina A II.2.2. Vitamina D IL2.3. Vitaminele E IL2.4. Vitaminele K qi rolul lor coenzimatic Bibliogralie

I. ENZIME

INTRODUCERE Existi doud condilii fundamentai.e pentru via!d.: prima ca entitdlile vii s5. se poate multiplica qi cea de a doua ca acestea si se poatd hrdni. Nici unul din cele dou5. fenomene nu este posibil fdr5. enzime deoarece miile de procese care suslin viala ar avea loc cu viteze imperceptibile in absenla enzimelor. Enzimele au o extraordinard putere cataliticd qi o mare specificitate, mai mult capacitatea 1or catalitici poate fl reglati cu multi precizie. t biocatalizatori care maresc viteza reactiilor

I.1. DEFIMTIE Enzimele sunt

chimice care au 1oc in organism, fdrd a suferi modilicdri structurale, regS.sindu-seneschimbate 1a sfArqitul reacliei. Ele catafizeazS. doar reacliile posibile din punct termodinamic, prin micgorarea energiei de activare. Prin energie de activare se inlelege energia necesarS. unei molecule de substrat, pentru a ajunge intr-o stare inalt energeticd numitS. stare de ftanzilie, stare favorabild formdrii produsului. Energia de activare este egal5 cu diferenla dintre energia libera a reactanli1or qi energia unui compus instabil, inalt energetic ce apare in cursul formdrii produsului. Prin substrat se inlelege o moleculd sau un grup de molecule asupra cdruia actioneazd errzirna. de vedere

in reacliile chimice, pentru ca dou6 molecule sa interactioneze ele trebuie sd vind in contact (Iig. l). Nu toate ciocnirile sunt inse eficiente in sensul cd, Iie coliziunea nu are loc dupi un unghi favorabil (figl.a), fre nu este suficient de puternicd. pentru a genera produgi de reactie (fig 1.b), Este nevoie ca moleculele si aibd o anumite incircdturd energeticd incdt ciocnirea sd. fie suficient de putemice ca sa genereze produqi (fig 1,c.), cu arte cuvinte, existd o bariere energetica ce trebuie depiqitd pentru ca reactanlii se se transforme in produqi de reacfie. Aceasti barierd. energetice poarte numeie de energie de activare Si este notatd G (fig. 2).

GP@ TA ) ( .@ i l )( ( y (,

u .8
\

G\

>b)
\-./

l.

+@
\--l

\ ",

a r--..,

,.( A) . \ \ \_/

! ^6 -@.o

s# aetranzltie
Fig.1 - In situati e a qi b ciocnir e sunt ineficiente deoarece nu duc ra produqi de reactie;'in situalia c ciocnirea a"Jr," ln"r"rrta I:t::: t la rormarea acestora "onducend

In absenla enzimelor puline molecule (uneori nici una) au suficientd energie pentru a depdgi aceasta barierd energetice qi a se tra'sforma in produgi. Deoarece viteza de reaclie este datd de numdrul de molecule de produs format in unitatea de timp, inseamna cE viteza de reac{ie in absenla enzimelor este micd. In faz1, gazoasd sau lichid5 moleculeie pot primi suficientd energie pentru a depdqi aceaste barierd energetici prin cre$terea

presiunii sau temperaturii

astfel ca ciocnirile dintre e1e sd devinS.

productive gi sd ducd 1aformarea de compugi. in organismele vii, moleculele nu pot primi energie in acest mod, in schimb bariera energetice poate fi micqorati astfel lncAt un numdr mai mare de molecule sd o poatd depdgi qi sd se transforme in produqi de reactie. Acest lucru este realizat prin prezenla unor "catalizatori" speciali qi anume enzimele. in consecinli, cu cat aceastd barierd energeticl va fi mai micd cu atat un numdr mai mare de molecule vor atinge starea de tranzilie, vor forma produqi de reaclie, deci viteza de reaclie va creqte (fig. 2).

Dire ctia dE darfesnrare

a reactiei

:] Fig. 2 - Varialia energiei libere funclie de direclia de desfe$urare a reacliei S)P. Graficul prezinte pe ordonate modilicdrile suferite de energia de activare in timpul reactiei iar pe abscisd schimbdrile chimice progresive suferite de substrat (rupere, formare de legaturi) in cursul transformSrii in produs. G".."r este diferenta de energie in cazul reacliei necatalizate, AG."t este diferenla de energie in cazul reacliei catalizate elfzi'lj,atic l2l.

Graficul din figura 2 prezintl, varialia energiei libere {cantitatea de energie din totalul energiei interne ce poate fl utilizat de o mo1ecul5. pentru: a forma noi legdturi in produs chimice etc.) in timpul in care conversiei este pe ordonatd

substratului

de reaclie,

reprezentate energia liber5 (G), iar pe abscisd direclia de desfS.qurarea reacliei. Energia liberd a produsului de reaclie P (G P/ este mult mai mic5. decAt cea a substratului S (G I , ca atare diferenla de energie dintre ceea ce din punct de cele doud stdri este negativd, G P - G S < 0,

vedere termodinamic

indicd. faptul cd reaclia se poate desfdgura in direcfia formirii produsului S) p. Altfel spus, reaclia este posibili din punct de vedere termodinamic, independent de pre?.enla oricirui catalizator. Cu toate acestea, deqi reaclia este posibild., pentru a se putea transforma in produs, substratul S trebuie mai int6i sd. atingd. starea de tranzlfie. ln aceastd stare atet reaclia directd. S)p cat gi cea inverse P)S sunt Ia fel de posibile. Diferenla de energie AG (intre energia liberi a substratului qi cea a stdrii de tranzilie), cunoscutd. ca energie de activare, reprezintd energia necesari tuturor aranjArilor gi rearanjdriior structurale pe care Ie suferd substratul pentru a se putea in produs. Ea are o valoare mare in cazul reacliei necata-lizate (AG necat). Valoarea mult mai mic5 a lui AG in cazul reactiei cataJizate de enzima (AG cat), indicd faptul ce aceasta ofera o alternativS. prin care toate aceste transformdri se fac mult mai sau uqor. Astfel prin aceasta ,,alternativd." ieaclia decurge mai rapid, fdri ca enzima s5. modifice energiile libere ale substratului sau produsuiui adicd fdr5. s5.intervind in echilibrul reactiei. Nu este obligator ca o reaclie chimicd sd decurgi" intr_o singurd etapd S)P, ci poate avea loc printr-o succesiune de reaclii secventiale (etape de reaclie) in care pot 1ua nagtere intermediari ca de ex. ES, Ep (fig. 2). Un intermediar este orice specie chimicd ce apare intr_o cale d.e reaclie cu o viald foarte scurte mai mare decat vibratia moleculard -1013 sec. Viteza unei astfel de reaclii este data de viteza etapei care necesitd cea mai mare energie de activare, cu alte cuvinte, de etapa ce decurge ce1 mai incet. Aceasti limitanti in de vitezd. concluzie viteza de reaclie este invers proporlionale cu reacfie poarta numele d.e reactie transforma

energia de activare. Enzimele nu fac al.tceva decAt sd micqoreze aceastd energie prin mecalisme speciale care insd nu influenleazd echilibrul chimic a1 reactiei.

I.2. NOMEI{CI"ATUR.A Fiecare enzimS.are dou5. denumiri: - o denumire uzualS. prin care sufixul "a25.' este ataqat denumirii substratului pe care aclioneazd, enzima (ureazd, glucozidazi) sau acliunii exercitate de aceasta (\ipazd,,peptidazdl. - o denumire sistematicd care face referire la tipui de reaclie pe cate enzrrna o cataJizeazd, qi pe baza ceruia aceasta poate fi exact Cr.' i.t-t-t':i:at.t.l)tt* u& ivQ,'ttlu-{t identificati. S"*l A elov 'f " J .: .l stabilit un sistem de clasificare zecirnal.d.care line seama de reaclia ] catlJizate gi d.enatura substratului. in acest sistem fiecare enzimi este I ia pentru-Enzi-"
I

""i Uni.r.rli Internallonale de rjloc.rumle

notate cu un numer de cod format din patru cifre, numdr care permite I identificarea enzimei, a substratului asupra cdruia reactiei catalizate: - prima cifr6 a numirului reacliei catalizate. - a doua cifrd a nurpdrului de cod definegte subclasa gi se referS. la tipul grupdrii din molecula substratului enzirrra. a treia cifr5. defineqte subsubclasa qi indicl gruparea asupra cdreia ac\ioneazd. ac\ioneazd qi a 1'-/',/ ;"1' i

de cod indicd clasa qi se referd la tipul

tralsferatd sau natura acceotorului. - a patra cifri reprezinti numdrul de ordine a enzimei in

subsubclasa resoectivd.

E
ab cd \
ttt\ / / // s1asz subclasa \ numdr de ordine \ subsubclasa

I
10

De exemplu enzima cu numdrul de cod E 1.1.1.1. este Alcool:NAD-oxidoreductaza, care catalizeazii dehidrogenarea a_lcoolului etiiic la aceta.ldehidd. Uzual se acceptd acele denumiri ce sunt in acord cu denumirea gtiinlificd ,,Alcool dehidrogenaza,, (ADH). Funclie de reacfia cata)izate, enzimele se clasiltcd in qase clase majore fiecare cu numeroase subgrupe: cataJizeazd. reacliite de oxido_ reducere; in func{ie de acceptorul de electroni se pot distinge: ). dehldrogenaze/ tedtctaze _ transfer5 electronii de la un substrat la alt substrat (altul decdt oxigenul); .2. ortgenaze - incorporeazd.direct oigenul in substrat; 3. oxtdaze - traasferd electronii de la un substrat direct la
,,.4. peroxidaze - transferA

/,."t.-0,-"1'- --\ (Td:1.-d":tT:,,,

oxlgen;

acceptor.

electronii de la substrat la HzOz ca

t.

catalizeazd tralsferul 2 ,-q l. Transferaze de grupdri func!ionale substrat (donor) pe alt substrat (acceptor). ,E CrtransJerqze - transferd unitali d.e un atom de carbon intre substrate (exemplu: metil_transferaze) ; _ ,Kamino-transferaze transferd gruparea amlno de pe un aminoacid pe un cetoacid: .7 . kinqze - tratsfer5 un radical fosfat din ATp pe un substrat; p/.fosforilaze - transferd radicalul fosfat din fosfat anorganic (Pa) pe un substrat.--*--_ cu ajutorul apdi: -

iiaroU..

) catahzeaz|, scindarea legdturilor chimice

"g. fosJataze - indepdrteazd radicalul pOsHz_ de pe un substrat; trU. fosfodiesterq.ze - cliveazd, legdturile fosfatdiesrence, cum ar fi cele din acizii nucleici; J"'r. proted.ze _ scindeazd legdturile peptidice din proteine.

/'
1\ -'-.

\
I

ll

t aze F catalizeaze, scindarea ":tt nehidrolituce a unei grupari de'!e-6n substrat cu formarea unei duble legAturi sau fixeazd. o grupare la o dubld tegdturd.: d.ecarboxilaze _ indepltteazd, ,LX' COzde pe substrat; fo.rmeazdaldehide in reaclii de eliminare; {>":o:*.y;htaze 4e;cd\A molecule fird implicarea ATp_utui. lzom.etue _Jcatalizeazd, .pl' reacliile de interconverstune t a zomenlor oplldilleometrici qi de catend: racemaze gi epimeraze .,L{ stereoizomerilor L D; 9i 4 xt. geometrici: y6. _ cataJizeazd. interconversiunea

rl

transferd grupdri intre atomii aceteiaqi molecute; ::::.cts_trans-izorneraze _ interconversiunea izomerilor

b .q' ll,igaze cataJizeaza unirea a doi Tl_."1151*ge,t compugiutiri;;a- ene;gi; eriberatd prin hidrolizaunei molecure (-'_-- de ATP. r . 5,!;.4| 6, l /i )7.i. , , t {;, ,.* /.(_
I.2.l. Oxldoreductaze O Reacliile de oxido_reducere sunt reaclii in care are loc un transfer de H2 sau electroni. Acest transfer este asrgurat de partea coenzimaticd. a enzimei (" structura enz. p.r7). principa.lele coenzime cu rol in oddo.,

izomerq.ze care catalizeazd reacfia de interconversie aldozd ,\ ::et9ze:

e. in multe reaclii transferul electronilor se face concomitent cu transferul protonilor (cu alte cuvlnte are loc transferul de atomi de H), astfel ce acceptarea de H/e(hidrogenarea) este echiva (tabel nr' "":;t;#*I*::o::"o*.oerea 1)' oxidoreductaze re catalizeaz-a oxidoreducerea gruprrilor: "";"-"r*^:oarea -cHz-oH; cHz-cHz_; _cH_NH2;_"n=;:

NADp*vezi p.7e), ,ffiT"::il':T:r,T";i: "..",:;ffi;":acidul lipoic, citocromii, coenzima

de H/e-

(dehidrogenarea) este

I
12

Tabei 1: Clasificarea generald a fenomenelor de oxido_reducere funclie de elementul transferat. Element transferat Acceptare de c5.treun substrat Hz eOz reducere reducere oxidare

Cedarede cetre unsubstrat

oxidare

----oxiaare
reducere

-.
;

Enzime care ,rlucreaza" cu Hz (e-): Dehidrogenaze N-)/ Dehidrogenazele sunt enzime ce ,,scot,, hidrogenul d.e la un substrat transferdndu-l unor ,,transportori" care sunt cunoscuti sub denumirea de NAD (nicotin adenin dinucleotid) si FAD (flavin adenin dinucleotid).
FAD -CH:-CH:-

I
FADH2 -CH:CH,'1,. \/ NADH+H+

- CH-a r{ OH

t-

-fiH-cHro

Observafie: FAD preia cei doi atomi de hidrogen de 1a acelagi tip de atomi in timp de NAD preia cei doi atomi de hidrogen de Ia atomi diq'rili. /f /{ Reductaze

Reductazele sunt enzime ce ,introduc,, hidrogenul ia un substrat acesta fiind preluat de la un ,,transportor" care este cunoscut sub denumirea de NADpH (nicotin adenin dinucleotid fosfatl
NAD|H+H+ -CH:CH-

NADP+ - CH2-CH2-

t3

Enzlme ce ,rlucreazdt' cu Oz: O, ,/ Oxldaan Oxidazele catalizeazS. reaclii in care oxigenul devine acceptor pentru hidrogenul transferat de 1a un substrat: SubstraFH + o, -!!@--$,,s O*igetaze Oxigenazele cataTizeazd reaclii in care oxigenul este introdus la un substrat: Subsfat-H + c)2 Monooxkenaza > substrat-oH + Hro subsb:at-H * o, 1,2.2. Ttarr,sfetaze CalaJizeazereaclii1e de transfer a unor grup5ri ,,G" (altele decAt H) de la un substrat Sr la qlt substrat 52, conform reactiei: Sr-G* + Sz -----+ Sr + Sz-G Grupirile transferate por fi grupdri ce contin un singur atorn de carbon (meti1, metilen etc), resturi de aldehide, cetone, aci1, alchil, glicozil, amino, fosfat, sulfat. ducort,+ o* hexokinad t ADp + GKp Glncoz6-fosfat I.2.3, Hidrolaze Hidrolazele cataTizeazd ruperea participarea apei, dup5. reaclia: A-B + HzO -----+ AH + BOH Legaturile care pot fi desfdcute prin hidrolizd. sunt legdturile esterice, eterice, peptidice, anhidrice, legdtura peptidicd), C-X, P-N. C-N (altele decdt C-N din unor legdturi organice, cu hdF* t o = subsb:at-oH sub$rat + H2O2

t4

Caracteristic

pentru

aceastS. clasd

de enzime este lipsa

coenzimelor. Ele necesitd prezeritraunor ioni meta1ici pentru activare. Din aceastd clasd. fac parte, in general, enzimele digestive: amilaza, Iipaza, tripsina, chimotripsina.
n T'fl ll' _HN -cH-c -e -In{-CH-e o jl Pepridaza Tn Q I u -HN-CH-C-OH

t"

ll + H2N-CH-C-NH
Rn+1

() o

Rn+1 Rn+1

lHzol

1.2.4. Llaze Liazele sunt enzime care cataJizeazd indepdrtarea unor grupdri din molecula substratului fdrd" participarea apei, ducAnd 1a formarea unei duble legS.turi:

-c-cXY

ll

------------> x-Y include

)":"( ac,tioneazd asupra

enzimele legdturilor C-C, C-O, C-N, C-S, C-X. '

I

Aceastd

clasd

care

1.2,5. lzom,eraze Izomerazele sunt enzimele care caLafizeazd. interconversiunea izomerilor optici, geometrici qi de caten6.
CHO |
I.lL -(J|-l

'ffpz-iznrrcraza

cHroH IcH2-o-P Dftilroxiaceton-fosfrt

cH2-o-P
Gliceraldehil- 3-fosfi t

c:o I

1.2.6. Ligaze sau sintetaze Ligazele sunt enzime cate cataTizeazS- formarea de legd.turi

chimice cu consum de energie (utiIizeaz6, energia eliberate din ATP pentru realizarea noii legdturi). In acest mod se real.izeazdlegituri C-O; C-S; C-N; C-C. Ex: glutaminsintetaza catalizeazd sintetiza glutaminei:
Glutanin-

Lchrtarnat + NI{4+ j\_+ ATP

chramhE ADP + Pa

15

I.3. STRUCTURA ENZIMELOR Din punct de vedere structural enzimele sunt (cu cAteva excepfii) proteine cu structura sau terliare (formate din dintr-un mai singur multe lant polipeptidic) cuaternarS. (formate

lanluri

polipeptidice sau subunitefl). Activitatea cataiiticd a enzimei depinde de integritatea sa structurali; astfel dac5. enzima este denaturat5. sau subunitalile ce o formeazd disociazi, aceasta iqi pierde capacitatea cata-1itici. Structura terfiard/ cuaternare determind o anumita aranjare spaliald care duce.la apantia gnqi ,,buzunar", unde se desfdsoard a4 ., t:z/,J, ..,,, . ,".,,. t.'1,. ...t^ /u(t /.,nji,Ji,,.:!tr reaclia caLalizatd.Acest 1oc (situs) poarte denumirea de centni activ al enzimei. Dupd unii autori centrul activ prezinte doud zone distincte $i ' , anume un situs de legare al substratului qi un situs cata-litic unde are loc cataliza propriu-zisd.. Pentru a inle1ege structura spaliald pe care o adopte centrul activ, se poate imagina mperea unei bare rigide de metal (fig. 3). O barA metalici .r se poate rupe tregand de capete in direclii

opuse, acliune in urma cdreia rezultd doud fragmente. Pentru aceasta este necesar un efort apreciabil, adicd o cantitate mare de energie. Dacd insd bara rigida este indoitd mperea acesteia se reaJizeazd cu un consum mult mai mic de energie. Prin indoire bara metalicd este adus5. intr-o stare intermediard ,,de tranzitje" din care trecerea ln cele doud fragmente separate, adicd ruperea ei se face mult mai ugor. Aceasta stare de tranzi\ie este reaLizatd de interacliile magnetice intre bard qi enzimd, interaclii care sunt de aqa naturd incAt,aduc" bara in starea de tranzilje foarte favorabild formdLriiprodusului/produqilor. Se poate deduce prin analogie ca structura centrului activ al enzimei este complementare nu neaperat cu structura substratului ci mai cur6nd cu structura stdrii de tranzi,tie prin care acesta va trece in transformarea lui in produs/produqi.

(a) Enrima nu ste plpzenti

'- -*'

- ,

SubsAat @ara ds metat)

-r ->

{r/tt,t
Star de tanzltis Oa$ inddla)

------* ,*i*t*
Prodnst (bale rupd)

{},}Enziha romplemsntarl Magneti

cu substntul

tc) Enzima complementar.e cu starea de tranzitib

m.-ffi-*_ffi
.g

"r v tt

Dir.cria & d.sE eit.n&lilt

tbn

j,-, tl""gir ea o enzima imaginari care catalizeazd ruperea unei _^-^ , ^T: ^prezinte oare qe metal (a), aclionafld asupra ei prin forle magnetice. O structuri a enzimei complementara cu substratul il itabilizeaza p. ingreunand indoirea (b); O ""."i" enzimei complementare cu starea de tranzitiJdestabilizeaza substratul ;strucjYe.a ravorzand ruperea acestuia. Interacliile magnetice sunt cele care furnizeazd aportJ de energie necesar pentru indoire. In diafarnele alaturate-este ilustratd varialia energiei de activare in cazul unei structuri complementare cu substratul gi in cazui unei structuri complementare cu starea de t. rrri1i", i., ca.ul complementaritdlii cu s hstratul complexul ES fiind mai stabil are o energie liberd mar mica decat a -mare substratului, in consecinle necesite o energie de acdvaie mJ dec6.t acesta.[21

Acliunea enzimei asupra unui substrat presupune ma1 tntai fixarea acestuia la centrui activ, adicd formarea comptexului ES. De-a lungul timpului formarea complexului enzim6, substrat ES a fost explicatd.de doud modele: - modelul clasic (Fischer) sau modelul cheie_broascd in care centrul activ al enzimei are o structurd rigida complementari cu cea a substratului, cuplarea acestuia fdcAndu_se dupd. modelul cheie-broascd.

Acest model este pulin cAteva cazuri complementare

eficient (deqi a fost evidenliat il va fixa ferm pe

in

de catalizl. enzimaticd) cu substratul

deoarece o enzime total acesta

ingreunAndu-i transformarea ulterioari.. - modelul "centrului activ indus,, (Koshland) care postuleazd ca centrul activ al enzimei are o conformalie relativ diferiti de a Centrul activ se comportd ca o matrild flexibild care poate lega substratui intr-o formi ce reduce la maxim gradele de libertate ale acestuia, in ceea ce prive$te rotalia, translafia, fapt care favorizeazd atingerea rapidd a stdrii de tranzi\ie, Aceasta activare, observate in cazul reacliilor catalizate de enzime. Pe lAngi structura centrului activ al enzimelor, un alt aspect structural se referi la alcdtuirea 1or. Enzimele in majoritatea 1or sunt heteroproteiene, formate dintr-o parte proteicd. (alcituitd doar din lanluri polipeptidice) numite apoproteind qi o parte neproteica ce este cunoscute sub mai multe denumiri: a. b. cofactor - dacd partea neproteicd este un ion metalic; coenziml. - dacd partea neproteicd este o moteculd reprezinta interpretarea datd. scdderii energiei de substratului.

organicd sau o structura ce conline o vitamind, asociate sau nu cu un ion metalic Ai care este slab legati de partea proteica. Precursorii coenzimelor impiicate in cataliza enzimaticd sunt vitamine hidrosolubile, prezentate pe larg in capitolul ,,Coenzime vitaminice". parte prosteticd _ dacd partea neproteicd este o structurd organicd legatd ferm de partea proteice. c. indepirtarea cofactorului sau a coenzimei duce la pierderea activitS.lii enzimatice. Apoproteina este responsabilE de specificitatea enzimaticd (de acliune, dar mai ales de substrat), in timp ce partea neprotelca este implicatd direct in catalizd.

I
IE

I.3.1. Izoenzime Anterior s_a afirmat cd unele

enzimeie sunt proteine cuaternare. Aceasta semnificd. faptul ce ele sunt aic5tuite din mai multe lanfuri potipeptidice (numite subunitdfi) asociate intre ele prin legaturi chimice slabe. posibiiitatea asocierii diferite a subunitdlilor duce hfiaritia unor enzime cu forme moleculare multiple numite izoenzime, IzoenzimeLe cata)izeaz,aaceeaqi reaclie chimicd. dar cu randament diferit qi au localizare tisulard. diferitdIzolarea $i evidentierea acestor izoforme se face pe baza proprietd.filor fizico_chimice diferite. Doud dintre cele mai intAlnite izoenzime in practica medicald, sunt LDH - lactat dehidrogenaza qi CK (CpK) _ creatrn kinaza (creatin fosfokinaza). LDH este un tetramer alcdtuit polipeptidice: unul de din doud tipuri de lanturi

(mu s cr e) . subunitatea l;*,l

inimii gi in general

lesuturilor cu metabolism aerob, iar subunitatea M (muscle) este caracteristicd muqchiului scheletic Ai_ in general organelor gi fesuturilor cu metaboiism anaerob (excepfie fac ficatul gi eritrocitul). Cele doud tipuri de subunitdli se asociazd cate patru pentru a forma un tetramer ducAnd la aparitia a 5 izoenzime: LDHI LDHZ LDHS LDH+ LDHs - HHH H ) cre$te in infarctul de miocard .HHHM -HHMM -HMMM -MMMM

"::.::,:l j',r",I ;" "ti "l ":::"L::

"

) creqte in afectarehepaticA CK este un dimer alcdtuit din doud tipuri de lanluri : unul de tip B (brain) cel de ai doilea de tip M (muscle). Subunitatea de tip B este specificd creierului, cea d.e tip M, muqchiului. Cele doui subunitdli se asociazd. diferit pentru a forma un dimer d6nd naqtere Ia 3 izoenzime.

CKr - BB CKz CKs - MB ) creqte in infarct in primele 6-24 ore. - MM gi funclionale

Se evidentiazd astfel importanfa cunoagterii particularitililor structurale aJe izoenzimelor in stabilirea cu acuratete a sunt asociate in aqa-numite compiexe unui diagnostic. Uneori enzimele

multienzimatice in care enzimele individuale sunt fixate prin Iegdturi slabe pe o proteind. central5, intr-o ordine ce corespunde intrdrii 1or in actiune. Aceaste organizare are ca scop transferul eficient al produqilor de reaclie ai unei enzime la enzima urmetoare, evit6ldu-se pierderile qi imprimAnd procesului o anumiti itezl. IJn exemplu de complex multienzimatic il constituie piruvat dehidrogenaza (pDH), care cataJizeazd, decarboxilarea oxidativd a acidului piruvic, compus ,cheie" in metabolismul glucidic.

I.4. SPECIFICITATE

slfff citatea enzi\:*ic5'^W# dea W#g ?9&7tr\vtft.erzirr5:1or

deosebi intre structuri' diferite. De aceasta ,,capacitate" este responsabild partea proteica a enzimei $i anume apoenzima. Specificitatea enzimelor se poate manipsta_..in trei variante principale: specificitate de reaclie, de substrat (i opti"a) t '-.-.' /lSfspecificitertea de reactie - denotd fapliiT-cd o enzima este ,,corJceputd" sE catalizeze un singur tip de reaclie. pornind de la aceasta treseturd s-a fhcut clasificarea enzimelor in cele qase grupe enzimatice.

fuffipecificitatea prezinta: J
t( "/
4

de substrat - care funclie de aria de actriune

specificitateabsolute;
specificitate absoluti de grup; specificitate relativd de grup;

I
20

Unele enzime actioneaze numai asupra unui singur substrat, catalizdrrd o singurd. reactie, de exemplu uteaza: HrNJ-NH, + H2o-l&33L* 2NH3 + Co2

a) Speclficiteteq

absolutd.

Aceasta enzimd este total inactivi fa{d. de compuQi foarte asemdndtori structural _ tiourea HzN_CS_NHz. De asemenea, arglnaza - enzima care cateJizea2d hidroliza L_argininei la uree gi ornitind nu poate cataliza hidroliza esterului metilic al argininei sau scindarea agmatinei, amina rezultati prin decarboxilarea argininei.
HN-CH2 I

-CH2-CH2-CH-COO" NH:

**0,,-

f H: c:o I NHz Uree

NHz Arginind

H2N-CH-CH2-{H2-cH rl + COOH rus^

d.e grup - prezt.te enzimere ce catalizeaz1. acelasi tip de reaclie asupra unui numdr restrens de substrate apropiate ca structura chimicd. fac pa_rte gJicozid,azele qi succin_ dehidrogenaza (sDH). sDH catarizeazd. reaclia de trecere a acidurui succinic 1a fumarat, dar cu aproximativ aceeagi vfteze qi dehidrogenarea acizilor L-metil_succinic, L-etil_succinic qi L_clor_ succinic. Hooc -cH2 -cHz-cooH
Acil succinb

b)

specilrcitatea

atsotuti.

Din

aceaste

categorie

srcch-d"hid.ogenara'' Hooc _cH:cH_cooH

Acid fumarb

de grap - prezlnte enzimele ce catalizeazd. acelaqi tip de reacfie asupra unui numAr relativ mare d.e substrate apropiate ca structura chimicd. Din acest grup fac parte ligazele sau esterazele care fac posibild scindarea mono-, di- trigriceridelor gi chiar arli esten cu structure chimicd mult mai compricata. Enzimeie proteoritice care hidrorizeazi

cl

specificitatea

rerqtrod

Iegdturile peptidice din proteine qi din alti compuqi neproteici, fac parte tot din acest grup. 3) Specificitate opticd sau stereochimicd. Este foarte rdspdnditd dat frind fapful c5. majoritatea substratelor au carboni asimetrici deci se gdsesc sub forma de stereoizomeri. Enzimele catalizeazd transformarea numai a unui stereoizomer (specificitatea opticS. este de obicei absoluti) neputAnd fi prelucrat celAlalt antipod optic de enzima. De exemplu, L-serin-hidroliaza

catalizeazd,numai dezaminarea L-serinei la piruvat, nu gi a D-serinei:

i l_*r, fH'?-oH _I* fH-NH, f cooH H2O COOH

Lserina

CH,

_i:\H

9H, t\l cooH

Hzo

pHs

- l:o
NH2cooH
Acil piruvi:

Enzimele care recunosc prezirrtd.specificitate geometricd. Ftmaraza,

substrate

cu

izomerie geometrici

de exemplu, permite hidratarea acidului fumaric

(izomer trans) gi nu a aciduhli maleic {izomer cis) cu formarea acidului malic ca orodus final:
H Funwaza -

HOOc--c:g-cooH
I H Acid turnrt

-H p :H o o c-

cH-cH2-cooH OH
Acil malic

I.s. MEcANIsMEDE cATALIZA

dl u

'' "' ')'

AtAt specificitatea cAt gi cataliza p.esupun complexului enzima-substrat ES.

(, stabilirea unor

' "' t '

I 6

leg5.turi intre enzimd gi substrat ce duc la formarea temporare a Formarea acestor legaturi tg1rrp_o,lqlg(mai mult sau mai pulin

extragerea lgqq"g"" miqc5rii libere a sub_stratului, 1ui din mediul apos etc. Cumulate toate aceste interacfii imprimd substratului o forma corespunzitoare stdrii de tranzitie si oferd

slabe) are ca scop

Odate substatul fixat, asupra lui ,,incep" sd acfioneze gruperi funclionale pozitionate adecvat, care permit ruperea sau formarea unor legdturi, printr_o varietate d.e mecanisme: mecanisme acido-bazice gi/sau covalente, mecanisme de tensionare a substratului, mecanisme bazate pe efecte entropice etc. S-a observat ci in cursul catalizei o enzimE. utllizeazd, de reguid mai multe mecaaisme simultarr. Grupdrile funclionale ce participd. la aceste mecanisme sunt: - aminoacizi din lanful polipeptidic; - compu$i organici (coenzime)/ qi ioni metalici: - ioni metalici. Dintre toate aceste mecanisme va fi prezentate cataliza ce se desfdqoard prin mecanism acido-bazic qi catalizd covalentd. cataliza acido-bazicd 4, rn acest tip de catalizd sun{ implicate gruped functionale cu caracter de acid sau bazd slaba, care 1a pH fiziologic pot ceda/primi un H+. in acest tip de reaclie iau naqtere intermediari instabili cu sarcina electricd. Cel mai intA_lnit aminoacid, care ia pH frziologic poate funcliona sub forma perechii acid.-bazdconjugatd. este histidina, care are pKn = 6 $i a carei comportare este prezentata mai jos: -NH-CH-COCH, tHN /.N:
+H+_H+

energia necesare catafizei p.oprilr-ri"".

-NH-fH-co-

__J",
nrSr-H
zl

Ptn=o tslo a

n t_
'44

Cataliza covalentd

ln acest tip de catalizd grup5rile funclionale ale centrului activ aI enzimei atacd nucleofil (in majoritatea cazurilor) sau electrofil (mai ra-r) substratul, ducAnd Ia formarea, intr_o secvenld. de reaclii, unui

intermediar legat covalent de enzimS. Acest intermediar covalent este mult mai labil dec6.tsubstratul inilial. Un mecanism de catalizl enzima.ucd, in care sunt utilizate atAt mecanisme acido-bazice cat $i covalente, il reprezinti nrperea legdturii peptidice sub acliunea chimotripsinei in urma cdreia rezultd. aminoacizii formatori.

-HN-CH-C-!I\-CH-C

ho r

p
tl -

H2o

HN-CH-C-oH

S.P r

a
+ Ii2N-CH-C-NH I Rn+1

Rn+1

Procesul are loc prin combinarea a doud tipuri de catalizd, in cursul reactiei luAnd naqtere at6.t intermediari instabili cu sarcind electricd cAt qi intermediari fixati covalent de enzimd. Centrul activ al enzimei prezintA o triade cataliticd a_lcdtuitd din trei aminoacizi qi anume Asptoz, Hyssz, gsltes.
't

Ser 10i

*o)

Fig.4 - Centrul catalitic al chimotripsinei evidenfiazd pozitionarea aminoacizilor Asp, Hys si ser astfel incat sd lie posibil transferul de protoni fiinia punctate) [6].

CAnd un substrat, care conline legetura peptidicd, se leag[ la centrul activ al chimotripsinei, are loc o uqoard modificare conformalionald care comprimd legatura de hidrogen dintre Hyssz qi Argtoz ducdnd Ia aparilia unei legdturi mai puternice. Aceasta interaclie cre$te pK.-ul Hyssz de 1a valoarea 7 (la histidina liberd) la valoarea 12, permi!6:nd histidinei sd.-gi accentue ze caracterul bazic incat ea devine capabil5 sE atragd protonul aparlinAnd gupdrii hidroxil de Ia Sertes. Deprotonarea imprimd Serles un caracter nucleofil puternic; are loc atacul grupdrii carbonil a substratului, atac in urma cS.ruia se formeazd un intermediar scurte, cu sarcinS.negative. Instabilitatea compusului incarcat cu viatd foarte

negativ

duce

ia

rearanjarea qi formarea unei duble legdturi intre carbon qi oxigen, care dezlocuieqte legd.tura dintre* carbon gi gruparea amino a legiturii peptidice, ducAnd la ruferea acesteia. Gruparea amino este protonate de Hyssz,uqurAndu-i_se astfel indepdrtarea. in aceastd etapa ia naqterea un intermediar legat prin legaturi estericd de enzima, denumit intermediar acil-enzimd. in etapa urmitoare o moleculi de apd este deprotonatd prin mecanism acido-bazic ducAnd la generarea unei grupdri hidroxil cu carater puternic nucleofil. Aceasta atac6 legitura estericd a acil_ enzimei generd.nd un nou intermediar cu sarcind negativi, cu viatd foarte scurt6. Instabilitatea acestuia produce rearanjari care duc la indepirtarea de reacfie, ce contine gruparea carboxil si la protonarea g91r9s gu regenerarea enzimei. produsului

25

Rr.6 Ltirtrtr | rotLld I

-'

\/

'*i
o.

YE]
)

r*-r'ui^i:

t"

t- s.,'

Fig.s . - Mecairismul detaliat aI reacti, ei catalizate de chimotripsin6. Chimotripsina peptidice la gruparea COOH a cale.Jj?.earA hidroliza legiturii aminoaciZilor. cu radicali aromatici (a). Pe parcursd catalizei se fornieazd in urma transferului unui proton (c), compugi instabili cu sarcina electricd. (d), iar in ufma ruperii legiturii peptidice Si eliberErii po4iunii ce confine gruparea amino, compuQi intermediari legafi covalent (e). Atacul nucleofil af apei (f) genefeaza um nou compus cu sarcine electrice foarte instabil (g), a cErui rupere va elibera o po4iune de la:rt polipeptidic ce contine gruparea carboxil (h) Qi va regenera enzima (i). [6]

26

I.6. CINETICA ENZIMATICA I.6.1. Notiuni de cinetlci generali Cinetica studiazd viteza cu care se desfdqoari diferite fenomene, inclusiv reacliile chimice. Cinetica enzimaticd studiaza viteza reacliilor desfdqoard in organism gi factorii care o influenfeazd. Principiile generale ale cineticii enunld chimice ce se

1egile care permit

calculul vitezei de reaclie in diferite reaclii chimice: 1. presupunAnd o reaclie chimicd ce are loc intr_o singure etape in care este implicat un singur substrat qi care este ireversibild (vezi exemplul barei rigide pC. 16),

S-P
viteza de reaclie este datd de cantitatea de reactant [A] consumate in unitatea de timp (semnul indicd consumul "_,, reactivului) sau cantitatea de produs [p] formatd in unitatea de timp. v=. dar unde: K= constanta de vitezi. dependentd de natura reactaltului condiliile de reactie. [A] = concentralia reactantului [P] = concentralia produsului Unitatea de mdsurd Jrenrnr. M I si de dtAt dtAl
dt

= dlPl
dt

V-tAl-V-klAl

semnificalia acestei loislan,l-t;*-"9

indicAnd ,,caltitatea" de timp necesard. transformarii unei ,.unitdti",.

"t""r'rr"i

rrit"r" unitare

Aceastd constantdestestrict specilicd fiec5reimotecut.,ffol"kllA

de natura

gi tiria

legdturilor

ce urmeaz6- a suferi tralsformiri

qi

dependentd de condiliile de reaclie (T, pH, tdrie ionicd., presiune). Pentru a intelege semnificalia constantei de vitezi. K, linAnd cont de expresia ei matematicd (sec-l), vom compara rlrperea unei bare de metal cu ruperea unei bare de material plastic. Ruperea unei bare de meta-l necesitd un timp (exprimat in secunde) mai mare decAt necesitd mperea unei bare de material plastic. Constanta de vitezd, fiind datd. de raportul l/sec, va avea valoare mai micd. in cazul barei de metal decdt in cazul barei de material plastic. Cu a_ltecuvinte viteza unitari pentru ruperea unei bare metalice este mai micd decAt viteza unitard pentru ruperea barei de material plastic. Se evidentiazd faptul cE structura dicteazi, merimea specificd a acestei constante, ce reprezintd viteza unitare, pentru fiecare compus in parte. 2. s5. presupunem o reaclie bimoleculard {vezi exemolul ciocnirii a doud molecule, p. 6) A+B---+ P+Q in mod analog viteza de reaclie este datd de cantitatea de reactivi consumatd in unitatea de timp sau de cantitatea de produsi de reactie formatd in unitatea de timp: IdP l =--rdnl v_ _ [d Al _ _ ldB l _ dt dt - dr -v-tAl.tBl-+V=ktAl.fBl in care : K = constanta de vitez6, dependentd de natura reactantilor si de conditiile de reactie [n] qi [e] = concentraliile reactangilor tpl Si tQl = concentraliile produqilor Unitatea de mdsurS.pentru M .I

Reaclii cu

-,.- _

_.".,

simultand a trei molecule fenomen relativ rar intalnit qi mult mai greu de definit din punct de vedere matematic.

-",.",,-;;;;";il';r:

ll";J0,i",o""

ciocnirea

Dacd se reprezintd. grafrc veiiiafia cantitd.tii de produs format in funcfie de timp se obline o curbd ce prezirrtd o porliune rectilinie (cu panta constante) care apoi se inclind qi in frnal se aplatizeazd (frg.6).

\J !,tuuJ A t u.A {tr'61 . L + t t s W c & C c _ .

Qa-ff

Fig. 6 - Variatia cantiteui de produs format funcfie de timp. Viteza de reaclie, date de dP/dt (care este tangenta la curbd, tgo,), nu este constante pe tot parcursuJ procesului, fapt evidenliat de modificarea targentei la curba (oo*or).

Din punct de vedere matematic tangenta in orice punct aI curbei data de relatia tg c = dP/dt va reprezenta irteza de reacfie, conform relaliei V = dP/dt. Portiunea liniarS. a curbei permite calcularea vitezei reale a procesului (numitd dupd unii autori viteza actuala, dupi ailii viteza Vo) atunci cAnd orice cantitate de reactant se transformi integral in produs, cAnd nu existd. reaclii reversibile, cAnd nu existd impiedicdri sterice generatg {e 4cumularea de prod.gs etc. pe mesure inilial5

cecantitatea a" ,"""t""t*To*

Datoritd faptului

il,iA^i Hffi*.k"'o.oo,r"

rormatd se

micqoreazS.qi viteza procesului scade. c6. viteza nu este aceeaqi pe tot parcursul procesului, este indicatd determinarea ei in primele secunde/minute ale procesului gi anume mdsurarea aqa-numitei viteze iniliale ve . in reacliile enzimatice activitatea unei enzime este apreciata funclie de cantitatea de produs formatd in unitatea de timp, prin urmare activitatea enzimatici este similard vitezei de reactie.

Activitatea enzimatica se exprime in: >::>2)/1J.I (unitdli internalionale) 1 Unitate Internafionali. reprezintl, cantitatea de enzimd. ce catalizeazl. tra-nsformarea unui pM de substrat/min in condilii standardizate pentru fiecare enzimd (temperaturd, pH optim etc.). - 7kat. reprezintd cantitatea de enzimi -=- )-Katal transformarea unui mo1 de substrat/sec. maxime. Kcat este numdrul ce catafizeazd.

2=. 3) Turnover - IG"t reprezintd o mesurd a activitdlii de molecule de

cata_litice

substrat transformat pe moleculd de enzimd qi in unitatea de timp cAnd enzima este saturate cu substrat. T\rrnoverul reprezintd. deci activitatea moleculard a enzimei. L6.2. Cinetica etrzimatici Conceptul de bazE al cineticii enzimatice consideri c6 formarea produsului de reac{ie este condilionatd. de formarea in prealabil a complexului enzima substrat ES, concept redat de relatia:
l

g .1,_ 5

___j_

gS _

E + p

Factorii care influenfeaz1. iteza de reaclie sunt, dupd cum se observS. din relalia de mai sus, concentralia substratului, concentralia enzimei la care se adaugd parametri ca temperatura qi pH_u1, la care se desfEgoardreaclia. a) Influenta pH-ului asupra actlvitegl enzimatice Varialiile de pH pot avea efecte atdt la nivelul enzimei, cat qi la nivelul substratului. Astfel, se poate modifica gradul de ionizare a unor grupdri funclionale de pe enzimi, a cdror sarcind (pozitivd sau negativS.)este necesard fie formdrii complexului enzimi._substrat, fie menlinerii conformaliei tridimensionate native a protein_enzimei, fie activitefli catalitjce propriu-zise (fig. 7). De asemenea, pH_ul mediului poate modifica gradul de iorizare al substratului, impiedicAnd sau

30

favorizAnd formarea complexului enzimd-substrat. Valoarea pH_ului 1a care reaclia enzimaticd se desfdqoara.cu vitezd maximd se numeste pH optim.

Influenla pH-ului asupra activitdlii enzimei. Structurile 1in care - .Itgbazice gruparile qi cele acide sunt fie ambele protonate, fie ambete neprotonate n,-i corespund ioniziri.i necesare activitSlii enzimatice. Intervalul de actlvitate al enzimei este cel in care formele bazice s tgttt Ptotott"te iar cele acide neprotonate' adica pHul optim este cuprins intre 6 gi

Figura 7 prezinti varialia activitdlii enzimatice a unei enzime lpotetice, funcfie de pH, pentru care ionizarea reziduurilor din centru activ este esenliale pentru catalizd. Cu alte cuvinte pentru ca enzima sd fie functionald centrul activ trebuie sd prezinte grLlparea bazici {B) in forma protonata (BH+), iar cea acidd (A) in formd neprotonate (A ); pK-ul formei bazice este 8; pK-ul formei acide este 6. La pH 7 in jur de 9Oo/o din ambele grupe (A si B) sunt prezente in formd activd., pe mdsurd ce pH-ul scade sau cregte, una sau a-1tadin cele doud. forme trece progresiv in forma inactivd. Cu alte cuvinte pentru enzima de fald pH-ul optim este situat in jurul valorii 7. pH_ul optlm pentru cele mai multe enzime are valori cuprinse intre 6_ g.

}cepfie r . 5 - i 0) . b)

fac enzimele digestive, pepsina (pH = 1,5-2), arginaza (pH = Influenta temperaturii asupra activitifii

enzimatice

Influenla temperaturii asupra activitdfii enzimatice derivi. din ::rtul ce odate cu cregterea temperaturii cre$te agitalia termicd gi prin '::=rare gi viteza de reactie. Peste o anumite temperaturd. enzimele ::r-in instabile qi ca urmare a denatur5rii iqi pierd activitatea intr-un :::erva.1foarte ingust de temperaturS.. Temperatura optimd a enzimelor -: organismele superioare nu depS.qeqte4OoC; eistd insd bacterii ::-nofile a ciror enzime prenntE- activitate optimd 1a 10OoC.

0.8 E
iJ- -

0.4

0.0 0 Temperaturd("()

f,nzimi denaturata

Fig.S - Influenla temperaturii asupra activitelii enzimei. Structura enzimei este menlinute intre anumite limite de temperature bana in jur de 4OoC) dupa care cre$terea agitaliei termice favoizeazd denaturarea. Aceasta cauzeazd distrueerea aranjarii spatiale esentiale pentru capacitatea catajitice a enzimei J3l.

cl enzimatice

Influen{a

cantitilii

de

enzimi

asupra

acti\rititii

influenla

concentraliei

enzimei asupra activitdlii

enzimatice

derivd din faptul cd odate cu mdrirea cantitelii de enzimd se md,reste

cantitatea de complex ES gi deci cantitatea de produs formatd, prin urrnare iteza de reactie cre$te. Spre exemplu, sub actiunea unei enzime, intr_un preparat biologic se formeazd X mg de produs p intr_un timp dat. Daca, repetandu-se experimentul, cu acelasi preparat, in acelaqi interval de timp, se formeazd.o cantitate de doud. ori mai mare de produs 2X mg p, inseamna cd in a doua situalie cantitatea de enzimd, care catafizeazdformarea de produs p, a fost de doud ori mai mare (fig.9). Proporlionalitatea dintre viteza de reaclie si cantitatea de enzimi are importanld practic5., deoarece permite determinarea concentraliei enzimelor din preparate biologice, determinare utili in diagnosticarea unor stari patologice.

Fig.g - Cinetica unei rea4ii enzimatice in prezen a unor concentratii crescetoare de enzimd. Addusarea, ra o cantitate n*a d" a unor cantita! crescdtoare de enzima Es r E2 , Er duce 1a f"r*;;" ",ruJi."t, il;iitaii crescetoare de produs P3> Pr > Pr, in acelaqiinterval de timp,

dl enzimatice

Influenla

concentratiei

substratului

asupra activititii

Dacd in organism cantitatea d.e enzimd (cu exceplia enzimelor inductibile) poate fi consideratd relativ constanta, concentralia substratelor variaze inse in fimite foarte largi. De aceea se poate afirma

-:-::

cu relative corectitudine ce viteza reactiei enzimatice depinde 1n principal de concentralia substratului. Dupd felul in care enzimele iqi modifici activitatea Ia in cregterea/scdderea cantitelii de substrat, acestea pot fr impirfite doud mari grupe: ce respectd cinetica Michaeiis -Menten; z.t/. - enzir.rre 4. - enzirne ce prezinte o activitate sinusoidalS., a$a numitele
-1 enzime alostericel,ff, 't-.2,/t

Comportarea diferitd a enzimelor qi diferenfele dintre cele doud categorii, vor fi prezentate pe laig in cele ce urmeazd. 1.6,2,1. Cinetlca de tip Michaelis-Menten Michaelis substratului $i Menten au studiat enzimatice influenla realizAld concentratiei urmitorul

asupra

activitefli

experiment: la o ca,ntitate constanta de enzimd au addugat cantitali crescatoare de substrat $i au inregistrat vitezele de reaclie mesurate. Cu datele oblinute au trasat un grafic in care pe abscisd sunt trecute concentraliile de substrat iar pe ordonatd vitezele de reaclie corespunzatoare (figura 10).

':l i-

[5] {mN)

Fig.10 - Variatia vitezei de reaclie, functie de concentratia substratului

34

AnalizAnd acest grafic se desprind urmdtoarele concluzii: concenttalii mici de substrat viteza este direct proporfionald ,!l7a cu concentratia acestuia (porfiunea liniard a curbei); '2f ra concentralii crescute de substrat viteza devine independenta de concentralia acestuia, adicd oricAt substrat am ad5uga viteza de reaclie nu mai cregte gi devine egald. cu viteza maximd (Vmax);

platoului indicd existenla fenomenului de saturatie adicd )faparilia indici o capacitate limitatd. a enzimei de a fixa substraful, irecAt oricdt substrat am adduga nu mai existd. centre active disponibile care sA-l accepte pentru prelucrare ulterioard. De aici concluzia este precedata obtgator de formarea unui complex intre enzimi" Si substrat si anume ES. pe grafic se poate determina jumdtate din viteza maximd. adicd Ymax/2; acestei viteze ii corespunde o concentratie de substrat cunoscute drept constanta |-Iichaelis_Menten (Km). Altfel spus Km reprezintd o concentratie de substrat pentru care viteza ;reactiei este egald"cu Vmax/ 2. nn aa informafii asupra afinitdtii enzimei pentru substrat: 14 astfel valori mari ale Km-ului indicd o alinitate scdzuti pentru substrat in timp ce valori mici ale Km_ului indicd o a-finitate crescuta pentru substrat. Acest lucru este vizibil din grafic unde enzima 1 are un Krnl (valoare micd), ceea ce indicd. faptul cd are nevoie de o cantitate micd de subshat pentru a atinge Vmax/2, in timp ce enzima 2 are nevoie de o cantitate mai mare de substrat pentru a atinge acelagi randament adicd. Vmax/2. Km are valori cuprinse intre 10-6 M - t0rM. cd formarea produsului

6fu'#j'u' 1l,U '-i.\'t n ltt lr2 k JJ

Michaelis gi Menten au stabilit o .et"iie matematica care exprimS" varialia vitezei de reaclie funclie de concentratia de substrat.
E+ S
--

Kr
K2

ES ----i-----+

K,

F . D ;-'

(1)

Conceptul de bazd al cineticii enzimatice (1) postuleazS. cd :eac{ia de formarea a produsului este una ireversibilS.. Viteza de ibrmare a acestuia este data de dP/dt (cantitatea de produs formatS. in 'rritatea de timp) care este insi proporlionale cu cantitatea de complex 'ESl. Aitfel spus viteza inilialn Vo $ezi p. 28\ este egale cu produsul dintre K: 9i concentralia complexului ES, produsul formAndu-se atAt iimp cat se formeazd complexul ES. V = dP/dt- [ES] adiaaV - [ES] deciVo = K3[ES1 Q)

a
It

e a

Complexul ES reprezintd o stare in care probabilitatea formdrii produsului este egali cu probabilitatea revenirii la compugii iniliali E respectiv S. De aceea concentralia reald a complexului [ES] este care se stabileqte intre reaclia de formare a

5 rt
ls a

dictate de raportul

complexului gi reaclii1e in care acesta se consume, atAt prin reaclia reversibild cAt gi prin trecerea in produs de reaclie: 1) reaclia de formare a complexului este dati de:
Vlo.r*," = K1[E]. [S]

(3)

b1 at
2\

reaclia de disfaritie

a complexului [ES] (4)

te
L1 de

= Kz[ES] Vde disparitiecauza6de reacda reversibila

Vde dispariliecauza6de trecerea in p.o6u, = K3IESJ (5) Din punct de vedere strict matematic cantitatea de enzima E nu apare in ecuafie deoarece, prezentl, in ambii termeni ai ecualiei 1, ea se anuleazd; din punct de vedere biochimic este acelaqi lucru pentru cd- enzirr,a se regS.seqteneconsumatd la sfdrqitul procesului. Relalia

ce la
ISe

tre t.

matematicd in condiliile acestea arati ci compusul S trece integral in P, cu alte cuvinte viteza de formare a complexului ES este egald"cu cea de consum.

0)

+ K3[BS] sau KrfEl.tsl = KztFSl KrtEl tsl = [Es] (Kz + K:)

(6) (7)

de unde:

= KJ t?;;tsl sau[ES] = tESl r\.2+

^3

tEt. ts1
K 2+ K 3

rrsr=ftfl rrr
\
KM

a\
este intru totul utild deoarece atAt

Relafia obtinutS. nu

concentratia enzirrrei [E] rdmash liberd. c6t $i concentralia substratului [S] la un moment dat, sunt dificil de determinat. Cantitatea d.e enzima rdmasa liberd poate fi insd calculatd ca diferenla intre cantitatea totald de enzimd. [Er] $i cea care este implicatS. in formarea complexului ES:

.tEl=tsrl_fEsl
t.

(e)

inlocuind [E] in relalia 8 aceasta devine:

= ( tstl - tEsl).tsl Km.[ES] Km. [ES] + tEsl.tsl= tE"Il. tsl Km+tsl ) = tE'Il.tsl [ES].(
tEr'l . l'Sl Km+ [S] Relalia 13 permite ca1culu1cantitilii de determinat stabilite experimental) din experimental) adicd din

(10) (1 1 )

(r2)
(1 3 )

de complex ES (foarte greu (care sunt

elemente cunoscute

cantitatea totald. de enzimd si

carutatea totala. de substrat. Dacd inmullim ambii termeni cu IG (care reprezintd. contanta de vitezd pentru formarea produsului) se obfine: K,'tESl = K3' [E'I] Km+ [S] (14)

-:::de: & . [ES] este viteza initiald, Vo, a procesului conform ecua{iei 2. IQ . [Er] reprezintd viteza maxima Vmax.a procSului, atunci c6nd toate cantitatea de enzima este ocupatd de substrat, conform aceleaqi ecuafii. in aceastS.situatie relatia 14 devine:

v o= Vnnx.S

Km+ [S]

(15)

Relalia 15 este cunoscuta sub numele de ecualia Michaelis_ \fenten qi stabile$te influenla concentraliei substratului asupra vitezei '-:nei reaclii cata-lizatede o enzimi. Ecualia stabilitd de Michaelis-Menten confirmd matematic :bservaliile lEcute prin analiza curbei oblinute experimental gi anume: 1) Ia concentralii mici de substrat, [S] << Kn, concentratia acestuia [S] poate fi neglijatd in raport cu Km qi viteza inilia1d Vo devine:
I

-. u o =-Vnnx'S

t<.-

Vnnx v ^ = -. s "Km

(16)

Relalia aratd c6. vtteza ini{ialn V., depinde, direct proportional, de concentralia substratului. Aceasta se traduce astfel: in cazul in care concentratia substratului cregte de doud. ori, viteza de reactie va creste :ot de doue ori. 1) la concentralii mari de substrat, [S] >> Km, valoarea 1ui Km poate fi neglijatS.in raport cu valoarea concentraliei substratului [S] 9i viteza initiald Vo devine:

vo Vnnx.S

tsl

Vo = Vmax

(17)

Relalia aratd cd la concentralii mari de substrat viteza devine independent6 de concentralia acestuia. Aceasta se traduce astfel:

38 oncat substrat am adel)ga vtteza de reacfie nu mai cre$te peste anumitd valoare. 3) la valori ale vitezei inifiale Vs = v^"./ 2 relalia devine: Vtlt* = V*.S 2 K m+S lsl .,,, I _ *" t=K; -

s a u K m+ t s l= 2 t s l s a u K m= [ s J (t 8

Relatia denotA semnificalia fizicd, real6.a lui K,,r qi anume: K6 reprezintd o concentra{ie de substrat pentru care vlteza iniliale a reacfiei Vo este egald cu Vmax/ 2. 4) Retafia:

r.=_&j5

Kl

(19)

descrie constanta Michaelir s_Mentehgi indicd. afinitatea enzimei fafd de substrat. Din punct de vedere matematic in situalia in care Ie are valori foarte mici expresia lui Km devine; _K,

ls.m=-----=r\1

Q0)

de descompunere inapoi in E qi S. Astfel reprezintd de fapt constalta de disociere a complexului ES. Disocierea complexului este strict dependentd de afinitatea ce edstd intre enzimd gi subsuat. Se deosebesc doud sttuatii: "ft',{ c6rrd Kr>Kz predomind tendinia de formare a compiexului ES, deci enzima are o afinitate crescutd pentru substrat, K,,' in aceasta sltuafie are valori foa_rte mici (raport subunitar). Se obfine confirmarea ::::1:::: r2lnl rlrqg.4

vitezd cea mai micd,.,",."'::;T;i::i:;i::":" :",*,l:ff: :; reactia inversd"

Din punct de vedere biochimic atunci cAnd IG are valori mici, reaclia de formare a produsului

=atematice a afirmaliei: ,,valori mici ale Km-ului indici a-finitate mare --e:tru substrat". ,-- -+cAnd Kr< Kz predomind tendinla de disociere a complexului

deci enzima are o a-finitate micd pentru substrat. in aceastd. -S. --::::afle K- are valori mari (raport supraunitar). Se obline confirmarea 8) :-atematicS. a afirmaliei: substrat". -:tru in concluzie ecualiile matematice oblinute confirmi concluziile :eCuse experimental. Utilitatea practicd a ecualiei stabilitd "valori mari ale Km-ului indicd a-finitate micd

de Michaelis-Menten

=:]ste in faptul cA aceasta permite: a) calculul turnoverului enzimei Relatia V"'". = K:. [Er] indicS. faptul c5" toate centrele active ale ::zimei sunt ocupate. Ks in aceastd situatie devine IG"t sau turnoverul ::-zimei care aratd numirul -.: se exprimd in sec-l. :1or diagnostice. in situafia in care concentralia substratului [S] este foarte mare, .:teza inilia15.este independentd de concentralia substratului qi devine cu Vmax. ==a15. Vo = Vmax sau Vo = K"", [Er] Aceasta inseamna c5. mS.surAnd iteza de molecule de substrat transformate pe :cl de enzimi (de toate centrele active a-leacesteia) in unitatea de timp t b) calcului concentrdtiei serice de enzirr.d-in scopul stabilirii

la saturatie {atunci c6nd

=:zima este saturate cu substrat) mdsurdm de fapt cantitatea totala ie enzimd [Er] prezentS.intr-o proba biologicd (sAngede exemplu) la un :oment dat. c) studierea influenlei inhibitorilor asupra vitezei de reac{ie. "Inhibifia activitdtii -{ceasta va fi prezentatd pe larg in capitolul
-=zirn-lar' ln 4C\

40

1.6,2.2. Ecualla Lineweaver-Burk Relalia oblinutd de Michaelis_Menten este ,incomod.d.,,atAt din punct de vedere matematic fiind o functie hiperbolicl (a cdrei proportionalitate este limitati), cAt 9i din punct de ved.ere practic Iiind necesare un numdr foarte mare de determindri practice pentru trasarea ei. O formd mai avantajoasd. a hcestei relalii a fost oblinutd. de Lineweaver qi Burk prin liniarizare. Liniarizareaa fost facute prin inversarea ecuatiei Michaelis-Menten obfinAndu_se ecuafia Lineweaver-Burk (ecuafia 22), in coordonate 1/Vs $i t/S . Trasarea graficului in coordonate reciproce,l /V6 funclie de 1/S, are avantajul de a permite determinarea cu mai multa precizie a vilezei maxime. care poate fi doar aproximatd in graficul in. coordonate directe Vo functie de S. Ecualia Michaelis 9i Menten f15) poate fi scrisi gi sub forma:
Vrnax.S _, vn = - Km+ [S]
t- tf,)

sau

Km + [Sl Vunx [Sl sau

vo

Vrnax'S Km+S

lKmll

Vunx tSl

Vnrax

(22)

Scrisd sub aceastd ultimd formd ecualie 15 devine o ecuatle de tipul y=ax + b in care _L $i _l_ sunt variabileie y respectiv x , iar K. tsl .l 91 "*" sunt constantele a $ ib ReprezentAnd inversul vitezei j_ in funclie de inversul concentraliei substratului * se obfine o dreaptd care taie axa y in punctul i* axa X in punctul a$a cum rerese dJn graficul * { alAturat (fig.11).

lr

Fig.ll - Reprezentarea gralicd a ecuafiei Lineweaver-Burk. axa x este data de - 1 y'K-, intersectia cu axa Y este data de 1/V*

Intersectia

cu

Intersec{ia cu cele doud axe se face la x = 0 (intersectia cu ordonata) respectiv y = 0 (intersecfia cu abscisa). Interseclia cu abscisa: y=g <-L=6
Nmll

adici:
(23) sau

o= t *

'rs *ut*
vmax I\m

1 I 1 ;z-=--::-'-a;vmru( LSI

Q4)

1__ [s] -

1 Km

(2s)

Intersectia cu ordonata: x=0 <+ I =0 adicE:

tsl

l= Vo

I Vrmx

e6)

Reprezentarea gra-fic6.a ecuafiei Michaelis - Menten qi a ecuafiei Linewever-Burk sunt prezentate comparativ ir frgura 12.

-l

r
FI b

a,rl,-+*^L-,_-. .oo,ao,,"t. dii"'Jtl v;;l'iJiiii:iasupra vite . b1in :"bstratului coordonatJil;:ii";!','i)lde

Fig.12. Inliuenta

loncentrarie;

reactie a) in

dereacfie.rncondirii.":::;T;1il:":::H"ilJ:':l;.
pot fi prezenti diverqi corr care pot influenta activitatea enzimelor' Influenla unor astfer o" >mpugi va fi prezentatd. in cele ce urmeazE-. ",to"ut Activitatea enzimelor poate fi diminuatd sau anihilatd de prezenta in mediu a unor

acttvitifii e3zlmelor Ecualia Michaelis_Menten sthbileqte o rela{ie intre viteza de reaclre qi concentratia substratului in situafia particulare in care in mediul de reacfie existd r

t.6.2.9. Inhibilia

xenobiotice in general) ' Acliunea lor poate avea efect reversibii sau ireversibil asupra activitalii enzimatice. 1.6.2,O.1.Inhibttia reversibili In cazul inhibifiei reversibile

de naturd endogend ilffi-:il1':1"T:':ff :l,l;:.il,"::: exogend (toxice, medicam tente'

inhibitorul se leaga prin legdturi slabe, reversibil, de enzimr ' Tipurile de inhibilie reversibild' cel mai des intilnite, sunt: inhibilia competitivd gi cea necompetrtivd.

43

1.6.2.3.1.1. Inhibifia competitivi in acest tip de inhibilie inhibitorul are o structure asemdndtoare :u substratul qi intr5. in competilie cu acesta pentrLl a ocuparea :entrului activ al enzimei. E;nzirna E poate lega fie substratul S, fie :rhibitorul I, fiind posibile urmdtoarele echilibre: S;z ES..-....._ -: EI ____jt_ E+ P P

Enzir/j,a angajata in complexul EI nu va genera produqi de :eac!ie, numai complexul ES va permite formarea acestora. Inhibitia Cepinde de concentralia substrafului anulatd prin creqterea cantitdlii qi a inhibitorului; ea poate fi de substrat. Mdrirea cantitd{ii de de la centrul catalitic

substrat, face posibild dezlocuirea inhibitorului saloare ca qi in absenla inhibitorului,

al enzimei gi atingerea vitezei maxime . Yiteza maximd va avea aceeagi dar in acest tip de inhibilie scade aparent afinitatea enziJnei pentru substrat. Cu a-lte cuvinte r 4"J/ rl j -'valoarea lui V-," nu se modifica, iar valoarea lui K,,, cre:tl ct//7'
I

InLibilie conpetitivd
I

vo
Inl,ibilie cornpelirivi

tif, irhibitef

Fig.13 - Efectul unui inhibitor competitiv asupra vitezei de reactie .eprezentat in coordonate Ve qi 56 (a) $i in coordonate reciproce l/Vo $i f/S F). Viteza maxime atinsa de enzima este aceeaqi indiferent de prezenta inhibitorului competitiv; valoarea lui Km creste modificAnd aparent alinitatea enzimei pentru substrat.

I
44

aiacidului succinic: "",," ":I:.lTi;l H[:ltr::

0

Un exemplu de inhibifie succindehidrogenazei care

competitivd il constltuie activitatez

:,TH"
AH,

COOH

cH,
cooH
I-

CH, l-

(uer"_p y
+ , A (acceptor,
fonlE oxida6) =.--

* '.J

cooH
CH ll +

"f cooH
Acil tunnrb

luc.epto., roirar"aug

AciC succinic

Principiul inhibi{iei competitive igi gdseqte aplicatie in practica terapeutice deoarece un numdr mare de medicamente sunt inhibitori competitivi ai unor enzime. CAteva exemple care ilustreazd acfiunea unor medicamente ce funclioneazd ca inhibitori enzlmatici, sunt prezentate in capitolul ,,Medicamente _ inhibitori competitivi, (p. 46). I.6.2.g.1,2, Inhibif ia ueconlpetitivi In acest tip de inhibifie, inhibitorul

are o structure diferitd de a substratului, deci nu intrd. in competifie cu acesta pentru ocuparea centrului activ al enzimei. Ei se fixeazd intr_un situs diferit de centrul activ, gi se poate lega fie de enzimd,,fie de complexul ES, fiind posibile urmetoareie echilibre:

EIS--)F--+

91a p

I I E+ P
produs, cere angajate r" #:Ti::"J;:j:; angajate in complexul ""*,ffi.,;:'""
micd, care poate fi ""r,,j",o;T:"r:;:::H;;:Tff:::"T
ESI Moleculele de enzir

ES

45

enzime doar una va genera produs, ceea ce va duce la o sc6dere

It

semnificativl a vitezei maxime a procesului, fSrd insd a se modifica r-aloarea Ku-u1ui. Deoarece aceqti inhibitori au o structure diferitd de a substratului, acest tip de inhibitie nu poate fi indepdrtatd scaae.(f 2 /4) .
Firi inhibitor

prin

cresterea concentra[iei de substrat. Prin urmare va]oarea 1ui Km a) rd-mAne constante, in timp ce valoarea lui V-"*
I

Inhihilje neconrpelitivE

r
I

I'

necompetitiv asupra vitezei de reaclie Fig.14 - Efectul unui inhibitor reprezentat in coordonate Vo S+So (a) $i in coordonate reciproce 1/Vo Si 1/S (b). Valoarca lui Km este nemodilicatd, inhibitoml avand structura diferitd de a substratului. Viteza maxima* atinsi de enzima este mai mice ca urmare a mrmdrului mai mic de molecule de enzime active.

1.6,2.3.2. Inhibilia ireversibili in cazul inhibiliei ireversibile inhibitorul prin legS.turi se 1eag5. puternice, covalente, de enzimd (la centru de catalizd sau la cel de legare a substratului), blocdnd definitiv activitatea enzimei; se spune ce en:zirr,,a a fost otravite. Exemple de "otrdvuri" sunt unii compugi organici (iodacetamida, p-clormercur benzoatul, compugii organofosforici), ionii metalelor grele (Ag*, Hg2*, Cd, Pb), agenli oidanli Diizo-propil-fluor-fosfatul etc. (un compus organofosforic) inhibd

ireversibil tripsina, blocAnd gmparea -OH provenitd din serind situatd in centrul catalitic.

46

H:\

CH

/rtr3

H:\

fH'

f' cH-cH2-O H
co I
Tripsina
I

6
+ F-P:O

I o

cH-cHr-O-P:O

f'?

rfH

coo ll
Hrgl^'\g11.

H:C''CH" 'cH, Dii-izo-propilfluor-fosfr t (DFP)

Acelaqi fenomen se petrece qi in cazur corinesterazei. DFp este un compus letal deoarece sisteazd degradarea acetilcolinei, compus esenfial pentru propagarea impulsului nervos. Metalele grele (Hg, pb, Cun- Ag) sunt inhibitori deoarece se combinS. cu grupdrile -SH ale enzimei, formAnd mercaptide qi blocend ireversibil activitatea acesteia. Enzima-SH + Ag* -__+ Enzimd_S_Ag + g* I.6,3. Medicamente - inhibitori competitiei Terapia medicamentoas E, se bazeaz6, pe inhibilia

competitivd, multe medicamente fiind inhibitori ai activitdlii unor enzime. I) Sulfamidelor sunt analogi structurali ai acidului para_ amino-benzoic:

nN$coou
acil para aminobenzob

H,N$sor-Nu,
sulfonamid.i Oacteriostatb)

Acidul para-aminobenzoic (pABA) este utilizat de unere bacterii in sinteza acidului folic, compus indispensabil cregterii lor. Sulfamidele intre in competilie cu acidul p_aminobenzoic ai inhibd producerea de acid folic necesar diviziunii bacteriene, impiedicdnd astfel inmullirea acestora.

47

HrN-/N-.nzN\ till
OH Acd folib

r----------1

*>A*o

/--\

crrrfrn{
l\- \l
L--------"\--

fcoi{NH-cutn\ PABA

2\

Chimioterapia

anticanceroase

face

apel

la

numerogi

fe

inhibilia sintezei de acizi antimetabolili, a caror administrare produce celulelor cu multiplicare rucleici, fapt ce determini blocarea diviziunii exemplu il constituie :apidd, cum sunt celulele tumorale' Un medicamentul cunoscut sub numele de metotrexat'

us
H2N-2N

se nd

\CID FOLIC ' ior-a inactiva) ,

I ""'N\ ll | n\,\N/-cH'-T Nu,

// \ -\jFCo-(GIu) cH:

f lo
EIYH ,Vt-y,,ty*.

I il^

'oto**'

.-A*1i",-il{_Lco-,cbh +?,\+*1._" NADPH P49P oH tln

dibidofolat

dhidroblat

n,r'r-ZN-.,,.N-<E H -' ii
CO-1Grr)

fA'

Erahidrofolar ACID FOLINIC (foma activa)

Acidul

folic indispensabil

diviziunii

celulare este adus in

suferi o serie de reduceri in organism prin aport exogen (p'83-84)' Aici erii f,)r. iba ind urmacslorarezulteaciduitetrahidrofolic(a$anumitaformS'activda de Administrarea acidului folic) implicat in diviziunea celulara' enzirrrd responsabil5 de metotrexat inhibd dihidrofolat reductaz a' astfel multiplicarea sinteza formei active a acidului folic' stopdnd celulard, inclusiv a celulelor tumorale'

48

3) Alt exemplu de inhibitor competitiv utilizat ca medicament este alopurinol-r.r.l.

NH,
t-

Nz\---N
\NA*/ H Adenina

tl ttl

AI'PI'RINOL ..\

?H
Nz\'n--N

tiltl

?H
Nz\r-N ti l tl
HTNAwAN/ H Guanina

.-..'

noANAN/ XANTTNA

--.--'-------.-> Xantin-oxidaza

t" V

lct

?H
Nz\_N lilt l soAN Ntrn
H ACID T]RIC

(x.o.)

aparfinAnd materialuiui genetic, "o-plrg sunt degradate printr-o serie de reaclii ce duc la un compus comun numrt xantinS. Acesta este oxidat in prezenla enzimei xantln oxidazd la acid uric, produs care este eliminat prin urina. Acidur uric este un compus cu solubiiitate relativ micd. Creqterea cantitdfii de acid uric in sAnge duce la acumularea iui in lesuturile moi sau in articulalii sub formd de tofi gutoqi, care declangeazd, reaclia inflamatorie, in boala numitd guti. Aiopurinol-ul, utilizat in tratamentul gutei, inhibS. acliunea xantin-oxidazei, prevenind incircarea organismului cu acid uric.

Adenina qi guanina,

:r.)

,", ,lr,r*rl /1SJ ; a,^ac

/

I.6.4. Cinetica de tip sinusoidal Ecualia Michaelis-Menten

descrie funcfionarea unor enzlme, care poate fi exprimatd. de o funclie de tip hiperbolic. Acest tip de funcgionare este ca.racteristic enzirnelor care au o afinitate datd. constanti' pentru substrat. De reguld. centru activ al acestor enzime se ocupe u$or cu substrat, se satureazi rapid qi activitatea lor devine independentd de concentralia substratului, depinzend doar de

initatea

intrinsecd a enzirnei pentru substrat. Ne aJldm in cazul in

:ere Km, afinitatea enzimei pentru substrat este ,,constante". Exista insd enzime care igi moduleazd activitatea funclie de -:onjuncturE", adicd uneori ptezir:le aflnitate mare pentru substrat, iteori au afinitate micd pentru acesta. Aceste enzime poarti numele :e enzime alosterice, sunt enzime ,,reglabi1e"cu afinitate adaptabili :leconstante) qi prezintd o cineticd de tip sinusoidal. Pentru a inleiege comportamentul acestor enzime va fi prezentate functionarea hemoglobinei care nu este o enzim.i, dar care poate reprezenta un modei pentru funclionarea enzimelor alosterice. Hemoglobina este o proteind care are rol in transportul Oz de la pld.mani 1a lesuturi. Ea nu are afinitate ,,constanta" fald de oxigen ci aceasta variazd funclie de condilii1e fiziologice qi de lesut. Astfel ea are afinitate mare fald de oxigen la nivel pulmonar, descdrcarea acestuia. Mentinerea constante a alinititii unde are loc pentru oxigen, incercarea oxigenului qi alinitate micd la nivel tisular unde se face adic5.menlinerea aceleaqi afrnit5li (mari, de exemplu) 9i la nivel tisular ar face imposibild descdrqarea acestuia qi oxigenarea lesuturilor. Cu a-lte cuvinte hemoglobinzi nu poate avea o aflnitate constantd, ea trebuie s6-gi ,adapteze" afinitatea fa!5. de oxigen, pentru a-qi indeplini rolul frziologic. Deci in studierea enzimelor constante ce se comportd definite asemindtor mai este

hemoglobinei, afinitatea

de Km nu

relevaltd. De aceea in cazul acestor enzime, nu mai este utilizatS. constanta Km ci un parametru S numit grad de saturare aJ enzimei, care se exprimd in procente [12]. Determinarea vitezei de reac{ie funclie oblinerea unor curbe de tip sinusoidd (ng 15). de concentrafia de substrat (gradul de saturaJe al enzimei) pentru aceste enzime a dus 1a

50

Fig. t5 - Reprezentarearali:1l

*"n"* ."t"p.",",'tli jf, il'::':dffi1?iu "i""t"" r'al"r,*ri"-r'a" "o-i;il

Analiza unui asemenea tip de curbd aratd ci: } la concentralii mici de substrat viteza d.e reaclie cre$te foarte putin (nu direct proporEonal pa in cazul cineticii Michaelis); p la concentralii ,,intermediare" addugarea unei mici cantitdli de substrat produce o creqtere bruscd, semnificativd, a vitezei de reacfie; viteza maximd este atinsd mai curdnd la concentralii foarte mari de substrat (fafd de cinetica Michaelis_Menten cdld viteza maximi se atinge relativ rapid la concentra{ii nu neaparat foarte mari de substrat); a"finitatea enzimei este dictatd direct de concentralia de substrat (in cazul cineticii Michaelis alinitatea rdm6le constante indiferent de concentralia substratului), acesta devenind un modulator al enzimei. Acest tip de activitate enzimaticd poate fi explicat prin fenomenul de cooperativitate (vezi modelul de funclionare a1 hemoglobinei, p.57) ce se manifesta atat la cre$terea cat $i la scd.derea cantitdlii de substrat; concentralia substratului pentru care viteza este Vmax/2 este notate ca S5osau So,s $i reprezinta gradul de saturare al enzimei ce determind atingerea unei viteze qald-vmax/2. ) ! !

;l|:f,SitJ:Li:T}ffY':-

Vo funcfie de concentraua ":t9Ti ceprezinte't etici-J-i.,,-,Joiaaralcurba continua

g" reaciie

)t

Factori care modlfici

viteza de reactie

Pe hngn influenla directi a concentraliei substratului asupra vitezei de reactie activitatea enzimelor alosterice este influenlatd' 9i de aqa-numilii functiona modulatori, substratele, efectori sau liganzL Ca modulatori metabolilii sau intermediarii pot metabolici'

Inlluenta modulatorilor asupra activitdlii unei enzime alosterice este prezentatS.in frgura 16.
lia a).
EN

Funclie de efectul pe care il exerciti, modulatorii sunt pozitivi (activatori) sau negativi (inhibitori) : 1) modulatorii pozitivi (activatori A) mdresc capacitatea de legare a substratului, in consecin!5 centrul activ se ocupa mai rapid, viteza creqte semnificativ gi curba tinde spre o alurd hiperbolicd (vezi funclionarea enzimelor a-lostericep. 54). modulatorii negativi (inhibitori I) micqoreazd capacitatea de 2l iegare a substratului, viteza scade semnificativ gi se accentueazd caracterul sinusoidal al curbei'
l

te

iti
de

te n ri

te
DT

t's {t.]t

in al
1.0

tsl
lc Fig.16 - Prezenla modulatorului pozitiv A m6re$te afnitatea enzimei pentru substrat li implicit saiurarea rapidd a acesteia, viteza cre$te brusc, alura curbei devine hiperbolic A. Prezenta modr.rlatorului negativ I micsoreazd afnitatea enzimei pentru substrat, viteza cre$te 1ent, curba i$i accentueaza aspectul sinusoid [6]'

ia concluzie: 1)

cinetica enzimaticd

evidenfiezd. doud tipuri

de

comportdri ale enzimelor: o comportare ce respecti. cinetica Michaelis_Menten, de tip hiperbolic, caracteristicd. enzimelor constitutive cu alinitate "constante" concentratia (mai mare sau mai micd.) fali acestuia, ln cazul cineticii de substrat indiferent de Michaelis Menten afinitatea Enzimele d.in aceasta

este o constantS., nu un parametru

variabil.

categorie au (de reguld.) un K,o mic, centrul activ al enzimei se ocupd uqor gi enzima ajunge rapid la saturatie. 2l substrat. o comportare enzimelor enzime ce i;i respecta cu cinetica sinusoidald, pentru de caracteristice alosterice

afrnitate

variabild.

Aceste

adapteazd. activitatea

functie

gi lucreazd diferentiat la concentralii mici respectiv mari de substrat. in cazul enzimelor alosterice afinitatea nu mai este o ,,constante" ci este un parametru variabil, dependent la rAndul lui de concentralia substratului qi de prezenfa/absenta modulatorilor.

concentratia substratuiui

r.7. REGLT\REA ACTTVTTaTTI TNZIMELOR Majoritatea enzimelor ri"spund la o cre$tere (de exemplu) a concentraliei substratului printr-o cre$tere a vitezei de reacfie. Aceasta are ca efect scdderea rapidd a concentraliei substratului, fapt care face necesard o nou5. reajustare a itezei de reacfie. Astfel reglarea vitezei de reaclie a enzimelor este esenliald pentru coordonarea proceselor metabolice. Principa.lele mecanisme prin care este reglati. activitatea

enzimelor dintr-o cale metabolicd, sunt reprezentate d.e: ,Xl Reglerc a alo stericd.; f) Regla:ea covalente (prin fosforilare-defosforilare) pro-enzimeior inactive in enzime active; fl /lansformarea l) Reglarea sintezei de enzime.

I.7.1. Reglarea alosterica este mecanismul cel mai complex coordondrii metabolice. Enzimele supuse acestui tip de reglare s:.int enzime alosterice, limitante de vitezS' in cadrul unui proces si =atalizeazd,de regu15 reaclii ireversibile. Reglarea activitelii 1or este posibild datoritd structurii 1or particulare. in cele ce urmeazd. vor fi .:ezentate pe larg structura, funclionarea gi factorii ce influenleazd. activitatea acestor enzime speciale. 1.7.L.1. Structura enzlmelor alosterice Enzimele :entrul alosterice sunt enzime care prezintd pe lAngd numit situs activ un situs (uneori mai multe) suplimentar,

sau centru alosteric (fig. 17). A1o provine din grecescul ,a1o" care la acest situs poartd numele :nseame altul. Compugii care se 1eag5. de modulatori alosteric sau efectori sau liganzi. Legarea unui modifrcS.ri conformalionale modulator care produce aie enzimei,

determini modifi carea afmitelii acesteia pentru substrat' Din punct de vedefe structural enzimele alosterice : * sunt proteine cu structure cuaternare alcdtuite din mai multe lanluri poiipeptidice, numite monomeri sau subunitdfi, care de reguld sunt in num5.r Par. * fiecare unitate prezintS- un centru activ gi unul sau mai multe centre alosterice. * fiecare subunitate (tight sau tense) se prezintd sub doui cu afinitate forme: o forma T substrat scdzutS. pentru

negativi) 9i o formd. R (relaxed) cu afinitate crescutS. pentru substrat (stabilizatd de modulatorii (stabilizat5. de modulatorii pozitivi).

Centri cat litici cu afinitate mici pentru substrat

*"-. *** -flilc*,ru

SrrreaTT

a,.s, c

Modulatorulnesativstcssn *"0r,,*', fl o-,tiv (sausubstHrur prcrerenlial d formaT qi nenline proteina in cooperrrivitlkr homorrop{pozttiva) | | alostericlln conforha a TT I ls teagi preferenliattaformaR ii mentrne prorein' atosteric,in conrormalia Rir ||
Cntri crtaliticl cu afinitste mare Pentru substrat

Starea RR

Fig.17 - Structura enzimelor alostedce, alc5tuite din monomen ce i$i pot modifica afinitatea pentru substrat funclie a" f.r"a p. , adopte h un moment dat: torma T cu afnitate sc5_zuta, forma R cu aliniiate ""* p"rrt.,] substrat. Modificarea de forme este dictate de prezen!"7.UJ. "ies"l,,ta *"JJ"iorilor I12l .

sd explice funcfionarea acestor enzime, modelul simetric qi modelul secventiai. Modelul simetric Acest model trebuie sd respecte condilia de simetne in sensul ci monomerii pot exista fie in forma T, fie in forma R, star e hibride TR nefiind admise (fig. IT). Legarea modulatorului (de exemplu modulator pozitiv) la starea T determind tranzilia acestuia la forma R fdrd aparifia de specii intermediare. In virtutea simetriei toli monomerii vor suferi tral:zilia T-+R ceea ce va accelera semnificativ legarea substratului.

1.7.1.2. Funclionarea enzlmelor alosterice Au fost elaborate dou6 modele care incearca

55

Iapt ce va determina o cre$tere bruscd a activit4ii enzimei, respectiv a ritezei de reaclie - efect cooperativ. Aceeaqi comportare se va manifesta 9i la fixarea unui modulator negativ, numai c5"efectul va fi contrar, de scS.dere rapidd a fixirii substratului, respectiv a itezei de reactie. Modelul secvential Acest model abandoneazS. principiul simetriei in sensul cE monomerii pot exista in forma T sau in forma R dar sunt admise qi formele hibride TR (fig. 18). Legarea unui modulator pozitiv la forma T, induce tranzilia T)R, dar efectul se limiteazd doar la monomerul vecin. Numai monomerului monomerul vecin va fixa cu mai multd ugurinld substratui 9i modifrcdndu-gi conformalia, va induce tranzilia T)R urmetor, fenomenul propagAndu-se din aproape in aproape la toli monomerii.
Contdcdalitid ql Ninhlle mlci

Cs{rr alo$edc

Cooperdtvftrta deg{tba

Cooperthl{te pad$vl

Fig.18 - Model secvential, in care monomerii pot adopta configuralii in intregime T sau R sau conliguratii hibride TR. Modulatorii pozitivi induc ttalfzilia T)R doar monomerului vecin ducand la aparitia formei mixte TR. Aceasta leage la unitatea R (ce are afinitate crescut5) substratul, ceea ce induce tranzilia T) R urmdtorului monomer. Modificarea se transmite progresiv tuturor monomerilor [ 12].

I
56

fi ilustrat pnn comportarea hemoglobinei. Hemoglobina este un tetramer alcdtuit din patru lanluri polipeptidice, numite subunitdli sau monomeri, in care fiecare subunitate transporte o moleculd de odgen. Hemoglobina se prezintd. sub doud forme: o formd tensionatd., cu alinitate micd pentru oxigen, determinati de o structure densd, cauzate de legituri de hidrogen, ce impiedicd migcarea Iiberd a monomerilor (Iig.2O); 2. o formi relaxate, cu afinitate mare pentru oxigen, determinatd de o structurd. ,afAnatd.", canrzatd-de ruperea unor legdturilor de hidrogen fapt ce permite miqcarea iiberi a monomer or: 1.

Modelul

sewenlial

poate

o., _\__*

(b)

nrjn,"*,*i:*i*il*#":glruf'+i:ikl#

$T:#:HlTrl"&:*?I;Hr*'ceantreneazed"ph";";i;ti;;;i;;fi;';

j:,xT:T: ,,,,,,.:,:'?""*; ,ltiii*H"efiffl :i:iLT"ffix,"'H: .|iRii::

La nivel pulmonar,

presiunea

crescutd a oxigenului

,for!eaz6,

Lg".ea" unei prime molecule de oxigen, in urma legdrii, F6z* din hem x pozrlioneazd, in centrul nucleului tetrapirolic ceea ce antreneazd cieplasarea histidinei apaltine (ng. 19). Apar aqadar modificdri conformalionale ale acestei subunitdli care duc la ruperea unor legdturi ionice s1abe,prezente in forma T. in Jrma acestor modific5ri forma T trece in forma R care are alinitatea crescutd pentru oxigen. Aceste modificdri sunt tralsmise subunitb.lilor urmetoare astfel ce monomerii 2, 3 Si 4 vor trece consecutiv in forma R Altfel spus prima moleculd. de oxigen se va lega greu, urmdtoarele din ce in ce mai ugor. Subunitdlile se inlluenleazd asadar reciproc, cooperand in fixarea substratului (frg.20). De aici no{iunea de cooperativitate in activitatea acestor enzime. l,a nivel tisular, datoritE. gradientului de presiune, oxigenul este descdrcat. Pierderea primei molecule de oxigen va favoriza conversia formei R in forma T, conrlersie ce se va transmite progresiv tuturor subunitdfilor. Astfel detaqarea primei molecule de oxigen va determina desprinderea din ce in ce mai rapidd a urmdtoarelor. proximale gi a intregii porliuni de lan! c5reia ii

r // ' ' U .::-:

EE

6 ,@

fl C F

lI @ [F li ll

=:=

]@ @, @ @ @ jl j :::= @ i ll ]i /l =:= ii ll

t10 i

&Q

@@

Fig.2O - Traazitia de la forma T la forma R. Legd.turile slabe dintre monomeri prezente in forma T ( punlile albastre) se rup progresiv pe masure ce odgenul este fixat. Fixarea fiecarei molecule de oxigen antreneaza tranzifia T) R a monomerului nvecinat. Progresiv trarzitia T) R este indusa pas cu pas tuturor monomerilor.

58

Observalie: la nivel tisular descdrcarea oxigenului nu este totald ci doar in proporfie de 5O%. Aceasta se explicd prin faptul cd o descdrcare tota-ld ar duce la stabilizarea formei T care s-ar oxigena mult mai greu la nivel pulmonar. pestrarea unui grad d.e saturare in oxigen duce la menfinerea unei forme intermediare (hibride) ce favoizeazd, prin efect homotrop oxigenarea rapidd Ia nivel pulmonar. 1.7,1.3. alosterlce Activitatea enzimelor alosterice este modificatd de a$a_numitii modulatori sau efectori sau liganzi. Funclie heterotropi. Modulatori homotropl in aceasti situatie modulatorul se identifici cu substratul. Cel mai adesea substratul acbveaze enzima care il transformh. Se spune ca substratul este modulator pozitiv gi genereazl un efect homotrop. Legarea unei molecule de substrat la unul din centrele active ale enzimei mare$te capacitatea de legare a celorla.lte centre active. Cu alte cuvinte monomerii se influen{eazd unii pe alfii, instatAndu_se aqanumitul efect cooperativ intre centrele active ale enzimei. Urmarea cooperdrii monomerilor este cre$terea bruscd a vitezei de reaclie observatd in cinetica sinusoidald (p.SO).Un exemplu de efect homotrop il poate constitui fixarea oxigenului la hemoglobind, acesta favorizAndu- qi propria legare. Modulatori heterotropi Modulatorii heterotropi sunt compuqi diferili de substrat, in general produqi de reactie sau metaboli{i qi pot genera doud. tipuri de efecte, reversibile gi anume: (a) feed-forward, de regula activator 9i (b) feed-back, de reguld inhibitor. de natura lor, modulatorii sunt homotropi sau Factorii care regleaze

acHvitatea

enzimelor

(J3Ifi*T.)
a) Reglarea feed - forward Acest tip de reglare a activitdtii enzimatice are scopul de a imprima un anumit ritrn unei c5i metabolice. Tralsformarea substratului A in produsul final H are loc printr-o succesiune de reacsi catalizate de diferite enzime, in care reaclia calalizatA de enzima Ez (de exemplu) este limitant6 de vitezd. Aceasta insemnd cd transformarea compusului B in C se reaizeazA cel mai incet, ceea ce poate duce 1a acumularea lrri. Creqterea concentratiei compusului B, in mediu de reaqtie face posibild fixarea lui, tn calitate de modulator pozitiv sau activator, la enzjrrra Es. Compusul B este deci un activator al enzimei, prin urmare fxarea lui la situsul alosteric al enzimei va detepmina o cre$tere a activitd$i enzimei Es, ceea ce va asigura o fluidizare a procesului, prin prelucrarea mai rapidi. a produsului F (prezent in cantitate din ce in ce mai mare ca urmare a inilierii cSii metabolice). Altfel spus un intermediar situat in amonte intr-o cale metabolicd o enzimd situatd in aval, sd se ,pregeteasce,' pentru a lace "atenjioneazS.' fald unui a1h;x sporit de substrat. b) Reglareafeed - back Acest tip de reglare a activitdfi enzimatice se nume$te inhibipe prin produs final, feed-back sau retroinhibilie. produsril final aclioneazd ca un efector alosteric negativ asupra enzimei reglatoare a procesului. Acumu.larea de produs H, ca urmare a neutilizdrii 1ui ir acelaqi ritm cu sinteza, face posibild fixarea ]ui, in calitate de modulator negativ, la E2care cateJiznaz\, efape fimitante de vitezd a procesr.dui. Se eviti asdel atAt epuizarea substratelor cat gi producerea irr exces a compugilor.

60

I.7.2. Reglarea covalenti

(prin fosforilare_defosforilare)

Un grup important de enzime iqi regleazd activitatea prin atagarea respectiv i:rdepdrtarea unei grupdri fosfat la un rest de serina, treonin5 sau tirozinS.. Ataqarea resfuIui fosfat poartd denumirea de fosforilare qi este catalizatd de o familie de enzime numite kinaze utilizdnd ATp_ul. indepdrtarea grupdrii fosfat poartE denumirea de defosforilare qi este catalizati de o familie de enzime numite fosfataze, cu qlutorul apei.

Enz-ser-OH

Enz-ser-O-PO32-

g^n

Rdspunsul la fosforilare/defosforilare este diferit funcfie de enzimd: astfel in urma fosforilSrii unele enzime se activeazd, a]tele se dezactiveaz.d,. Un exemplu de reglare a unui proces metabolic in care este utilizati reglarea covalentE il constituie degradarea/sinteza glicogenului. In urma fosforilSrii glicogen-fosforilaza (enzima responsabild de degradarea glicogenr.rlui) se activeazi, in timp ce glicogen-sin tetaza (enztma responsabild de sinteza glicogenului) se dezactiveaza. Astfel prin fosforilarea simr.rltand a unor enzime, se asigurd activarea unei cdi metabolice concomitent cu blocarea ciii metabolice opuse. I.7,3. Transformarea pro_enzlmelor in eazime active Unele enzime sunt secretate irr organism in formd inactivd

de pro_ enzimS. sau zimogen. De reguld. zimogenii sunt sintetiza! lttr_un anumit compartiment i:r formd. inactivh 9i sunt activafi la locul acSunii sub inlluenla unor factori locali sau autocatalitic. Aceste transformbri au caracter ireversibil 9i implic5 hidroliza unor legdturi peptidice fcovalente)

de la capdtut N terminal 1in cete mai'riLrtte cazuri) urmatS. de indepirtarea unor oiigopeptide qi expunerea centrului activ al enzimei. Un exempiu de zimogeni il constituie enzimele pancreatice (tripsina, chimotripsina secretate de palcreas $i activate in intestin) (frg.21) sau enzimele implicate ir: coagulare (sintetizate in ficat qi activate in sAnge) cunoscute sub numele de factorii coasulSrii.
pepsinogen-4 sau Deosina PePstnd tripsins > chimofipsini

tripsinogen -ipd!4-!gg94slqB.!!@-chimotripsinogen tripsina

(un zlmogen,inactlv) -l
f,

| lEntrokin|'n I

Om--'l

Pcptid de mascare

Centru activ

Tripsini (o protrz4 activl) F

it b u
e)

Fig.21 - Tripsinogenrt este secretat in forme inactive in pancreas. in intestin are loc activarea la tripsine sub actiunea enterokinazei. Activarea se rea.lizeazd prin indepartarea unui fragment oligopeptidic care mascheaza centrul activ. Fragmentul oligopeptidic este situat, de reguld, la capatul N termina-I gi indepdrtare lui duce la expunerea centrului activ al enzimei 115].

L
62

I.7.4. Reglarea sintezei de enzime Mecanismele prezentate mai sus modifici activitatea enzimelor existente deja in orgaaism. Celule i$i pot inse regla gi cantitatea de enzimd prezentd la un moment dat, prin regrarea sintezei acesteia. in acest caz reglarea este exercitate h nivelul genelor gi este realizata prin procese de induclie sau represie. se referd la stimularea sintezei de noi molecule de enzimd ca rdspuns la un semnal tralsmis de o moleculd de inductor Substratul poate funcliona ca inductor, acesta stimulefid de regula sinteza enzimei care il prelucreazd. Represia reprezintd blocarea sintezei de noi molecule de enzim5 ca rAspuns la prezen{a unui represor. De multe on produgii reactiei cata)izate de o anumitd enzimd., aclioneazd in ca.litate de represori limitand sinteza respectivei enzime. Acest tip de reglare opereazd,_'intermitent funcfie de condiliile frziologice la un moment dat. Un exemplu de enzima inductibild este glucokinaza, prezentd. doar in ficat, a carei sinteza este indusd de nivelele crescute de glucozi. in acest mod organismul face fald aportului crescut de glucozd,, dupa absorblie. Modificarea cantiti{ii de enzimd ca rd.spuns la prezenla unui inductor (sau absenla unui represor) qi care se traduce prin sintezd de proteine, este un fenomen Lent (ore/zite). in contrast modificdrile in activitatea enzimei, cauzate de mecanismele alosterice, se instaleazd rapid (secunde/minute). Pe ldngd" enzimele inductibile, in organism exista $i enzime care se gS.sesc in cantitate relativ constaltd., in sensul cd. rata lor de formare egaTeazdrata dispariliei lor, cauzatl.de procesele normale de degradare. Aceste enzime sunt cunoscute sub denumirea de enzime constitutive. Ele nu sunt supuse reglarii prin mecarrism de inductie/represie; sunt aqa_numitele enzime de servici,,housekeeping_ enzJmes" cu afinitate mare pentru substrat gi care saturdndu_se rapid Induclia

:i]lg

de enzimd constitutivS. il """-ptt-, \'/ A :cnstituie hexokinaza, enzima importanta'iir metabolizarea ghtcozei.
'.,

eficienla

maxima.

Un

I.8. IMPORTANTA BIOMEDICALA A ENZIMELOR Importanla biomedicald a enzimelor este date de utilizarea 1or in iagnosticarea unor bo1i, precum gi de folosirea lor in scop terapeutic. I.8.1. Utilizarea enzimelor in stabilirea unui diagnostic Majoritatea proceselor enzimatice se petrec la nivel celular, in :rnp ce determinarea enzimelor se face in general in lichide biologice sange total, plasmS, ser, urin5., lichid cefa,lorahidian etc.). Enzimele
:i

:rezente in plasmd pot fi clasificate in doud grupe: } enzime care aclioneazl- asupra unor substrate prezente in mod enzime plasmatice funclionale qi au ro1 funclional la acest :onstant in p1asm5.in concentralii semnificative. Astfel de enzime se

ri

tq

lunesc

te de

rivel deoarece catalizeazd.reaclii chimice in plasmd. Ele sunt secretate ::r diferite organe (de ex. ficat) qi scdderea activitdlii acestor enzime in plasmd indicd lezarea orgEnului care le produce. Astfel de enzime sunt enzimele coagulSrii qi fibrinolizei. D enzime care aclioneaze asupra unor substrate prezente in celule. de enzime se numesc enzime plasrnatice nefunclionale deoarece -A.stfel substratele pe care e1e aclioneazd nu sunt prezente in plasmd, ci in ce1u1e. Aceste enzime sunt totu$i prezente in plasma. (in concentralii constante, mici), prezenla 1or datordrrdu-se distrucliei celulare, normale. Enzimele plasmatice nefunclionale pot proveni: a) de 1a organe secretoare (ex. pancreas) sau b) din compartimente celulare. a) in cazul enzimelor provenite de la organe secretoare, de enzim5: cre$terea concentratiei concentralia lor plasmaticd poate varia atAt in sensul creqterii cAt si al scS.derii cantitali obstruclie indicS. o a c5ii de secretie sau o modificare a permeabilitdlii

lul . de : 1n zzd

care rde [e de
v t fie

rde :plngrapid

membranelor celulare (ex.creqterea amilazemiei), in timp ce scdderea concentraliei indicd o atrofiere a organului secretor.

64

b) In cazul enzimelor exclusiv intracelulare, prezenla lor in plasmi poate varia doar in sensul cre$terii concentra{iei lor, fapt ce indicS. o 1i25. sau o modificare a permeabilitdlii membrarare ca urnare a actiunii unor factori infecfioqi, toxici sau ca o consecinte a traumatismelor tisulare. Fiecare organ are un profil enzimatic propriu in funclie de particularitdlile metabolice legate de funclia sa. O bund" parte din enzime se gdsesc in toate organele, doar proporfia dintre ele diferd de la organ la organ. De exemplu, ficatul este bogat in glutamic_piruvic transaminaza (GTp), glutamat dehidrogenaza (GLDH) 9i succinat dehidrogenaza (SDH) fiind sarac in creatjn kinaza (CpK), in timp ce miocardui, musculatura, sunt bogate in cpK. Aceasta face ca reziunile hepatice si fie caracteri zate p:ir- cregteri ate GpT, GLDH qi SDH, iar cele musculare gi miocardice prin cregteri ale CpK. Determinarea acestui profil engimatic permite confirmarea unui diagnostic cdt Si urmdrirea evoluliei bolii prin determinarea concentratiei enzimelor specifice organului respectiv. Un exemplu este infarctui de miocard in care prolilul enzimatic este cel prezentat in frgara 22.
3 I ;
I

.,--'-.-

tD X Cna.

o7a ett aaaj!6tard

Fig 22 - Nivelele CpK2 $i ale LDH in plasma in infarctul de miocard. CpK2 _.., atmge concentralii serice maxime iD 24 o.re ( I zil de la instalarea infarctului. LDH total creSte mai incet atingand nivele maxime intr_un interval de +8 ore (2 zile).

65

Muqchiul cardiac este singurul tesut ce contine izoenzirna CpKz (CKMs).Aparitia in sange a acestei enzime Ia trei ore dupd instalarea durerii in piept, este specificd infarctului de miocard, qi ea prezintd activitate maximd la aprodmativ 24 ore de la insta-larea acestuia. Lactat dehidrogenaza (LDH) creqte Si ea in infarct, dar activitatea maximd. se observd la aproximativ 30-48 ore de instalarea infarctului. Astfel determinarea LDH este utild. in diagnostic pentru pacientii investigati dupd 48 de la infarct (timp la care CIG poate prezenta valori neconcludente) cd:t gi pentru a urm5ri evolulia bolii, scaderea activitdtii LDH frind un indiciu de depdqire a infarctului. O altd modalitatea de investigare a unei afecliuni este cea a determindrii izoenzimelor specifice unui anumit lesut. Un exemplu iI constituie tot infarctul de miocard in care poate fi determinata o izoformi, a enzirr.,ei LDH, specificd doar muqchiului 24-48 ore de la instalarea infarctului (fig. 23). in cazul enzimelor intracelulare, enzime sunt loca-lizate doar intr-un (enzime uniloculare) prezentS. doar in cum diferenlierea localizdrii lor Astfel unele celular piruvic compartiment gi glutamic permite aprecierea gradulgi de lezate a celulei/fesutului. singur LDH ar fi: glutamat sau cardiac. Izoenzirrra LDHr este specificd cordului; concentralia ei atinge valoarea maximd in

dehidrogenaza (GIDH)

mitocondrii,

transaminaza (GPT)prezente numai in citoplasmd. AIte enzime sunt prezente at6.t in citozol cdt gi in mitocondrii (enzime biloculare), ca de exemplu glutamic oxalacetic transaminaza (GOT). Creqterea LDH qi GPT intr-o afectiune hepaticd sugereaze leziuni limitate la spaliul citoplasmatic. Cre$terea concomitenta gi a GOT indicd o posibild. leziune mai avansatd care intereseazS.inclusiv membranele mitocondriale. Confirmarea este data de dozarea GIDH, enzime strict mitocondriald.

66

' l.

Fig.23 - Profilul seric al lactat izoertzimeTor dehidrogenazei (LDH) in serul unui pacient sdn5tos $i in infarct. in serul normal LDHI este prezentd in concentratii mai mici decat LDHz (a). in infarct, nivelul total al LDH cu cre$te proglesiv (b),
.resfPree in sneciel a

And|

I [ | | r 234 Tlpul l.oeddm$

catod

concentraliilor LDHI care depdqesc nivelele LDHz intre 12- 24 ore (c)- cresteri secundare ale concentrafiilor LDHs pot apare ca urmare a congestiei hepatice (c). Asfel pot fi monitorizate $i secundare ale complicaliile infarctuiui [11].

c) O modalitatea

de diagnosticare

moderne

a apdrut

prin

asocierea enzimelor cu imunoglobulinele in a$a numitele teste ELISA (enzime -linked immunoabsorbent assay).

(al

lo,
ln.ohr( rr i.rol rm 6ntln. r.d.nrol, ,trllltdl r. l..tl In d&sprl ry.$l{i{- Utuk.n r !.ri. d* rlr!. r|! {'tliE

lNb* er .nihdit rr..m. h $n r{. nsrt mot.t wi4n, !l!*e *tnhdF*l.i hrtd.. trd d{.. r.dc {nar, ln al$Or sr.iidrrtrn tr{r Mrl!.n.

G}

o-w(

(dl
LrubuN.r lubitr.t rDr(in( riBaonE rdlt tttll .r{a.|. h$..lltu itma.rdlhr'ql..rlFer +.*4!(Et!. rle.ru$ln DriFsrrnt. tlruan{l$nki a da.dali.

Fig 24 - Principiul tehnicii ELISA. intr-o prime etapa se fixeazd. un anticorp specific pe suportuJ solid (a). Se aplica apoi serul testat. Antigenul din ser se va fixa pe anticorpul specifrc (b), dupe care se va add.uga anticorpul specilic marcat cu enzimd (c). in ultima etapd se adauga substratul specifrc enzimei {d), care in urma acliunii acesteia va genera un compus colorat, a carui intensitate este propo4ionala cu cantitatea de antigen din serul testat I121.

Metoda consta in
t

generarea unor

anticorpi

specifici, prin

inocularea la un animal de experienl5 (qoarece,iepure) a unui antigen uman, cum ar fi virusul hepatitei. Acest anticorp specific este fixat pe o supra-fale sotdi intr-o capsule mici de polistiren numitd. godeu. hepatitei la un pacient, serul Pentru a evidenlia prezen.tra virusului

oblinut din sAngele acestuia, este pus in godeu. Aici are loc o primi incubare prin care antigenul din sAngele pacientului (in cazul de fafd virusul hepatititei) se combine cu anticorpul specific fixat pe godeu. Se indepdrteazS.apoi componentele nereacfionate, se fac o serie de spdldri cu solutii tampon adecvate, astfel incet pe suprafala solide rdmane doar complexul antigen-anticorp. Se realizeazd o a doua incubare prin addugarea unei solulii ce contine acelagi anticorp specific, marcat insd. cu o enzimd, adic5. un anticorp la care s-a legat covalent o enzimA, de regule o peroxidaz,e.In aceastd etape anticorpul marcat cu enzima se va fixa doar acolo unde antedor s-a fixat antigenul. DupE o procedurd

68

de spdlare in care se indepdrteazd, excesul de anticorp marcat se face o ultimd incubare prin addugarea substratului specific enzimei. Enzima va actiona asupra substratului gener6ld, de reguld, un compus colorat. Reaclia enzimaticd este apoi stopate adiugand, de reguld, un acid puternic (ex. HCI). Cu cAt culoarea generate va fi mai intensd. cu atat cantitatea de enzimi. fixatd a fost mai mare, deci qi cantitatea de antigen din ser mai mare. Altfel spus, intensitatea culorii generate este propo4ionala cu cantitatea de antigen din ser (figura 24). I.8.2. Utilizarea enzimelor in scop tetapeutic Cele mai intalnite enzime utilizate ca agenli terapeutici sunt streptokinaza Si asparagi naza. de miocard pentru dizolvarea cheagului. Ea activeazE plasminogenul la plasmini., enzimd foarte activd in liza cheagului la elemente componente solubile. Asparaginaza este utilizatd in terapia anticanceroasd. Celulele tumorale au nevoie de cantitdli crescute de asparagind pe care o ,furd,, din sAnge, lipsind astfel celulele normale de acest amrno acid. Administrarea de asparaginaza scade nivelul acestui aminoacid si irnplicit viabilitatea celulelor tumorale. Utilitatea terapeuticS. a multor enzime este limitatd, deoarece, fiind proteine, ele pot avea rol antigenic. Streptokinaza este utilizatd" in infarctul

69

II. COENZIMP VITAMINICE Vitaminele sunt substanfe organice cu greutate molecularA mic5., cu structuri chimice, proprietdli fizice, chimice gi biologice diferite. Ele nu pot fi sintetizate in organism de aceea trebuie aduse prin aport a-limentar. Necesarul zilnic la declangarea unor stari de vitamine patologice este mic specifice, (cateva miligrame sau micrograme/zi), insd lipsa din alimentatie a acestora, duce numite

auitaminoze. Vitaminele nu constituie sursa energeticd sau piasticd, pentru organism, dar sunt indispensabile pentru funclionarea organismului, coenzimatici, funclionale . Cercetitorul pentru aceste polonez, Kazirnir Funk considerate a propus ca denumire atunci factori nutritivi deoarece majoritatea vitaminelor in aceasta ca1itate indeplinind sunt normalS a roluri

constituentl

importante

substantre,

suplimentari pe lAngd glucide, lipide, proteine, numele de "vitamine" (amine vitale). Aceasta qi pentru fapful cd primui preparat izolat d,e Funk din tdrdlele de orez era din punct de vedere chimic o amind. Denumirea de vitamind se pastreaza $i astSzi, deqi s-a dovedit c5. din punct de vedere chimic, e1enu sunt toate amine. Existd grupuri de substanle cu structuri chimice inrudite cu structura diferitelor vitamine, care indeplinesc aceleagi funclii qi a cdror carenld determind aceea$i avitaminozd qi care se numesc vitamere. Existd deasemenea substarle cu structure chimicd

asemenatoare cu a vitaminelor,

dar cu acliune antagonicd, care

administrate produc efectele avitamiozelor specifice gi care se numesc antivitaminele.

I
10

Clasiflcarea

vitaminelot

se

bazeazd, pe

cnterii

de

solubilitate: F vitamine liposolubile (solubile in grd.simi) _ A, D, E, K; F vitamine hidrosolubile (solubile in apd) _ Br, Bz biotina, acidul pantotenic, acidul folic, Brz, vitamina C.

Bo, pp,

VITAMINE ,/\ ./\

Solubileir apn (hidrosolubile)

/\
Solubile h grnsimi

(liposolubile)

ComplexulB

Care nu apa4in complexului B

I I

VitaminaA (retinol,p-carotenul) VitaminaD (colecalciferol) VitaminaK (filochinona,menadi

Vitamina E (locoferoli)

Vitamina C (acidul ascolbic) I.

Cu tol ih eliberarc de energie

I Y

I t

Alrele

+
Vitanina86

Tiarnina Acid folic @1) Riboflavina@2) Vitamina Bl2 Niacina(PP) Biotina Acidul pantotenic (85)

Fig .25 _ Clasificarea vitarninelor

N. 1. VITAMINELE HIDROSOLUBILE Vitaminele hidrosolubile aparlin complexului vitaminic B {B1, Bz, Ba, Bo, PP, acid pantotenic, acid folic) vitamina C. $i

se acumuleaz.E in organism in concentratii toxice qi se elimind in principal pe cale renali.

Fiind

solubile in apd nu

Vitaminele

hidrosolubile

indeplinesc

in

organism

rol

de

coenzime, de aceea putem face referire la ele ca la coenzime derivate din vitamine. Altfel spus coenzimele reprezinta forma activa a vitaminelor.

II.1.1. Vitamina Br $l coenzima tlaminpirofosfat Vitamina Bl (tiamina, aneurina, vitamina anti

beri-beri,

vitamina antinevriticd) este alcEtuith dintr-un nucleu pirimidinic qi un nucleu tiazolic, substituite qi unite printr-o grupare metiienicd..

,TlY"',\--+.",
H,A\n,.rcr l.ts,.{tcu2- cH2-oH
Tiamina Absorblia tiaminei se reaTizeaz\.la nivelul intestinului tiamin-pirofosfat (TPP). liberE (plasmd, LCR) 9i esterificatd ca TPP (80%), formd coenzimatica care este activd biolosic.
Tiamin pirofosforilaz*,2'..t-,, kinaza 'l ll ------------->.._,/1 tt CH, \ . N--------tr CH r I lt

subtire,

prin procese active qi pasive; absorbtia activd presupune formarea in organism tiamina se gd.seqte

,,**-

a.ip

AMP

"r' \'\H,

O ^ ]! \y'cH;cnr-o-P-o-i-oH I OH TPP

o X IOH

o Rol metabollc.

Sub formd de TPP participd in calitate de

coenzimS. la unele procese metabolice, decarboxilarea oxidativd. a aceto-acizilor {acid piruvic qi acid o-cetoglutaric). De asemenea, Tpp constituie coenzima transcetolazelor, enzillr.re din calea pentozofosforicd.

'I

o Tulburiri

de aport vitaminic

Simptomele deficienlei pot fi cauzate de malnutriEe, defecte de absorblie, pierderi vitaminice d.atorate terapiei cu diuretice, hemodializd, diaree. Deficitul vitaminic poate conduce la boala numrta beri_beri. ce se caracterizeaza prin: - simptome neurologice (somnolenld, dureri de cap, newiti perifericd); - simptome gastro-intestinale; - simptome la nivelul aparatului locomotor. Simptomele moderate ale defrcienlei tiaminice includ: confuzie mintald, ataxie (inabilitatea de a realiza un controi fin al func(iilor motorii) qi oftalmoplegie (pierderea coordondrii miqc5rii ochilor). Aceste simptome Korsakoff. La animale, se intAlnes-c $i in r. tiaminicd sindromul Werrricke_ pierderea

deficienla

conduce

la

coordondrii musculare, ca retractia capului (opistotonus), caracteristic porumbeilor cu hipovitaminozd Br. Hipervitaminoza tiaminice nu apare in mod obiqnuit. Cu totul excepfional pot apare fenomene de intoleranli (1e9in, dispnee, tahicardie).

Bz (riboflavina) gi coenzimele flavinice Apartine clasei pigmenlilor galbeni sau flavinelor naturale. Este constituita dintr-un nucleu triciclic, derivat de izoaloxazind. o catend. $i latera-ld de ribitol:

II.1.2. Vitamira

?' ?'?n

''"JArruYTr^
H,cA./\l$ j-NH
o

"

!Hz-CH-6H-CI|CH2-OH

in organism, riboflavina se gdsegte sub form5. liberd. (p1asm5, lapte, urinh qi retind), cAt 9i legatd (FMN, FAD, enzime flavinice) in diferite tesuturi ca rinichi, ficat, inimd, muqchi. o Rol metabollc Riboflavina flavinmononucleotid intrd in structura qi formelor sale coenzimatice, (FAD). (FMN) flavinadenindinucleotid

Transformarea sa in ester monofosforic {FMN} are loc in toate celulele organismului, sub acliunea unei flavokinaze:

Flavin-adenin-

Ribofl auina -+:gE{Ist-+

/\ ATP ADP

FN,[,J

Prin unirea FMN cu acidul adenozin-SlP (AMP), sub influenta flavin-adenin-pirofosforilazei, se formeazd FAD-u1. Dup5. nomenclatura stricta, FMN-ul nu este un mononucleotid, iar FAD-ul nu este un dinucleotid, deoarece in loc'de perfioze au un alcool polihidroxilic, ribitolul, iar flavina nu este o'bazd azoIat6.adevirata.

<--FMN

AMP-+ FAD

Flavinenzimele particip5 la reacfii de oxidoreducere d.eoarece ciclul izoaloxazinic poate suferi reduceri reversibite, prin hxarea temporard la Nr gi Nro, a doi atomi de hidrogen, cu mutarea dublei legdturi. Hidrogenii sunt preluafi de la diferite substrate reduse (SH2), cu care intrd in reaclie Si care se oxideazd.(So*):

u,c/-6N--/-;a
-.^t n3L-\,,4\J ,^ t

'

r .*..NH

:I'
-

H,c
HrC

-2eFMNH2 sauFADH2

-2H-

FMN sauFAD

FMN qi FAD se gisesc in celuld sub formd. de complexe cu proteinele, constituind sisteme enzimatice de mare rmportanta in oxiddrile celulare - flavinenzimele. qi in gnecanismul vederii (transformd lungimile de undd mici in lungimi de undi mai mari, perceptibile), in ftziologia glandelor lacrimale, in mecalismul de producere a HCl in mucoasa gastricd., in activitatea altor vitamine qi hormoni (conservd activitatea vitaminei Br gi este legatd de activitatea hormonilor corticosuprarenali qi a insulinei). o Tulburirl Riboflavina intervine

de aport vltaminic

se manifest5 prin aparilia unor leziuni ale mucoasei gastrice, buco-faringiene, leziuni cutanate. La om, carenfa este cunoscute sub denumirea de ,,pe1agr6 fdrd pelagrf', cu simptomele: stomatite angulard., leziuni umede la collurile gurii gi nasuiui, conjunctivitd, cataractd, blefaritd, cre$terea in volum a limbii. F Hipervitaminoza. determini: Megadozele administrate timp indelungat crampe musculare, poliurie, utilizarea qi metabolizarea

> Hipovltaminoza

defectuoasd a altor vitamine, datoritd competiliei pentru compugi de fosforilare-

.-

\,rlrarnina

u'r'3' Viteoiaa Br (piridorina) si coenzimere derivate

!6 (piridoxina, adermina, factor

prin natura radicalului cH2oH

includetrei compuqi natura.li,derivalide piridini,

din pozilia 4: QHO

"-"Ti:TTj::
fH2NH,

oFrf)fcr,or
Hrc\,./

ou/-ycw,on
H3c\.j

oHf\p-cH,on
Hrc\-./
Piridoxamin6

o Rolul metabolic Piridoxalul $i piridoxamina intervin in metabolism sub formd coenzimaticd. de piridoxal_S_fosfat, respectiv piridoxamtn_S-fosfat (p5p), ln care gruparea de alcool primar din pozilia Seste fosforilatd in urma reacfiei cu ATp.

otfy"rz-GporH:
Hrc\..r1
Trans '*Pfidoxalfosfat

tzHo-(CH2-NH2)

f*J "-c{oos
]f c-H
OH H:C

\--

p""arboxilare

transsurfurare (transferul i:'ffi;J1Tll;,^1.""1".1 ":,ff,t;.

Bo intervine in multe reaclii metabolice la care participd aminoacizii: transarninare, decarboxilare a c_arrrlno _acizilot (tirozina, arginina, acid eluta'11in I Aa-^^:-^-_ ,

Vitamina

r-

1"i"t"ir.a qi homocisteind), in absorbfia din intestin gi intrarea aminoacizilor in celuld.. . Tulburiri de aport witaninlc

sinteza cisteinei), desulfurar.

Ca semne ale delicienfei se pot menliona: stirile de nervozitate, insomnie, tulburdri de mers, afecfiuni cutanate in jurul nasului, ochilor, gurii, limfocitopenie. Carenla vitaminei Ba favorizeazd aparifia cariilor dentare, conduce la modifrcdri in metabolismul triptofanulu i, printr-o excrelie excesivd.de acid xanturenic.

caracteizat

Medicamentul ISONIAZID (hidrazida acidului izonicotinic), uzual utilizat in tratamentul tuberculozei, reactioneazd.cu Bo pentru a forma un derivat hidrazonic, care inhibd enzimele ce con{in piridoxal_5_p. Pacienlii tratali mult timp cu isogriazid denoltl o neutropenie perifericS.,care rdspunde foarte bine 1d terapia cu 86.

Q*o-*r-NH2

+ Fc

UOH srontan ----,/l

"'"" I l
?'r",
\__/

I
Piriloxal hklrazona

co--NH-N:crr5N

6"ron

uz:ual utilizatd in tratamentul pacienlilor cu boala Wilson, cistinurie qi artritd reumatoidi, reaclioneaze cu 86, pentru a forma un derivat tiazolidinic

De

asemenea, peniciiinamina

(beta-dimetii-cisteina)

inactiv. Pacienlii tratali

cu penicilamind

dez'olte. ocazional convulsii,

care pot fi prevenite prin tratament cu vitamind Bo. IL1.4. Blotina (witamlna Hl qi rolul ei coenzimatic Molecula biotinei este constituitd din doud nuclee condensate, un nucleu tetrahidro-imidazolic (A) qi unul tetrahidro-tiofenic (B) la care este grefatd. o catend laterald de acid n-valerialic. Se cunosc doi izomeri natura.li, alfa qi beta-biotina, izolali din ficat qi lapte, respectiv din gdlbenugul de ou:

?,,,
H_N-;\N_H
^ H-t-C"--+{ t Bl H2C\^_,.c H-(cHrr-cooH
lD z

,l

lr

r-f=1-t
Dl

H-N-:-N-H t^l

H2C\-,.cIFqrrcH-cHr

f",

cooH

Beta-biotina

Alh-biotina

in

produsele natufale -

biotina

apare combinati

cu lizina,

compus numit biocitine:

Biotina-CO-NH-(CHr4-CH-COOH

NHz

Biocitinaza, enzimS. evidenliatd. in plasmd, ficat, pancreas, hidrolizeazl compusui, eliberAnd biotind. Enzimele care contin biotind au in centrul catalitic, resturi de lizind, prin care se fixeazd vitamina. Cu auidina, glicoproteind termolabild din albuqul de ou crud, forrlreazl- biotin_auidina, compus stabil, rezistent la acliunea enzimelor proteolitice, nedisociabil prin dia1iz6. sub aceasta formd., vitamina nu se absoarbe in tractul disestiv.

18

o Rol metabolic Biotina transporta grupdri COz active, in calitate de grupare prosteticd a unor sisteme enzimatice de carboxilare (carboxilaze) care catafizeazE. fixarea COz pe diferite substrate. in reacliile de carboxilare, COz activat de citre enzime: ATP, participd sub form5. de carboxi-biotin-

Hcot+ArP-l----+-d ,i_#" i J" TfFEnz. oon o:5__-i,_-l t,b--r"-irnc't4-co i

Anhidridd-Pcarbonica
Biotin-Enzimi

*u,. - oiX"il"'",:-r"

---r*

coolr ^o e<i-rt-i-Ns
I

cooJ__^
CH,

I tcooH
Biotin-enzimi

rflT"

t^l

H2C\s,,.c tt-{cH2 )4-co

|n-Enz.

Piruvat-carboxilad

Carboxi-biotin-enzimi

o Tulburiri Carenla metabolismului

de aport vitaminic alecteaz^, intermediar, aproape sinteza toate de prin novo compartimentele a enzimelor,

metabolismul glucidic, Iipidic etc. F llipovitaminoza se manifesti tulburdri nervoase,

dermatite, oboseald musculari, anemie, sclderea apetitului. Dupd un consum mare de albuq de ou crud, 1a qobolani apare un sindrom deficitar biotinic, numit 'boala albuqului de ou", ce se manifestd prin dermatitd, alopecie in jurul ochilor gi paralizia membrelor posterioare.

U.1.5. Vitamina PP (liacinal Ca vitamine PP (niacina,

Si coenzimele nicotinamidlce factorul pelagro-preventiv) sunt

desemnati doi compuqi, derivali de piridind, acidul nicotinic (niacina) qi amida acidului nicotinic (niacinamida):

6\$..!,

f-f-coou

Z\fuo-Nn"
6\,,/2

ttl

Acid nicotinic

Nilotinamioa

in sAnge se gS.segtesub formd de coenzimS. (80% in globulele roqii) 9i sub formd. de amidd liberd., in plasmd. Vitamina PP se sintetizeazd i:r organism din triptofan; din 60 mg triptofan rezultd. 1 mg acid nicotinic. . Rol metabolic actjoneazS, in organism sub forma a doud.

Nicotinamida

coenzime, nicotinamid adenin.flinucleotid (NAD.) 9i nicotinamid adenin dinucleotid-fosfat (NADPf , in reacfiile de oxido-reducere.

(+
oH (PO3H2)

NAD" (NADp,l Acestea sunt formele oxidate ce pot fi reduse in NADH+ H* qi NADPH+ H*, reducere ce are 1ocla nucleul piridinic al nicotinamidei:

80

4
tNH,

+2H+ +2H+

ffiC" +H+
\N/

R NADH+H+

Aceste doud forme intenrin celulard., constituind

in procesele de oxidoreducere

coenzima multor dehidro gerraze.

Spre deosebire de coenzimele flavinice (FMN qi FAD), coenzimele piridinice (NAD. gi NADP") pot exista liber in celuld; pot fi disociate de partea proteice. NAD. participd in special la reactiile de degradare oddative, iar NADPH, in special in reacliile de sinteze reductive (acizi graqi, proteine etc.). I.

Formele

reduse

ale

acestor doue coenzime prezintd, absorb{ie specific5. in U.V. la 340 nm, oxidate in nu timp ce formele nici o prezintd.

absorbtie la aceastd lungime de undd. Aceasta proprietate serveSte la dozarea activitdlii qi a a_ltor

dehidrogenazelor

enzime a ciror activitate poate fi cuplatd cu o reaclie de dehidrogenare.

8l

. Tulburiri

de aport vitanlnlc

La om carenla de vitamind PP se manifestd prin pelagrd (pellaagra - pieie asprd, brund). Pelagra se instaleazd cAnd dieta este constituitd din porumb, sdrac in triptofan in exclusivitate qi vitamind" Ba (regim pelagrogen).

Semne ale peiagrei - oboseal5.,sldbiciune, indigestie, anorexie, urmatd dupd. cAteva luni de o dermatitd. (mai ales pe pielea expusd. la soare), diaree qi demenli (boala celor trei D). Deregldrile metabolice din pelagri sunt greu de definit deoarece carenta de vitamini triptofan. Peiagra poate insoti 9i alte boli specifice unor defecte metaboiice din metabolismul triptofanului: boa-la Hartnup (defect de absorblie a triptofanului) sau sindromul carcinoid (proliferarea matigrrS. a celulelor care sintet)zeazd serotonina al carei precursor este triptofanul). II.1.5. Acidul pantote+lc (vltamina Bxf ql coenzima A Acidul antidermatitic pantotenic (vitamina Bx, factor hepatic, factor al gdinilor) este format din acidul pantoic qi p-alanind". H'C O OHo 'lrii-ll HG-CH2-C- CH-e-NH-CH2- CH2-c- oH
H:C Acid pantoic
\-----------'Y----------J Aci'Cpantotenb

PP poate Ii indusd de carenta altor vitamine, in

special Bo in lipsa cereia nu se mai sintetizeazd vitamind" PP din

p-alanina

Poate Ii sintetizat de plante gi microorganisme. Se absoarbe la nivelul intestinului fosfopantotenic. qi imediat, tot in aceste celule, este fosforilat la gruparea de alcool primar, formdnd acidul 4,-

82

Formele active ale acidului pantotenic sunt 4,_fosfopalteteina qi coenzima A (CoASH).

ctrr-i il-E+* l:i' i --- r r lL I I

r.r'cH2-cH2-s -c',- cH,-8i

P-alanina

Acidpantoic

1"';;;"

Acid pantotenic

CoASH

,
-O:P-o

pr,l

? "Hi' OH _ J;

k'-.J

Riboza

Rol metabolic

F CoA are ro1 deosebit in metabolismul glucidic, lipidic qi proteic fiind tratsportor de grupdri acil R-CO-. Legdtura dintre CoA gi restul acil se realizeazd. prin intermediul grupirii _SH rezuitdnd un tioester (R-CO-S-CoA) in care legdtura tioestericd este echivalentd ca energie cu o legeture macroergicd din ATp. F 4'-fosfopanteteina are rol in sinteza acizilor gragi. 4,_ fosfopanteteina este legatd de un rest de serind din proteina acil transportoare ACP-(Acyl Carrier protein), in complexul multienzimatic numit acid gras-sintetaza, complex ce catalizeazd sinteza acizilor gragi. . Tulburifile dup5. de aport vitaminic administrarea

la om sunt cunoscure numal de antagoniqti. Scdderea stare de

experimental.

concentratiei acidului

pantotenic se caracterizeazd, pnn

oboseald, ameleli, hipotonie musculard, tulburdri gastrointestinale (gastrite), scdderea rezistentei 1a infeclii. De obicei deficienfa de acid pantotenic este insofitS. qi de defrcienla altor vitamine. Din punct de

83

vedere metabolic apar deficienle in capacitatea de acetilare, eliminarea crescutE de 17-cetosteroizi si alte vitamine hidrosolubile. II. 1.7. Acldul derivate Acidul pteroilglutamic C), derivalii inrudili folic. Este constituit dintr-un heterociclu numit pteridinS., acid pamino-benzoic qi acid glutamic: ( vit.M, factorul U, factorul R, coenzima gi formele conjugate constituie grupul aciduiui follc pterollglutamicf 6l coenzimele

lacidul

\i

I
I

COOH

N/-CHr-'fIrN

-, HN- qH{CHr2-COoH
Acid glutamic

il

Pirimidini -+ i +Pirazi15+i * Acid p-NH2* i > i benzoicCABA) "-.> i Pteridini Acid pteroic-"""""""' i Acid pteroilglutamic

Rol metabolic (FH+), forma activd a acidului folic serveqte qi utilizarea fragmentelor de un singur carbon in diferite

Acidul tetrahidrofolic la transferul

stdri de oxidare: -CHs, -CHz-, -CH=, -CHO, -CH=NH, care se pot fixa la Ns, N10sau ca o punte metilenicd intre Ns Si N10lig.26. Metabolismul folatului este complex. Sursa de un atom de carbon este serina, care transferd gmparea sa hidroximetil la FH+ formdnd Ns, N1o-metilen-FH+din care se pot forma gi alte forme active: Ns-formil-FHa Ns_CH3_FH+, Nro_CHg_FH+, N5,N1o-metenil-FHa, Coenzimele acidului folic participi homoserini la sinteza metioninei din (Ns-CHa-FH+),sinteza acidului timidilic din acid uridilic

(Ns, N1o-metilen-FH+),in sinteza nucleului de purind (Ns, Nro-metenilFH+ qi Nro-formil-FH+) etc.

84

H,N("Y"Y;
No-\ I oH

r$

ir

l.l

,o

s-(cttz-Nrrn iH ,,,

Acid tetmhidrofolic (FHa)

../*-t-"\
-cH3
rEtil

--NF-->

N\./r\slcHr-N't
.\
N

tl0

cHc N5-nEri!FHa

cH. ----------> N s ' to l'

lr0 *.,EcHr7\ ""r'

-cH
nEtenil

NENlO

N5-N lo-nptenilFHa

-Q:o

--:;;;'+

.ii" "N5|"l:o '!

fonnil

./N.rfN=., | ll

I N\.'\ilcH,-N-

ro

r!
N10-formilFH+ ./N.rr-N\ | ll I to N=,,As-}-cHr-N-

../*-t-*\
ttr0 N\,,\s,,J_cHr-Nt" l C:NH
H

- CH ---:--> Ns llfrrmimino

rl '
IFC-NH

N5-brmimino-FH+

N l0 formiminoFlI4

Fig 26 - Atomii implicati in transferul fragrnentelor de un atom de carbon. Ns este locul de legare a grupdrilor metil, formimino, Nro locul ae telare af grupdrilor formil gi formimino, iar gruparile metilen si metenil formeazE prtr"gi i.rt atomii Ns $i Nro. "

-::

Tulburirl

de aPort vitaminic de absorbfie, deficit de enzime sau terapia prin cu unele

Deficienla de acid folic apare din cauza unui aport alimentar scezut, stres (sarcin5.), tulburdri implicate in sistemul de transport

medicamente. Carenla mari qi rare). Datoriti acidului relafiei strAnse dintre activitatea metabolismului folic gi cea a vitaminei 812, este destul de greu de a se manifesti exclusiv perturbarea hematopoezei, simptomul fiind anemia megaloblasticd (cu eritrocite

diferenlia simptomele clinice dintre cele doud stdri de carentd. II.1.8 Vltamina Brz {cobalamloaf si rolul el coenzimatic Vitamina antipernicios, Bn (cobalamina, ciancobalamina, factor factor extrinsec Castle) este un complex organo-

metalic, cu inel corinic (tetrapirolic), similar nucieului porfirinic, la care se adaugd ionul de cebalt. Nucleul corinic are substituite grupe -CHs, acetamidice gi propion-amidice. in centrul acestui macrociclu se gese$te ionul Co3*, cu num5.rul de coordinalie 6:4 legdturi se realizeazd cu atomii de N pirolici, o legiturS. cu gruparea -CN, iar a 6-a legdturd- se realizeaz6 cu dimetiibenzimidazol-ul. intregul complex, fird gruparea -CN, se numeqte cobalamind.. Radicalul R poate fi diferit, rezultdnd forme variate ale vitaminei, de exemplu: in ciancobalamind R=CN (ciancobalamina se formeazd in procesul de purificare qi reprezintd forma comerciald a vitaminei); in hidroxicobalamind R=OH; in 5'-dreoxiadenozilcobalaminS. R=5'XCHg.

deoxiadenozil; in metilcobalamine

I
86

CHr

CH2CH2CONH.,

cH2cH2coNHCHr-i -o-f-

I{
it

?"o
o

CH,
Absorbfia intestinald a vitaminei

Brz este mediatd prin receptori, in ileon, necesitdnd legarea vitaminei de o glicoproteind. foarte specificd, numitd "factor intrinsec,, secretat de celulere parietale ale mucoasei gastrice. Dupi absorblie, vitamina se leagi de o proteine plasmaticd, trapscobalamina II, in vederea transportului la tesuturi. in ficat, excesul de vitamind se depoziteazd sub formd de 5,_ deoxiadenozil-cobalamind (70%), OH_cobalamind (27o/ol sau netilcobalamind (3%), fixate pe proteine celulare. r Rol metabolic

Vitamina Brz pdtrunde in celuld, prin endocitozd, sub formd de OH-cobalamind, metilAndu-se apoi la CHs_cobalamind. O cantitate importantd intrd in mitocondrii qi se tralsformd in 5,_ d eoxiadenozil-cobalamind. Cele cobalaminei doud. forme sunt coenzimatice, in metabolic active, ale

a doud sisteme enzimatice: metilmalonil-C oA'izolrrreraza respectiv homocrstein_CHs_ transferaza (sau metionin-sintaza), care catalizeaza urmatoarele reactii:

implicate

func{ionarea

87

Homocisteind

Honncistein-transfer (CQ-cobalamina)

Metionina.

Reacfie de metilare (citoplasmi)

OH-cobalamina

L-nemmatorul-LoA

5'-deoxiadenozilcobalamina) .-=-=-.-+

Succinil_CoA

Reaclie de rearanrament innamolecular (mitocondde)

in absenla cobalaminei: a) reactia de metilare se opre$te, Ns-CHg_FH+se acumuleaze, blocAnd folatul in a$a numita l.capcarld a folatului, (fig 24). Astfel, homocisteina rdmdne nemetildtd. gi se poate elimina (homocistinurie), prin urind.

b) reaclia de rearanjare intramoleculara se blocheazd, acidul L_ metil-malonic se acumuleaza $i se elimina prin urina (acidurie metilmalonicd). Cobalamina $i folatul sunt implicate in diferite procese d.e metilare inclusiv metiiarea histonelor, in timpul repficarii ADN_ului

$'g.2al.

88

H,N-HC-COOH -l CH,

CH, tS

t-

cHr (metionina)

(homocisleina)

(metilcobalamind)

trirTtoerim IA

nEtlfrexat IG)
1\- Ll l i - r n4

a"r ror J ' a". J dftitrofolic

,l

1.,->NAJ)P

-/

xelpu*H* ^folar-redLrtaza

.-

v
Timidini

t
ADN

I
diviziunl oehlara Fig 27 - Rolul vitaminei Brz $i al acidului folic Metabolismul acidului folic Ai al vitaminePl2 sunt intergsrelate.ln lipsa acidului folic, formele active a1e acestuia Ns-NrofFH4 qi Ns-CH37mH+, implicate in siteza de purine $i timidina necesare diviziunii delulare, sunt delicitare, prin urmare multiplicarea celulara este incetinite. Un prim simptom este anemia megaloblastica. in lipsa vitaminei Brz, metil cobalamina CHg-Brz nu se mai formeaze, procesul de metilare aI homocisteinei diminue, formarea metioninei necesara metilSrii gaor compu$i esenliali este stopat6.. Gruparea metil rSlnerle blocate pe Ns-CH3rtrFH4, folalii rdmenand sechestrati in forma metihte, asa numita capcane a folahtui. Se instaleaz6 simptomele de anemie megalolasticS, iar dace [psa vitaminei Brz este de lunge durate, apar in plus Si simptome neurologice. Din acest motiv anemia megaloblastice tratate doar prin administrarea de folali poate masca deficitul de Br2, ca-re ulterior poate genera disfunclii neurologice majore. De aceea anemia rnegaloblasticS. trebuie tratate prin administrarea combinate de acid folic $i vitamine 812.

!9

TulbEriri

dc aport vitaminie

Sindromul tipic al carenlei de vitamind Brz il constituie anemia pernicioasd sau anemia Biermer, caracterizati, prin eritropoezd. megaloblastica, cu modiflc5ri ale leucopoezei qi formdrii de trombocite. AlterArile hematologice, caracteristice, pot fi insolite de astenie, paloare, dispnee, atrofia mucoaseior digestive, tulburiri neryoase (scdderea rS.spunsurilor reflexe gi a perceperii senzoriale, greutate in vorbire qi mers), c6.t 9i tulburiri gastro-intestinale. Anemia rezultd din perturbarea sintezei ADN, care a.Iecteazd formarea nucleului noilor eritrocite. In aceste cazuri globulele rogii circulante sunt, in mare parte, forme primitive qi cu viafd scurtd.. In carenta de cobalarnini pe langa modifrcdrile hematopoetice (modificiri int6lnite qi in carenla de acid folic) apar simptome neurologice, care devin ireversibile in cazul unui deficit prelungit. IL1.9. Vitamlna C (acidul ascorbic, factor antiscorbutic) La inceput, a fost denumit acid heruronic, av6nd o structurd asemdnetoare monozaharidelor. Forma L este cea mai activd.

3
HO-C

't

'o-+I
H -<]'

i__-l A

i___l o:f 9

Ho-f-u
cH2oH
Forma redusd (Acid ascorbic)

fl Ha
Ho-f-H

cH2oH
Forma oxidaa (Acid dehiclroascorbic)

Este sintetizatd de toate plantele, de unele microorganisme qi de majoritatea animalelor, cu exceplia omului, primatelor qi cobaiului, care sunt dependente de aportul exogen.

90

o Rol metabolic Nu are ro1 coenzimatic tipic, dar este necesar5 pentru buna funcfionare a creierului, ficatului, glandeior endocrine, in hematopoezd, hemoglobino-genezd, etc., participAnd reacfii de oxido-reducere. Principalele reacfii Ia care participd vitamina C sunt: hidroxilarea prolinei qi lizinei pentru sinteza colagenului, hidroxilarea fenilalaninei, sinteza catecolaminelor, hidroxilarea steroizilor, desaturarea acizilor graqi, absorbfia fierului, metabolizarea xenobioticelor etc. o Tulburirl de aport vitaminic 1a numeroase

Carenla vitaminei sau aportul alimentar redus poate conduce la tulburdri gastro-intestina.le, boli infeclioase, neoplazi| afecfiuni metabolice caqectizante Si \a apailia saorbututui. Apari{ia scorbutului este prebedatd de anemie, inapetente, scdderea rezistenlei la efort, infecfii, dureri articulare, uscdciunea
tF o rr? n F n fF l ^ r

intr-un

stadiu

mai

avansat

apar

hemoragii

subcutane,

musculare, gingivale. Apar leziuni a_le lesutului osos qi cartilagiilor, ca urnare a perturbdrii biosintezei colagenului. Stocajul normal al vitaminei C este suficient pentru cel pulin 3-4 luni inaintea aparitiei semnelor de scorbut. Nu sunt cunoscute efecte toxice, dar supradozarea poate de Ca insolubil, conduce la littazd- renald, datoritd formdrii oxalatului

c5.t gi datoritS. efectului nefavorabil asupra absorbliei vitaminei Br. II. 2. VITAMINE LIPOSOLI'BILE Din punct de vedere chimic vitaminele liposolubile fac parte din clasa terpenelor, compuqi polienici, constituili din resturi de izopren, unite cap la coadi. Dupd numS.rul resturilor izoprenice conlinute, pot exista in naturd monoterpene (2 resturi), sesquiterpene (3 resturi), diterpene (4 resturi), triterpene (6 resturi) $i tetraterpene (8 resturi).

Aceqti compuqi pot avea structuri

liniare, ciclice sau combinate. de

Vitaminele liposolubile cuprind in moleculele 1or ambele tipuri structuri.

Vitaminele Liposolubile se gS.sescin mod obiqnuit asociate cu lipidele din alimentele naturale. Absorblia lor se face in aceleagi condilii ca qi a lipidelor, adicd in prezenta grS.similor, a bilei gi a sucului pancreatic. Dupi vitaminele liposolubile limfatici sunt transportate de chilomicroni absorblie, pe cale

in sAnge unde sunt transportate de lipoproteine specifice, Sunt depozitate in ficat (vitamina A, D, K),

nefrind solubile in plasmi.

sau in lesutul adipos (vitamina E), pentru diferite perioade de timp. Supradozarea vitaminelor liposolubile conduce la instalarea unor steri toxice (hipervitaminozd) mai ales in cazul vitaminelor A gi D. Nu sunt excretate in urinS; in cea mai ma-re parte sunt eliminate pe cale biliard in fecale. Vitamina A (Retinol, axeroftol, vitamina

Ir.2.l. antixeroftalmic[,

vitamina {rnosolubil5. de cre$tere) Sub numele de vitamina A sunt cunoscute doud vitamine, r9
'8

retinol (Ar) qi 3-dehidroretinol (Az).

t6 l7 H

m
CH,OH
tf

H3

cH2oH

;-

-CH"
18 A1)

Retinol (Vitamina

dehidrcretinol r .A2) 3-uwrruvrvurvr ryitamiB \ '.^rr' ^2' "

Vitamina ,{1 este un alcool polienic cu 2O atomi de carbon, cu duble legdturi conjugate, conlindnd Ia un capd.tun ciclu de B-iononi. Vitamina Az este 3-dehidroretinol, ce conline o legd.turd.dubld suplimentard intre Cs gi C+. Gruparea de alcool irrimar din pozilia 15 se poate oxida in organism reversibil la aldehidS. (retinal) sau ireversibil, la acid retinoic.

,,\jt
Retinol

ot

.\..cH
Retinal

r1 5

----> ,,\.'oot
Acil retinoic

92

In organism, vitamina A se formeazS. in special la nivelul mucoasei intestinale, prin transformarea provitaminelor A (cl, I Ci fcarotenii) - prin oxidare 1a Crs. Randamentul cel mai bun este obtinut din p-caroten, care avAnd 1a ambele capete cicluri de p-ionond. va conduce la doud molecule de vitamina A.

B iononn

p caroten

B ionona

Ea se depoziteazd in principa.l la nivel hepatic; depozitul de vitaminS. A din ficat poate asigura necesarul organismului pentru o perioadS. lung5. de timp (chiar peste 1 an). Iipsa vitaminei E. Ingerarea indelungatd de alimente bogate in caroten duce la depozitatea acestora in lesuturi, apdrdnd xantodermia - ingilbenirea pielii, in special a palmelor qi tdlpilor, cu exceplia sclerelor care, rimAnAnd a1be, permit diferenlierea de icter. Hipercarotenemia nu atrage Si hipervitaminoza A. Vitamina A se gdseqte in produsele de origine animald in cantitate mai mare decet in cele vegetale: ficatul unor pegti de apd dulce, gdlbenuq de ou, lapte. Aceste depozite scad in

Rolurile eitaminei A F Vitamina A (retinol -CHzOH) este indispensabila vielii qi cre$terii norma-le (in privinla staturii qi greut6!ii). Retinolul exercitd acliune protectoare asupra epiteliilor, asupra mucoaselor, impiedicAnd pd.trunderea microorganismelor (acliune antiinfecfioasd), are rol in funclionarea aparatului genital gi de reproducere (spermatogenezd).

) Vitamina A, sub formd a" oxidarea retinoluiui,

.etinoic (-COOH), rezultatS. din ^cia aclioneazh in calitate de hormon prin legarea de

receptori nucleari responsabili de activarea unor gene. Acidul retinoic poate inlocui retinolul in cre$terea qi diferenlierea epiteliilor, fiind considerat chiar mai activ, dar nu poate substitui retinalul in procesul vederii. F Vitamina A (retinal) sub forma 1 1-cis-retinal (-CHO) este implicatd in procesul vederii. Clclul vlzual Vitamina A constituie gruparea prosteticd a tuturor existente in retind. este alcatuite dintr-o proteinS. specificS.numitd opsind sau "scotopsind" (scotos = intuneric), la care Rodopsina, pigment fotosensibil, este legatd vitamina A forma 1 1-cis-retinal. in procesul vederii, atunci cAnd, rodopsina este expusi lumind, au loc o serie de izometiz.Eti reversibile cis sunt convertite in impulsuri creier. la pigmenlilor fotosensibili vizuali, din celulele fotoreceptoare (conuri gi bastonaqe), retinolul sau

trans, ce + nervoase transmise de nervul optic la

11-cis-Retinal

A1l-trans-Retinal

Izomerizarea retinalului la lumind qi neglijabild

cis in trans are loc cu intensitate, mare Aceasta izomerizare in care se

la intuneric.

reaJizeazS. trecerea de la o stare bogat energetici, cis-retinal, la o stare saracS. energetic, trans-retina1, este insotita de degajare de energie convertita in miqcare atomicd care, amplificatI,, nervos. genereazS, impulsul

Izomerizatea cis-trans altereaz| geometria labili a moleculei de rodopsind, producdld desprinderea opsinei. Maximul de absorblie al rodopsinei se deplaseazd de la 500 nm (roqu) spre spectrul retinalului liber (380 nm) cu formarea unor intermediari cu maxime de absorbtie gi culori diferite. La intuneric, au 1oc reacliile de refacere a rodopsinei, care in 11-cis-retinal qi legarea necesitS"transformarea all-trans-retinalului

lui spontanS. de opsinS. in aceastS. etape sunt implicate reactii de reducere / oxidare 1a care participd ca acceptor respectiv donor de H, sistemul NAD./NADH+H-, in ca-litate de coenzimA a alcool dehidrogenazei (retinol dehidro genazdl.
, Rodopsina \

Opsina

(-cHo)
NADH
Alcool-dehidrogenaza NAD+

alCCHo) l(-oH)

l (-oH)

,ll
tl
Sange g lssuhrri

In retind se p[streazd un echilibru intre retina-l qi retinol care implicd schimburi continue ctt rezerva generald de vitamini A a + organismului (ochi sAnge + lesuturi). Instalarea rapidd a tulburirilor vizuale (hemera-1opie) in carenta de vitaminS. A se explicd prin scdderea refacerii rodopsinei din cauza aportului insuficient de precursori, ceea ce are drept consecinld. scdderearodopsinei din retind. Existenla hemeralopiei independent6 de carenla de vitamind A (albinism, la bdtrAli in glaucomul cu cataracte, diabet, graviditate,

boli hepatice, intoxicalii

cu alcool, Pb, As etc.) s-ar putea datora +

retinoltr 9i faptului cd in procesul vederii participi gi alte vitamine (Br qi Bz) qi a1!i factori, hormonal.i sau alter5rii echilibrului "retinal de altd naturd, factori mai pulin cunoscuti. . Necesarrrl de vitamind A este in funclie de greutatea corporald, vArst6, climat, stare fiziologicd.. Necesarul este mai mare in regim bogat in lipide. o Tulburirile imprejurdri: de aport vitaminic se pot insta.la in diferite de a in absorbtia lipidelor, lipsa din alimente, incapacitatea organismului

transforma carotenii in vitamina A, tulburdri

carotenilor gi a vitaminei, depozitarea insuficientS. (boli hepatice), defrcienlA de Zn (necesar mobilizdrii vitaminei A din ficat), ma-inutrilie proteicS.. Deficienta de vitamin5. A, la copii 9i animale tinere: Y afecteaz\, sistemul osos (oprirea creSterii oaselor, erupfii dentare intdrziate, rdddcini rdu implantate, alterarea emailului dentar) gi apoi a lesuturilor moi. ) duce la oprirea divizipnii celulare qi atrofia celulelor deja formate, Ia interzierea severd a creqterii inclusiv a sistemului nervos. F duce 1a keratinizarea epiteliilor, indiferent de originea 1or, ceea ce conduce 1a tulburdri a1e glandelor exocrine, lacrimale, pie1e, tractusul digestiv, respirator, urogenital. Carenta de vitamind A se manifestd in principal la nivelul ochilor prin: sciderea capacitelii de adaptare de Ia lumind la intuneric (nictalopie) qi sciderea acuitdlii vizuale cu ingustarea spectrului vizual pentru albastru-galben precum $i oboseala la citit (hemeralopie). Dacd avitaminoza se accentueaze qi este de lunge durate apar leziuni a1e epiteliului conjunctiv (xeroftalmie), manifestatd prin uscarea epiteliilor (xerozd), atrofra glandelor lacrimale (cu scS.derea lacrimilor qi umectare insuficienti) qi lipsa de lizozirn (factor de proteclie antimicrobiand). Corneea se opacifiazd, continuAnd cu perforarea purulentd a ochiului

96

(keratomalacie), proces care d.uce la orbire (cecitate). Carenta de vitamind. A poate fi insofltd de infeclii sponta-ne. > Hipervitaminoza A

Dozele excesive de vitamini. A produc fenomene de intoxicatie acutd., manifestatS. prin amefeli, cefalee, somnolenta sau intoxicare cronicS. (anorexie, tegumente uscacte, buze uscate, ragade comisurale). Megadozele de vitamind A produc reabsorbfia oaselor prin stimularea activite$i proteolitice lizozomale, stimuiarea secre(iei de parathormon (PTH) 9i efecte teratogene la femeile gravide. Consumul exagerat de caroteni produce ,,icterul carotenic,,. CAnd se depdQe$tecapacitatea de fixare a proteinei de legare a retinolului (retinol binding protien - RBC) are efecte litice asupra membranelor biologice. Lezarea membranelor eritrocitare de cdtre retinol este inhibatd de vitamina E (tocoferol). I IL2.2. Vitamina D (colecalciferol, vitamina arltirahitici) Grupul vitaminelor D este reprezentat de cinci vitamine cu structurd. chimicS. 9i acfiune asemenetoare notate de Ia 2 la 6. Provitaminele D sunt derivali sterolici cu structura urmatoare: ciclopentaloperhidrofenantren. radica-1ului R.
\,.J | ,.'"3

Ele se diferenfiazd dupd structura

-CIHH<H_gl_cH
t\

CH3 'cH3 Fxgosterol,provitaminaD2 (ergocabiferol) qH.

R -in-cs,-cn

-cs^-61-"'
cHr

7-dehilrocobsteroL provitamirn D3. (cobcabiferol)

97

Precursorii

nu

prezintE

aclivitate

vitaminice.

Activitatea

vitaminicd se dobAndeqte prin activare, proces care cuprinde dou5. etape: activarea primari 5i activarea secundare.

r'o'utrcoffififfi

viamlne I -l-aSffisecrinoara>

a2 -a activaresecundara ^^-- ^ 1.15-1oH12_D zJ_\Jn_u----------------

o,.{

Activatea

primari.

Transformarea

provitaminei

in vitamina

prin deschiderea, sub acliunea razelor ultraviolete, a D se reaJizeaz1. inelului B intre Cs $i Cro cu apari{ia unei duble legdturi intre Cro gi Crq. Rezulta o trien5., care constituie structura de bazd, ce conferd activitate biologicd comund (antira}ritica), catenele laterale fiind resposabile de intensitatea pctivitelii vitaminice. Suprairadierea duce la compugi toxici. . Activarea secundari conste din dou6. procese de hidroxilare succesive ce au loc in ficat gi rinichi. Prima hidroxilare a vitaminei Ds are 1oc in ficat, in pozi{ia 25 a catenei laterale, formdndu-se 25-hidroxi-Dg. A doua hidroxilare are loc in rinichi, unde forma hidroxilatd in pozifr.a25 suferd o noud hidroxilare in pozitia o la carbonul 1. Rezultd 1,25-dihidroxi-colecalciferolul sau 1,25-dihidroxi-Dg care este forma vitaminicd cu activitate maximi in metabolismul calciului. Derivatul monohidroxilat (25-OH-D:) este de 4-5 ori mai activ decdt vitamina D3, in prevenirea rahitismului, iar derivatul dihidroxilat 1,25-(OH)z-Ds este de 2O-30 ori mai eficient decd.t D: in transportul intestinal de Ca** Si respectiv, in prevenirea rahitismului.

98

7-Dehidrocolesterol

u.v.l(niele)

,^.fl,!r
f I

.^-A
T
I | Y ficat

YR

!7,fcllfteror (viraminaD3)

'../W

oH

25-OH-D3

d'^.."o.,/

al )r-

"?*a$ *

r' ' .-a>

1,25-Dihidroxi-D3 (calcitriol)

24,25-Dihidroxi-D3 (inactiv)

Rolul metabolic d vltamlnel

Vitamina Da este privitd astdzi mai mult ca un hormon decdt ca o vitamind. 1,2S-(OH)z-Dssau calcitriolul regleazd metabolismul fosfo-ca.lcic prin acliunile exercitate asupra tesuturilor tint5.: intestin, os, rinichi (fig 28).

Fig-28. Metabolismul Si acliunea vitaminei D. Forma activa a vltamlnei Ds, 1,25_ (OH)r-D:, aclioneazd la nivel intestinal ai osos stimuland absorblia respecti" 'n""."^ calciului, iar la nivel renal impiedicAnd eliminarea lui I1l.

calcitriolul este transportat la locul de acliune unde se fixeazd pe proteine receptoare citoplasmatice qi > apoi este translocat la nucleu unde printr-un acliunii unui hormon steroid induce mecanlsm similar unei proteine sinteza

La niuelul intestinului

I
100

transportoare

de calciu

(Calcium

Binding

protein

CBp) care

favoizeazi absorbtia de Ca** contra gradientului de concentrafie. Le nilur.tut htbilor renall I,2S-(OH)z-Ds stimule azE sinteza :> CaRP renale qi deci reabsorbfia, preintAmpindnd excretia de Ca**. nive1atl osului actiunea 1,25-(OH)z-Ds este mai )> ta compiicatd qi mai pulin clar6. Vitamina asiguri. fixarea Ca** qi pO+s-in spaliile libere dintre capetele nespiralate ale moleculelor de colagen gi stimuleazi" sinteza unei proteine specifice care leagi Ca**, osteocalcina. Calciul se fixeaz1. in faza minerald a osului, sub formE de hidroxiapatita, Caro(pO+)o(OH)2, aleturi de cantitdti mici de citrat, Na*, Mg** qi CO3z-. u ;y'?Fu :Arutdrl de aport vitamlnic Htpottttaminozq. D >r Formarea defectoase in piele a vitaminei Dg, aportul alimentar scdzut gi/sau defecte intestinale de absorblie a vitaminei pot duce la stdri de hipouitaminozd D. Hipovitaminozele D conduc la stdri de boali" care se manifestd prin: - defecte in mineralizarea osului. - perturbari in metabolismul mineral (Ca.. gi pOa:J Si a secretiei de parathormon (PTH); in deficienla de vitamind D absorblia de Ca2* fiind perturbatd apare hipocalcemia, insolitd secundar gi compensatoriu de cre$terea secretiei de PIH, care determini mobilizarea Ca2* din oase pentru normalizarea calcemiei. Din caracteizatd, punct prin de vedere biochimic hipocalcemie hipovitaminoza sau D este

moderatd

normocalcemie,

hipofosfatemie, activitate crescutS. a fosfatazei alcaline. nivele crescute de parathormon gi scdzute de 1,25-(OH)z-Ds. Din punct de vedere clinic, hipovitaminoza D este caracterizata de scdderea rezistenlei Hipovitaminoza D la mecanice a oaselor (inmuierea oaselor). copii se nume$te rahitism iar 1a adult

l0l

osteomalacie.

La

adult,

rezerva

de

calciu

fiind

mai

mare,

hipovitaminoza se instaleazS.mai greu. Hipocalcemia dezvoltd 1a adult osteoporoza (reducerea masei osoase pe unitate de volum la un nivel situat sub cel necesar funcliei normale). Osteoporoza apare la femei postpartum sau dupa instalarea menopauzei, ceea ce dovedegte dependenta hormonalh a acesteia. Tratamentul cu estrogeni previne instalarea osteoporozei (se pare c5. estrogenii protejeazd osul impotriva agentilor care determind. resorblia osului, in special pTH). Sunt descrise boli genetice datorate unui defect i:r sinteza renald a 1,25-(OH)z-Ds,care produc rahitismul dependent de vitamina D (tip I) gi mai rar boli cavzate de deficienle ale receptorului citoplasmatic pentru 1,25-(OH)z-D:, care produc rahitism independent de vitamina D (tip II). ) Htperuita ndnoza D Dupa ingestia cronicd, oral5., a unor doze mari de vitamind D pot apare intoxicatii cu vitaminE D caracterizate prin anorexie, v5rshturi, diaree, astenie, mialgie, pierderi in greutate, hipercalcemie, hipercalciurie. Patologic are 1og calcifierea lesuturilor moi qi in special la nivel renal (nefroca-lcinoza), cornee, aortd, pldmdni, inimd.. Suprimarea administrdrii de vitamind" D, prin aplicarea unui regim sdrac in Ca, produce o mobilizare lentd. a Ca din lesuturile moi qi revenirea la normal a calcemiei. Atunci cdnd nu este compromisi. grav, functia renali se normalizeazd,, IL2.3.

Vltaminele

E (tocoferolii, vitaminele

antisterilitdtii,

vitaminele de reproducere) Numele de tocoferol provine de la funclia biologicd de a favoriza fertilitatea (tokos - na$tere; phesein - a purta). Vitaminele E sunt un grup de vitamine - tocoferoli - formati dintr-un nucleu de croman substituit qi o catend lateral5" ramificati _
rtfll-

r02

cr,Tocoferol Sunt patru tocoferoli importanli: d, p, T, 6 - care se diferenliazb. intre ei prin numdrul de grupiri metil din nucleul cromanic; proprietSlile vitaminice sunt proporlionale cu numSrul grupelor -CHs, deci o-tocoferolul va fi ce1mai activ biologic, avend trei grupdri metil, 5, 7, 8-trimetil tocol. Absorbtia vitaminelor intestinului liposoiubile. ,tocoferolii trec in se,nge unde sunt vehiculali de p-lipoproteinele plasmatice, apoi sunt repartizafi in toate organele, depozitele fS.cAndu-sein lesutul adipos. Intracelular, vitaminele E se acumuleazd- in membranare citoplasmatice gi mitocondriale 9i De 1a intestin, pe cale limfaticd, sublire, in E din a1imentalie are loc la nivelul ca qi celelalte vitamine

aceleagi condilii

fosfolipidele in reticulul

endoplasmatic. Concentralia vitaminelor E in aceste organite este in funclie de aportul vitaminic, de peroxidanli, antioxidanfi, de seleniu alimentar gi de aportul de aminoacizi cu sulf. in procesele metabolice, tocoferolii sunt tralsformafi in compuqi chinonici, hidrochinonici care se elimind prin bild, 8Oo/o, iar restul prin urind, sub formd conjugatd cu acidul glicuronic. O E nol biochimic. Vitamina E nu are o functie biologicd specificd pentru a explica numeroasele consecinfe care apar in carenla de vitamind E la animalele de experien{5 (este vitamina in ceutarea unei boli). Acliunea qntioxidantd. Vitamina E este consideratd ce1mai / eficace antioxidant liposolubil nafural. Substanlele cele mai sensibile la peroxidare sunt lipidele celulare gi lipidele din membranele

103

organitelor nesaturate. Sub

subcelulare,

Si

dintre

acestea in

special,

lipidele

acliunea

oxigenului

molecular,

acizii

polinesaturali

formeazS peroxizi lipidici prin peroxidare, proces autocatalitic, care se desfhgoard dup5. un mecanism radicalic, prin reaclii inldnfuite:
(QtL J9-qJJr,,. p. * H. R-OO + R. + A

Initierc:

a-H

R'+ 02Propagare: intrerupere:

R-H+ R-OO.-=+R_OOH AH + R-OO.-->R-OOH

A' este un radical stabil, provenit din tocoferol, capabil sd inhibe propagarea reacfiilor radicalice in lanf din peroxidarea lipidicd..

cl- Tocoferol -->

,.CHz

Radical tocoferil putin reaotiv

Tocoferil-chinond stabile

Acliunea pentru viala

antioxidantd

a vitaminei impreund

E are o importantd cu vitamina

mare

C $i alti antioxidantri alimentari ar fi implicali in protejarea cdilor respiratorii qi mai ales a tesutului pulmonar de acliunea nocivd a aerului poluat (Os, NzO). Efectele nocive ale oxidanlilor pot fi ilustrate prin schema urmatoare:

celulei, intrucat

I
104

Acizi gragi polinesaturati din fosfolipidemembranare AntioxldalF Ql @ Oxidanri (v{arruuE) (Fe2+, Cu2+, 02) I Y Peroxizilipidici

I v
Degradarea acizilor gra;r din fosfolipidele membranare

--- _ r f^--.--. urobule ro$u

/''

-''

t\
Reticul endoplasmatic

I
Fragilitate_crescutil 5ihemolizn Pemreabilitate crescuE | I Eliberarea enzimelor hidrolitice { Modificiri la nivel tisular

I
Dezintegraxea struch.uilor necesare acliriii enzimelor prezente la acest nivel I n"ctivarea enzimelor

eE 2-

T:ulb:uteri de aport vltaminlc E --' gilooltatnlftoza Efectele carenlei de vitamind

E sau hipovitaminozei E se de perioada de deficit

manifestd gradat $i progresiv in funclie vitaminic.

Semnele deficienfei de vitamind. E la om se manifesti paralel cu perturbarile absorbliei de grdsimi qi constau in: slhbiciune musculare, fragilitate eritrocitarS., fenomene care dispar prin administrarea vitaminei E. Independent de gradul de alterare a lipidelor, la animale, s-au evidenfiat tulburdri a1ecapacitdlii de reproducere la ambele sexe.

105

Nu sunt dovezi care se ateste cd vitamina E, la om, este necesard pentru fertilitate. Totugi, sunt unele date conform cd.rora concentraga sanguina de tocoferoli cre$te progresiv in sarcin5 p6ld la 50-100% sau chiar mai mult in ultima lund fald de primul trimestru de sarcind. Aceasta constituie o condifie pentru evolu{ia qi dezvoltarea Revenirea la valori normale se face in primele 2_5 tuni de la na$tere, insd concentratlia ei creqte in lapte. La femeiie cu avort habitual, concentratia tocoferolului in s6'ge este de 2_4 ori mai sc6zut decAt la femeile cu sarcind normald. ) Elpteruttannlnoza Administrarea duce la involulia inferioare. E gi abuzivd de vitamind E, Ia om. indelungati lhtului.

ovarelor, tulburdri

nervoase qi dureri ale membrelor

II.2.4. Vitaminele K (Fllochlnona) si rolul lor coenzimafic Grupul vitaminelor K (Filochinona, vitamina coaguldrii, vitamina antihemoragicd, factor protrombinic) sunt derivafi de nafiochinond care la Cs conlin.sau nu un radical variabil de atomi de carbon.

R=

"rr"*oxlt"-,"r,-"",-lxlcHr3-H
fin]l

R=

(CH'{H{_CH,-H dihmesil

cH" t-

Vitamina Kr (filochinona) are la Cs un larlt lateral de litit (20 atomi de carbon). Vitamina I{z (farnochinona) conline un radical difarnesil {30 atomi de carbon).

I
106

Vitamina IG (menadiona) - in care radicalul R este H, este sinteticd qi este solubild in apd spre deosebire de Kr Si Kz. Vitamina K este produsd in intestin de bacterii intestinale sau adusd prin aport alimentar. Absorblia vitaminelor Kr qi Kz (natura-1e)se face impreuna cu lipidele, apoi pe cale limfaticd trec in se,ngeqi de aici in ficat. Cea mai mare cantitate a vitaminelor K naturale se depoziteazd temporar in Iicat; vitaminele K sintetice frind solubile se absorb in absenla sdrurilor biliare. Ele nu se acumuleazi, excesul find eliminat prin glucurono- sau sulfo-conjugare. e ,.Y Rohtl metabolic al vitaminei K Principalul ro1 al vitaminei K este in modificarea post transcripfionali a unor proteine in principal a factorilor coagulirii, unde in calitate de coenzirrrd,participi,la 1-carboxilarea unor resturi glutamil prezente in aceste proteine. I. (factorul iI), proconvertina Proteinele coaguldrii: protrornbina

(factorul VII), factorul Christmas (factorul IX), factorul Stuart (factorul X), sunt sintetizate in ficat sub formd de precursori inactivi (zimogeni). Pentru ca aceqti factori sd fie transformali in formele biologic active este necesard carboxilarea posttranscdplionald a resturilor glutamil, din precursori, la acid 1.- carboxi glutamic, carboxilare catalizate de vita-rnina K.

qooCH,,
I

-OOCI
_--:________-__>

I-c-cH-NlF ll

CH,

t-

co,

TCOOCH
/alr r'

VitaminaK

i _C-CH_NIF

tl o
Gla Acid T-carboxi-glutamic

Glu Acid glutamic

Resturile carboxil au o mare capacitate de chelatare a ionilor de Ca2* care servesc la legarea fosfolipidelor cu protrombina interacliune

107

specifice pentru activarea protrombinei la trombina, factorul activ al coaguiSrii (fig 28).

Fig 28. Rolul vitaminei K in coagulare. precursorii factorilor coagderii sunt sinteti"ali in formi inactivd, caractirizatn de prezenla .*Li- g*pa.i carboxil. Ei sufere procesul de activare sub acliunea ,iil;"i K, conste in ;;!"" -pr*i.riu"""to, introducerea_ unei g.upari carboll. !,,ffi-*i".". ""r" doue grupari carboxil (incdrcate nesativl in pozilie adiacentd, fi*;;;; u5urinta ionii Ca2*, ducr6nd la formarea lomolexului protromUinJcJcif*ii*sange. Acesta leage fosfolipidele de pe suprafal-a plachetilor, in p"-"""r.,t de coagulare "*pa-;;H;

Si warfarina (derivali cumarinici) inhibd reaclia de carboxilare.a acidului glutamic $t sunt folosili ca agenti anticoagulanli atunci cAnd existd primejdia coaguErii sAngelui la nivelul vaselor sanguine (tromboze). o T\rlburiri de aport wltaminic K se instaleazd cand existd. tulburdri in absorbtia de lipide (deficit de bild), afecliuni intestinale, alterarea florei intestinale, afecliuni hepatice, boli infeclioase. K duce la scdderea protrombinei. prelungirea timpului de coagulare Si aparilia de fenomene hemoragice spontane. in perioada imediat postnatale, nou n5sculii sunt predispugi la hemoragii deoarece se nasc f6r1. rezewe de vitamind K, av6nd intestinul sterii. Careanla de vitamind Carenla de vitamind

Antivitaminele

K, dicumarolul