Sunteți pe pagina 1din 61

INTRODUCERE Ultimul deceniu al secolului XX-lea tiina oenologic s -a impus printr- o ampl desfurare a investigaiilor, ce in de unii microcomponeni endogeni

cu proprieti deosebit de importante pentru organismul uman. n aspect geografic, aceste cercetri cuprind toate continentele unde se culti v via de vie. Substanele , care au focalizat n mod deosebit atenia cercettorilor oenologi, chimiti, iginieniti, fa rmaciti sunt : resveratrolul i proantocianidinele- componeni de natur fenolic, laitmotivul binecunoscutului paradox francez( Scut aru I., 1995). De mai bine de zece ani, britanicii i americanii ncearc s dezlege miracolul francez. Dei francezii au o dieta bogat n grsimi, unt, brnz, carne, foie gras(ficat de pasre gras, produs printr - o tehnologie special) i toate deliciile din fructe pe care inima le cere, tot ei sunt cei care sufer cel mai puin de boli de inim.Mult mai puini francezi sufer de cancer intestinal sau b oli reumatice dect americanii, mai puin au probleme la circulaia sngelui , au anse mai puine s se mbolnveasc de osteoporoz i cu mult mai puini tineri francezi dect cei americani au probleme de digestie sau fac alergie la anumite alimente. n acest context e de men ionat i problema obezitii :doar 10% dintre francezi sunt declarai suprapondera li, n timp ce 22% dintre britanici i 33% dintre americani sunt declarai obezi. Compuii biologici activi descoperii n vinul rou, alune sau alte produse vegetale au prezentat, n urma cercetrilor, capaciti de prelungire a duratei de activitate vit al la organisme cu regim limitat de calorii. Savantul David Sinclair, doctor n tiine medicale i cercettor la Harv ard Medical School, a observat n studiile sale c resveratrolul i proantocianidinele au un puternic efect antioxidant i anti coagulator, mpiedicnd blocarea vaselor sangvine,care este cea mai frecvent cauz a atacurilor cardiace i congestiilor cerebrale. Studiile efectuate la Universitatea din Harvard explic, ntr - o ultim msur, de ce persoanele care consum moderat vin ro u alturi de fructe, legume i crnoase( nu grase) prezint un risc minim n ceea ce privete accidentele cardio -vasculare. Aceast descoperire ar putea duce la crearea unor noi medicamente sau aditive alimentare pentru prelungirea durata vieii, pentru pr evenirea sau tratarea maladiilor cardiovasculare i c elor legate de mbatrnire(Gaina B.,Roman O., Bourzeix M. et al., 2007).
1

1. Rolul curativ i nutritiv al compuilor biologic activi din struguri i vin nc din cele mai vechi timpuri n medicin se folosete t ratamentul cu struguri. Razes din Babilon (a. 950 p. Ch.) i Hipocrate din Grecia Antic foloseau pe larg strugurii i mustul la tratarea multor boli. O utilizare mai ampl dateaz din secolul al XlX-lea, cnd ampeloterapia, bazat pe rezultatele obinute n medicin, biologie, biochimie se aplic pe larg n Frana, Germania, Italia, Elveia . n Moldova leagnul ampeloterapiei este oraul balnear Camenca, unde la nceputul secolului al XlX-lea contele P. H. Vihtphenschtein a folosit pantele sud vestice ale Nistrului pentru cultivarea soiurilor de mas aduse din Frana, Italia i Elveia cu nalte proprieti curative. Contele a deschis pe teritoriul moiei sale un spital, n care se aplica ampeloterapia la tratarea invalizilor rzboiului ruso -francez din 1812. n prezent, pe locul unde se afl acest spital mic a fost construit un sanatoriu cu peste 500 de locuri. Aici se aplic pe larg ampeloterapia i se trateaz pacieni din toate rile fostei U.R.S.S. (KARPOV S., 1997). Conform rezultatelor obinute, bobiele de struguri exercit asupra organismului diferite aciuni: diuretic, purgativ, sudorific i, dup cum s - a mai menionat, amelioreaz schimbul de substane i normalizeaz tensiunea arterial. Ampeloterapia se recomand la tr atarea anemiei, astmului bronhic, a hemoroizilor, bolilor hepatice de rinichi etc. Este necesar s menionm c strugurii sunt contraindicai n cazul ulcerului gastric i duodenal, bolilor trac tului intestinal, diabetului zaharat, obezitii , iar n cazul aciditii ridicate a stomacului vinul se consum atent, selectndu -se vinuri cu aciditate sczut . Vinurile de struguri conin cantiti minime de vitamine, care nu pot satisface pe deplin cer inele organismului, ns diversitatea i aciunea complex a vitaminelor determi n importana lor. Vitaminele B 1 , B 2 , B 6 , B 12 , PP i acidul pantotenic sunt prezente n cantiti ce satisfac aproximativ 10% din necesitile zilnice ale omului. Biotina i acidul folic se gsesc ntr - o msur mai mic, iar mezoinozitul n cantiti ce corespund aproximativ necesarului zilnic al omului. n vinurile roii multe vitamine (mai ales vitamina P) se gsesc n cantiti mai mari comparativ cu cel e albe. Substanele tanante din struguri i vinurile roii posed aciune antiradioactiv, iar pectina stimuleaz eliminarea din organism a stroniului. n vin s-au descoperit multiple microelemente, dintre care 24 de elemente, inclusiv mangan, zinc, rubidiu, fluor, vanadiu, iod, titan, cobalt etc. care sunt de o importan vital , cnd trec din struguri n vin. Dintre substanele minerale cele mai
2

mari cantiti (pn la 4 g/l) se ntlnesc n vinurile supuse fermentrii pe botin, n special n vinurile roii seci i de tip Madeira. Predominant este potasiul i fosforul, care joac un rol important la reglarea echilibrului acido - alcalin i prevenirea deficitului n schimbul de sruri. Vinurile albe seci conin mai puine substane minerale - p n la 2 g/l. S- a dovedit c vinul nltur oboseala organismului, intensific activitatea slbit a inimii. Bunoar, pentru ntreinerea activitii slbite a inimii mpreun cu alte remedii profesorul Zaharin G. A. aplica i vinul de struguri. Iar cunoscutul medic, p rofesor al Universiti din Moscova, Golubev N., timp de 50 de ani a practicat vindecarea cu vin de struguri. El considera c cea mai bun butur pentru ridicarea tonusului vital i a activitii slbite a inimii este vinul spumant.La vindecarea bolnavilo r epuizai i slbii el folosea vinurile tari de tip Madeira i Portwein, prescriindu-le doar c teva linguri pe zi. Vinurile albe seci posed, dup prerea lui, aciune tonic asupra sistemului nervos i a inimii i se pot prescr ie bolnavilor n cantitate de p n la 0,5 1 pe zi. La tratarea cu vin este important s se in cont de starea organismului i posibilele contraindicaii. La Institutul de Cercetri tiinifice a Metodelor Fizice de Tratament i Medicin Climatologic I. M. Secenov din lalta s -a acumulat o experien pozitiv de tratare cu vin a bolnavilor cardio -vasculari. S- a demonstrat c vinurile naturale din struguri acioneaz favorabil asupra oamenilor de vrst avansat, normal iznd somnul , i totodat se consider ca fiind secret u l snt ii bune i a vieii lungi, dup cum afirma i Platon "Vinul este laptele btrnilor". n rezultatele cercetrilor efectuate asupra aciunii de vindecare cu vinuri, efectuate de doctorul Eilo (Bordeaux, Frana), s - a fcut ncercarea de a crea un cod oenoterapeutic. n acest cod, de exemplu, se recomand, n caz de anemie, consumarea nainte de mas a vinurilor roii seci n cantitate de dou pahare ; n caz de ateroscleroz se recomand vinuri albe seci cu ap mineral n cantitate de 0, 5 l pe zi; n caz de vome-vin spumant rece ; n tuberculoz acut se recomand vin ro u n cantiti mici; n diabet - vinuri de mas tinere; suferinzilor de avitaminoz li se recomand toate varietile de vinuri n cantiti dieteti ce; n caz de dizenterie se consum vinuri ro ii seci. Bolnavii de grip, pneumonie i pneumonie bronhic deseori folosesc vinuri roii fierbini cu zahr, aa -numitele glintwein. n Moldova este binecunoscut practica tratrii rcelilor, guturaiului, gripelor cu vin ndulcit cu miere i picant cu piper rou numit izvar .
3

Prof. Sinikin V. a constatat c victimelor avariei de la Ce rnobl le este foarte indicat cte un pahar de vi n rou sec zilnic. Astfel, n 3 - 5 sptmni coninutul cesiului radioactiv din snge scade de 3 ori. Aceasta ne vorbete despre efectul de protecie al vinurilor roii mpotriva contaminrii radioactive.

Desigur, cea mai important problem a oenoterapiei este alegerea tipului i dozei vinului. Vinul, ca i orice substan medicinal, luat n doze excesive, aduce daune sntii, iar n cantiti mici are aciune benefic. Acesta e un factor important n t ratarea diferitelor afeciuni. n ceea ce privete dozarea, e bine s se in cont de proverbele populare : Vinul te nveselete cnd l be i n cantiti mici, iar cnd l bei mult te stpnete.Ce nseamn A bea cu msur? nseamn s consumi att ct s simi noi fore, o nou energie, s sesizezi claritatea i agerimea gndirii i fineea mediului ambiant. A indica aceast msur ca un etalon unic este im posibil fiecare trebuie s i - o cunoasc singur. Dup prerea sociologilor francezi, cultura consumrii buturilor alcoolice determin n mare msur cultura societii n general. Arta consumrii i aprecierii vinului este unul din elementele de baz a culturii omului.

n concluzie, abord nd problema rolului curativ i nutritiv al compuilor biologici activi, se cere de menionat, c coninutul lor n struguri, must i vin este relativ sczut. ns n ansamblu efectul lor sumar asupra proceselor vitale n organismul uman este considerabil. Aminoacizii, coninndu - se n cantiti mai importante, alturi de acizii organici, prezint un factor important n reglarea multiplelor metabolisme contribuind la asimilarea mai complet a glucidelor, lipidelor i pol isaharidelor n procesele nutriiei umane. ns rolul curativ decisiv l joac compuii cu proprieti biologice nalte numii - resveratroli, proantocianidine, i anume lor le revine rolul decisiv n protecia organismului contra proceselor nefaste genera te de majorarea concentraiei n radicali liberi i agravarea maladiilor cardio vasculare, a diabetului zaharat, cancerului, mbtrnirii rapide a pielii i a organismului n ntregime.

2. Principalii compui biochimici activi din struguri i vinuri Rolul benefic al vinurilor roii asupra organismului uman este bine cunoscut, datorit coninutului n alcool, acizi organici, substane azotate, polifenoli, substane minerale etc., vinul se constituie i ca un aliment energetic ( rdea C., Srbu Gh., rdea A., 2000). Un litru de vin sec are un potenial energetic de 600 -800 kcal, iar un vin licoros care este mai bogat n alcool i glucide - n medie 1700 kcal (Gaina B.,2000). Datorit coninutului n acizi organic, a ionilor de hidrogen (p H), a compuilor fenolici i, n primul rnd, a taninurilor, l - a determinat pe Louis Pasteur pe bun dreptate s afirme nc din secolul al XIX - lea c "Vinul este cea mai sntoas i cea mai igienic butur". Aceasta se datoreaz, mai nti de toate, prezenei legturilor fenolice, multe dintre care ntresc vasele sangvine astfel mpiedicnd dezvoltarea aterosclerozei i a altor boli cardiovasculare, posed o aciune bactericid i o activitate antioxidant nalt .
Aciune antioxidant Aciune antiinflamatorie

Aciune anticancerigen

Aciune de ntrire a vaselor capilare

Complexul substanelor fenolice

Captatori de radicali liberi

Aciune antiviral

Aciune antihistaminic

Aciune de ncetinire a mbtrnirii celulelor

Eliminarea substanelor toxice din organism

Figura 1: Aciunea biologic a substanelor fenolice asupra organismului uman S-a constatat c n rile n care se consum zilnic vin rou, cum ar fi Frana (Bordeaux), Italia, Spania, frecvena maladiilor cardio -vasculare este cu mult mai sczut dect n rile n care se prefer preponderant buturi tari i mai puin vin. Ca urmare consumului zilnic de vin, longevitatea este mai mare, iar infarctul miocardic i accidentele vas culare cerebrale snt mai reduse (Pomohaci N., Cotea V.D., Stoian V., i col.,2000).
5

Despre aciunile benefice ale vinului rou asupra organismului uman se vorbete tot mai frecvent, datorit coninutului compuilor fenolici,i n primul rnd, a proantocianidinelor, cu nsuiri biologic active importante.( Brenna O., Pagliarini E., 2001 ; ., .., 2005). S- a demonstrat experimental c unele substane fenolice ar putea prelungi durata vie ii cu 30- 50% (Brenna O., Pagliarini E., 2001). Rezultatele numeroaselor cercetri au demonstrat c cele mai puternice aciuni ale substanelor fenolice se atest la substanele: resveratrol, cvercitina i dihidrocvercitina. Aceste substane ncetinesc oxidarea membranelor lipidice, previne aciunea duntoare a radicalilor liberi, prentmpin mbtrnirea celulelor.

Figura 2 : Structura chimic a cvercitinei i resveratrolului. Resveratrolul(3,5,4'- trihydroxystilben) dup clasificare se atribuie la fitoalexeni - substane sintetizate de ctre plante care asigur o imunitate nalt(le apr de infeciile micotice i bacteriene).Cantiti importante de resveratrol se acumuleaz n pielia boabelor de vi de vie, de aceea vinurile roii fermentate pe botin conin cantiti mai mari de resveratrol n comparaie cu vinurile albe de mas, a cror proces de degradare a glucidelor e derulat normal. Pe de alt parte, exist opinii c aciunile pozitive ale resveratrolului se manifect numai n cazul unor concentraii avansate ale a cestuia care nu exist n vin (C order R.,2009). Pe baza resveratrolului i a dihidrocvercitinei, industria farmacologic autohton i cea strin produce preparate medicamentoase cu aciune antioxidant, regeneratoare, dezintoxicant i diuretic (A.Flucol, B. Flucol, Resvert, Red Wine Ext ract, Red Wine Plus i altele). Cvercitina, ca i resveratrolul posed proprieti antitumorale remarcabile. Ea are efecte benefice i ajut la profilaxia cancerului, prostatitei, maladiilor cardiovasculare, catar actelor, alergiilor/inflamaiilor i maladiilor respiratorii aa ca bronita i astma. Alimentele bogate n cvercitin includ merele, ceaiul, ceapa, strugurii roii, broccoli, ciree i mure.

Acizii aromatic (acizii fenolcarbonici) joac un rol semnificativ n formarea caracteristicilor organoleptice ale vinului(buchetul i gustul), particip la procesele biochimice de producere i pstrare a vinurilor. Coninutul calitativ i cantitativ a acizilor fenolcarbonici i a flavonolilor este cercetat prin metoda HPLC ( ., .., 2005). Conform datelor experimentale (Tabelul 1), cea mai mare parte din coninutul sumar de acizi fenolcarbonici identificai n vinurile roii seci este atribuit acidului galic (50-85%) . Coninutul sumar de acizi fenolcarbonici n vinurile roii seci Substana Variaia concentraiei , mg/dm Italia 65,0-76,0 2,6-6,0 0.4-1.2 1,4-2,7 2,5-3.8 3,1-7.4 2,7-4,2 0,8-1,2 0,1-1,0 2,3-14,3 1,7-2,6 1,5-3,5
3

Tabelul 1

Acizii fenolcarbonici: Moldova Gruzia Frana galic 15,2-79,4 58,0-78,5 28,5-69,7 protocatehic p-hidroxibenzoic vanilie siremc cofeic p-cumaric ferulic salicilic Cvercitina Dihidrocvercitina Resveratrol 1,6-4,4 0,3-1,2 1,1-4,8 1,0-4,4 0,6-7,5 0,0-3,1 0,0-1,2 0,2-2,1 0,1-10,8 0,5-2,4 0,2-3,2 3,2-8,3 0,9-1,5 2,4-5,4 4,3-7,8 3,6-16,7 2,8-7,8 1,1-2,3 0,1-1,0 4,1-21,8 1,9-2,4 3,0-7,2 3,2-7,6 66966669 0,7-1,8 , 1,4-5,1 6969,7 2,0-6,8 2,6-17,4 2,4-9,4 0,6-1,4 0,5-4,3 2,7-27,2 1,4-2,9 2,5-17,3

Spania 30,92,8-9,0 94,6 1,2-1,8 1,6-3,2 2,6-4,3 3,7-1 4,2-9,8 1.9 0,9-1,8 0,2-1,0 0,5-13,5 1,4-2,2 0,7-4,7

Cili 29,0-95,0 2,6-11,3 0,6-2,5 1,0-6,4 2,3-1 1,2 6,9-15,9 4,5-8,8 0,8-1,3 0,3-2,1 6,0-42,9 1,1-2,4 0,7-8,9

Este cunoscut faptul, c la formarea caracteristicilor organoleptice ale vinului un rol esenial l costituie terpenele aromatice pe larg rspndite n regnul vegetal (n jurul la 4000), fapt ce a determinat cercetarea lor aprofundat n numeroase lucrri ( Ribreau-Gayon P., Dubourdieu D., Danche B., 1998; Srghi C., Zironni R., 1994 ; Aceeva N.M., Gugucichina T.I., Gontareva E.N. i al. 2006). n struguri se gsesc pn la 40 de compui terpenici. Monoterpenele, cele mai aromate, se gsesc sub forma de alcooli monoterpenici, i anume linalol, -terpeneol, nerol, geraniol, citronellol, o-trienol, care exprim aroma de trandafir. Concentraia monoterpenolilor n soiurile cu aroma simpl, inclusiv cele noi, este inferioar pragului de percepere (Gaina B., Bejan V., Panfil E., 2000).

2.1.RESVERATROLUL 2.1.1 Generaliti. Structura chimic i proprietile resveratrolului. Resveratrolul (3,5,4-trihi droxistilben) este o fitoalexin ce aparine clasei compuilor polifenolici numii stilbeni, care sunt produi de unele specii de plante cu ajutorul sintezei enzimei stilbene, ca rspuns la stres, infecii micotice i radiaii ultraviolete (UV). Ace ste substane vegetale posed proprieti biochimice remarcabile i reprezint un compus solubil n grsimi care apare n 2 config uraii : cis - i trans (figura 3 ).

trans-resveratrol E-resveratrol

cis-resveratrol Z-resveratrol

Figura 3 : Structura chimic a trans - i cis -resveratrolului Numai izomerul trans-resveratrol este produs natural n timpul maturrii strugurilor, ns el poate suferi o izomerizare n forma cis-resveratrol prin intermediul unui proces fotochimic, prin iradierea cu raze UV sau printr-un proces enzimatic (figura 4) :

Figura 4 : Procesul de fotoizomerizare a trans-resveratrolului n forma cis-resveratrol Proprietile fizico-chimice ale resveratrolului: 1) Formula chimica : C 14 H 12 O 3 ; 2) Masa molara: 228,25 ; 3) Se prezint sub forma unui praf alb cu particule galben deschis ; 4) Punctul de topire: 265-266 C ; 5) Solubilitate n ap: mai mare de 100 g/ml la 25 C ; 6) Solubilitate n etanol: 50g/l ; 7) Antioxidant mai puternic de 50 de ori dect vitamina E i C la un loc ;
8

2.1.2 Resveratrolii n natur. Scurt istoric . Resveratrolul a fost identificat pentru prima dat n 1939 de ctre chimistul japonez, Michio Takaoka ca i constituent al extractului de rdcin de Veratrum grandiflorum i mai apoi din rdcina de Fallopia japonica (sau Polygonum cuspidatum ).Mult timp aceast substan nu a fost luat n seam, pn n anul 1976 cnd s- a descoperit c se conine n cantiti destul de mari n str ugurii roii,n special n pelia strugurilor. Dar cele mai multe cercetri dateaz din anul 1992 cnd oamenii de tiin au nceput s se intereseze de efectele resveratrolului ,cnd prezena acestuia a fost depistat n vinurile roii. ncepnd cu 2006, studiile privind efectele benefice ale resveratrolului asupra oranismului uman datorit proprietilor sale antioxidante, anticancerigene i mutegene au fost amplificate considerabil. Resveratrolul i unii compui ai si cu glucoza, ca comp oneni constituieni, n cantiti mici se ntlnesc n materialul lemnos, rdcinile viei de vie i n seminele bobielor. Resveratrolul se gsete n general n fructele de culoare indigo - viiniu spre negru: dude, ciree, zmeur, corcodue, fragi, afine,coacz neagr, arahide, struguri (preponderent n pieli i semine) . ntr-o cantitate de 50-100 mg/ g pieli de strugure, se gsete de dou ori mai mult resveratrol dect n oricare alt surs identificat . Resveratrolul se mai gsete de asemenea n concentraii mari n rdcinile unor plante asiatice dintre care Polygonum cuspidatum este cel mai bogat n trans- resveratrol permind astfel extracia n concentraii de pn la 99%. n tabelul 2 este prezentat cantitatea total de resveratrol ce se conine n unele alimente. Coninutul sumar al resveratrolului n strugurii roii i arahide. Alimentul Cantitatea (g) Struguri roii Arahide (crude) Arahide (prelucrate) Unt de arahide 160 146 180 258 Cantitatea total de resveratrol (mg) 0,24-1,25 0,01-0,26 0,32-1,28 0,04-0,13 Tabelul 2

Coninutul resveratrolilor (mg/kg) 0,07-1,78 1,77-7,11 0,15-0,50 1,50-7,81

Din datele prezentate

rezult c strugurii roii au un coninut relativ nalt de

resveratrol comparativ cu arahidele native i netratate.


9

2.1.3. Interactivitatea moleculei de resveratrol cu ciuperca Botrytis cinerea. Resveratrolii pot fi sintetizai de plant ca mijloc de autoprotejare cu proprieti antimicotice n raport cu Botrytis cinerea i Plasmopara viticola . Biosinteza n frunze i bobie este stimulat de condiiile neprielnice, de razele ultraviolete, de pre zena unor cantiti relativ mari de metale grele (n special de cupru) etc. Dup cele menionate anterior, rezult c resveratrolul este secretat de ctre strugurii de vi de vie atunci cnd acetia sunt atacai de ctre ciupercile i bacteriile parazite, n acest fel se declaneaz o reacie a viei de vie care se va opune dezvoltrii ciupercii , n special a ciupercii Botrytis cinerea , unde este des ntilnit efectul su de eliberare a etilenei asupra strugurilor infectai (figura 5 ).Dezvoltarea acesteia fiind favorizat de anumii factori externi: umiditatea, temperatura, esuturile moarte, leziunile plantelor,lumina.

Figura 5: Producerea de etilen de strugurii infectai cu Botrytis cinerea (5L de suspensie la 10 3 conidia mL -1 /strugure). La nceput se observ emisiile de etilen de la fructele netratate (_ ) comparativ cu cele tratate cu trans-resveratrol ( ) n primele 4 zile. Studiile anterioare au indicat c trans -resveratrolaul are efecte reale inhibitoare asupra germinaiei Botrytis cinerea i, de asemenea, pe creterea miceliilor (Adrian M., Jeandet P., Veneau J. et al., 1997). O concentraie de aproximativ 1 60 mg/l de resveratrol (figura 6 ) este puternic inhibant pentru ciuperc.
10

100

75 % Germinare

50

25

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160

Conc resv (mg/ dm 3 )

Figura 6: Inhibarea germinrii sporilor ciupercii Botrytis Cinerea de ctre resveratrol Deci, este necesar ca condiiile mediului (umidita te, temperatur) s nu fie suficient de favorabile pentru ca ciuperca s poat trece bariera p e care via de vie o manifest. Atunci cnd ciuperca atac via de vie, aceasta produce oxidaze (p-difenoloxidaza sau altfel spus polifenoloxidaz, lacaza), care distrug resveratrolul n cteva minute (figura 7 ) i las loc liber ciupercii care devine mucegaiului bobielor de struguri.

(Degradarea resveratrolului)

Absorbana

Timpul (min) Figura 7 : Degradarea resveratrolului de ctre polifenoloxidaza ciupercii Botrytis cinerea Vinul rezultat din acest tip de recolt nu numai c nu conine resveratrol, dar are i o barier antioxidant diminuat. Vinul este oxidat, brun i dezvolt arome maderizate deseori neplcute (de sol, de petic , alteori de fungi).
11

2.1. 4. Activitatea biologic a resveratrolului i a derivailor si. Molecula de baz, produs de ctre via -de-vie este izomerul trans- al resveratrolului,care mp reun cu derivaii si (figura 8 ) posed proprieti antioxidante importante.

Figura 8 : Structura chimic a trans - resveratrolului (I), cis- resveratrolului (II) i a derivailor trans -resveratrolului (II-VI). Conform acestei figuri, fiecare grup hidroxil a derivailor este protejat de grupe metilice (III, IV, V) i un derivat cu legtur dubl redus (VI). Compararea activitii antioxidante a trans- resveratrol i derivailor si, estimat n testele in vitro , este raportat n tabelul 3. Rezultatele sunt exprimate prin EQ (testul Citronelal) i EC 50 (microzomi i testele DPPH) din fiecare compus.

Activitatea antioxidant a trans -resveratrolulu i i a derivailor II -VI. Compound I II III IV V VI Citronellal EQ 1358,81 24138,0 66120,3 3557,43 >1000 26011,2 Microsomes EC 50 0,770,08 1,100,09 2,400,34 1,220,18 >1000 1,570,17

Tabelul 3

DPPH EC 50 24,51,5 24,11,2 48,64,2 30,12,1 >1000 106,86,3


12

Din datele prezentate, se observ o relaie invers proporional ntre activitatea antioxidant i valorile EQ i EC 50 : cu ct e mai puternic antioxidantul cu att e mai mic valoarea acestora. n toate cele 3 teste, trans-resveratrol (I) a demonstrat cea mai mare activitate antioxidant, n timp ce compusul V nu exercit nici un efect semnificativ. Figura 9 demonstreaz efectele trans-resveratrolului (I) i derivatele pe producie TBARS indus de TBHP n fibroblaste umane normale.

Figura 9: Activitatea antioxidant a trans - resveratrolului (I)i a derivailor II -VI. Activitatea antioxidant a 60 M trans - resveratrolul (I) sau derivaii II -VI, exprimat ca procent de inhibare a produciei TBARS n fibroblaste umane normale tratai cu TBHP (ter -butilhidroperoxid). Valorile S.D, nseamn c sunt prezentate cel puin 5 experimente independente. Efectele resveratrolului asupra radicalilor liberi n organism este bine cunoscut,i anume efectul su inhibitor asupra sintezei ADN -ului. n acest scop, capacitatea trans-resveratrolului de a inhiba sinteza ADN (polimeraza i ) a fost co mparat cu ceilali derivai, at t n celule,ct i n testele in vitro (figura 10).

Figura 10: Efectele tran- resveratrolului(I) i a derivailor si (II -VI) n sinteza ADN- ului n celule i n vit ro. Rezultatele raportate n fig.10 A arat c printre derivate, numai compusul IV inhib ncorporarea BrdUrd ntr - o msur similar cu trans -resveratrolul. Rezultate comparabile au fost obinute n testele in vitro privind act ivitatea ADN polimerazei (fig. 10B).
13

2.1. 5. Cercetri privind coninutul i dinamica coninutului de resveratrol n vinuri i influena acvitii lor asupra celulelor. Primele lucrri tiinifice ce in de resveratrol au fost conduse de L angcan e i Pryce n 1976 (Langcane P., Pryce R.J., 1976). Spre anii 1990, acest subiect a fost reluat la Universitatea din Bourgogne n jurul a 2 axe, cu P. Jeandet (Jeandet P., Bessis R., Gautheron B., 1991) asupra biochimiei moleculei i caracterul su de protejare a viei de vie contra infeciilor micotice i cu Blanche (Blanche D., Rustan I., Durand P ., 1997) asupra activitii marcante contra bolilor cardiovasculare. Cercetrile n domeniu au demostrat c variaia concentraiei de resveratrol n vin are la baz o serie de factori, cum snt: originea geografic, expunerea la infecii micotice, clima, solul, soiul, tehnica vinificrii. Trebuie, n primul rnd ca varietatea viei de vie, a soiului, s fie una productoare de resveratrol. Printre aceste varieti gsim: Pinot noir, Gamay, Caberne t- Sauvignon i Mourvedre. Dup Dr. G oldberg (Goldberg D.M., Yan J., Diamandis E.P., 1994) de la Universitatea din Toronto care a analizat numeroase vinuri din lume, n faa clasamentului se afl Pinot noir. De asemenea, asupra cantitii resveratrolului i nflueneaz po zitiv perioada de macerare, doza anhidridei sul furoase, protecia mustului i vinului de aciunea oxigenului i oxidazelor etc. Un interes tiinific i practic prezint studiul resveratrolilor n vinurile, sucurile produse i comercializate Spania i Frana (tabelul 4). Coninutul resveratrolilor n vinurile i sucurile produse n Spania i Frana.
Buturi Cantitatea total de resveratrol n 150 ml (mg) Vinuri albe (Spania) Pinot noir (Frana) Vinuri roze (Spania) Vinuri roii (Spania) Vinuri roii (Frana) Suc de struguri (Spania) Suc de struguri (Frana) 0,01-0,27 0,06-0,30 0,06-0,53 0,29-1,89 0,30-1,07 0,17-1,30 0,21-1,76

Tabelul 4

Cantitatea total de resveratrol (mg/dm3) 0,05-1,80 0,40-2,0 0,43-3,52 1,92-12,59 1,98-7,13 1,14-8,69 1,37-11,71

Rezultatele obinute atest o concentraie sporit a resveratrolilor n vinurile roii i mai mic n cele albe. Vinurile roii spaniole conin mai muli stilb eni comparativ cu cele franceze, n schimb sucurile din struguri produse n Frana sunt mai bogate n resveratroli n c omparaie cu cele din Spania(Roy H., Lundy S., 2005).
14

Odat cu cercetrile efectuate n rile Uniunii Europene privind coninutul i dinamica resveratrolilor, specialitii din Republica Moldova, n co laborare cu colegii din Frana (Gaina B., Roman O., Bourzeix M., 2007) au fcut cercetri n acelai domeniu. Studiul dinamicii resveratrolilor pe pacursul maturizrii strugurilor a fost realizat la o serie de clon e de vi de vie din selecia naional francez, cultivate n coleciiile colii Superioare Agronomice din Montpellier (ENSAM) i a Institutului Naional pentru Viticultur i Vinificaie din Chiinu (INVV ), n calitate de exemplu prezentm dinamica resveratrolilor n mustul din soiul Pinot noir (clona 667), realizat pe parcursul maturizrii boabelor de struguri ncepnd cu 25 august 2004 cu un interval al dete rminrilor de 10 zile (tabelul 5 ). La aciditatea titrabil de 9,2 g/dm 3 i coninutul n zhar de 96 g/dm 3 s-a testat o concentraie total a resveratrolilor de 2,34 g/dm 3 ; pe parcursul a 30 zile s-a atins maturizarea biologic cu aciditatea titrabil 6,l g/ dm 3 i zharul de 190 g/ dm 3 i cu suma total a resveratrolilor de 4,38 mg/ dm 3 . Matur itatea tehnologic a fost atins dup 20 zile urmare a maturitii biologice, indicii tehnologici alctuind : aciditate titrabil 5,1 g/dm 3 , zharul 230 g/dm 3 i suma total a resveratrolilor 6,21 mg/dm 3 . Tabelul 5 Dinamica coninutului de resveratrol n boabele i mustul de Pinot noir (Montpellier, 2004).
Nr d/o 1. 2. 3. 4. 5. 6. Data prelurii probei 25.08.04 05.09.04 15.09.04 25.09.04 05.10.04 15.10.04 Obiectul de investigaie, concentraia n mas a zahrului, aciditatea titrabil Suc din boabe; zah.=96 g/dm3 ac.=9,2 g/dm3 Suc din boabe; zah.=110 g/dm3 ac.=8,7 g/dm3 Suc din boabe; zah.=150 g/dm3 ac.=7,7 g/dm3 Suc din boabe; zah.=190 g/dm3 ac.=6,1 g/dm3 Suc din boabe; zah.=210 g/dm3 ac.=5,8 g/dm3 Suc din boabe; zah.=230 g/dm3 ac.=5,1 g/dm3 Concentraia de resveratrol, mg/dm3 Trans-resveratrol 1,11 1,39 2,01 2,29 3,37 3,77 Cis-resveratrol 1,23 1,34 1,83 2,09 2,25 2,44 Suma total de resveratrol 2,34 2,73 3,84 4,38 5,62 6,21

n concluzie, constat m c de la nceputul maturiz rii strugurilor i pe parcursul a 50 zile, concentra ia resveratrolilor a sporit de cca 3 ori, atingnd nivelul de 6,21 mg/dm 3 la soiul Pinot noir cultivat n condi iile regiunii Roussillon Languedoc din sudul Fran ei (clona 667 a ENTAV Fran a).
15

Resveratrolii, ndeplinind funcii fiziologice importante la via de vie, cum snt rezistena la stresuri (atacul de micomicete, vtmtori, temperaturi joase n timpul iernii etc.), se gsesc n sucul boabelor n cantiti relativ joase (0,5 -5,5 mg/dm3). Aceti constitueni biochimici ai mustului i vinului joac o importan major n protecia organismului uman contra surplusului de radicali liberi prin captarea i eliminarea lor din organism, prin protejarea sistemului cardiovascular de depunerile pe interiorul vaselor a colesterolului negativ. Din punct de vedere al efectului pe care poate s-l exercite resveratrolii asupra redoxpotenialului din vinuri, precum i asupra redox-potenialului n organismul uman (scderea concentraiei radicalilor liberi), este important s cunoatem care snt diminurile resveratrolilor din vinurile brute pe ntreaga caten a schemei tehnologice de prelucrare i condiionare a lor. Un astfel de studiu a fost realizat la Staiunea de Cercetri Agronomice din Narbonne cu participarea profesorului Michele Bourzeix pentru vinul brut Cabernet-Sauvignon (2004,Narbonne), fapt ce a permis obinerea unor date experimentale exacte ce in de procentajul nlturrii din vin a resveratrolilor n urma efecturii diverselor operaiuni tehnologice (tabelul 6).

Dinamica coninutului resveratrolilor n funcie de operaiunile tehnologice n vinul brut Cabernet-Sauvignon.


N. d/o 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Denumirea operaiunii tehnologice Control Enzimarea cu pectinaz + glicozidaz Decantarea la rece Prelucrarea cu bentonit Prelucrarea cu gelatin Filtrarea grosier Filtrarea fin Filtrarea prin membran Doza sau concentraia, temperatura 5g/hl t = 4C, =12 ore c=1 g/dm3 c=0,2 g/dm3 ,, Zeitz" ,, Zeitz" d= 0,45 Concentraia de resveratrol, mg/dm3 Transresveratrol 4,7 4,5 4,2 3,1 4,1 4,3 4,0 4,1 Cisresveratrol 4,1 4,0 3,4 2,3 2,7 3,4 3,1 2,7 Suma total de resveratrol 8,8 8,5 7,6 5,4 6,8 7,7 7,1 6,8

Tabelul 6
% nlturrii 0 3 14 39 23 12 19 23

Acest studiu efectuat la Staiunea de Cercetri Agronomice din Narbonne cu participarea profesorului Michele Bourzeix, au permis obinerea unor rezultate concrete privind procentul nlturrii din vin a resveratrolilor n urma efecturii diverselor operaiuni tehnologice ( Bourzeix M., 1985).
16

Spre exemplu, la tratarea vinului brut cu pectinaz i -glicozidaz s-a atestat o diminuare de 3% a resveratrolilor, ns cea mai mare diminuare a avut loc la preucrarea cu bentonit a vinului brut n doze de 1mg/dm3, n aceste condiii,concentraia rezidual a resveratrolilor a constituit 5,4 mg/dm3 din 8,8 mg/dm3 coninut iniial. Bentonita, n calitate de sorbent natural, absoarbe cantiti importante de resveratrol datorit suprafeei sale bine structurate i deschise comparativ cu ali compui fenolici, sorbia crora este mult mai inferioar. Este important de menionat, c, dei orice operaiune de filtrare a vinului brut poate diminua coninutul de resveratroli de la 12% pn la 23 % (filtrarea grosier, fin i prin membrane), totui suma total a nlturrii compuilor cercetai atinge 54%, ceea ce este puin mai mult dect jumtate din coninutul iniial a acestor compui. O nlturare considerabil a resveratrolului din vin s -a depistat n urma interaciunii acestuia cu levurile din vin, fapt demonstrat n urma unui studiu realizat de Gai na B. i Roman O. la Institutul Universitar al Viei i Vinului din Dijon, Frana n colaborare cu profesorul Gougeon Regis; sedimentarea levurilor dup finalizarea fermentaiei alcoolice diminuaz coninutul resveratrolilor prin adsorbia lor pe suprafaa membranelor celulare cu cca 80%( Gaina B., Roman O., Gougeon R., 2007 ). Despre proprietile biologic active ale compuilor fenolici din struguri,must,suc i vinuri, i rolul lor n tratarea maladiilor din domeniul uv oterapiei i oenoterapiei (Gaina B., Savin Gh., Bejan V. i al., 2005) atest a cademicianul Boris Gaina, n lucrarea sa, unde se menioneaz c pentru utilizarea vinurilor n oenot erapie, se recomand de a folosi vinurile brute netratate (Primeur, Mlado, Tulburel), iar n uvoterapie- struguri i must proaspt, la fel netratai i conservai la frig. (Gaina B., 2000) n ultimul deceniu a crescut semnificativ interesul consumatorilor de vinuri fa de producia vitivinicol ecologic. Studiile recente, realizate la Institutul Naional al Viei i Vinului din Moldova, n colaborare cu Institutul Naional de Cercetri Agronomice din Narbonne (Frana) au avut ca scop determinarea concentraiei resveratrolilor n vinurile ecologice obinute din unele soiuri noi rezistente la factori biotici i abiotici ai mediului ambiant. Despre tratarea limitat a acestor soiuri contra bolilor i vtmtorilor s-a menionat n diverse publicaii din R.Moldova (Gaina B.,2000; Gaina B.,2002; Duca G.,Gaina B.,Covaleov O.,i al.,2004), ns primele rezultate obinute ncepnd cu anul 2005 privind coninutul resveratrolilor n vinurile ecologice (tabelul 7) au fost expuse n lucrarea Gaina B.(2007).

17

Tabelul 7 Concentraia resveratrolilor n vinurile ecologice obinute din soiuri noi(Chiinu, 2005).
Nr d/o 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Denumirea vinului (soiul de vi de vie) Riton (alb) Legenda (alb) Viorica (alb) Pervene Magaracia (alb) Negru de Ialoveni (rou) Rubin Tairova (rou) Iubilei Magaracia (rou) Originea strugurilor (localitatea) Chiinu, INVV Chiinu, INVV Chiinu, INVV Vulcneti, SEV Chiinu, INVV Cahul,SS Cahul,SS Concentraia de resveratrol, mg/dm3 Trans-resveratrol 1,07 1,44 1,92 2,01 5,13 4,41 5,01 Cis-resveratrol 0,93 1,12 1,41 1,33 4,71 3,19 3,66 Suma total de resveratrol 2,63 2,56 3,33 3,34 9,84 7,60 8,67

Un coninut mai redus al resveratrolilor se atest la vinurile albe din soiurile Riton, Legenda, Viorica i Pervene Magaracia (de la 2,63 mg/dm3 pn la 3,34 mg/dm3) n comparaie cu o concentraie sporit a resveratrolilor n vinurile roii din varietile Negru de laloveni, Rubin Tairova i lubilei Magaracia (de la 7,60 mg/dm3 pn la 9,84 mg/dm3). E de menionat c aceste vinuri au fost netratate, deci, doar n vinurile materie prim s-ar putea determina concentraii palpitabile de resveratroli. Analiza cromatografic HPLC aduce clar informaie mult mai bogat dect

analiza spectrofotometric, deoarece aceasta permite detectarea izomerilor i a dimerilor resveratrolului. Se observ, de fapt, i prezena dehidromerului a trans -eviniferina, care ar putea implica contaminarea solu iei mam de resveratrol (Jeandet P.,Breuil A.C., Adrian M., et al.,1997). S- a observat pentru prima dat c coninutul de viniferin crete odat cu creterea coninutului de resveratrol n soluie, dup cum este prezentat n figura 11.

Figura 11: Evoluia concentraiilor iniiale(CO) n resveratrol i viniferin msurate prin HPLC, n funcie de concentraia teoretic a vinului model.
18

Resveratrolul (3,5,4-trihidroxistilben) este considerat ca fiind un constituent al vinului, n special a vinurilor roii (Goldberg D.M., Yan J., Diamandis E.P et al., 1995; Jeandet P., Bessis R., Sbaghi M., et al.,1995 ). Numeroase metode de analiz a resveratrolului n vinuri au fost utilizate de ctre oamenii de tiin din strintatea (Jeandet P., Bessis R., Maume B.F., et al.,1995 ; Lamuela-Raventos R.M.,Waterhouse A.L.,1993; Lamuela-Raventos R.M., Romeo-Perez A.I.,1995; Mattivi F., 1993; Pezet R., Pont V., Cuenat P.,1994 ; Siemann E.H., Creasy L.L., 1992). Studii n domeniu au fost efectuate i de cercettorii italieni (Pace-Asciak C.R., Hahn S., Diamandis E.P., i al.,1995) care au fcut o comparaie ntre cromatrogramele HPLC al e vinului alb i rou (figura 12 ).

Figura 12: Comparaie ntre Cromatogramele HPLC la 278 nm de vinuri albe i roii folosite. Cromatograma (A) se refer la vin alb (Trebbiano d'Abruzzo 1996); cromatogram ( B)- la un vin rou (Montepulciano d'Abruzzo 1995). Componenii identificai sunt: 1. Acid Prothocatechinic; 2. Acid galic; 3. (+)- Catechine; 4. (-)-Epicatechina; 5. Trans-resveratrol; 6. Rutina. Aa cum se arat n figura 12 , vinul rou conine o cantitate mai mare de co mpui fenolici dect vinul alb. Proeminent vrfurile corespuns acidul protocatechinic i acidului galic, identificate cu numerele 1 i 2, respectiv, (+) - catechina i ( -)epicatechina, (vrf urile 3 i respectiv 4), trans-resveratrolul (vrf 5) i rutina (vrf 6), au fost prezente doar n vinul rou.Interesul sporit fa de resveratroli i unii derivai ai si este strns legat de rolul pe care l - ar putea exercita acetia n diminuarea riscului maladii lor cardiovasculare a consumatorilor de vinuri roii i care cultiv un mod sntos de via (Frankel E.N.,1993). Un rol aparte este atribuit unui alt reprezentant al acestor compui biologici i anume - piceida (Lamuela-Raventos R.M., Romeo-Perez A.I.,1995;), n cadrul acestei lucrri, n anul 2006 la Institutul Universitar al Viei i Vinului(IUVV, Dijon), n
19

colaborare cu Laboratorul de CEnologie - din Universitatea Reims s-a utilizat o metod HPLC care a permis de a realiza separarea i analiza izomerilor cis i trans a celor 4 stilbeni - resveratrol, piceida, pterostilben i un dimer al resveratrolului. Acea st metod a permis determinarea concentraiei fiecruia din stilbeni ntr-o selecie de vinuri, n funcie de soiul, de regiunea de producere, inclusiv de AOC* i de metodele de vinificare. P rintre polifenoli care atrag cea mai mare atenie, sunt resverat rolul i cuazercina din cauza abundenei lor relative n produsele alimentare i a potenialului terapeutic i efectelor lor biologice multiple n tratarea diferitor boli. Resveratrolul, cuazercina i standardele lor interne au fost cuantificate la 320 nm (resveratrol), 286 nm (4,4 '- dihidroxibifenil) i 370 nm (cuazercin i 2 ", 5,7 Trihydroxyflavone). Cromatogramele fig.13. la aceste lungimi de und sunt prezentate n

Figura 13: Cromatogramele HPLC de probe de snge tratate cu a) 5M resveratrol (ambele nregistrate la 286 i 320 nm). Cromatogramele la aceste lungimi de und arat c analiii sunt at t de bine

integrai i fr picuri care s interfereze matricea de snge. Acest lucru se aplic i n plasm, deoarece polifenolii sunt bine cunoscui prin efectul lor de a se lega cu aviditate de albumin, i sunt, prin urmare, "sechestrai" n plasm (Rolinski, O.J., Martin, A., Birch, D. J., 2008). *AOC- denumire de origine controlat.
20

Cercetrile efecutate la Institutul din Padova, Departamentul experimental de tiine biomedicale, referitor la efectele trans - resveratrolului i a unor derivai ai si asupra obolanilor, pentru a obine rezultate concrete n ceea ce privete activitatea acestor compu i la nivel intravenos (figura 14 ) i activitatea organelor principale (creier, ficat, plmni, rinichi,intestine etc.).

mAU 40 30

R-S R-S R Glucuronidase

R-G 20 10 No treatment 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Time(min) Sulfatase

Figura 14: Cromatogramele HPLC- UV (320 nm) a unei probe de snge retras dup 4 ore de la administrare intragastric RGS (0,22 mmol / kg); cromatogramele reprezi nt alicote de aceeai prob, fr nici un tratament enzimatic i dup tratamentul cu sulfataz sau cu glucuronidaza, cum este indicat: R -S: resveratrolsulfat;R-G: resveratrol-glucuronid, R: resveratrol. n urma majorrii concentraiei sangvine (figura 15) s-a observat o majorare nesemnificativ a resveratrolului, n schimb se observ creterea derivailor si.

Figura 15: Concentraia sanguin vs curbele de timp pentru resveratrol i metaboliii si principali (3,4 ' -disulfatului (R-SS),3 - glucuronid (RG), 3-sulfat (RS)) dup administrarea gastric de resveratrol (A) sau RGS (B) la 0,22 mmol / kg doz.
21

n 2005 , oamenii de tiin italieni (Vita J.A.,2005) au obinut primul rezultat pozitiv de suplimentare a resveratrolului la vertebrate(figura 16) n ceea ce privete efectele pozitive ale resveratrolului la nivelul activitii celulare.

Figura 16: Cromatograma reprezentativ a plasmei de obolan (A); plasm martor mbogit cu 5 nmol/g de trans-resveratrol (B); probele de plasm obinute la 90 min. dup administrarea intravenoas a 15 mg / kg de trans-resveratrol (C) n : creier, intestine, ficat, plmni, rinichi. Vrf 1: trans-resveratrol, vrf 2 :trans-resveratrol glucuronid; vrf 3: transresveratrol sulfat. Se observ un pic al trans-resveratrolului i trans-resveratrol glucuronid n toate cazurile, ceea ce atest o stimulare intens a acestor organe n urma admnistrrii unei anumite cantiti de trans-resveratrol.Un studiu asemntor a fost efectuat de ctre Johan Auwerx (de la Institutul de Genetic i Biologie Celular i Molecular din Illkirch, Frana), care mpreun cu coautori au publicat un articol online, n revista ,,Cell" n noiembrie 2006, n care s-a demonstrat c oarecii hrnii cu resveratrol pentru 15 sptmni au rezistena mult mai mare pe banda de alergat. Studiul a susinut ipoteza lui Sinclair c efectele resveratrolului sunt ntr-adevr datorit la activarea genei Sirtuin 1( Kaeberlein., Matt., McDonagh., et al., "Substrate-specific activation of sirtuins by resveratrol", 2005).
22

Complexitatea i interactivitatea ansamblului de caractere biologice depinde de prezena moleculei de resveratrol. Atunci cnd totul s - a desfurat bine i resveratrolul este prezent n struguri la nivelul pieliei substana joac rol de barier.Ca urmare vinurile roii, unde pielia este supus macerrii, vor conine o cantitate mai mare de resveratrol , n timp ce vinul alb conine mult mai puin resveratrol, deoarece este sup us fermentrii dup ce pielia a fost nlturat . Cantitatea de resveratrol variaz ntre 0,5- 22 mg/l n vinurile roii i 0,2 -3 mg/l n cele albe. S- a demonstrat deja c toate speciile i varietile Vitis nu prezint aceleai aptitudini de sintez a stilbenilor(Lamuela-Raventos R.M.,Waterhouse A.L.,1993 ; Xiao, J., Suzuki, M., Jiang, X., Chen, X., 2008). Referitor la acest studiu realizat de cercettorii moldavi i francezi n comun, vinurile elaborate din Pinot noir, i mai ales cele din varietile Gamay, prezint un coninut relativ ridicat n resveratrol, total respectiv 8 i 29 mg/l total (Gaina B., Roman O., Bourzeix M., Gougeon R.,2007 ). Referitor la diferena de sintetizare a stilbenilor n funcie de specia de vi de vie au fost fcute ample cercetri de ctre Mihail V. Blagosklonny n Roswelt Park Cancer Institute, Statele Unite ale Americii (2011). n acest studiu s-a analizat funcia de phytoalexin resveratrol, produs de StSy ( stilben sintaza). S-a constatat c soiul Pinot Noir, a acumulat cantiti mai mici de glycoside trans-piceid, n timp ce Vitis rupestris a produs masiv trans-resveratrol i substana toxic oxidativ -viniferin, indicnd faptul c metabolismul preferat de resveratrol se regsete n specia Vitis. Acest studiu, ne arat c, n rspuns la Harpin (bacterie patogen), soiul Pinot Noir este mai sensibil i produce o cantitate mai redus de resveratrol i piceid de glicozide, n timp ce speciile rezistente Vitis rupestris au tendina s acumuleze resveratrol. Harpin elicitor a determinat o acumulare temporar (StSy) transcrieri, care este mai puternic n Vitis rupestris n comparaie cu Vitis vinifera la varietatea Pinot Noir (Qiao F., Chang XL., Nick P., 2010). Pentru a investiga, dac produsul de StSy, adic resveratrol stilbenic, sau derivaii si (figura 17 A), de asemenea, se acumuleaz ca rspuns la elicitor, abundena de resveratrol a fost cuantificat prin HPLC n ambele linii celulare dup tratament Harpin.

Figura 17 A : Ci alternat ive de glicozilare a resveratrolului


23

Figura 17 B : Acumularea stilbe nilor ca rspuns la Harpin n Pinot noir i Vitis rupestris. Pentru a ntelege funcia biologic a acumulrii de resveratrol, a u fost investigate n continuare r spunsurile celulare exogene la resveratrol (figura 18).

Figura 18(A-D) : Reaciile ,,Pinot noir" i V.rupestris la administrarea resveratrolului. A. O relaie doz - rspuns pentru cretere (msurat ca creterea n volum a celulelor) peste concentraia resveratrol. B. Timpul de inhibare a creterii, ca rspuns la administrarea a 50 M de resveratrol n comparaie cu controlul solventul (concentraie egal din etanol). C. Timpul la alcalinizarea extracelulare indus de 50 M resveratrol (+ res), comparativ cu controlul solvent (-res). D. Relaia doz - rspuns la starea de echilibru a pH - ului peste concentraia de resveratrol (evaluat la dou ore dup adugarea de resveratrol.
24

Figura 18 (E-H) : rspuns de aprare a genelor la administrarea a 50M de resveratrol, inclusiv codificarea sintazei reveratrol (RS), stilben sintetazei (StSy), genele proteine legate 5 i 10 (PR5, PR10), i inhibarea genei proteinei poligalacturonaz (PGIP) detectate pr in semiquantitative RT-PCR. E, G . prezint un gel reprezentant, F, H .arat valorile medii i erorile standard la con (de control, barele albe), 0,5 h (bare cu cruci), 1 h (bare orizontal n dungi), i 3 h (baruri cu dungi verticale) dup adugarea a 50 resveratrol pM din cel puin trei serii experimentale independente, n raport cu valoarea de control respectiv, folosind factorul alungire 1- (EF1) ca standard intern. Hematocritului (PCV) la diferite concentraii de resveratrol a fost msurat la faza de staionare dup 7 zile de cretere (Figura 18A), i s -a observat o diminuare de la 10 M resveratrol apropiat de nivelul zero la 500 M n ambele linii de celule c u o influena mai mare asupra Vitis rupestris n comparaie cu soiul Pinot Noir . Timpul de inhibare a creterii (Figura 18B) a artat un decalaj de 48 h i a ajuns la 80% (n comparaie cu controlul solventul) la 96 de ore n ambele linii celulare. Cu toate acestea, inhibarea a fost mult mai pronunat la 96 ore , comparativ cu faza staionar trei zile mai t rziu.Astfel, inhibarea a fost compensat cu timpul, aparent mai rapid n Vitis vinifera la Pinot Noir, dect n Vitis rupestris. n urmtoarea etap, alcalinizarea extracelular, ca un indicator celular rapid i comod de aprare plante (Felix G., Regenass M,, Boller T., 1993) a fost analizat ca rspuns la 50 M res veratrol (corespunz nd cu jumtatea concentraiei maxime, ca rspuns la elicitor). n ambele linii celulare, alcalinizarea a fost detectabil la 30 min,
25

dar dezvoltat mai rapid n Vitis rupestris (Figura 18C). Doz - rspuns a pH (figura 18 D) au artat o cretere proporional cu concentraiilor de resveratrol ating nd o valoar e maxim de 1,25 uniti, dei a fost prezentat aceast cretere,nu a fo st la fel de pronunat n Pinot Noir . Totui n majoritatea liniilor de celule sunt prezente fluctuaii necontrolate ale pH - ului, n consecin are loc defalcarea vacuolar i moartea celulelor. Un al doilea aspect al hipersensibilitii legate de moartea celular programat este reorganizarea Actin (Lamb C, Dixon RA., 1997 ; Franklin-Tong VE, Goutay CW., 2008). n figura 19 este reprezentat reacia microfibrelor i a filamentelor Actin la resveratrol.

Figura 19 : Rspunsul microfilamentelor la administrarea Harpin i resveratrol. Celulele de Pinot Noir (A, C, E) i Vitis rupestris (B, D, F) au fost tratate fie cu etanol ca solvent de control, cu resveratrol (50 M), sau cu Harpin (9 g l -1 ), iar microfilamentele au fost co lorate prin imunofluorescen. C nd microfilamentele au fost vizualizate dup 30min. tratam ent, fie cu solventul (figura 19 A, B), sau cu 50 M resveratrol (figura 19 C, D), nu a fost gsit nici - o diferen de celulele netratate. Totui, tratamentul cu Harpin (9 g.l -1 ) a condus la dezintegrarea microfilametelor n Vitis rupestr is dar nu i n Pinot Noir (figura 19E, F).
26

Spre deoseb ire de microtubuli, rspunsul filamentelor de actin la resveratrol a fost pronu nat n Vitis rupestris (figura 20 ). n comparaie cu controlul netratat, n cazul n care s-au observat fire fine de actin n periferia celulelor, filamentele de actin au fost puternic combinate i contractate spre nucleu dup 30 minute tratament cu resveratrol.

Figura 20 : Rspunsul filamentelor de actin la resveratrol. A. Organizarea actinei n Vitis rupestris ntr- o celul de control dup 30 min. a administrrii a 50M resveratrol,vizualizat la faloid fluorescent. B. Rspunsul actinei la administrarea a 50 M resveratrol in vivo folosind marcatorul de actin tutun. Dimensiuni baruri= 20m. C. Indic relocaliz area auxin-efluxului PIN1-RFP dup tratamentul cu inhibitor de actin LatB(2M).Sgeile indic relocalizarea markerului PIN1 -RFP. Dimensiuni baruri= 20m.

27

Toate imaginile au fost capturate cu ajutorul unui microscop AxioImager Z.1 (Zeiss), echipat cu un slider microscop ApoTome prin seturi de filtre de 38 HE pentru FITC sau GFP (excitaie la 470 nm, fascicule la 495 nm, iar emisiile la 525 nm) sau 43 HE pentru PIN1- RFP (excitaie la 550 nm, fascicule la 570 nm, iar emisiile la 605 nm). Cnd filamentele Actin au fost eliminate de Latrunculin B, reintegrarea PIN1RFP n membrana plasmatic a fost afectat rezultnd aglomerri intracelulare (figura 20C, rndul de sus). n mod similar, 50 M resveratrol au fost capabili de a induce o ag lomerare similar, dar cu o nt rziere de aproximativ 15 min, comparativ cu tratamentul cu Latrunculin B (figura 20C, rndul de jos). Acest rspuns rapid celular la resveratrol a fost urmat, o zi mai t rziu, de o scdere a indicelui mitotic, i o stimulare de celule moarte. Aceste rspunsuri au fost dependente de concentraia de resveratrol i au fost afectate deja la cea mai sczut concentraie testat a 1 M resveratrol. n plus, sincronia diviziunii celulare,un diagnostic pentru activitatea de transport a actin-auxin( Nick P.,2010), a fost perturbat rezult nd o scdere progresiv a unui v rf- 6 de frecven diagnosticate peste vrful-5 c nd concentraia de resveratrol a ajuns la 10 M.

n concluzie, putem afirma c microtubulii, care sunt eliminai prin elicitor n Vitis rupestris, nu rspund semnificativ la tratamentul cu resveratrol. Rspunsul actinei la resveratrol este m ai puternic n Vitis rupestris i mai slab n Vitis labrusca soiul Pinot Noir.

28

2.1.6. Rolul resveratrolului n protec ia organismului uman contra radicalilor liberi. Aciuni benefice. Resveratrolul protejeaz celulele endoteliale de stresul oxidativ indus de oxidarea LDL(colesterolului negativ,ru) fie prin intermediul activitii directe de neutralizarea a radicalilor liberi,ct i prin inhibarea aciunii nicotinamid adenin nucleotid fosfat oxidazei (NOX). Resveratrolul are o aciune anti -inflamatorie prin inhibarea ciclooxigenazei CO X i prin reducerea sintezei de prostaglandine pro inflamatorii i vaso - protectiv, prin creterea produciei de oxid nitric i producia redus de peptide vasoactive demostrnd o eficacitate nalt n protecia cardio vascular. n ciuda multitudinii de aciuni observate, mecanismul de aciune al acestui compus nu este nc complet desluit. Exist studii care indic modificarea expresiei unor enzime precum COX2 i ODC, inhibarea unor enzime active la nivelul cyt P450 i activarea unei proteine reglatoar e Sir-2, o protein-deacetilaza NAD-dependent. Se pare ca mecanismul din urm a fost asociat cu creterea longevitii. De asemenea se pare ca resveratrolul mimeaz efectele protective ale SIRT1 (o proteina tip Sir-2 specific mamiferelor). Aceste efecte sunt similare restriciei calorice (RC), acesta fiind si unul dintre mecansimele posibile de aciune ale polifenolului. Resveratrolul i RC produc modificri metabolice, precum scderea insulinei si creterea biogenezei mitocondriale. S-a observat c alterarea cilor semnalizatoare ale insulinei i modificrile produse n activitatea mitocondrial, rezult din activarea unei enzime adenosin monofosfat kinaza (AMPK). AMPK este activat de o serie de factori patologici, legai de stresul celular, printre care deprivarea de glucoza, hipoxia, stres-ul oxidativ sau diferii hormoni precum leptina sau adiponectina. Activarea AMPK joac un rol important mpotriva stresului oxidativ, mai ales mpotriva ischemiei, reducnd mrimea infarctului. De asemenea s-a observat ca AMPK este activat si de ctre neuronii hipotalamici sub influena unor condiii restrictive alimentare (dieta). Biplab Dasgupta si Jeffrey Milbrandt de la Departamentul de patologie si Neurologie, Washington University School of Medicine SUA (2011), au realizat un studiu pe culturi celulare privind modul de aciune al resveratrolului i efectele sale protective (Schema 1). Ei au plecat de la observaia c o parte din schimbrile metabolice produse de ctre resveratrol sunt asemantoare cu cele care au loc la activarea AMPK. Astfel ei au considerat ca ipoteza iniial c activarea AMPK ar putea fi un important mediator n exercitarea proprietilor compusului la nivel neuronal.

29

Schema 1 : Aciunile molecului de resveratrol asupra organismului uman Astfel, ei au utilizat culturi celulare neuro2a neuroblastoma, care au fost tratate cu 10 M resveratrol. Apoi a fost urmarit activarea AMPK prin utilizarea de anticorpi fosfo -AMPK specifici. Dup circa 2 ore, cercettorii au observat o important cretere a fosforilrii AMPK, cretere meninut pn la 72 de ore de la tratare. Pentru a confirma aceast observaie, cei doi oameni de stiin i-au concentrat atenia asupra fosforilrii acetilcoenzimei A carboxilazei (acetil-CoA carboxilaza sau ACC), int primar a AMPK-ului activat. Ca urmare, experimentul lor a confirmat ipoteza iniial c resveratrolul prezint aciuni asemantoare RC (promovarea biogenezei mitocondriale i a eficienei bioenergetice). Pentru a cerceta n continuare efectele neuroprotective la nivelul creierului, echipa de cercettori a injectat intraperitoneal (i.p.) resveratrol unui grup de oareci masculi n vrsta de 2 luni. n paralel s-a format i un grup de control care a primit un alt grup de oareci masculi n vrst de 2 luni, crora li s-a injectat intraperitoneal un vehicul inert(ce nu conine resveratrol). Analiza ulterioar a relevat faptul c o singur injecie cu resveratrol a determinat o cretere a activrii prin fosforilare a AMPK i a ACC de pn de 2 ori mai mult, n numai 2 ore. Aceste rezultate indic faptul ca administrarea i.p. de resveratrol, produce o activare a AMPK, iar aceast activare determin o fosforilare a ACC, o int important a AMPK-ului activat.
30

ntr-un studiu realizat de Pezzuto i coleg. (Jang M., Uneani G.O, Slowing K., et al., 1997) s-a demonstrat c resveratrolul a fost eficient n cele trei faze ale cancerului. Mai mult, savanii de la Universitatea din Liecester au prezentat miercuri, 5 decembrie 2012, probe despre modul n care resveratrolul care se gsete n vinul rou poate preveni cancerul (figura 21).

Figura 21 : Aciunea resveratrolului n prevenirea cancerului. Cercettorii de la universitatea din Liecester au cercetat nivelurile resveratrolului care poate fi benefic n prevenirea cancerului folosind modelul din laborator, acetia au descoperit c o cantitate zilnic de resveratrol, echivalent cu dou pahare de vin, poate njumti rata tumorilor intestinale. De asemenea, s-a demonstrat activitatea antioxidant i antimutagenic a resveratrolului, precum i niveluri crescute ale chinon-reductazei, o enzim capabil de detoxifiere n cazul carcinogenezei. Resveratrolul a fost raportat ca eficient mpotriva disfunciilor celulelor neuronale i mpotriva morii celulare i este eficient mpotriva maladiilor Huntington i Alzheimer. Cercettorii de la Northeastern Ohio Universities College of Medicine i Ohio State University demonstreaz c molecula de resveratrol are o aciune inhibitorie direct asupra fibroblastilor cardiaci i poate inhiba progresia fibrozei cardiac( figura 22).
31

Viovalabilitatea resveratrolului depinde de formele sale conjugate: glucuronat i sulfonat, chiar dac majoritatea studiilor in vitro folosesc forma agliconic a resveratrolului.

Figura 22: Aciunea inhibitoare a resveratrolului la nivel celular. Mecanismele prin care molecula de resveratrol ar putea prelungi viaa nu sunt nc bine nelese, dar acest lucru pare s funcioneze prin inhibarea lipazei, reducnd absorbia grsimii n pereii intestinali. Numai n forma trans- molecula este capabil s activeze gena SIRT 1 in vitro. Recent, Kaeberlein i coleg. au adus n discuie aceast teorie, care reunete resveratrolul, SIRT 1 i reducerea de calorii. Molecula de resveratrol pare s potenteze efectul unor medicamente antiretrovirale, mpotriva HIV in vitro. Un grup de cercettori de la National Institutes of Aging laboratory din Baltimore, mpreun cu specialiti din Australia i Spania, sub conducerea dr. David Sinclair, profesor de patologie la Harvard Medical School, au efectuat recent un studiu (2010-2012) pe baza moleculei de resveratrol, prin care s-a demonstrat ca va fi posibil ca populaia s fie ferit de efectele dunatoare ale dietelor bogate n calorii i grsimi, o problema major a societii moderne.
32

Fcnd o sintez a informaiei anterioare, putem enumera principalele efecte ale resveratrolului :

Antioxidant

Antibacterian

Antiinflamator

Neuroprotector

trans-resveratrol

Antitumoral

Cardioprotector

Antimutagen

Schema 2 : Cele mai importante efecte ale resveratrolului asupra organismului

Resveratrolul este cel mai puternic antioxidant , el ncheag i ndeprteaz radicalii liberi din organism,n acelai timp stimuleaz nmulirea celulelor sntoase si capacitatea lor de regenerare.Resveratrolul menine capacitatea de funcionare normal a trombocitelor, ajut la scderea vscozitii s ngelui, mbun atindu -se astfel circulaia s ngelui.Are proprietatea de a ncetini cu 50% sporirea celulelor cancerigene sau poate chiar s le stopeze.

33

2.2 Proantocianidinele 2.1.1 Generaliti. Tanine din semine de struguri (proantocianidine), activitatea
biologic i aplicaii. Taninele condensate izolate din semine de struguri (TSS), numite altfel proantocianidine, reprezint o grup de substane naturale cu structur polifenolic. Interesul fa de aceti compui este determinat de mai muli factori. n primul rnd ei posed un spectru larg de activiti biologice, iar prezena lor n dieta uman e considerat ca o msur preventiv n combaterea maladiilor severe, cum ar fi cancerul i ictusul cerebral. Asimilarea benefic a taninelor din struguri e legat de consumul moderat de vin. n acelai timp seminele de struguri reprezint deeuri ale produciei vinicole i ele conin de asemenea cantiti semnificative de compui polifenolici. innd cont de faptul c valorificarea produselor secundare ale industriei vinicole reprezint o direcie de cercetare prioritar recunoscut de Guvernul Republicii Moldova, un ir de companii au iniiat programe de cercetare orientate spre elaborarea procedurilor eficiente de extracie a proantocianidinelor din seminele de struguri. n mod cronologic, prima surs explorat de tanine condensate a fost scoara de pin. Ulterior, una dintre sursele preferabile ale acestor compui au devenit seminele de struguri, graie faptului disponibilitii lor n cantiti industriale. n rezultat, pe piaa produselor secundare vinicole au aprut un ir de extracte din semine de struguri, reprezentnd surse sigure de tanine. Taninele reprezint nite compui polihidroxilai cu structur aromatic care n primul rnd sunt caracterizai de proprietatea de a forma complexe insolubile cu proteinele salivare. Deaceea prezena acestor compui n vin contribuie la proprietile lui organoleptice, n primul rnd la culoare i astringen.(Vidal S., Cartalade D., Souquet J.M., et al. 2002;Jorgensen E.M., Marin A.B., Kennedy J. A., et al. 2004; Gonzalez-Manzano S., Santos-Buelga C., Perez-Alonso J.J, et al. 2006; Peyrot des Gachons C., Kennedy J. A., et al. 2003).n afar de aceasta, derivaii flavan-3-olului reprezint antioxidani importani n celulele vii. De aceea taninele din semine de struguri sunt examinate n primul rnd datorit activitii lor antioxidante. Se cunoate c potenialul de oxido-reducere a compuilor fenolici este sufficient de mic pentru a interaciona cu diferite specii oxidante prin intermediul diferitor mecanisme, de regul prin un mecanism de captare a radicalilor liberi(Freitas V., Glories Y., Laquerre M., i al. 1998 ; Uchida S., Edamatsu R., Hiramatsu R., i al. 1987). Aceti compui au un rol semnificativ n calitate de repeleni pentru protecia plantelor contra agenilor patogeni i diferitor duntori(Gonzalez-Manzano S., Santos-Buelga C., PerezAlonso J.J, et al. 2006). Datele literare demonstreaz c taninele au o aciune protectoare n cazul
34

degradrii oxidative a AND-ului precum i o aciune benefic n inhibarea preventiv a carcinogenezei (Pinelo M., Laurie V.F., Waterhouse A.L., et al. 2006). De rnd cu proprietile lor antioxidative, proantocianidinele pot influena eliberarea oxidului de azot de ctre celulele endoteliale (Fitzpatrick D.F., Fleming R.C., Bing B., et al. 2000). Bazndu-se pe aceste mecanisme de aciune, compuii polifenolici din produsele vinicole au fost prezentai n diferite publicaii ca substane cu aciune antibacterian, antiviral, anticarcinogenic, antiinflamatoric, antialergic i vasodilatatorie. De asemenea taninele respective au demonstrate capacitatea de a inhiba agregarea trombocitelor, de a mbunti permeabilitatea vaselor sangvine i de a diminua fragilitatea lor.Au mai fost relatate studii despre efectul enotaninelor asupra sistemelor enzimatice cum ar fi fosfolipazele A2,ciclooxigenazele i lipooxigenazele. n rezultat beneficiul potenial al enotaninelor pentru sntatea uman a fost recunoscut pe larg(Santos-Buelga C., Scalbert A., et al. 2000). Aceasta a condus la aplicaii fitofarmaceutice diverse a enotaninelor condensate: prevenirea maladiilor cardiovasculare,reducerea edemelor, mbuntirea circulaiei periferice, mbuntirea vederii,tratarea retinopatiei diabetice,hipercolesterolemiei,stabilizarea tonusului esuturilor conjunctive,reducerea reaciilor alergice i inflamatorii, ameliorarea tratamentului plgilor precum i mbuntirea funciei imunitare(Murray M, Pizzorno J., 1999). Extractele dinsemine de struguri (spre exemplu preparatul Leucoselect) sunt utilizate att ca ingredieni activi n produse farmaceutice ct i n calitate de aditivi alimentari. Aceste extracte contribuie nprimul rnd la tratarea fragilitii i creterea stabilitii pereilor vaselor sanguine, precum i la captarea radicalilor liberi activi i inhibarea ionilor superoxidici(Gabetta B., Fuzzati N., Griffini A., 2000). n baza acestor circumstane, proantocianidinele din seminele de struguri prezint un interes sporit n calitate de compui biologici activi cu un spectru larg de activiti. Un grup de cercettori tiinifici, au demonstrat c proantocianidinele extrase din semine de struguri au fost gsite capabile de a reduce n mod semnificativ creterea papilomavirusului uman HPV 16 care stimuleaza apariia celulelor canceroase. Astfel, oamenii de tiin, au salutat activitatea lor, ca un pas important n dezvoltarea de tratamente alternative de cancer deoarece chimioterapia standard i radioterapia, utilizate frecvent pentru a trata pacienii cu cancer, de multe ori au efecte secundare dureri i reacii severe, care includ leziuni tisulare i defeciuni. Descoperirea i validarea de noi tratamente si strategii de prevenire, lipsite de aceste efecte secundare nocive, reprezint unul dintre obiectivele principale ale cercettorilor oenologi.

35

2.2.2 Structura chimic i proprietile proantocianidinelor Componena proantocianidinelor din seminele de struguri este foarte complex. Unitile structurale care stau la baza acestei complexiti sunt doi compui polifinolici relativi simpli: catehina1 i epi-catehina2 (figura 23)
21 31 41

HO

8 7 6

A
5

O B
4

2 3

11

C
61

OH HO

51

O OH OH 2

OH OH

OH

OH

OH

Figura 23: Structura chimic a catehinei(1) i epicatehinei (2) n urma condensrii oxidative ntre atomii de carbon C-4 ai catehinei1 sau epi-catehinei2 cu atomii de carbon C-6 sau C-8 ale acelorai molecule se formeaz lanuri oligomerice. Aceti oligomeri reprezint o pletor de compui ce difer prin gradul de polimerizare (GP), modul de jonciune a monomerilor i succesiunea lor. Proantocianidinele B1-B4 (figura 24), care conin legtura C4-C8 sunt cei mai rspndii dimeri (da Silva J, Rigaud J, Cheynier V, et al. 1991).n multe cazuri oligomerii formai au grupa hidroxil la atomul de carbon C-3 esterificat cu acidul galic(Fitzpatrick D.F., Fleming R.C., Bing B., et al. 2000; da Silva J, Rigaud J, Cheynier V, et al. 1991).
OH HO
3 4

HO

O OH O
3

O
3 4

OH OH OH
3

OH OH OH OH HO

OH O

OH HO

R2 OH 3 R1=OH; R2=H Proantocianidina B1 4 R1=H; R2=OH Proantocianidina B2

R1

R2 OH 5 R1=OH; R2=H Proantocianidina B3 6 R1=H; R2=OH Proantocianidina B4

R1

OH

Figura 24 : Structura chimic a proantocianidinelor B1-B4 E de menionat faptul c numai cteva proantocianidine au fost isolate n stare individual i caracterizate. Structura lor include compui de la dimeri la tetrameri(Gabetta B., Fuzzati N., Griffini A., et al. 2000). n acelai timp distribuia proantocianidinelor oligomerice n seminele de struguri, inclusive n soiurile albe, a fost studiat de muli autori(Gabetta B., Fuzzati N., Griffini A., et al. 2000; da Silva J, Rigaud J, Cheynier V, et al. 1991 ; Oszmianski J., Sapis J.C., 1989 ; Lea A.G.H., Bridle P., Timberlake C.F., et al. 1979 ; Romeyer F.M., Macheix J., Sapis J., 1986 ; da Silva R.J.M., Bourzeix M., Cheynier, V., et al. 1991; da Silva R.J.M., Rosec J.P.,
36

Bourzeix M., et al. 1992). Flavanoidele monomerice i esterii lor cu acidul galic predomin n fraciile solubile n ap a compuilor polifenolici obinuti din seminele de struguri. Oligomerii snt reprezentai n general de proantocianidinele de tip B( da Silva R.J.M., Bourzeix M., Cheynier, V., et al. 1991; Santos-Buelga C., Francia-Aricha E.M., EscribanoBailon,M.T., 1995). Structura lor a fost investigat n lucrrile publicate(Pekic B., Kovac V., Alonso E., et al. 1998 ; Kovac V., Bourzeix M., Heredia N., et al. 1990 ; Kovac V., Alonso E., Revilla E., et al. 1995). Un studiu comparativ al compoziiei flavan-3-olilor a fost de asemenea efectuat(Santos-Buelga C., Francia-Aricha E.M., Escribano-Bailon M.T., 1995). Compuii cercetai au provenit din 17 soiuri diferite de struguri din Spania, incluznd 10 soiuri roii i 7 albe. Un numr total de 27 proantocianidine au fost izolate: (+)-catehina1, (-)-epi-catehina2, epicatehin-3-O-galat, dimerii B-1 B-7 (3)-(9), trimerii C-1 (11) i C-2 (12), de rnd cu un ir numeros de proantocianidine esterificate cu acidul galic la grupa hidroxil C-3 n ciclul B i la grupa fenolic de la atomul C-3 al ciclului C.
O
3 4

HO

OH OH

HO

O
3 4

OH OH

OH OH

OH OH

HO HO
6

HO HO
6

R2 R1 HO HO

R2 R1 HO HO

7 R1=H; R2=OH Proantocianidina B5 8 R1=OH; R2=H Proantocianidina B7

9 R1=OH; R2=H Proantocianidina B6 10 R1=H; R2=OH Proantocianidina B8

HO

O
3 4

OH HO OH O
3

O
3 4

OH OH OH
3

OH OH OH OH
3

OH O

OH HO

OH HO

OH OH HO
8

OH OH HO
8

OH OH
3

O OH

O OH

OH

OH

OH 11 Proantocianidina C1

OH 12 Proantocianidina C2

Figura 25: Structurile chimice ale derivailor proantocianidinelor


37

n rndul compuilor esterificai sunt dimeri i trimeri ai flavan-3-olului, unii din ei conin dou fragmente de acid galic. Dimerul B-2 (4) predomin n grupa respectiv. Proantocianidinele descries difer nu numai dup numrul i succesiunea unitilor flavan-3-olice, modul de esterificare, dar i dup modul diferit de jonciune a monomerilor (C-4 C-8 sau C-4 C-6) i configuraia la atomul de carbon C-4 ( sau ). Lucrarea n cauz prezint numai un singur tetramer descris, el consistnd numai din uniti ale epi-catehinei [epi-catehina (4-8)- epicatehina (4-8)- epi-catehina (4-8)- epi-catehina]. Izolarea taninelor polimerice individuale reprezint o sarcin dificil. Toate exemplele din literatur relateaz numai izolarea unor fracii ce conin amestecuri ale ctorva polimeri individuali(Gabetta B., Fuzzati N., Griffini A., et al. 2000). Gradul mediu de polimerizare (GmP) al flavan-3-olilor poate fi diferit i datele obinute depind de metoda de determinare. Conform autorilor(Vidal S., Cartalade D., Souquet J.M., et al. 2002), proantocianidinele cum asa molecular mare pot conine pn la 20 uniti de flavan-3-ol, i acesti compui sunt solubili n vin. Din esterii acidului galic a fost identificat un octamertrigaloilat(de Freitas V., Glories Y., Bourgeois G., et al. 1998). Cercetrile masspectrometrice(Hayasaka Y., Waters E.J., Cheynier V., et al. 2003) relateaz grade de polimerizare de la 9 la 11 uniti. n acelai timp, bazndu-se pe experimentele hidrolizei acide(Sun B.S., Leandro C., da Silva J.M.R, et al. 1998), au fost obinute valori mai mari ale GP, variind de la 17 pn la 31 uniti. Conform studiilor realizate pn n prezent se cunosc mai multe metode moderne de cercetare a proantocianidinelor, dup cum ar fi cromatografia de performan nalt cu lichide (HPLC) i spectrometria de mas (MS). ns pentru a putea fi cercetate, este nevoie de a cunoate metodele de extragere a acestora. Astfel, n lucrarea unui grup de autori ( V. Kulciki, P. F. Vlad*, Gh. Duca, T. Lupacu, 2007) sunt menionate unele metode de extracie utilizate n izolarea proantocianidinelor din seminele de struguri folosind amestecul de aceton-ap n diferite proporii (70:30 n prezen de silicagel, 60:40 la +4oC, 50:50 la temperature camerei), methanol pur la temperatura camerei, methanol cu adaus de acid ascorbic (1g/l) la -20oC, urmat de amestecul methanol-ap (1:1) la -24oC i aceton-ap (75:25), totul n atmosfer de azot (Santos-Buelga C., Francia-Aricha E.M., Escribano-Bailon M.T, 1995; Monagas M., GomezCordovez C., Bartolomea B., et al. 2003). Metanolul a fost utilizat de asemenea i n combinaie cu ali solveni pentru extracia taninelor din semine de struguri. Cteva exemple includ extracia cu methanol acidulat cu HCl,() amestec metanol-ap (75:25) la temperatura camerei i iradiere ultrasonic. Etanolul apos a fost utilizat pentru extracia taninelor din seminele de struguri, (de Freitas V., Glories Y., Laquerre M., et al. 1998; Darne G., Madero T.J., 1979) precum i a
38

proantocianidinelor din Rhodiola semenovii( Kuliev R.Z., Akhmedov U.;, Khalmatov Kh.Kh., et al. 2004). Un alt exemplu interesant de extracie (Kuliev, R.Z.; Akhmedov, U.; Khalmatov, Kh.Kh., et al. 2004), include fracionarea unui extract etanolic apos prin extracie succesiv cu eter dietilic i etilacetat, ce a condus la fracii mai simple ale proantocianidinelor. Partea eteric a inclus (+)-catehina (1), (+)-galocatehina (13), (-)-epi-catehina (2), (-) epi-catehingalat (14), ()-epi-galocatehin (15), (-)-epi-galocatehingalat (16) i acid galic (17). Fracia din etilacetat a inclus urmtorii dimeri: (+)-catehin-(4-8)-(+)-catehin (18), (-)-epi-catehingalat-(4-8)-(-)-epicatehingalat (19) i (-)-epi-catehin-(4-8)-(-)-epi-catehingalat (20).
OH HO O
3

OH R2

HO

O
3 4

OH HO OH O
3

O
3 4

OH OH OH
3

OH OH OH OH HO

R1 O

R1

OH 13 R1=-OH; R2=OH 14 R1=-OGalloyl; R2=H 15 R1=-OH; R2=OH 16 R1=-OGalloyl; R2=OH

OH HO

OH OH HO HO HO 17 18 COOH

R2

OH

OH 19 R1=R2=-OGalloyl 20 R1=-OH; R2=-OGalloyl

Figura 26: Fraciile pronatocianidinelor

2.2.3 Progrese tehnico-tiinifice n studierea i implementarea proantocianidinelor.

2.2.3.1 Rolul proantocianidinelor n tratarea bolilor neurodegenerativ n ultimii ani, continu s se realizeze cercetri din ce n ce mai intens n ceea ce const extragerea acestor compui biologic activi din strugurii pentru valorificarea lor la elaborarea diferitor preparate pentru industria alimentar, cosmetic i farmaceutic sau ca supliment alimentar. Astfel s-a constatat c extractul din semine de struguri este benefic pentru prevenirea i tratamentarea unei boli neurodegenerative. Acest extract de semine de struguri coninnd unul sau mai muli compui derivai din acestea au puterea de a reduce acumularea, agregarea i / sau
39

depunerea de amiloid sau oligomerii si i / sau pentru a reduce misfolding-ul, acumulare i / sau agregarea Tau proteinelor sau a altor proteine. Bolile neurodegenerative sunt asociate cu condiiile n care celulele neuronale se deterioreaz, i pierd funcia, i de multe ori mor. Consecinele bolilor neurodegenerative sunt de multe ori devastatoare. Pacienii cu boli neurodegenerative pot suferi deteriorri grave n abilitile cognitive sau legate de sistemul locomotor. Ca urmare, calitatea lor de sperana de via i a vieii pot fi reduse considerabil. n cazul organismului uman, aceste boli includ boala Alzheimer, boala Parkinson, scleroz lateral amiotrofic, boala Huntington, demen fronto-temporal. Precum am atestat n lucrarea autorilor (V. Kulciki, P. F. Vlad*, Gh. Duca, T. Lupacu, 2007) importana proantocianidinelor, structura lor chimic i metodele de cercetare, n final, n cadrul unui experiment HPLC semipreparativ a fost descoperit un compus individual i conform datelor MS acest compus e un trimergaloilat, structura 21 (figura 27) a fost propus n baza numai a experimentelor MS-MS. Dar pentru a stabili definitive structura acestui compus, n special stereochimia lui sunt necesare studii adaugtoare.
OH OH OH OH HO O OH OH OH OH HO O OH OH O OH O OH OH

HO

21
OH

Figura 27: Structura chimic a trimergaloitatului. In acest mod, un grup de savani (Giulio Maria Pasinetti, Lap Ho, Jun Wang, 2010), au realizat o invenie care prevede o metod de reducere a misfolding-lui, acumulare, agregarea sau depunere de A (amiloid peptid) oligomeric A, proteinele Tau sau alte proteine asociate cu o bolile neurodegenerative. i totodat, au stabilit structura compusului tructura 21, precum i stereochimia lui. Metoda implic administrarea unei cantiti eficiente dintr-o compoziie farmaceutic care cuprinde un extract de semine de struguri sau unul sau mai muli compui derivate din acestea (figura 28).
40

Figura 28: Structura molecular a unui proanthocianidin tipic heteropolimeric.

Compoziia farmaceutic poate s conin un ingredient activ, ales din grupul format de un antioxidant, un inhibitor acetilcolinesterazei, i combinaii ale acestora. ntr-o variant particular, extractul din semine de struguri cuprinde aproximativ 12% n greutate din proantocianidingalloylated raportat la greutatea total a proantocianidinei n extract. Prezenta invenie se bazeaz pe descoperirea compuilor obtinui dintr-un extract de semine de struguri ca inhibitori eficieni mpotriva misfolding-ului, acumulare, agregarea i / sau depunerea de A, proteinei Tau, i alte proteine care sunt asociate cu diferite boli neurodegenerative. Concret, invenia se bazeaz parial pe descoperirea c anumite tipuri de extract de semine de struguri reduc sau inhib formarea de oligomeri de sintetic A1-40 (A40) i A1-42 (A42) n vitro (figura 29)

41

Figura 29 : Efectul MNG-AZ GSE privind conversia A peptidic n formele lor oligomerici solubile n vitro. Fig. 2A i 2B, dodecil sulfat de electroforeza gelului de poliacrilamid de sodiu (SDS-PAGE) a produsului de incubare A1-42 (2A) i A 1-40 (2B), cu diferite cantiti de MNGAZ GSE. Fig. 2C i 2D rezultatul SDS-PAGE a A
1-42

(2C) i A1-40 (2D), n prezena sau

absena MNG-AZ GSE urmrind Foto-induse Reticularea Proteine nemodificate (PICUP)

42

Figura 30: ilustreaz o A cu efect de inhibare a MNG-AZ investigat de metabolismul MTT. Fig. 3A (i 3C) arat toxicitatea cu greutate molecular mic A1-40 (i A1-42) i efectul de MNG-AZ n reducerea toxicitii. Fig. 3B (i 3D) arat toxicitatea A1-40 agregare (i A agregare) i efectul de MNG-AZ n reducerea toxicitii
1-42

Figura 31: 4A i 4B arat efectul de MNG-AZ GSE asupra funciei cognitive la tulpina, varsta si sex-potrivit animalelor slbatice de tip masurate prin teste Morris-labirint de ap. Rolul benefic al produsului bogat n extracte de proantocianidine a fost demonstrat pe exemplul Drosophilei care era infectat cu o boala neurodegenerativ.

43

n acest mod, administrarea preparatului MNG-AZ la un individ ce sufer de boala Huntington are un efect benefic la tratarea acesteia manifestndu-se prin mrirea numarului de organisme i perioada de supraveuire. Acest efect poate fi examinat conform Fig.32 i Fig.33.

Figura 32: % de supravieuire peste zile n modelul Drosophila de boala Huntington. n acest caz grupul de organisme a fost tratat cu un extract de semine de struguri unde, cercurile haurate reprezint rezultate din grupul de control iar cele nehaurate ale insectelor crora le-a fost administrat preparat.

Figura 33: % de supravieuire peste zile ntr-un model de Drosophila HD n acest caz, acelai efect a fost obinut, ns, s-a folosit metod de tratare, prepartul MNG-AZ, unde diamantele umbrite reprezint rezultate din grupul de control iar cele neumbrite-rezultatele din grupul supus tratrii.

44

Experimentul pe baza Drosophilei nu a fost unicul experiment care a servit la luarea deciziilor referitor la rolul inhibitor al extractului din semine de struguri. Deasemenea, acestea cercetri au fost elaborate prin administrarea n creierul oarecilor Tg2576 (oareci transgenici care exprim proteine amiloid mutant precursor i prezint deteriorarea AD-tip cognitiv), i semnificativ mbuntete sau ncetinite pierderea funciei cognitive la oareci Tg2576 (comparativ cu oarecii netratai).

Figura 34: schema de evaluare test folosind posterioarele extensive la nivelul membrelor pentru unun oarec JNPL3 model transgenicde tauopathy. Tendina animalelor natural de a extinde membrele posterioare lateral atunci cnd acestea sunt agate de cozi cu capul n jos, sunt evaluate n conformitate cu un sistem de rating de patru puncte: 4 = functionarea normala (fig. 34A), 3 = insuficien renal uoar (Fig. 34B), 2 = insuficien hepatic moderat (fig. 34C), i 1 = afectare severa (fig. 34D). Folosind aceast exemplu prin tratarea oarecelui, s-au observat anumite schimbri care pot fi explicate analiznd graficele urmatoare :

45

Figura 35: efectul unui tratament GSE pe un model de oarece JNPL3 transgenic tauopathy. Fig. 7A arat depreciere cu motor la oareci JNPL3, la vrsta de 5 luni i 13 luni, respectiv, atunci cand sunt tratai cu GSE, n comparaie cu cele care nu sunt tratate cu GSE. Fig. 7B prezint n comparaie rata de mortalitate ntre soarecii JNPL3 netratai i cei tratai cu GSE, grafice de linie caracterizeaz prin aceea c reprezint % de indivizi supravieuind n timp. Examinnd aceste date experimentale, putem concluziona c acest preparat cu extrat de proantocianidine elaborat pentru tratarea bolilor neurodegenerative reduce acumularea, agregarea i/ sau agregarea Tau proteinelor, astfel, prin administrarea acestui preparat, se reduce sperana de viaa a celulelor care provoc aceste boli. 2.2.3.2 Interactivitatea moleculei de proantocianidina cu Centella asiatica Boli care afecteaz inima sunt de obicei clasificate n boli de inima pe termen lung. Mai precis, bolile cardiovasculare care se refer la clasa bolilor de inima, care implic inima i vasele de snge (artere i vene). Un tip dintre bolile cardiovasculare este ateroscleroza. Ateroscleroza este un sindrom care afecteaz vasele de snge arteriale, care transport snge bogat n oxigen la inima i alte pri ale corpului. Aceasta se refer la procesul n care depozitele de substane grase, colesterol, produse celulare reziduale, calciu,se depund pe pereii vasculari, ducnd la ngroarea peretului vascular, i micorarea lasticitii n rezultat, se micoreaz lumenul vascular i, ca rezultat, poate provoca dereglri de vascularizare n organe(creer, cord...) d ucnd
46

la procese de eschemie i infracturi. Din aceste considerente, medicii-savani caut remediul potrivit i ct mai inofensiv pentru sntatea uman. Abascal K i colab. "Botanicals for chronic venous insufficiency",terapii alternative i complementare, Vol.. 13, N [.] 6, decembrie 2007, pp. 304-311; au prezentat plante care sunt utile ca terapie adjuvant pentru tratamentul insuficienei venoase cronice. Plantele utilizate includ Ruscus aculeatus, semine de castan slbatic, Centella asiatica, Vitis vinifera i proantocianidine oligomerice cum ar fi Pycnogenol (R). Astfel, pentru utilizare nprevenirea sau tratamentul aterosclerozei s-a descoperit c extractul din semine de struguri poate fi implimentat la prepararea unui compus de uz medical, un preparat care conine o combinaie de proantocianidine precum Pycnogenol sau semine de struguri i Centella asiatica i / sau extrase ale acestora. Rezultatele experimentului la un grup de pacieni Vrsta Pacieni api Numrul de pacieni 63.3; 7 62.4; 5.1 57 58 38 34 Brbai

Tabelul 8. Plac aterosclerotic Artera fumural 66 57 Artera carotid 69 66

pentru testare

n concluzie, rezultatele observate sugereaz o aciune pozitiv important a combinaiei de Pycnogenol (R) + Teca si Pycnogenol combinaie (R) + Teca + Aspirina (APT), la micorarea depunerilor de substante aterosclerotice pe peretele interior al vaselor sanguine, reduce apariia plcilor aterosclerotice pe vasele carotide i femurale, care sunt cele mai periculoase tipuri de placi, asociate de evenimente cardiovasculare ce duc la embolizare i tromboza.

II. MATERIALE I METODE II.1.MATERIALE n cadrul investigaiilor realizate la tema:compui biologici activi din sucul boabelor, must i vinurile obinute din el au fost utilizate n calitate de materiale bobie a varietilor : Soiuri albe - Chardonnay, Chasselas, Riton, Legenda, Viorica, Alb de Ialoveni i soiuri roii - Pervene Magaracia , Pinot noir, Cabernet-Sauvignon, Gamay, Merlot, Regent (Diana x Chambourcin), Negru de Ialoveni,Rubin Tairova,Iubilei Magaracia.
47

Aceste materiale au fost colectate n diferite ri viti-vinicole, printre care Frana, Elveia i Moldova. n studiul realizat au fost utilizate n calitate de marqeuri , resveratrolii ; procesul sorbiei resveratrolilor au fost analizate pe levuri selectate i pregtite special. Vinurile din Bourgogne au fost furnizate de Biroul Interprofesional de Vinuri din Bourgogne (BIVB), ct i de productori de vinuri elaborat pe baza soiului Pinot noir. Vinurile au fost filtrate mai apoi injectate(20 l) direct n sistemul HPLC. n condiii de analiz deja descrise n literatura de specialitate( Jeandet P., Breuil A.C., Adrian M., et al., 1997). n calitate de materiale au fost la fel utilizate i vinuri de mas seci, naturale (netratate- brute, tratate, condiionate. mbuteliate). Studiul coninutului resveratrolilor n v inurile obinute din soiuri noi ( Gaina B.,2007) cu rezisten sporit la factorii biotici i abiotici a mediului ambiant a inclus varietile noi,din selecia intraspecific Riton, Legenda, Viorica, Pervene, Magaracia(albe),Negru de Ialoven, Rubin Tatarova i Iubilei Magaracia (roii) . Studiul dinamicii resveratrolilor pe parcursul maturizrii strugurilor a fost realizat cu utilizarea bobielor i sucului extras din ele pentru determinarea concentraiei resveratrolilor. Utilajul tehnologic i de laborator utilizat n cadrul investigaii include:
a.

materiale tehnologice - desciorchintor - zdrobitor, pomp cu melc, fermentator,

pres cu membran, refrigerator, filtru cu membrane i filtru cu plci, etc.


b.

materiale secundare oenologice - bentonit, gelatin, enzime pectolitice i (3

glicozidazice, anhidrida sulfuroas, filtru carton, plci filtrante din acetat celuloz pentru instalaiile cu microfiltrare i altel e.
c.

materiale de investigaie - spectrofotometre, refractometre, pH-metru, oximetru,

chromatografe HPLC, microscop, etc. II.2. METODE

II.2.1. Dozarea resveratrolului prin spectrofotometrie


Spectrofotometria este o metod analitic cantitativ care const n msurarea absorbanei sau a densitii optice a unei substane chimice date n soluie. Cu ct aceasta este mai concentrat cu att ea absoarbe mai mult lumin n limitele de proporionalitate enunate de legea lui Beer - Lambert. Densitatea optic a soluiilor este determinat de un spectrofotometru prealabil
48

etalonat la lungimea de und de absorbie a substanei chimice ce trebuie studiat. Pentru izoterma de adsorbie, concentraiile n resveratrol n soluiile limpezite obinute n urma ultracentrifugrii au fost msurate prin spectroscopie UV la lungimea de und 305nm, folosind o cuv din cuar de l cm i referindu - ne la o dreapt de etalonare extern (y=0,1179x ; r 2 =0,9996 ; n=6, figu ra II.1). Dilurile necesare au fost fcute astfel nct s satisfac legea lui Beer -Lambert. Figura II.1 : Gama de calibrare pentru analiza spectrofotometric UV.

y=0,1179x ; r2 =0,9996 ; n=6, gama concentraiilor resveratrolului de la 1 la 30 mg/kg.

II.2.2.

Dozarea resveratrolului prin HPLC

Cromatografia lichid de nalt performan (HPLC) permite separarea, detectarea i cuantificarea a numeroi compui organici ne volatili. Reuita separrii se bazeaz pe alegerea corect a fazei staionare i a fazei mobile(amestec de eluani) innd cont de compuii prezeni. n cazul nostru, analizele au fost realizate ut iziliznd coloana C18 , cu un gradient de eluare linear(acetonitril/ap) i un flux de l ml/min. Un volum de 40 l de soluie au fost injectate pentru orice analiz. O dubl detectare a fost realizat printr -un cuplaj UV/fluorimetrie (Adrian, 2000). Cuantificarea speciilor
49

detectate a fost realizat referindu - ne la o dreapt de etalonare extern (y=76530x ; r 2 =0,9979; n=9, gama de la 1 la 50mg/kg, fig. 2). Figura II. 2 : Gama de calibrare pentru analiza prin HPLC.

y=76530x ; r2 =0,9979; n=9, gama concentraiilor resveratrolului de la 1 la 50 mg/kg.

II.2.3 Metodele fizico-chimic HPLC Odat cu progresul remarcabil al tehnicilor HPLC, aceast metod a fost pe larg utilizat la analiza polifenolilor de diferit origine botanic, inclusiv a taninelor condensate din vin, struguri i semine de struguri. Punctul forte al acestei metode const n posibilitatea de a separa compuii polifenolici cu polaritate avansat la tmperatur ambiental, fr a recurge la derivatizare sau la nclzirea probei. n ultima decad metodele HPLC au cunoscut o serie de inovaii, care au promovat efficient performana metodei. n primul rind e necesar de a meniona introducerea larga a detectoarelor cu gril de diode pentru monitorizarea procesului de separare n domeniile UV-Vis. Aceasta a dat posibilitate de a analiza eluatul de pe coloana HPLC pe toat
50

banda spectral, fcnd astfel posibil nregistrarea n regim continuu (on fly) a spectrelor UVVis ale picurilor individuale sau chiar ale seciunilor din picurile cromatografice. n aa fel a devenit posibil de a identifica componentele separate ale amestecurilor analizate n baza spectrelor UV-Vis, precum i de a estima puritatea compuilor separai i eficiena separrii. Alt mbuntire revoluionar, care a avut un impact colosal asupra utilizrii foart largi a tehnicii HPLC a fost combinarea aparatului HPLC cu spectrometrul de mas. Aceasta a fost posibil n urma apariiei metodelor eficiente de ionizare, mai ales a metodei de ionizare prin electro-spray, i nu n ultimul rind de apariia micro-coloanelor HPLC care au redus substanial debitul solvenilor i volumele picurilor cromatografice. n aa fel metoda hibrid LC-MS a devenit cea mai universal tehnic analitic pentru studiul unui ir larg de compui, ncepnd de la compui cu mas molecular mic pn la biololimeri. n baza acestor progrese, HPLC i-a gsit aplicare n diferite domenii ale studiului compuilor naturali, inclusiv n studiul polifenolilor din struguri. Lucrrile de pionierat cu utilizarea metodei HPLC n oenologie aparin lui Nagel i Wulf, care printre primii au publicat o serie de articole n acest domeniu.42-44 n timp ce aceste prime investigaii au tins s evidenieze noutatea metodei, n particular rapiditatea analizei, oenologii au nceput n scurt timp s aplice aceast tehnic n monitorizarea calitii vinului, inclusiv n monitorizarea schimbrilor n coninutul de flavonoide n timpul fermentrii i maturrii vinurilor roii. (Nagel C.W., Wulf L.W., 1979) Metoda HPLC a fost de asemenea aplicat n studiul coninutului de procianidine n vinuri i buturi slab alcoolizate, precum i n studiul profilului de antocianidine n vinuri pe durata anilor de maturare.( McCloskey L.P., Yengoyan L.S., 1981) Un articol larg de analiz a utilizrii HPLC n studiul flavonoidelor din produsele alimentare a fost publicat la sfritul anilor 90.( Merken HM, Beecher GR., 2000) Acest articol cuprinde perioada pn la 1999. n anii urmtori ns, au aprut mai multe publicaii ce in de utilizarea HPLC n studiul proantocianidinelor din struguri, mai ales publicaii ce relateaz exploatarea noilor inovaii din HPLC. Pentru proantocianidinele din alimente, analiza HPLC e efectuat n cele mai dese cazuri n varianta fazelor reversate (RP). Dozarea cantitativ este efectuat n baza detectoarelor UV, de obicei la 280 nm. ns detectarea UV nu este specific pentru proantocianidine, n condiia prezenei n matricea analitic a altor compui polifenolici. Deaceea uneori se recurge la detectarea prin fluorescen (excitare la 276 nm i emisie la 316 nm), ceea ce ofer sensitivitate crescut i selectivitate fa de procianidine.( Lazarus SA, Adamson GE, Hammerstone JF, et al. 1999) Coloanele RP C18 au fost utilizate pentru a separa de la monomeri la trimeri n produse
51

alimentare din Spania,(de Pascual-Teresa S., Santos-Buelga C., Rivas-Gonzalo J.C., 2000) de la monomeri la tetrameri n vin(Carando S., Teissedre PL., Rascual-Martinez L. et al. 1999; Fuleki T., da Silva R.J.M., 1997) i semine de struguri. (Fuleki T., da Silva R.J.M., 1997 ; Peng Z., Hayasaka Y., Iland P.G., et al. 2001) Oligomerii proantocianidinici se separ n dependen de gradul lor de polimerizare (de la monomeri la tetrameri) ca compui individuali, ns ordinea de eluare nu este n concordan cu masa molecular. Analiza oligomerilor superiori tetramerilor nu a dat rezoluie satisfctoare a picurilor pe coloane cu faz reversat. Cu mrirea masei moleculare se observ o suprapunere avansat a picurilor i coeluare a oligomerilor izomerici superiori. Multe relatri despre utilizarea metodei HPLC n analiza TSS sunt dedicate investigaiilor activitii lor biologice. Fitzpatrick i colaboratorii au descris izolarea din seminele de struguri i caracterizarea unor compui responsabili de relaxarea endotelium-dependent a activitii vaselor sanguine. Seminele de struguri de soiul Concord au fost extrase cu methanol i compuii obinui au fost analizai prin metoda HPLC analitic i semipreparativ dup o fracionare preliminar. A fost folosit un system cromatografic Waters, cuplat cu un detector Waters 481 UV-Vis, precoloan i coloan cu faz reversat Radial Pak NovaPak C18. Eluarea a fost efectuat n regim de gradient al componenei eluantului, utiliznd doi solveni. Faza mobil A a fost apa, iar faza mobil B a fost soluia de 10% acid acetic n ap. Gradientul a evoluat de la 25%B pn la 100% B n regim isocratic, timp de 55 min conform unui profil complex. Debitul eluentului a fost de 1.0 ml/min, iar detectarea UV la 280 nm. Extractele integrale au artat un profil complex, cu puine picuri separate i identificate. Ecxepie au fcut acidul galic, epicatehina i epicatehingalatul. Una din fraciile obinute dup o fracionare preliminar prin gel-filtrare a fost separat satisfctor, iar compuii individuali au artatactivitate biologic elevat.

II.2.4 Metod de obinere, din semine de struguri, a unui extract sub form de pulbere, cu un coninut ridicat de proantocinidine Un alt procedeu de extracie a proantocianidinelor din semine de struguri pentru a putea obine un extract sub form de pulbere a fost realizat de ctre un grup de inventatori (Burghelea Beatrice, Cmpeanu Romulus Ilie, 2007),care a prezentat modalitatea prin care strugurii se trateaz cu ap i/sau alcool etilic, la o temperatur de pn la 120C i o presiune de 1 atm, timp de 45...60 min, dup care extractul polifenolic n soluie de alcool etilic, bogat n proantocianidine se concentreaz, se centrifugheaz i se filtreaz, obinndu-se un extract care,
52

ulterior, se purific i se mbogete prin trecerea pe o coloan cromatografic avnd faza invers. Acest produs obinut poate fi utilizat ca ingredient cu proprieti antioxidante n industria alimentar, cosmetic i farmaceutic sau ca supliment alimentar. Dac primele invenii aveau la baz metode de extracie cu solveni organici cum sunt metanolul i/sau acetona sau acetatul de etil (brevet OSIM 99206/1990, cerere de brevet US 5484594/1996-01-16, cerere de brevet US 5773262/1998-06-30, cerere de brevet US 5912363/1999-06-15, brevet 6544581/2003-04-08), n ultimul timp datorit reglementrilor impuse n industria alimentar, farmaceutic i cosmetic a fost necesar s se gseasc soluii pentru nlocuirea lor cu metode alternative, ecologice, de extracie, purificare i concentrare.

Procedeul de obinere din semine de struguri a unui extract sub form de pulbere cu un coninut bogat n polifenoli, cuprinde: Obinerea unui extract lichid brut prin extracia componentelor polifenolice din semine de struguri cu ap sau cu o soluie de 5-50 % alcool etilic n ap, la temperatur de max.120C i o presiune de 1 atm, timp de 45-60 mn, raportul n volume ntre semine i faza lichidafiind cuprns ntre 1:2 i 1:3; Obinerea unui extract lichid total prin concentrarea, centrifugurea i filtrarea extractului lichid brut ; Opional, obinerea unui extract lichid total mbogit n proantocianidine monomerice prin trecerea extractului lichid total pe o coloan cromatografic de silice cu lanuri alchilice C8 i eluare cu o soluie de alcool etilic 50-96%; Obinerea unei pulberi prin liofilizarea extractului lichid total sau a extractului lichid mbogit.

Concluzie
Rezultatele investigaiilor din ultimii ani ne permit s constatm existena efectelor benefice ale polifenolilor din semine de struguri. Capacitatea acestei categorii de polifenoli de a consuma radicalii liberi de oxigen din mediu n care acetia se afl este superioar altor antioxiani bine cunoscuti, cum ar fi vitamna C, E, betacaroten. Substanele polifenolice sunt de 10-20 de ori mai puternice dect vitamina E n protecia anti-oxidativ a LDL-colesterolului. Fiind consumatori de radicali liberi ai oxigenului, cum sunt superoxizii anionul superoxid, oxigenul singlet i radicalii hidrozxil, acetia inhib agregarea trombocitelor, intervin n reaciile
53

de sintez i eliberae a multor substane care provoac inflamaii, inhib enzimele care pot vtma integritatea i elasticitatea capilarelor, a pelii i a altor esuturi. Confer protecie materialului genetic (ADN), ferindu-l de mutaii. Protejeaz ficatul, inima i sistemul nervos de agresiunea radicalilor liberi. ns cea mai mare atenie se atrage la substanele polifenolice : resveratrolii i proantocianidinele, care au un puternic efect antioxidant. Studiile realizate asupra proantocianidinelor din struguri au demonstrat c acetia ofer protecie mpotriva bolii Parkinson i a afeciunilor oculare. Polifenolii cresc rezistena arterelor i venelor, mbuntesc microcirculaia, fluidific sngele i protejeaz fibrele de colagen, meninnd sntatea vaselor de snge, au efect tonic general, sunt recomandate n stri de astenie, oboseal, pentru efectul lor revigorant, contribuie la revitalizarea organismului dupa eforturi fizice si intelectuale. n ceea ce privete rolul resveratrolului n oganismul uman, se poate spune c datorit proprietilor sale de a capta radicalii liberi din organism, poate fi considerat medicamentul secolului XXI, prin faptul c diminueaz riscul bolilor cardiovasculare cu 30%-50%, posed puternice efecte anti-inflamatorii i antibactericide : menine fermitatea pielii, elasticitatea, mpiedic mbtrnirea prematur, mbuntind capacitatea memoriei, reface structura genelor afectate, lupt mpotriva disfunciilor celulelor neuronale i mpotriva morii celulare i este eficient mpotriva maladiilor Huntington i Alzheimer. Datorit acestor multiple proprieti, aceti compui au provocat interesul multor cercettori tiinifici de a studia structura i fiziologia lor, comportamentul acestora asupra organismului uman, care prezint anumite patologii, i fiind urmrind n acest mod evoluia tratrii acestor abateri ai funcionrii normale a activitii organismului uman administrat n diferite doze. Aceste cercetri au avut succes i n acest mod, astzi s-au gsit metode eficiente de extragere a lor pentru a putea valorifica potenialul lor atit nutritiv ct i terapeutic.

Bibliografie
1. Adrian M., Jeandet P., Veneau J., Weston LA, Bessis R., Biological activity of resveratrol, a stilbenic compound from grapevines, against Botrytis cinerea, the causal agent for gray mold. J Chem Ecol 23: 1689-1702. 2. Arpenti G.N. - . 1994. P. 124-136

54

3. Bejan V., Elaborarea procedeelor tehnologice de obinere a vinurilor de calitate n plaiul Plena -Mndreti din Codrii Moldovei, Autoref. Tezei doctor n tehnic, 2007, Chiinu, INVV, pag. 10-13. 4. Belcaro G., Burki C., Ferrari V. Combination of proanthocyanidins and Centellaasiatica for the treatment atherosclerosis. Horphang Research IP (PYC) LTD., Limasol (CY). 2012Pub. No.: US 2012/0164244 A1 5. Blanche D., Rustan I., Durand P., Lesgards G., Loreau N. GasChromatography analysis of resveratrol in plasma, lipoproteins and cells after in vitro incubation, J.Chromat. 1997; 702; pag.103-110. 6. Bourzeix M., Le vin-aliment. Station d'Oenologie et Technologie Vegetale, Narbonne, 1995, pag.17 7. Brenna O., Pagliarini E., Multivariate analysis of antioxidant power and polyphenolic composition in red wines-J. Agr. And Food Chem. 2001. 49. Nr. 10. pag 484. 8. Burghelea B., Cmpeanu R.I.,Kontek A.C., Porumb R., Procedeu de obinere, din semine de struguri, a unui extract sub form de pulbere, cu uncontinutridicat de proantocianidine. 16.07.2007 9. Carando S, Teissedre PL, Rascual-Martinez L, Cabanis JC. Levels of flavan-3-ols in French wine. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 41614166. 10. Carpov S., Tehnologia general a Industriei Alimentare,Chiinu-Bucureti: Ed. tiina, 1997. pag. 300. 11. Cotea V.D., Tratat de oenologie, Bucureti, 1995, 1998, vol.1,2, pag.628. 12. Darne, G.; Madero, T.J. Mise au point dune methode dextraction des lipides solubles totaux, des glusides solubles totaux et des composes phenoliques solubles totaux des organes de la vigne. Vitis. 1979, 18(3), 221-228. 13. Duca G., Gaina B., Covaleov O., , Ed.tiina, Chiinu, 2004, pag.13-72 14. Felix G., Regenass M., Boller T.,Specific perception of subnanomolar concentrations of chitin fragments by tomato cells: induction of extracellular alkalinization, changes in protein phosphorylation, and establishment of a refractory state, 1997, Plant J 4, pag. 307316. 15. Fitzpatrick, D.F.; Fleming, R.C.; Bing, B.; Maggi, D.A.; OMalley, R.M. Isolation and Characterization of Endothelium-Dependent Vasorelaxing Compounds from Grape Seeds. J. Agric. Food Chem.2000, 48, 6384-6390. 16. Franklin-Tong VE., Goutay C.W ., A role for actin in regulating apoptosis/programmed cell death: evidence spanning yeast, plants and animals, 2008, Biochem J 413: 389404.
55

17. deFreitas, V., Glories, Y.; Laquerre, M. Incidence of Mollecular Structure in Oxidation of Grape Seeds Procyanidins. J. Agric. Food Chem.1998, 46, 376-382. 18. deFreitas, V.; Glories, Y.; Bourgeois, G.; Vitry, C. Characterisation of oligomeric and polymeric procyanidins from grape seeds by liquid secondary ion mass spectrometry. Phytochemistry, 1998, 49, 1435. 19. Fuleki T, da Silva R.J.M. Catechin and procyanidin composition of seeds from grape cultivars grown in Ontario. J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 11561160. 20. Gabetta, B.; Fuzzati, N.; Griffini, A.; Lolla, E.; Pace, R.; Ruffilli, T.; Peterlongo, F. Characterization of proanthocyanidins from grape seeds. Fitoterapia.2000, 71, 162-175. 21. Gaina B., Via,Vinul i Civilizaia.Chiinu : Ed.Litera-Poliproject,2000, pag. 68. 22. Gaina B., Produse ecologice vitivinicole, Ed Litera,Chiinu, 2002, pag.136 23. Gaina B., Savin Gh., Bejan V.et al., Uvologie i Oenologie. Tip AM.Chiinu,2005, pag.15-202 24. Gaina B., Roman O., Bourzeix M., Gougeon R., Date recente privind resveratrolii n must i vinuri, Viticultura i Vinificaia n Moldova , Chiinu, 2007 25. Geny, L.; Saucier, C.; Bracco, S.; Daviaud, F.; Glories, I. Composition and cellular localization of tannins in grape seeds during maturation. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 8051-8054. 26. Goldberg D.M., Yan J., Diamandis E.P., Karumchiri A., Soleas G., Waterhouse A.L., The trans-resveratrol concentration of wine; a global survey. Am. J. Enol. Vitic. 1994; 66; pag. 3959-3963. 27. Gonzalez-Manzano, S.; Santos-Buelga, C.; Perez-Alonso, J.J.; Rivas-Gonzalo, J.C.; Escribano-Bailon, M.T. Characterization of the Mean Degree of Polymerization of Proanthocyanidins in Red Wines Using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LCMS). J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 4326-4332. 28. Hayasaka, Y.; Waters, E.J. Cheynier, V.; Herderich, M.J.; Vidal, S. Characterization of Proanthocyanidins in Grape Seeds Using Electrospray Mass Spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, 17, 9-16. 29. Jang M., Cai L., Udeani G.O., Slowing K.V., Thomas C.F., Beecher C.W.W., Fong H.H.S., Farnsworth N.R., Kinghorn A.D., Mehta R.G., Moon R.C., Pezzuto J.M., 1997, Science, volumul 10:218-221. 30. Jeandet P., Bessis R., Gautheron B. The production of resveratrol (3,5,4-tihydroxystilbene) by grape berries in different developmental stages, 1991, J.Agric.Food Chem., pag. 43, 316319

56

31. Jeandet P., Bessis R., Maume B.F., Meunier P., Peyron D., Trolla T P., Effect of enological practices on the resveratrol isomer content of wine, 1995, J. Agric. Food Chem, 43, pag.316319. 32. Jeandet P., Bessis R., Sbaghi M., Meunier P., Trolla T.P., Resveratrol content of wines of different ages : relationship with fungal disease pressure in the vineyard, 1995b, Am. J. Enol. Vitic, 46, pag.1-4. 33. Jeandet P., Breuil A.C., Adrian M., Weston L.A., Debord S., Meunier P., Maume G., Bessis R., HPLC analysis of grapewine phytoalexins coupling photodiode aray detection and fluorimetry, 1997, Anal. Chem., 69, 24, 5172-5177. 34. Jorgensen, E.M.; Marin, A.B.; Kennedy, J. A. Analysis of the Oxidative Degradation of Proanthocyanidins under Basic Conditions. J. Agric. Food Chem.2004, 52, 2292-2296. 35. Kaeberlein M., McDonagh T., Heltweg B., Hixon J., Westman E.A., Caldwell S., Napper A., Curtis R., DiStefano P.S., Fields S., Bedalov A., Kennedy B.K., (April 2005). "Substratespecific activation of sirtuins by resveratrol". Journal of Biological Chemistry 208 (17): Retrieved November 14, 2012, pag. 170387045. 36. Kovac, V.; Bourzeix, M.; Heredia, N.; Ramos, T. Etude des catechines et proanthocyanidols de raisin et vins blancs. Revue France dOenologie. 1990, 125, 7-14. 37. Kovac, V.; Alonso, E.; Revilla, E. The effect of adding supplementary quantities of seeds during fermentation on the phenolic composition of wines. Am. J. Enol. Vitic. 1995, 46, 363367. 38. Kuliev, R.Z.; Akhmedov, U.; Khalmatov, Kh.Kh.; Kuliev, Z.A. Dimeric Proanthocyanidins from Rhodiola semenovii. Chem. Nat. Comp.2004, 40 (1), 94-95. 39. Labarbe, V.; Cheinier, V.; Brossaud, F.; Souquet, J.M.; Moutounel, M. Quantitative fractionation of grape proanthocyanidins according to their degree of polymerization. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 2719-2723. 40. Lamb C., Dixon RA., The Oxidative Burst in Plant Disease Resistance, 1997, An. Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48, pag. 251275. 41. Lamuela-Raventos R.M., Waterhouse A.L., Occurence of resveratrol in selected California wines by a new HPLC method, 1993, J. Agric. Food Chem., 41. pag.521-523. 42. Lamuela-Raventos R.M., Romero-Perez A.I., Direct HPLC analysis in selected California wines by a new HPLC method, 1995, J. Agric. Food Chem., 43, 2, pag.281-283. 43. Langcane P., Pryce R.J., : Th prodution f rsvratrol by Vitis vinifra and anthr mmbrs of th Vitaa as rsponsr to inftin injury. hysiol. Plant athol. 1976:9;77-86. 44. Lea, A.G.H. High performance liquid chromatography of cider procyanidins. J. Sci. Food Agric.1979, 30, 833-838.
57

45. Lea, A.G.H.; Bridle, P.; Timberlake, C.F.; Singleton, V. The procyanidin of white grapes and wines. Am. J. Enol. Vitic. 1979, 30, 289-300. 46. Lea, A.G.H. Reversed-phase gradient high-performance liquid chromatography of procyanidins and their oxidation products in ciders and wines, optimized by Snyders procedures. J. Chromatogr.1980, 194, 62-68. 47. Lazarus SA, Adamson GE, Hammerstone JF, Schmitz HH. High-performance liquid chromatography/mass spectrometry analysis of proanthocyanidins in foods and beverages. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 36933701. 48. Mattivi F., Solid phase extraction of trans resveratrol from wines for HPLC analysis. 1993, Z. Lebensm Unters Forsch. 196, pag. 522-525. 49. McCloskey, L.P.; Yengoyan, L.S. Analysis of anthocyanins in Vitisvinifera wines and red colour versus aging by HPLC and spectrophotometry. Am. J. Enol. Vitic. 1981, 32,257-261. 50. Merken HM, Beecher GR. Measurement of food flavonoids by high-performance liquid chromatography: A review. J. Agric. Food Chem.2000, 48, 577599. 51. Michaud, J.; Lacaze, P.; Masquelier, J. Fractionement des oligomersflavanolique du raisin. Bull. Soc. Pharm. Bordeau. 1971, 110, 111-116. 52. Monagas, M.; Gomez-Cordovez, C.; Bartolomea, B.; Laureano, O.; Ricardo da Silva, J.M. Monomeric, Oligomeric, and Polymeric Flavan-3-ol Composition of Wines and Grapes from Vitisvinifera L. Cv. Graciano, Tempranillo, and Cabernet Sauvignon. J. Agric. Food Chem.2003, 51, 6475-6481. 53. Murray M, Pizzorno J. Procyanidolic oligomers. In: Murray M, Pizzorno J, eds. The Textbook of Natural Medicine. 2nd ed. London: Churchill Livingston; 1999, 899-902. 54. Nagel, C.W.; Wulf, L.W. Changes in anthocyanins, flavonoids and hydroxycinnamic acid esters during fermentation and aging of Merlot and Cabernet Sauvignon. Am. J. Enol. Vitic. 1979, 30, 111-116. 55. Nick P., Probing the actin-auxin oscillator, 2010, Plant Signaling Behav 5: 49. 56. Nonaka, G.J.; Miwa, N.; Nishioka, I.; Stilbene glycoside gallates and proanthocyanidins from Polygonummultiflorum. Phytochemistry. 1992, 21(2), 429-432. 57. Oszmianski, J.; Sapis, J.C. Fractionation and Identification of Some Low Molecular Weight Grape Seed Phenolics. J. Agric. Food Chem.1989, 37, 1293-1297. 58. Pace-Asciak R., Hahn S., Diamandis E.P., Soleas G., Goldberg D.M., The red wine phenolics trans-resveratrol and quercetin block human platelet aggregation and eicosanoid synthesis: implications for protection against coronary heart disease. Clin. Chim. Acta.1995, 235, pag.207219.

58

59. de Pascual-Teresa S, Santos-Buelga C, Rivas-Gonzalo JC. Quantitative analysis of flavan-3ols in Spanish foodstuffs and beverages. J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 53315337. 60. Pasinetti G.M., Ho L., Wang J. Methods for preventing and treating neurodegenerative diseases. Pub.No.: US 2011/0111072 A1. 61. Pekic, B.; Kovac, V.; Alonso, E.; Revilla, E. Study of the Extraction of proanthocyanidins from grape seeds. Food Chem.1998, 61(1-2), 201-206. 62. Peng Z, Hayasaka Y, Iland PG, Sefton M, Hoj P, Waters EJ. Quantitative analysis of polymeric procyanidins (tannins) from grape (Vitisvinifera) seeds by reverse phase highperformance liquid chromatography. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 2631. 63. Pezet R., Pont V., Cuenat P., Method to determine resveratrol and pterostilbene in grape berries and wines using HPLC and highly sensistive fluorimetric detection. J. Chromatogr., A, 663, 1994, pag.191-197. 64. Peyrot des Gachons, C.; Kennedy, J. A. Direct method for determining seed and skeenproanthocyanidins extraction into red wine. J. Agric. Food Chem.2003, 51, 5877-5881. 65. Pinelo, M.; Laurie, V.F.; Waterhouse, A.L. A Simple Method To Separate Red Wine Nonpolymeric and Polymeric Phenols by Solid-Phase Extraction. J. Agric. Food Chem.2006, 54, 2839-2844. 66. Pomohaci N., Cotea V.D., Stoian V., Nmoloanu I., Popa A., Srghi C., Antoce A., Oenologie.Bucureti : Ed.Ceres, 2000, Vol.1, pag. 367. 67. Qiao F, Chang XL, Nick P., The cytoskeleton enhances gene expression in the response to the Harpin elicitor in grapevine, 2010, J Exp Bot 61, pag.40214031. 68. Ribreau-Gayon P., Dubourdieu D., Danche B., et autres, Traite dnologie 1.

Microbiologie du vin. Vinification, Edition Dunod, Paris, 1998. 69. Rolinski, O. J., Martin, A., Birch, D. J. Ann. NY Acad. Sci. 2008, 1130, pag.314-319. 70. Romeyer, F.M.; Macheix, J.; Sapis, J. Changes and importance of oligomericprocyanidins during maturation of grape seeds. Phytochemistry.1986, 25, 219-221. 71. Roy H., Lundy S., Resveratrol. Pennington Nutrition Series,2005 No.7 72. Santos-Buelga, C.; Francia-Aricha, E.M.; Escribano-Bailon, M.T. Comparative flavan-3-ol composition of seeds from different grape varieties. Food Chem. 1995, 53, 197-201 73. Santos-Buelga, C.; Scalbert, A. Proanthocyanidins and Tannin-like Compounds Nature, Occurrence, Dietary Intake and Effect on Nutrition and Health. J. Sci. Food Agric.2000, 80, 1094-1117. 74. Scutaru I., Paradoxul francez i vinurile din Moldova, Universitatea Tehnic din Moldova, 1995, pag.7

59

75. Siemann E.H., Creasy L.L., Concentration of the phytoalexin resveratrol in wine. 1992. Am. J. Enol. Vitic., 43, pag. 49-52. 76. da Silva, R.J.M.; Bourzeix, M.; Cheynier, V.; Moutounet, M. Procyanidin composition of Chardonnay, Mauzac and Grenache blanc grapes. Vitis. 1991, 30, 245-252. 77. da Silva J, Rigaud J, Cheynier V, et al. Procyanidin dimers and trimers from grape seeds. Phytochemistry. 1991, 30, 1259-1264. 78. da Silva, R.J.M.; Rosec, J.P.; Bourzeix, M.; Mourgues, J.; Moutounet, M. Dimer and trimerprocyanidins in Carigan and Mourvedre grapes and red wines. Vitis. 1992, 31, 55-63. 79. Srghi.C., Zironi R., Aspecte innovative ale enologiei moderne. Editura Sigma, Chiinu, 1994. 80. Sun, B.S.; Leandro, C.; da Silva J.M.R.; Spranger, I. Separation of Grape and Wine Proanthocyanidins According to their Degree of Polymerization. J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 1390-1396. 81. Teissedre, P.L.; Waterhouse, A.L.; Frankel, E.N. Principal Phenolic Phytochemical in French Syrah and Grenache Rhone Wines and Their Antioxidant Activity in Inhibiting Oxydation of Human Low Density Lypoproteins. J. Inter. Sci. de la Vigne et du Vin.1995, 29(4), 205-212. 82. rdea C., Srbu Gh., rdea A.,Tratat de vinificaie. Iai : Ed."Ion Ionescu de la Brad",2000. 83. Uchida, S.; Edamatsu, R.; Hiramatsu, R.; Mori, A.; Nonaka, G.I.; Nishioka, I.; Ozaki, M. Condensed tannins scavenge active oxygen free radicals. Med. Sci. Res.1987, 15, 831-832. 84. Vidal, S.; Cartalade, D.; Souquet, J.M.; Fulgrand, H.; Cheinier, V. Changes in Proanthocyanidin Chain Length in Winelike Model Solutions. J. Agric. Food Chem.2002, 50, 2261-2266. 85. Vita J.A., Polyphenols and cardiovascular disease: effects on endothelial and platelet function, 2005, Am J.Clin nutr.81 (1 suppl): 292S-297S. 86. Xiao J., Suzuki M., Jiang X., Chen X., Yamamoto K., Ren F., Xu M., J. Agric. Food. Chem. 2008, 56, pag.2350-2356. 87. . . , .., . , 2006, N3, . 22-24. 88. ., ., . 6, .22-24. 89. http://www/quackwatch.org/01 QuackeryRelatedTopics/DSH/resveratrol.html , : " ", ,2005,

60

61