METODE CROMATOGRAFICE DE ANALIZA

CROMATOGRAFIA -reprezinta o metoda de separare bazata pe repartitia diferentiata

a componentilor unui amestec de separate intre doua faze in contact si care se situeaza
intr-un raport de miscare relativ una fata de cealalta (definita prin termenii de faza
stationara si faza mobile).Separarea cromatografica este rezultatul unor procese
repetate de sorbtie-desorbtie a componentilor probei in faza stationara si faza
mobila[26] Repartitia diferentiata a analitilor intre cele doua faze aflate in contact este
controlata prin constanta de distributie K descrisa prin raportul!K " #S$#% unde #s
reprezinta concentratia analitului in faza stationaraiar #% reprezinta concetratia
analitului in faza mobila.
CLASIFICAREA METODELOR CROMATOGRAFICE DE ANALIZA - %etodele
cromatografice se clasifica dupa o serie de criterii! caracteristicile fizico-c&imice ale
proceselor sau sistemelor natura fazelor mobile si stationara aspectele de ordin
te&nic(dispunerea fazei stationare modul de deplasare a probei parametrii de operare)
tabelul '
'.#el mai utilizat criteriu de clasificare este natura sau starea de agregare a celor doua
faze.
FAZA STATONARA poate sa fie solida sau lic&ida in cel de al doilea caz lic&idul fiind
depus pe un suport solid.fazele stationare lic&ide trebuie sa indeplineasca unele conditii
speciale cum ar fi volatilitatea foarte scazuta miscibilitate redusa cu solventii
uzualiviscozitate ridicate pentru a ramane pe un support in timp ce faza mobila curge
prin coloana.
FAZA MIBILA poate fi un lic&id(() un gaz()) sau un fluid supercritic(*S) nemiscibile
cu faza stationara. +aca faza mobile este un gaz vorbim de cromatografie de
gaze(#)) daca este un lic&id de cromatografie de lic&ide(#() iar daca este un fluid
supercritic de cromatografie de fluide in stare supercritical (#*S) fuidul supercritic este
o substanta care se afla deasura presiunii si temperaturii sale critice.
,abelul '. #lasificarea metodelor cromatografice in functie de natura fazelor intre analiti
se distribuie diferentiat
*-.- %/01(- *-.-
S,-,1/2-R-
+324%1R3 S1%0/
(
gaz solid #romatografia de repartitie gaz-solid #)S
gaz lic&id #romatografia de repartitie gaz-lic&id #)(
lic&id lic&id #romatografia de repartitie lic&id-lic&id #((
lic&id solid #romatografia de repartitie lic&id-solid #(S
*luid
supercritic
Solid sau lic&id #romatografia de fluide in stare
supercritica
#*S
2.1n functie de 5R/#3S4( +3 S35-R-R3 metodele cromatografice se impart in doua
categorii ! -metode bazate pe afinitatea diferiat a componentilor(in care sunt incluse
metodele de repartitie absorbtie sc&imb ionic afinitate)6 -metode bazate pe marimea
diferita a componentilor(e7! e7cluziunea sterica) 8.#onsiderand %/+4( +3
+35(-S-R3 a probei se pot distinge urmatoarele te&nici! cromatografia prin elutie prin
dizlocare frontala si cu goluri sau vacante 9.1n ceea ce priveste 5-R-%3,R11 +3
/53R-R3-temperatura coloanei si debitul purtatorului-acestia pot fi constanti sau
variabili rezultand cromatografia izoterma cu temperatura programata(gradient de
tempertatura) sau cu debit programat(gradient de presiune).
SCHEMA BLOC A UNUI CROMATOGRAF - 5rocesul cromatografic de separare se
realizeaza prin alternarea succesiva a starilorde ec&ilibru si neec&ilibru generate de
repartitia analitului intre faze. Sistemul cromatografic evolueaza in sensul realizarii starii
de ec&ilibru la repartitie(este atinsa constanta de distributie K pentru fiecare dintre
analiti). Starea de neec&ilibru imediat consecutiva starii e ec&ilibru este generata prin
miscarea fazei mobile.3lementele constructive ale unui cromatrograf sunt prezentate
sc&ematic in fig. '.
proba 8 :
''2' 9 6
*ig.'-sc&ema unui cromatograf
'-sursa de eluent6 2-in;ector6 8-coloana69-detector6 :-termostat6-inregistrator
1.3luentul(faza mobila) are rolul de a transporta proba prin coloana cromatografica.
2.1n;ectorul asigura reproductibilitatea probei introduse in coloana. 3ficienta separarii si
e7actitatea rezultatelor depend de introducerea probei si deci constructia in;ectorului.
1n;ectoarele sunt diferite pentru cromatografia de gaze si cea de lic&ide .3.coloana
'
2
cromatografica cotine la un moment dat cele doua faze cromatografice si este locul
unde se realizeaza separarea componentelor probei. +in cauza interactiunii moleculelor
cu faza stationara componentele din probaraman in urma eluentului in functie de
diferentele care e7ista intre constantele ec&ilibrului de repartitie intre cele doua faze. #a
urmare se produce o diferentiere a vitezelor lor de migrare si in final separarea.4.Scopul
+etectorului este de a pune in evidenta componentii ce parasesc coloana
cromatografica antrenati de faza mobila. +etectorul este piesa cea mai importanta a
unui cromatograf dupa coloana cromatografica .37ista 2 categori de detector ! universali
si specifici . #ei universali sunt sensibili la un nr. %are de componenti iar cei specifici
sunt sensibili numai la anumiti componenti .4n detector ideal trebuie sa indeplineasca o
serie de conditii ! raspuns rapid in prezenta solutului 6 stabilitate in timpul functionarii 6un
domeniu larg de raspuns linear 6 sensibilitate inalta 6 manipulare si etalonare usoara .
+etectorii pot fi diferentiali si integrali. +etectorii diferentiali masoara conc. instantanee
sau debitul de masa al solutului ce paraseste coloana cromatografica. +etectorii
integrali acumuleaza raspuns datorat componentilor probei iar semnalul inregistrat ne
indica cantitatea totala care a parasit coloana cromatografica la un anumit moment.
Raspunsul detectorului este functie de unele sc&imbari in proprietatile fizice ale gazului
ce paraseste coloana cromatografica in prezenta componentilor probei. -ceste
sc&imbari pot fi ! conductibilitate termica 6ionizare in flacara 6 conductibilitate electrica 6
ionizare sub influenta radiatiei . 5.,ermostatul-asigura temp uniforma a intregului
s<stem prin care circula proba.
6.1nregistratorul-preia semnalele amplificate de circuitul detectorului inscriind
rezultatele analizei sub forma cromatografica . #romatografele moderne sunt conectate
la un calculator legat la randul sau la o imprimata care preia rolul de inregistrator.
#romatograma- reprezinta rezultatul unei separari cromatograme si este generata de
procesul de detective a analitilor . in ordinea elutiei acestora(fig2.=.)5rocesul de detect
ie consta in masurarea continua in timp a unei prop care caracterizeaza dupa caz
totalitatea sau numai specii de analiti separate in procesul cromatografic
.#romatograma reprezinta deci o dependecnt functional reprezentabila intr-un s<stem
bidimensional de coordonate .5e abscisa ste reprezentat timpul scurs din momentul
in;ectiei probei in sist romatografic si pana in momentul elutiei ultimei specii de analiti
( cea mai puternica retinuta in faza stationara ). 5e ordonata se va reprezenta
proprietatea masurata.
3
' 2 9 : *ig.2 #romatograma
6
>
%omentul elutei unei specii de analit din sist cromatografic corespunde unei variatii a
raspunsului generat de sist de detectie proportional cu masa sau conc compusului in
cauza .4n astfel de semnal produs de catre detector in momentul evolutiei unui anumit
compus este cunoscut sub numele de pic cro!"o#r!$ic . 5icul cromatografic poate fi
caract. prin 2 tipuri de parametri !-calitativi (timpul de retentie absolut timpul de retentie
relativ volumul de retentie absolut volumul de retentie relativ si factorul de
capacitate ) si cantitativi ( aria si inaltimea picului cromatografic ).
Tip%& '( r("()"i( !*+o&%" ,"R-.repre timpul scurs de la in;ectarea probei in sist
cromatografic si pana in momentul detectiei unui raspuns ma7im la elutia uneia din
speciile separate .
Tip%& '( r("()"i( r(&!"i/ ,"R-. corespunde timpului pe care o specie de analiti il
petrece in faza stationara .+iferenta dintre timpul de retentie absolute si timpul de
retentie relativ corespunde perioadei de timp pe care solutul a petrecut-o in faza
mobila .,impul necesar frontului de faza mobile pt a parcurge coloana cromatografica
se defineste ca fiind timpul mort (t%) .#a definitie alternativa timpul mort poate fi
considerat timpul de retentie absolute al unui compus care nu se distribuie deloc in faza
stationara (ct sa de distributie K fiind nula ). Se stabileste in acestmod relatia ! "R0 "R 1
"M %arimilor tR respective tR li se pot asocia valorile ?R si respective ?R cunoscute
sub numele de volum de retentie absolute respectiv volum de retentie relative
.Retentia se masoara de obicei in unitati de timp dar unitatile de volum sunt mai e7acte
.Relatia dintre unitatea de timp si cea de volum se face prin intermediul debitului fazei
mobile (+). ?R" tR@+ . F!c"or%& '( c!p!ci"!"( ,2
I
)- poate fi definit ca marime
care indica de cate ori timpul de repartitie a specie de analit in faza stationara este mai
mare decat timpul cat acesta se gaseste in faza mobile .2
I
0"R 3"M0"R."M 3"M
M!rii&( c( c!r!c"(ri4(!4! proc(+%& '( +(p!r!r( 5 E$ici()"!.separarii
cromatografice se refera la capacitatea sist cromatografic de a elua analitii supusi
separarii sub forms unor picuri e7rem de inguste .-cest termen este corelat cu nr. de
ec&ilibre de repartitie intre faze care se realizeaza pe toata durata procesului de
separare . 5t a caract acest proces se introduce notiunea de taler teoretic ca fiind
portiunea din coloana cromatografica in care se realizeaza un proces elementar de
repartitie la ec&ilibru .(ungimea de coloana pt care o astfel de stare de ec&ilibru este
atinsa poarta denumirea de inaltime a talerului teoretic (A). 1ntre lungimea totala a
coloanei cromatografice (()si inaltimea talerului (A) se stabileste relatia ! ("A@2 unde
2 reprez nr talerelor teoretice ale unei coloane cromatografice ( este practic ec&ivalent
cu nr de stari consecutive de ec&ilibru pe parcursul separarii cromatografice in acea
coloana ). 2r de talere teoretice (2) poate fi calculate cu a; marimilor ce caract picul
cromatografic .
N0"R
2
3
2
016"R
2
36
2
*05.545"R
2
36
2
7.504 "
2
R38
2
i


S(&(c"i/i"!"(!.separarii cromatografice reprez capacitatea sist cromatografic de a
separa analiti cu proprietati e7treme de asemanatoare si este descrisa prin $!c"or%& '(
+(p!r!r( notat cu . *actorul de separare se refera la o perec&e de analiti eluati
consecutiv din coloanareprezentati in urma detectiei prin doua picuri adiacente. +aca
"' adica cei doi analiti au acelasi coeficienti de distributie ei nu pot fi separati si
conditiile analitice trebuie modificate.
092391022
I
321
I
unde !K' si K2 sunt coeficientii de repartitie(distributie) intre cele
doua faze corespunzator celor doi analiti separati consecutive' si 26 iar K
B
' si C
B
2 sunt
factorii de capacitate corespunzatori.
REZOLUTIA unei separari cromatografice este o masura mai e7plicita a gradului de
separare a doi compusi. Rezolutia cromatografica(Rs) se defineste ca marimea ce
caract global calitatea separarii fiind masurabila prin insasi parametrii care definesc
picul cromatografic
RS0"R2."R132:,112-4nde! tR' si tR2 sunt timpii de retentie ai celor doi compusi6 ' si 2
repr distributiile lor e7primate in unitati de timp. +aca Rs"' apro7 D9E din moleculele
celor doi compusi vecini sunt separate. Se considera ca separarea este totala atunci
cand Rs"':.
ANALIZA CALITATI;A SI CANTITATI;A IN CROMATOGRAFIE
ANALIZA CALITATI;A(1+32,1*1#-R3- S40S,-2,3(/R S35-R-,3) se
realizeaza la iesirea din coloana cu a;utorul detectorului. #romatograma reprez
succesiunea de picuri cromatografice produsa de detector. +etectorul transforma o prop
a compusilor da analizat in semnal electric proportional cu cantitatea de substanta.
1dentificarea componentilor corespunzatori picurilor cromatografice se poate face in
doua moduri!-prin compararea timpilor de retentie ai componentilor cu al unor etaloane
cunoscute in aceleasi conditii e7perimentale6 aceasta metoda nu asigura certitudinea
identitatii unei substante6-prin retinerea componentilor eluati pentru o analiza ulterioara
prina alte te&nici analitice cum ar fi spectometria in 1R sau spectometria de masa
contribuind astfel la cresterea procentelor de certitudine.
+aca pentru caract sunt utilizate datele de retentie este necesar sa se controleze cu
gri;a parametrii de curgere si de temperatura deoarece comparatia dintre proba
necunoscuta si standard se face tocmai pe baza acestor date. 1ntrucat foarte multi
compusi diferiti pot avea acelasi timp(sau volum) de retentie este necesar sa se
utilizeze mai multe coloane cu selectivitati diferite.
5entru ANALIZA CANTITATI;A este foarte important standardizarea conditiilor de
lucru si cunoasterea factorului de raspuns al detectorului pentru fiecare component
determinat. -naliza cantitativa consta in trei etape!-obtinerea comtogramei6
-masurarea ma7imelor(picurilor) sau a suprafetelor -interpretare rezultatelor
Suprafata integrate a unui pic este direct prop cu cantiatea de solut eluat. Se poate
utilize si inaltimea picului dar rezultatele sunt mai putin precise. %asurarea suprafetei
se face prin urmatoarele metode!metoda triung&iului metoda planimetrarii(care consta
in determinarea ariei cu a;utorul unui planimetru) metoda decuparii si cantaririi
integrarea electronica. #alculul rezultatelor se poate face in mai multe moduri!
normalizarea interna standardizarea interna metoda adaosului standard.1n cadrul
("o'(i '( )or!&i4!r( comnpozitia procentuala este determinate prin masurarea
ariei fiecarui pic si impartirea ariilor individuale la toata aria totala. -cest lucru
presupune ca au fost eluate toate picurile probei si ca raspunsul detectorului este
acelasi pentru fiecare compus.
STANDARDIZAREA INTERNA consta in adugarea la proba de analizat inainte de a fi
analizata a unei cantitati cunoscute dintr-o substanta standard. Se determina apoi
raportul dintre suprafetele picurilor substantei standard si cele ale substantei de
analizat pe baza caruia se poate determina cantiatea de substanta din proba. Ci0Ai:$i
3AS:$+ :CS
4nde! #i este concentratia compusului de analizat 6 #s este concentratia standardului 6
-i este aria corespunzatoare picului compusului de analizat6 -s este aria
corespunzatoare picului standard6 fi fs sunt factorii de raspuns ai detectorului pentru
cele doua substante.
1n cazul ("o'(i !'!o+%&%i +"!)'!r' se obtin cromatograme pentru proba ca atare si
dupa ce s-a adaugat in proba o cantiate cunoscuta din substanta de analizat.
+iferenta dintre suprafetele celor doua picuri cromatografice este suficienta pentru a
determina cantiatea initiala de substanta din proba . Ci0CS:Ai 3A.Ai -unde - este aria
obtinuta dupa adaugarea cantitatii standard.