IZOLAREA I CONFIRMAREA

BACTERIILOR COLIFORME

Bacteriile coliforme sunt
- bacili aerobi sau facultativ anaerobi, nesporulai, Gram negativi;
- fermenteaz lactoza la 37
0
C, cu producere de gaze, n condiiile indicate incubrii uzual pe mediul
B.B.L.V.;
Cele mai multe STANDARDE descriu procedurile de izolare a speciilor care fermenteaz lactoza i produc gaze
la 35-37C, de form bacilar sau cocobacilar: E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter i Serratia.

Limitele contaminrii cu bacterii coliforme n cazul produselor alimentare de origine animal sunt
foarte largi.
Bacteriile coliforme, nu sunt n general, bacterii patogene;
sunt INDICATOR SANITAR (igienic);
este recunoscut faptul c i numrul mare, de bacterii coliforme poate produce fenomene nedorite produsului sau
consumatorului

Limitele contaminrii cu bacterii coliforme n cazul produselor alimentare de origine animal sunt
foarte largi.
Bacteriile coliforme, nu sunt n general, bacterii patogene;
sunt INDICATOR SANITAR (igienic);
este recunoscut faptul c i numrul mare, de bacterii coliforme poate produce fenomene nedorite
produsului sau consumatorului.
n grupa bacteriilor coliforme sunt cuprinse , n principal, genurile:
- Escherichia,
- Enterobacter i
- Klebsiella (Brzoi D., 1978).
n grupa bacteriilor coliforme sunt cuprinse , n principal, genurile:
- Escherichia,
- Enterobacter i
- Klebsiella (Brzoi D., 1978).

Criteriile morfologice nu sunt suficiente pentru identificarea genurilor.
Configuraia biochimic este important, ns examenele serologice bazate pe structura lor antigenic,
sunt considerate exacte.
Confirmarea serologic a speciei de cercetat, urmeaz apoi doar ca o continuare fireasc a finalizrii
rezultatelor nu este utilizata n mod curent.
Pentru efectuarea unor examene serologice precise este nevoie de decodificarea profilului biochimic.
Profilul biochimic a fost stabilit prin utilizarea galeriilor ID 32 E sau galeriilor tip 32 GN,
utilizate pentru identificarea tulpinilor de Enterobacteriaceae.
Pentru efectuarea unor examene serologice precise este nevoie de decodificarea profilului biochimic.
Profilul biochimic a fost stabilit prin utilizarea galeriilor ID 32 E sau galeriilor tip 32 GN,
utilizate pentru identificarea tulpinilor de Enterobacteriaceae.















Directive generale pentru stabilirea numrului de bacterii coliforme. Tehnica numrului cel mai
probabil

SR ISO 4831/2009

SR ISO 4831/2009 Directive generale pentru stabilirea numrului de bacterii coliforme Tehnica
numrului cel mai probabil prevede directivele generale pentru stabilirea numrului cel mai probabil de
bacterii coliforme din produsele ALIMENTARE DE ORIGINE ANIMAL destinate consumului uman.

Din cauza diversitii produselor alimentare care intr n acest domeniu de aplicare se vor aplica pe ct posibil
aceste directive cu exactitate i nu se va recurge la derogri, dect atunci cnd acest lucru nu poate fi evitat.
Metoda este mai puin precis dect SR ISO 4832 metoda prin numrarea coloniilor obinute pe mediu solid,
ns permite o analiz mai substanial.
Definiie
Utilizarea prezentului Standard Internaional, se aplic urmtoarea definiie:
coliforme sunt bacterii care cresc/se dezvolt la temperatura specificat (35
o
C sau 37
o
C),
produc fermentarea lactozei, cu producere de gaz, atunci cnd analiza este efectuat pe mediile de
cultura i n condiiile prevzute n metoda specificat conform SR ISO 4831.
INCUBAREA
Tuburile nsmnate se vor incuba la 30
o
C, 35
o
C sau 37
o
C (ultimele dou temperaturi fiind preferate), timp de
24 ore sau 48 de ore (dac la 24 de ore nu se constat cretere microbian).
Principiu de lucru
nsmnarea a trei eprubete cu mediul de mbogire B.B.L.V., la trei diluii succesive (de ex. 10-3,
10-4, 10-5), cu o cantitate determinat de eantion pentru analiz (1 ml), dac produsul care se
examineaz este lichid sau cu o cantitate determinat de suspensie-mam, n cazul produselor solide.
Identic se procedeaz cu nsmnarea diluiilor obinute din eantionul pentru analiz sau din
suspensia-mam, dar se utilizeaz mediu BBLV dublu concentrat.
Rensmnarea se face din culturile aflate n eprubetele cu mediul bulion cu triptoz i lauril sulfat
(LST) dublu concentrat i din culturile provenite din prima serie de eprubete cu mediul bulion cu
triptoz i lauril sulfat (LST) simplu concentrat, care sunt opace, tulburi sau care au provocat o degajare
de gaz, ntr-o serie de eprubete cu mediu de confirmare bulion lactozat cu bil i verde briliant (BBLV)



METODA ORIZONTAL PENTRU ENUMERAREA BACTERI I LOR COLI FORME.
METODA NUMRRII COLONIILOR.
SR ISO 4832/2009

SR ISO 4832/2009
Acest Standard Internaional stabilete directivele generale privind obinerea numrului de bacterii
coliforme din produsele alimetare destinate consumului uman, prin numrarea direct a coloniilor caracteristice
obinute pe un mediu solid specific - VRBL, dup incubare la 35
o
C sau 37
o
C i fermentarea lactozei cu
producere de gaz pe mediul BBLV - specificat de standard.

Stabilirea numrului de bacterii coliforme se efectueaz prin numrarea direct a coloniilor obinute pe
un mediu solid (VRBL mediu cu cristal violet, rou neutru, bil i lactoz), dup incubare la 30
o
C sau 37
o
C,
temperatura fcnd obiectul unui acord ntre prile interesate.

Definiie
La utilizarea prezentului Standard Internaional (S.I.), se aplic urmtoarea definiie: prin bacterii
coliforme se neleg bacteriile care cresc/se dezvolt, la temperatura specificat (adic 35
o
C sau 37
o
C, conform
nelegerii), formeaz colonii caracteristice n mediu de VRBL (geloz-lactoz, bil, cristal violet i cu rou
neutru), atunci cnd analiza este efectuat dup metoda specificat n prezentul S.I.
Principiu
nsmnarea n profunzimea unui mediu selectiv solid (VRBL), turnat n dou plci Petri, cu o cantitate
determinat de eantion pentru analiz, dac produsul care se examineaz este lichid sau cu o cantitate
determinat de suspensie-mam.
nsmnarea a cel puin nc o diluie urmtoare, obinute din eantionul pentru analiz sau din
suspensia-mam.
INCUBAREA plcilor se face la 35
o
C sau 37
o
C, timp de 24 - 48 ore.

ATENIE!
NSMNAREA
Pe mediul VRBL se efectueaz ntre 2 straturi de mediu. Aceasta presupune turnarea unui strat n
cantitate de 12-15ml, se las la solidificat, se adaug inoculum, iar dup ce acesta a ptruns n mediu se
adaug un al doilea strat de mediu (4 ml la temperatura de 44
o
C, maxim 47
o
C), pentru a limita
dezvoltarea coloniilor i a fi numrate cu uurin.
INCUBAREA plcilor se face la 30
o
C, 35
o
C sau 37
o
C, timp de 24 - 48 ore.

CITIREA sau NUMRAREA
Se consider colonii prezumtive de bacterii coliforme, acele colonii care prezint coloraie roz i au un
diametru mai mare de 0,5 mm.
Se citesc plcile cu colonii tipice care conin ntre 10 i 150 de colonii.
Citirea coloniilor caracteristice pe mediul VRBL trebuie difereniate de coloniile de Escherichia coli i
alte tipuri de coliformi.
Coliformi totali Coliformi termotolerani
Coliformi totali sunt bacteriile care cresc pe medii specifice pentru coliformi la temperatura de
incubare de 35
o
C sau 37
o
C.



Coliformi termotolerani sunt reprezentani de bacteriile care cresc pe medii specifice pentru
coliformi la temperatura de incubare de 44
o
C.

CONFIRMAREA
Se preleveaz cte 5 colonii minim din fiecare plac n care s-au identificat colonii tipice de bacterii coliforme i
se nsmeaz n cte un tub cu cte 10 ml de BBLV (bulion , bila, lactoz i verde briliant ).
INCUBAREA
Tuburile cu cte 10 ml de bulion lactoz i verde briliant nsmnate se vor incuba 35
o
C sau 37
o
C, timp de 24
- 48 ore.
Se considera coliformi - bacteriile care formeaz colonii tipice pe mediul VRBL i formeaz gaz n tubuleele
DURHAM - la T
o
de incubare din SR ISO pe mediul BBLV.

IZOLAREA I CONFIRMAREA SPECIEI ESCHERI CHI A COLI DIN PRODUSELE ALIMENTARE
DE ORIGINE ANIMAL

Izolarea i confirmarea Escherichia coli din produsele alimentare se efectueaz
- conform SR ISO/TS 16 649 1,2,3/2009 sau conform SR ISO 7251/2009
E. coli reprezint cel mai bun indicator al CONTAMINRII FECALE a produselor alimentare.
E. coli reprezint un bun indicator al CONTAMINRII RECENTE a produselor alimentare.
Trebuie sublinat aspectul de adaptabilitate al bacteriilor n general i al speciei E. coli n special, la modificri de
temperatur: frig, congelare, modificri de umiditate (uscciune), modificri de pH, rezisten la antibiotice, etc.
Escherichia coli sau colibacilii sunt bacterii aerobe din grupul coliformelor, se prezint sub form de bastona,
sunt mobile, nesporogene, fermenteaz lactoza la 44
0
C, cu producere de gaze i formare de indol din triptofan .
Ross T., Ratkowsky D.A., Mellefont L.A., McMeekin, (2003), consider c dezvoltarea speciei
E. coli este influenat de mai muli factori: temperatur - este favorizat de o temperatur cuprins ntre 7,63 i
47,43C, existena unor soluii, la o activitatea a apei cuprins ntre 0,951 i 0,999, ajutat de soluii de clorur
de sodiu i la un pH situat ntre 4,0 i 8,2.
Tipul de bacterii
Care se dezvolt
Incubare le 30
o
C Incubare le 44
o
C sau
44,5
o
C
Coliformi totali Colonii roz
Diametru <0,5 mm
Inhibate sau colonii necaracteristice
Coliformi termotolerani Colonii roz
Diametru > 0,5 mm
Colonii roz
Diametru > 0,5 mm
Alte bacterii
Necoliforme
Colonii incolore sau de alte culori
Diametru < 0,5 mm
Inhibate sau colonii necaracteristice
Mecanismele adaptrilor sunt de natur genetic, traduse prin modificri n genom i al transcripiei expresiei
acestor modificri la nivelul genelor.
COLIBACILII sunt bacterii care au form de bastonae mici, drepte - bacili sau cocobacili (2,0-6,0/1,1-1,5
micrometri, vii i 1,0-3,0/0,4-0,7 micrometri, moarte i colorate), Gram negative, aezate izolat sau n perechi,
adesea mobile dar i imobile, unele tulpini capsuleaz, formnd microcapsule, asporogene.
Temperatura optim de dezvoltare este de 37
0
C, dar se dezvolt foarte bine i la 44-45
0
C. Aceast ultim
temperatur fiind un criteriu de diferniere, denumit testul Eyjkman-Mackensie. n laboratoare de
bacteriologie alimentar, aceast test se utilizeaz pentru diferenierea lui E. coli de speciile nrudite, de tip
Enterobacter, Klebsiella sau alte enterobacterii.
E. coli se dezvolt foarte bine n prezena srurilor biliare i a bilei, a srurilor de seleniu, a colorantului
verde briliant, a tetrationatului, etc.
Se dezvolt bine la pH neutru; nu se dezvolt la pH mai mic de 5,9 i mor la pH acid.
Pe medii nutritive simple se dezvolt bine, producnd turbiditate intens, uneori cu inel la suprafa pe
bulionul simplu, cu adunarea unui depozit n cazul culturilor vechi, iar pe suprafaa agarului nutritiv
cresc colonii netede, de 2-6 mm, uor convexe, opace, nepigmentate, de tip S. Culturile degaj miros
fecaloid, amoniacal.
Brzoi D. i colab., (1999), descriu c aproximativ 95% din tulpinile de E. coli sunt indol pozitive, rou-
metil pozitive, Voges-Proskauer negative, citrat negative, beta-galactozidaz i beta-glucuronidaz
pozitive i sunt cuprinse n E. coli biotipul 1. Celelalte tulpini rspund diferit, fiind indol negative, nu
elaboreaz enzime de tipul beta-galactozidaz i beta-glucuronidaz i sunt catalogate ca aparinnd E.
coli biotipului 2.
Testele biochimice cele mai importante i care sunt utilizate pentru identificarea speciei E. coli au fost
urmtoarele:
cretere aerob la 44-45
0
C;
producere de gaze captate n tubulee Durham n medii specifice BBLV, LST, etc.;
producerea indolului;
fermentarea glucozei i/sau lactozei;
formarea de colonii roii-violacee, cu centrul mai nchis la culoare, cu reflexe metalizate auriu-verzui,
caracteristice pe suprafaa mediului GEAM sau Levine
utilizarea glucozei cu formarea de produi acizi stabili, ceea ce determin reacia roului de metil
pozitiv;
metabolizarea glucozei cu producere de acetoin, reacia Voges-Proskauer negativ;
neutilizarea citratului ca unic surs de carbon;
fermentarea sorbitolul i producerea beta-galactozidazei, exceptnd tulpinile de E. coli O
157
H
7
-
enterohemoragic.
utilizarea glucozei cu formarea de produi acizi stabili, ceea ce determin reacia roului de metil
pozitiv;
metabolizarea glucozei cu producere de acetoin, reacia Voges-Proskauer negativ;
neutilizarea citratului ca unic surs de carbon;
fermentarea sorbitolul i producerea beta-galactozidazei, exceptnd tulpinile de E. coli O
157
H
7
-
enterohemoragic.
Speciile din genul Escherichia fermenteaz glucoza, lactoza, manita, trehaloza, produc lizin-
decarboxilaz. Exist i unele excepii, de exemplu, tulpinile enteroinvazive, care sunt lactoz i
lizindecarbixilaz negative.
Diferenierea tulpinilor aparinnd biotipului 1 fa de biotipul 2 se efectueaz pe baza testului IMVIC.