SISTEME ENZIMATICE DE APARARE ANTI-STRES

OXIDATIV
Enzimele cheie implicate in detoxifierea speciilor reactive de oxigen la toate
organismele aerobe sunt: superoxid dismutaza (EC1.15.1.1), glutation peroxidaza (EC
1.11.1.9), peroxidaza (EC1.11.1.7), catalaza (EC 1.11.1.6), glutation S-tranferaza,
toate fiind abundente in tesuturile pestilor (DiGiulio et al., 1989). La aceste enzime de
adauga sistemul auxiliar care furnizeaza echivalentii de reducere necesari activitatii
detoxifiante (glutation reductaza EC 1.6.4.2). Deoarece majoritatea activitatilor
acestor enzime sunt induse de speciile reactive de oxigen, ele reprezinta indicatori ai
stresului oxidativ.

CATALAZA
Majoritatea celulelor aerobe contin catalaza. La animale este prezenta in
aproape toate organele, fiind concentrata in special in ficat. In celula, catalaza se
gaseste in peroxizomi si, in cantitati mult mai mici, in mitocondrie si reticulul
endoplasmatic. De aceea, H2O2 generat in vivo nu poate fi substrat la catalazei decat
daca acesta difuzeaza in peroxizomi.
Enzima este alcatuita din 4 subunitati proteice de cate 60 Kda, fiecare din ele
continand o grupare hem lecata la centrul catalitic activ si o molecula de NADPH.
Hemul este localizat intr-o cavitate nepolara care comunica cu suprafata prin canale
inguste, limitandu-se astfel accesul moleculelor mai mari decat H2O2.
Reactia in care este implicata catalaza este una de disproportionare, o
molecula de H2O2 fiind redusa in timp ce o alta este oxidata.

Catalaza Fe (III) + H2O2

Compus I +

H2O2

Compus I + H2O
Catalaza Fe (III) + H2O

+ O2
2 H2O2

2H2O + O2

Structura exacta a compusului I nu este cunoscuta cu exactitate. Catalaza este

una din cele mai eficiente enzime cunoscute. Este atat de eficienta incat nu poate fi
saturata de nici o concentratie de H2O2, oricat de mare ar fi aceasta. Enzima prezinta si
activitate peroxidazica, limitarea acesteia datorandu-se accesibilitatii scazute a
substratelor la hem.
ROOH

AH2

H2O + ROH +A

Donorii de hidrogen pot fi metanolul, etanolul, acidul formic, fenolul.

Chiar daca aceasta enzima nu este esentiala pentru anumite tipuri de celule in
conditii normale, ea joaca un rol important in raspunsul adaptativ al celulelor la
stresul oxidativ.

GLUTATION PEROXIDAZA
Grupul de enzime cuprins sub aceasta denumire este implicat in catalizarea
reactiei de reducere a hidroperoxidului de hidrogen cuplata cu oxidarea glutationului:

H2O2

GSH

GSSG + 2 H2O

Glutation peroxidazele (GPx) sunt larg raspandite in tesuturile animale, GSH

fiind donorul de hidrogen specific. Pot servi drept substrate pentru aceste enzime si
alti peroxizi organici: ai purinelor, ai acizilor grasi polinesaturati, ai steroizilor.
Gruparea peroxid a acestor substrate este redusa la gruparea hidroxil:

R-OOH

GSH

R-OH +GSSG

Enzimele sunt alcatuite din patru subunitati proteice, fiecare avand un atom
de Se sub forma selenocisteinei. Acesta este motivul pentru care prezenta Se in dieta
tuturor animalelor este impusa. Actiunea glutation peroxidazei si catalazei este
concertata, glutation peroxidaza actionand la concentratii mici de H2O2 si la
concentratii fiziologice de GSH, in timp ce catalaza actioneaza la concentratii crescute
de H2O2. In timp ce catalaza se gaseste mai ales in peroxizomi, glutation peroxidaza
este localizata in citosol si matrixul mitocondrial (cca 10% din GPx total). In
organismele aerobe, rolul glutation peroxidazei in reducerea H2O2 poate fi considerat
foarte mic comparativ cu eficienta catalazei. Dar produsii peroxidati ai lipidelor
rezultati in urma atacului radicalilor liberi asupra lipidelor membranare pot provoca
distrugeri ale membranei si chiar la nivelul DNA.
Familia glutation peroxidazelor este alcatuita din mai multi membri. Un
membru al familiei este fosfolipid hidroperoxid glutation peroxidaza (PHGPx),
enzima ce foloseste drept substrat resturi ale acizilor grasi peroxidatece intra in
constitutia unor structuri membranare. In intestin, un alt membru al acestei familii,
GPx-GI metabolizeaza peroxizii lipidici din hrana, dar si pe cei formati in urma
peroxidarii lipidelor din intestin. Reducerea hidroperoxizilor dependenta de GSH este
considerata un mecanism major al apararii organismelor aerobe impotriva stresului
oxidativ. Faptul ca mai multe proteine neinrudite genetic capabile sa reduca H2O2
si/sau lipidele hidroperoxidate exista in organismele aerobe prin intermediul GSH,
atesta importanta fiziologica a activitatii lor. Prezenta acestor acestor proteine
apartinand unor familii de gene diferite pare sa fi conferit un avantaj in selectia
organismelor aerobe in cursul evolutiei.

GLUTATION S-TRANSFERAZA
Glutation S-transferazele (GST) reprezinta un grup mare de enzime intalnit la
organisme incapand cu procariote si pana la mamifere. GST prezinta o functie
esentiala in procesul de detoxificare prin indepartarea compusilor xenobiotici si joaca
un rol important in protectia impotriva stresului oxidativ, cancer si alte maladii
degenerative, inclusiv maladii asociate imbatranirii. GST a fost asociat cu un numar
mare de compusi, inclusiv steroizi si carcinogeni, actionand ca o proteina reglatoare.
Reactia catalizata de GST presupune atacul nucleofil al al glutationului redus
(GSH) asupra substratului electrofil.

GS + R-X

GS-R + X

Rolul protectiv in celula deriva din faptul ca aceste conjugate cu glutationul

sunt mult mai solubile decat compusii din care provin, acestea putand fi mult mai usor
excretate din celula. In anumite organisme, procariote, de exemplu, enzimele din
2

superfamilia GST servesc producerii mai multor compusi de reactie asociati cu

biodegradarea poluantilor persistenti ai mediului (de exemplu, compusi aromatici
halogenati). Au fost determinate peste 400 de secvente GST diferite, incadrate in cca
25 de clase diferite. Toate structurile GST cunoscute prezinta 2 domenii: un domeniu
N-terminal asociat cu tioredoxina si un domeniu C-terminal ce contine 4 secvente
helicale diferite. Domeniul N-terminal contine si situsul de legare al GSH, in timp ce
domeniul C-terminal asigura elementele structurale primare asociate cu specificitatea
celui de al doilea substrat.
Studii numeroase ce investigau peroxidarea lipidelor au examinat activitatea
glutation S-transferazica asupra unor substrate de tipul hidroperoxidului de cumen sau
de t-butil. Unele substrate fiziologic importante precum hidroperoxizii fosfolipidelor,
au fost, de asemenea folosite pentru a masura activitatea anumitor GST-aze.

GLUTATION REDUCTAZA
Toate enzimele prezentate mai sus utilizau GSH si duceau la producerea de
GSSG. Raportul dintre glutationul redus (GSH) si cel oxidat (GSSG) trebuie
mentinut constant in celule. La acest lucru contribuie enzima glutation reductaza care
catalizeaza reducerea formei disulfurice a glutationului, necesitand NADPH generat,
in special, din suntul pentozofosfatilor:

H+

GSSG + NADPH +

2GSH + NADP+

Glutation reducatza este un dimer cu MMr=105KDa, fiecare din cele doua

subunitati proteice avand cate o grupare FAD. Desi initial a fost propus un mecanism
ping-pong pentru acesta enzima, inhibitia competitiva a NADP+ si proprietatile
reactiei reversibile au condus la formularea unui mecanism branched in care enzima
poate functiona atat dupa un mecanism ping-pong cat si dupa modelul secvential, in
functie de concentratia de GSSG. Prin studii de cristalografie cu raze X s-a
demonstrat existenta e doua situsuri diferite de legare pentru GSSG si NADPH.
Aparent NADPH reduce FAD care transfera doi electroni la doi atomi de S
dintr-o punte disulfurica formata intre doua resturi de cisteina din centru catalitic activ
al enzimei. Cele doua grupari SH formate astfel interactioneaza cu GSSG pe care il
reduce si reface puntea disulfurica initiala a enzimei.

LACTAT DEHIDROGENAZA
L-lactat: NAD+ oxidoreductaza (LDH) este implicata in fermentatiile lactice,
catalizand urmatoarea reactie:

CH3-CHOH-COOH
COOH + NADH +H+

NAD+

CH 3-CO-

Lactat dehidrogenaza este o enzima intalnita in aproximativ toate tesuturile

pestilor, ficatul si muschii scheletici posedand cele mai mari activitati, muschiul
cardiac avand mai putina enzima. LDH este prezenta si in eritrocite, rinichi, branhii,
pancreas, creier, etc. In cazul lactat dehidrogeneazei s-a pus in evidenta existenta a 5
izoforme, proteine cu structura tetramera ce sunt constituite din legarea catenelor
polipeptidice de tip M si H, codificate de gene distincte. Toate izoenzimele au
aproximativ o MMr=130KDa, diferentele de migrare electroforetica fiind datorate
structurii diferite rezultate prin combinarea celor doua tipuri de catene polipeptidice.
Astfel, LDH1 are 4 catene de tip H (H4), LDH 2 are 3 catene H si una M (H 3M), LDH3
este un heterotetramer H2M2, LDH4 este constituit din 3 catene de tip M si una dip H
(HM3), iar LDH5 este de tipul M4.
3

Izoenzime LDH
LDH1, LDH2

Tesuturi
Muschi cardiac, eritrocite, celule
glomerulare, renale, creier, cristalin
Plaman, pancreas, splina, timus,
glande suprarenale, tiroida, noduli
limfatici, leucocite
Muschi scheletic, ficat, celule
tubulare renale, granulocite, tumori
maligne.

LDH3
LDH4, LDH4

SUPEROXID DISMUTAZA
Desi descoperita cu multi ani inainte in sangele bovinelor, ficatul cabalinelor
sau creier, fiind considerata ca o forma de inmagazinare a cuprului, enzima a fost
desemnata drept SOD in 1969 de catre Mc Cord si Fridovich. Exista doua tipuri de
enzime, o Mn SOD prezenta in mitocondrie si o CuZnSOD ce se gaseste in citosol,
lizozomi, peroxizomi, nucleu si spatiul intermembranar mitocondrial. FeSOD nu s-au
identificat in tesuturile animale, ci doar la unele plante superioare, bacterii si alge.
Activitatea superoxid dismutazei mitocondriale reprezinta pana la 60% din activiatea
tisulara totala (Radi et al.). Concentratiile enzimei tind sa fie foarte mari datorita
inaltei reactivitati radicalilor superoxid.
Cu/Zn superoxid dismutazele sunt prezente in toate celulele eucariote. Ele
sunt formate din doua subunitati proteice, fiecare dintre ele continand in centrul
catalitic activ un ion de cupru si unul de zinc. Ionii de zinc participa la reactiile:

Enzima-Cu2+ + O2.Enzima Cu+ + O2.- + 2H+

2 O2.- + 2H+

Enzima Cu+ + O2
Enzima-Cu2+ + H2O2

H2O2 + O2

MnSOD superoxid dismutazele sunt prezente atat la animale cat si la plante

si la bacterii. In majoritatea tesuturilor animale ea este prezenta exclusiv in
mitocondrie. In eritrocitele umane, care sunt lipsite de mitocondrii, nu se gaseste
deloc Mn SOD, in timp ce in ficat 10% din activitatea SOD este datorata acestei
enzime. Mn SOD la organismele superioare din patru subunitati proteice. Eliminarea
ionului de mangan din centrul catalitic activ al enximei ar duce la pierderea activitatii
enximatice. SOD actioneaza nu numai prin eliminarea excesului de radical superoxid,
ci poate indeparta si oxigenul singlet, deci, indirect, peroxidarea lipidica. SOD este o
enzima inductibila, efectul inductiv al O2.- asupra sintezei acesteia fiind demonstrat la
bacterii anaerobe si facultativ aerobe, dar si la mamifere. In ficatul de peste au fost
identificate cel putin 5 izoforme ale superoxid dismutazei care se modifica frecvent in
pesti in ariile poluate (Pedrajas et al. 1993). Activitatea superoxid dismutazica creste
foarte rapid in eritrocitele de crap, cand pestii sunt expusi la 10mg/l paraquat in apa,
maximul inregistrandu-se la 12h (Matkovics et al.), urmat de scaderea sub nivelul
control dupa 48-96h. Scaderea activitatii dupa expunerea prelungita pot fi explicate
prin inhibarea enzimei de catre produsii sai, H2O2 sau prin .OH (Bray et al., 1974).