CITOMETRIA

DE FLUX

CE ESTE CITOMETRIA
DE FLUX?

Metod de msurare a caracteristicilor fizice

i/sau biochimice ale particulelor (celule,
nuclei, organite celulare):

Mrimea
Granularitatea
Cantitatea de ADN
Antigene de suprafa

Metod de sortare a celulelor

ETAPE
1.

Prepararea suspensiei de celule

2.

Marcarea celulelor

3.

Achiziia datelor

4.

Stocarea datelor

5.

Interpretarea datelor

PRODUCEREA ANTICORPILOR
MONOCLONALI
Antigen
Fuzionarea
celulelor
HIBRIDOM

Mielom

Plasmocite
producatoare de Ac

Testarea clonelor

Cultivarea
hibridoamelor

Hibridoamele se separa
si se cultiva
Mentinerea
hibridoamelor in
soareci

Clonele
dorite se
cultiva sau
se
congeleaza
Anticorpii monoclonali
sunt purificati

FLUOROCROMII

AcM sunt conjugai cu fluorocromi

Spectru de absorbie (excitaie)
Spectru de emisie
Pentru 2 parametri 2 AcM cuplai cu 2
fluorocromi cu spectre de emisie diferite:

Izotiocianat de fluorescein (FITC)

Phycoeritrin (PE)

TC
FI

FITC

FITC

FITC

FI
T

C
T
FI

FITC

102

103

Intensitatea fluorescenei

FIT
C

101

FITC

FITC

Numar de evenimente

IMUNOFLUORESCENA

104

COMPONENTELE
CITOMETRULUI DE FLUX

Sistem fluidic

Sistem optic

Sistem electronic

SISTEMUL FLUIDIC

Celule aflate n suspensie:

Snge
Lichid sinovial
LCR
Ganglioni limfatici
Tumori solide

Lichid de nveli
Curent intern unicelular ir indian
Intersectare cu un fascicul de lumin

SISTEMUL FLUIDIC
Ac de injecie
Camer de
scurgere

Lichid de
nveli

Flux
laminar

SISTEMUL OPTIC DE
EXCITAIE

Sursa laser (Ar =488 nm)

Fascicul luminos dispersie i stimularea
fluorocromilor
Dispersia luminii:

Emisia luminii fluorescente:

=0 Forward Scatter (FS) dimensiunea

=90 Side Scatter (SS) granularitatea
~ cantitatea de fluorocromi info calitative i
cantitative

Elemente optice de focalizare (lentile)

FS I SS
Forward Scatter
LASER

LASER

Side Scatter

SISTEMUL OPTIC DE
COLECTARE

Conversie semnal optic semnal electronic

Detectori pentru:

Lumina dispersat: n fa, lateral

Emisia de fluorescen
Filtre optice

CITOMETRUL DE FLUX

SISTEMUL ELECTRONIC

Recepionarea impulsurilor detectorilor

Prelucrarea semnalului
Prezentarea rezultatelor:

Histograme 1 parametru
Grafice 2 parametri: 1 punct = 1 particul (dotplot)

ELEMENTE FIGURATE

GRAFIC DOT-PLOT PENTRU

FITC I PE
FITC+ / PE+

PE+

PE FL

FITC- / PE-

FITC FL

FITC+

FITC / PE

SORTAREA CELULELOR

Separarea unei (sub)populaii celulare dintrun amestec:

Mrime
Granularitate
Antigene de suprafa

SORTAREA CELULELOR ETAPE

1.
2.
3.
4.
5.

6.

Identificarea criteriului
Marcarea cu AcM+fluorocromi
Identificarea celulei e de interes?
ncrcare cu sarcini pozitive/negative/fr
Cmp magnetic deflectare spre tuburi
colectoare
Centrifugare

SORTAREA CELULELOR

LASER 488 nm

Senzor FS
Detector de
fluorescen

Plci ncrcate
magnetic

Tuburi de colectare

APLICAII

Analiza subpopulaiilor limfocitare

Diagnosticul hemopatiilor maligne
Biologie celular
Identificarea unor molecule HLA
Determinarea unor autoanticorpi
Studiul ciclului i al funciilor celulare
Diagnosticul, evoluia, prognosticul tumorilor
maligne solide
Microbiologie

ANALIZA ADN
G2

G0
G1

G0G1

E
v
e
n
i
m
e
n
t
e

s
0

200

400

G2 M
600

4N
2N
Cantitatea de ADN

800

1000

150
75
0

E
v
e
n
i
m
e
n
t
e

225

300

ANALIZA ADN

200

400

2N

600

800

4N

Fluorescen PE

1000

300

ANALIZA ADN

225
75

150

Peak aneuploid

E
v
e
n
i
m
e
n
t
e

Index ADN 1,21

200

400

600

Fluorescen PE

800

1000