STRATEGII IN SINTEZA SI

BIOSINTEZA
C12

BIOSINTEZA DIRIJATA SI SEMISINTEZA

IN PRODUCEREA ANTIBIOTICELOR
1

ANTIBIOTICE
= medicamente chimioterapice produse de microorganisme si au proprietatea
de a incetini multiplicarea unor organisme patogene, implicate etiologic in
diferite boli si sindroame infectioase si de a le distruge.
Agenti patogeni = microorganisme in diferite stadii ale evolutiei
biologice (virusi, ricketsii, protoplaste, bacterii)

Se obtin in special prin fermentatie, biosinteza facandu-se cu microorganisme

specifice.
Prin antibioza, antonimul termenului de simbioza, se intelege imposibilitatea
existentei si dezvoltarii simultane, in aceleasi conditii, a doua sau mai multe
organisme vii. Substantele chimice naturale produse de microorganisme si
utilizate in tratamente antiinfectioase au fost denumite antibiotice.
2

Pe langa eficienta antimicrobiana se are in vedere faptul ca antibioticele

trebuie sa se aproprie cat mai mult de conditia de netoxicitate asupra
organismului si in acest scop se considera ideala doza maxima de 500
mg/kg corp.

Antibioticele intervin in metabolismul celulelor bacteriene producand fie

stoparea multiplicarii bacteriilor (efect bacteriostatic), fie distrugerea completa
a bacteriilor aflate in stare de repaus si a celor aflate in proces de crestere
(efect bactericid).

CLASIFICAREA ANTIBIOTICELOR
Multitudinea antibioticelor, 10% din totalul medicamentelor utilizate in
terapeutica medicala, necesita o sistematizare a acestora, iar clasificarea
se poate efectua functie de urmatoarele criterii :
a) dupa originea microorganismului producator:
- antibiotice produse de bacterii (Schizomycetes): (80% din antibiotice provin
din specii de Streptomyces si Actinomyces, iar 5% din specii de Bacillus);
- antibiotice produse de fungi (11% din antibiotice sunt produse de Penicilllium
si Aspergillus, iar 3% din specii de Cephalosporium)
b) dupa structura chimica:
- antibiotice cu structura alifatica (alicina)
- antibiotice cu structura aromatica (acid gladiolic, cloramfenicol)
- antibiotice cu structura chinonica (fumigatina, ftiocol)
- antibiotice cu cloruri de furan si piran (acid penicilanic)
- antibiotice heterociclice cu azot in molecula (acid aspergilic)
- antibiotice heterociclice cu azot si sulf in molecula (peniciline)
- antibiotice cu structura polipeptidica (gramicidina)
- antibiotice cu structura complexa (macrolide)

c) dupa biogeneza:
- antibiotice derivate din aminoacizi (oxamicina, peniciline, cefalosporine,
bacitracina, polimixine) ;
- antibiotice derivate partial sau total din unitati de acid acetic activat
(eritromicina, grizeofulvina, tetracicline, macrolide, antibiotice polienice,
rifampicine);
- antibiotice derivate din glucide simple (gentamicina, streptomicina,
kanamicina, neomicina).
d) dupa grupul de agenti patogeni asupra carora sunt active antibioticele:
- antibiotice antibacteriene (medicatia antibacterina): Gramicidina,
Bacitracina, Polimixinele
- antibiotice antifungice (medicatia antimitotica): Penicilinele, Grizeofulvina
- antibiotice antituberculoase: Streptomicina
- antibiotice antivirale: Aciclovir, Amantadina, Vidarabina
- antibiotice cu actiune impotriva protozoarelor si metazoarelor (medicatia
antiparazitara): antimalarice, antihelmintice
- antibiotice cu actiune antitumorala
5

e) dupa mecanismul de actiune impotriva infectiei:

- actiune asupra peretelui celular, cu efect bactericid (de distrugere a
bacteriilor), numai in faza de multiplicare a bacteriilor: Penicilinele G si V,
Oxacilina, Ampicilina, Cefalosporinele
- actiune asupra membranei citoplasmatice, cu efect bactericid: Polimixina
B, Colistina, Amfotericina B.
- actiune de inhibare a sintezei proteinelor, la nivelul ribozomilor, cu efect
bactericid, in faza de multiplicare si in faza de repaus a bacteriilor si
bacteriostatic (oprirea multiplicarii bacteriene): Streptomicina, Tetraciclinele,
Eritromicina, Lincomicina
- actiune de inhibare a sintezei acizilor nucleici, cu efect bacteriostatic si
bactericid: Novobiocina, Rifampicina, Griseofulvina, Acidul nalidixic si alte
chinone
- actiune competitiva prin substituire de metaboliti analogi, cu efect
bacteriostatic si bactericid, desi nu sunt antibiotice: sulfamide

Beta-lactamice: Penicilinele, Cefalosporinele

-

CO

N
H

H
C

H
C

OC

CH3

CH3
CH

OCO
CH
+

(CH2)3

CO

NH

H3N

N
O

Penicilina

R = benzil
heptil

COOH

C6H5-CH2-

COOH
Cefalosporina

Penicilina G (sau II)

CH3-(CH2)5-CH2- Penicilina K (sau IV)

fenoximetil C6H5-O-CH2-

CH2-COOH

Cephalosporium

Penicilina V (sau V cinci)

Penicillium
7

Aminoglicozidice: Streptomicina, Kanamicina, Gentamicina

HN

NH2
O

HO
H2N
HN

N
H

OH
OH

CH

H
C

NH

HC NHCH3

HC OH

HC
O

C
H

Streptomyces

HO CH

OH

CH
CH3

CH
CH2OH

Streptomicina

Streptomyces noursei

Antibiotice polienice: Nistatina

CH3
CH3

HO
H3C

O
CH3

OH

OH

COOH
O

OH

OH

OH

OH

OH H2N
H

OH

OH

Tetracicline: Doxiciclina
R4 R R R1
3
2

OH

N(CH3)2

OH
OH O

OH
CONH2

Streptomyces erythreum

Macrolide: Eritromicina

D desozamina

(CH3)2N
HO

CH3

H
H

OH

CH3 OH

Cladinoza
O

H
H

OCH3
CH3

H3C
CH3

H3C

OH

Eritronolida

OH

C2H5
CH3

CH3

10

f) dupa spectrul antimicrobian (totalitatea microorganismelor sensibile la un

chimioterapic reprezinta spectrul antimicrobian al acestuia si este caracteristic
fiecarei substante):
- antibiotice de spectru ingust de tip penicilinic sau de tip streptomicinic
- antibiotice cu spectru larg si foarte larg de actiune (Tetracicline,
Cloramfenicol, cefalosporine de generatia a II-a si a III-a)
- antibiotice de inlocuire (in cazul aparitiei fenomenului de rezistenta,
macrolidele, lincosamidele)
- antibiotice de rezerva (toxice, ca Vancomicina, sau care produc rezistenta,
ca Rifampicina)
- antibiotice de exceptie (active pe germeni de spital, Fosfomicina)
In general, bacteriile gram-pozitive sunt mai sensibile decat cele gramnegative. Bacilul tuberculos, ciupercile, virusurile, protozoarele sunt mai
sensibile la mai putine substante.

11

 Sursa de carbon
Anumite surse de carbon care sunt asimilate rapid in timpul biosintezei
exercita o influenta negativa asupra biosintezei (efect glucoza )
In anumite cazuri acest efect este dependent de concentratie si se considera
ca fiind optim intervalul de 28-100 mM glucoza.
Surse de carbon si actiunea lor asupra producerii de antibiotice
Antibiotic
Cefalosporina C
Cefamicina
Cloramfenicol
Kanamicina
Penicilina
Neomicina
Novobiocina

Surse de carbon cu
influenta negativa
Glucoza
Glicerina
Glucoza
Glucoza
Glucoza
Glucoza
Citrat

Surse de carbon cu
influenta pozitiva
Zaharoza
Amidon
Glicerina
Galactoza
Galactoza
Maltoza
Glucoza

12

 Surse de azot
- anorganic: azotat, fosfat sau sulfat de amoniu
- organic: aminoacizi si peptide din faina de soia sau porumb se
metabolizeaza lent
pH-ul mediului de cultura (pH-ul optim pentru faza de crestere a masei
celulare este de 4,5.....5, iar pentru faza de producere a penicilinelor este
de 7,0....7,5.
Fosfatul anorganic (0,3 300 mg)
MgSO47H2O
alte elemente (Mn, Fe, Co, Cu, Zn), iar concentratia optima a acestora
este de ordinul g/l
temperatura ( 25 1 C)
cantitatea de aer (1-1,5 l aer/litru mediu x min)
13

PENICILINE
1929 Alexander FLEMING penicilina
Peniciline au ca mecanism de actiune:

impiedicarea formarii peretelui celular (celulele microbiene, lipsite de

perete, sint expuse tensiunilor osmotice si mor; bacteriile care nu au perete
celular (micoplasme, protoplasti) nu sint sensibile la actiunea penicilinelor)

se pot lega covalent de anumite proteine membranare specifice

(PBP=penicillin-binding-protein) cu functiile enzimatice

pot actiona asupra functiei enzimatice a proteinelor, ducand la autoliza

unora dintre bacterii (de exemplu, carbenicilina asupra Pseudomonas) sau
la inhibarea cresterii, pentru altele (actiunea antibioticelor -lactamice
asupra stafilococului auriu, pneumococului sau a unor streptococi)

14

Activitatea antimicrobiana a penicilinelor este evaluata in unitati

internationale de activitate (UI), acestea reprezentand cantitatea minima
de penicilina care, dizolvata in 50 ml bulion, inhiba o cultura de 18 ore
stafilococ de referinta, Staphylococcus aureus. Pentru penicilina G o
unitate internationala este egala cu 0,6 sau un miligram de penicilina
contine 1667 U.I.
Activitatea celorlalte peniciline se calculeaza cu relatia:
A

MG ( Na ) 1667
Mx

unde MG(Na) este masa moleculara a penicilinei G, forma sodiu

Mx este masa penicilinei testate

15

Proprietati intalnite la majoritatea penicilinelor si care pot fi considerate ca

definitorii pentru intreaga clasa:

substante solide, de culoare alba sau aproape alba si in general pot fi

obtinute in stare cristalina;

nu au puncte de topire nete si se descompun in timpul incalzirii;

contin in structura lor chimica cel putin o grupare carboxil, care le
confera caracter de acizi, iar taria lor variaza functie de substituenti ;

ca acizi sunt solubile in solventi organici, proprietate care este utilizata la

izolarea si purificarea lor prin extractie lichid-lichid, iar prezenta in molecula
a unei grupe polare, in special a unei grupe amino, reduce sau anuleaza
solubilitatea in solventi organici nepolari;

sarurile de sodiu sau de potasiu ale penicilinelor sunt solubile in solventi

polari, usor solubile in apa si uneori in dimetilformaldehida si metanol;

16

 reactia penicilinelor cu baze tari serveste la determinarea chimica a

continutului in penicilina a preparatelor farmaceutice care contin aceste
antibiotice;

anumite bacterii sunt formatoare de beta-lacmataza, au capacitatea de

a deschide hidrolitic inelul beta-lactamic al penicilinelor, facandu-le astfel
ineficiente;

prin spectrul de actiune al unui antibiotic se intelege cate tipuri de

germeni pot fi distruse de o anumita substanta. Cu cat spectru este mai
larg cu atat creste frecventa, intensitatea si complexitatea efectelor
secundare.

17

METODE DE OBTINERE
Sinteza chimica
Biosinteza
Semisinteza

Sinteza chimica a penicilinelor

Cercetarile privind biosinteza penicilinelor sunt numeroase ca numar si au
stabilite cu exactitate structura moleculei de penicilina, iar modul de formare
este confirmat de sintezele chimice efectuate cu atom de carbon marcat,
prima sinteza chimica fiind realizata in anul 1957 de Sheehan. Randamentul
acestor reactii este foarte mic ele au rolul de a ilustra ca penicilinele sunt
obtinute din trei substante de baza: d-valina, l-cisteina si anumiti acizi acetici
-substituiti.
18

H3C

H3C
CH

H3C

CH

COOH

NH2

Cl

CH2

COCl

CH
H3C

H3C
C

Ac2O
H3C

HN

C
H

CH

CH3

H2S
CH3OH

NH

CO

COOH

H3C
CH
H3C SH

NH

CH

COCH3

COOH

H2O (HXl)
H3C
CH
H3C SH

CH

COOH

COOH

Obtinerea D-penicilaminei
19

Cl

Biosinteza penicilinelor

! calitatea susei

! compozitia mediului de cultura

In obtinerea biotehnologica a penicilinelor se disting urmatoarele faze:

I Prepararea si sterilizarea mediului nutritiv
II Fermentatia
III Separarea produselor de fermentatie cu obtinere de penicilina bruta
IV Purificarea, concentrarea si cristalizarea solutiei native in vederea
obtinerii penicilinei pure

Prepararea si sterilizarea mediului nutritiv

Sursa de carbon
lactoza
amidonul
melasa de sfecla
20

 Surse de azot
Intrucat penicilinele contin un atom de azot in nucleul de baza este
necesara gasirea mecanismelor prin care sa se asigure aportul constant
al acestui element in structura si, in acest scop, sunt utilizati aminoacizi si
produse de natura polipeptidica, sub forma de concentrate (peptona) sau
sub forma bruta (faina de soia, mazare, porumb).
pH-ul mediului de cultura: pH-ul optim pentru faza de crestere a masei
celulare este de 4,5.....5, iar pentru faza de producere a penicilinelor este
de 7,0....7,5 (valoarea optima a acestuia se pastreaza prin introducerea
NaOH 10-40%, sau NH3 solutie 25% sau gazos in mediul de cultura)
temperatura ( 25 1 C)
cantitatea de aer: 1-1,5 l aer/litru mediu x min

21

Doua metode de fermentatie:

- in suprafata (cultivarea ciupercii Penicillium notatum pe medii nutritive
lichide, in straturi subtiri de 1-2 cm, in recipienti cu suprafata mare) cantitati
mici de antibiotic
- in profunzime (izolat si folosit o anumita tulpina de Penicillium chrysogeum,
inalt productiva, cultivata pe medii imbunatatite, in conditii submerse,
realizandu-se economie de spatiu, culturi omogene si randamente ridicate in
substanta activa
durata fermentatiei este de cateva zile (140 200 ore), iar controlul
procesului se poate aprecia dupa dezvoltarea miceliului.
in urma fermentatiei, penicilinele se gasesc in lichidul care trebuie
separat de miceliu. Penicilinele se separa din filtrat prin extractii fizice
repetate, in urma carora rezulta o solutie cu o activitate de 60-80.000 UI/ml.
Produsele de biosinteza se gasesc in lichidul final de fermentatie in
concentratii reduse (0,5-8%), fiind, in general, compusi labili chimic si termic.
In plus, in lichidele de fermentatie se gasesc numerosi compusi secundari,
unii cu caracteristici fizico-chimice asemanatoare cu ale produselor utile.
22

Fluxul general al separarii penicilinelor de biosinteza cuprinde urmatoarele

etape:
1-filtrarea lichidului de fermentatie cu ajutorul filtrelor rotative cu vid,
in scopul separarii biomasei de lichidul care contine penicilinele (penicilinele
sint produse extracelulare);
2-extractia penicilinelor din filtrate cu un solvent organic in doua sau
mai multe stadii, in functie de concentratia lor in solutie;
3- reextractia penicilinelor din solventul organic cu o solutie de
carbonat de sodium sau de potasiu;
4-cristalizarea si purificarea, in functie de tipul de penicilina.
Penicilinele se separa prin extractie lichid-lichid, la un pH al fazei
apoase corespunzator formei nedisociate a antibioticului. Pentru a putea fi
extrase eficient, produsele de biosinteza trebuie transformate intr-o forma
care sa fie solubilizata cu usurinta in solvent.
In functie de natura chimica, se pot separa prin:
- extractie cu solventi organici
- sorbtie pe schimbatori de ioni
- adsorbtie pe carbune sau alumina

23

Pentru extractia produselor de biosinteza polare se utilizeaza alcooli, esteri,

cetone, iar pentru cele nepolare eter de petrol, diclormetan, dicloretan, etc.
Cel mai adesea se foloseste acetatul de butil sau de izobutil, iar solventul
epuizat se regenereaza si se foloseste la o noua extractie.
Deoarece in majoritatea cazurilor, produsele de biosinteza sint putin
stabile in mediu acid sau bazic, contactarea fazelor, transferul de masa si
separarea fazelor trebuie sa se realizeze cu viteze ridicate, motiv pentru
care se prefera extractoarele centrifugale. Pentru unii produsi foarte
solubili in apa, in lichidul de fermentatie se adauga o sare (K 2SO4) pana la
saturatie, ceea ce determina precipitarea produsului de biosinteza (saltingout) si usurarea extractiei acestuia.
Dupa extractia cu acetat de butil si reextractia cu carbonat de sodiu
(potasiu), solutia de benzilpenicilina (penicilina G potasica sau sodica) se
trateaza cu carbune activ, iar antibioticul se cristalizeaza prin antrenarea
azeotropa a apei cu butanol la 4-6 mm Hg, se filtreaza si se spala cu butanol
si cloroform sau acetona.
Penicilina V precipitata (cu acid sulfuric sau clorhidric diluat) se filtreaza pe
filtru nuce si se usuca la 35 C, la vid de 100-225 mm Hg, timp de 16-20 de
24
ore.

Semisinteza penicilinelor
Penicilinele G sau V, folosite curent in terapeutica, precum si unele
produse preparate sub forma de saruri ale penicilinelor naturale nu
intrunesc cele patru calitati esentiale pentru utilizare, respectiv
acidorezistenta, stabilitate la penicilinaza, spectru larg antibacterian si lipsa
fenomenelor alergice.
1959 identificarea si izolarea acidului 6-amino-penicilanic, (6-AP) in
lichidul de fermentatie, lipsit de precursori a mucegaiului Penicillium

posibilitatea sintetizarii de noi peniciline, cu spectru larg de actiune

antimicrobiana, rezistenta in mediu acid si absortie la administrare orala
Metode de obtinere a 6-AP

biosinteza directa folosind mutanti de Penicillium chrysogenum nu s-a

dovedit avantajoasa din punct de vedere economic, datorita randamentelor
mici de biosinteza si a dificultatilor de izolare a acidului
25

 hidroliza chimica a penicilinei G sau V

hidroliza cu enzime imobilizate este conditionata de pretul enzimei si de
tehnica de imobilizare a acesteia
- producatori de penicilinaze: fungi (Aspergillus, Cephalosporium), drojdii,
actinomicete, bacterii (Escherichia coli, Acetobacter aerogenes, Proteus,
Pseudomonas), dintre acestea fiind folosita in procedeele industriale
Escherichia coli.
Avantaje:
- costuri reduse
- timpului scurt de cultivare sursele microbiene
- se obtin compusi de inalta puritate
- randamente ridicate
- se elimina neajunsurile inerente proceselor biologice, respectiv infectiile
si degradarea tulpinilor de microorganisme
In fabricatia penicilinelor de semisinteza se disting urmatoarele faze
tehnologice :
I Obtinerea clorurilor acide
II Condensarea clorurilor acide cu acidul 6-AP
III Separarea, cristalizarea si purificarea penicilinelor de semisinteza 26

Izolarea acidului 6-aminopenicilanic (6-AP) obtinut prin biosinteza si

acilarea prin sinteza chimica, cu agenti care sa nu-i afecteze ciclul -lactamic.
Exemple de peniciline semisintetice antipenicilinazice:
- metilicina
- nafcilina
- izoxazolilpenicilinele

rezistenta la -lactamaza este favorizata de prezenta radicalilor voluminosi

prezenti in molecula
= peniciline antistafilococice sunt active in infectii provocate de
majoritatea stafilococilor
- nu pot traversa peretele exterior al celulei si afinitatea scazuta pentru
proteinele membranare specifice rezistenta unor germeni gram-negativ
la acest tip de peniciline
27

OBTINEREA BIOTEHNOLOGICA A TETRACICLINELOR

= antibiotice cu spectru larg de activitate antibacteriana fata de un domeniu larg
de germeni

se caracterizeaza printr-o joasa toxicitate fata de organismele umane.

activitatea antimicrobiana a acestor antibiotice este de cel putin 0,75 U.I.\1mg
substanta uscata

active la administrarea orala

una din familiile de agenti chimioterapeutici cu cea mai larga utilizare
Tetraciclinele:
- substante solide, cristaline, de culoare galbena
- au caracter amfoter (formand saruri cu bazele si cu acizi)
- cu ionii metalici produc chelati, produsi care pot fi folositi in etapele de
purificare si separare a tetraciclinelor, precum si in operatiile de identificare si
dozare ale acestora
- se caracterizeaza usor prin spectre electronice de absortie si fluorescenta , fiind
28
singurele antibiotice colorate

Tetraciclinele se deosebesc intre ele functie de anumite caracteristici. Astfel:

- din punct de vedere al stabilitatii chimice tetraciclina simpla este
superioara celorlalte tetracicline si de aceea, de multe ori, este utilizata
drept compus de referinta in confectionarea discurilor pentru antibiograme;
- din punct de vedere al tolerantei digestive, tetraciclina simpla prezinta
cele mai putine efecte secundare;
- din punct de vedere al solubilitatii este necesar de subliniat ca au fost
obtinute preparate injectabile numai din tetraciclina si oxitetraciclina;
- din punct de vedere al actiunii antimicrobiene, tetraciclinele prezinta
actiune bacteriostatica, fiind mai active in fazele de metabolism microbian
intens.
Inconvenientele de utilizare a acestor antibiotice constau in:
- solubilitatea redusa in apa
- instabilitatea hidrolitica a clorhidratilor

29