Platforma celulară Vero în producția de vaccinuri

Proiect realizat de
Butură Mihail
Darie Alexandra
Cuprins

 Introducere
 Evoluții recente în vaccinurile derivate din celule Vero Rotavirus
 Vaccinurile anti-Flavivirus. Encefalita japoneza.
 Febra Dengue
 Encefalita provocata de virusul West Nile
 Virusul Chikungunya
 Sindromul respirator acut sever
 Variola
 Bibliografie
Introducere

 Dezvoltarea sistemelor de culturi celulare pentru propagarea virusului a dus la

progrese majore în dezvoltarea vaccinurilor virale. Sistemele de culturi celulare
primară și diploidă sunt acum înlocuite de utilizarea liniilor celulare continue
(CCL). Aceste substraturi sunt din ce in ce mai utilizate de catre autoritățile de
reglementare, deoarece tehnologiile de screening îmbunătățite elimină temerile
cu privire la potențialele proprietăți oncogene.
 Linia celulară Vero este una din cele mai acceptate CCL de către autoritățile de
reglementare și a fost utilizată de peste 30 de ani pentru producerea de vaccinuri
împotriva virusului poliomielitei și a virusului rabic. Recunoașterea recentă a
vaccinului împotriva virusului viu derivat din celulele Vero a dus la o explozie în
dezvoltarea unei serii de noi vaccinuri virale, variind de la vaccinurile pediatrice
împotriva infecțiilor cu rotavirus la vaccinurile inactivate întregi împotriva gripei
pandemice . Aceste evoluții au ilustrat valoarea acestei platforme de cultură
celulară în dezvoltarea rapidă a vaccinurilor împotriva unor boli virale.
 Una dintre cele mai importante evoluții din istoria dezvoltării vaccinurilor virale a fost demonstrarea
propagării virusului în cultura celulară staționară. Descoperirea lui Enders, Weller și Robbins a
faptului că virusului poliomielitei ar putea fi cultivat în cultura celulară a fost una dintre
descoperirile științifice cheie care au condus la dezvoltarea vaccinurilor împotriva acestei boli. În
plus, raportul potrivit căruia virusurile umane ar putea fi cultivate in vitro într-un mod relativ sigur și
ușor în culturile de celule monostrat a condus la progrese semnificative în dezvoltarea vaccinurilor
virale în următorii 60 de ani. Înainte de această dezvoltare, puține vaccinuri virale disponibile au fost
produse în sisteme animale, cum ar fi pielea de vițel pentru variolă, măduva spinării pentru rabie și
creierul de soarece pentru encefalita japoneză sau în ouăle embrionate în cazul virușilor de gripali și
febrei galbene.
 Activitatea acestor cercetatori a fost precursorul dezvoltărilor majore care au permis fabricarea de
vaccinuri sigure și eficiente împotriva mai multor boli virale. Primul succes a fost creșterea de
poliovirus Lansing de tip II în culturi monostrat de celule umane care a dus la dezvoltarea vaccinului
poliovirus inactivat (IPV). Licențierea IPV a fost primul rezultat a revoluției culturii celulare. Această
primă generație de vaccinuri utilizează culturi de celule primare , principalele surse de celule pentru
cultura primară fiind primatele, embrioni de pui sau de rață, hamsteri și iepuri. Toate aceste sisteme
timpurii de cultură celulară primară au suferit din cauza dezavantajului materiei prime inconsistente
și a preocupărilor legate de contaminarea cu un număr de agenți potențiali adventiți. Următoarea
dezvoltare majoră în cultura celulară pentru producerea de vaccin a fost utilizarea liniilor celulare
diploide umane pentru propagarea virusului pentru a evita dificultățile asociate cu utilizarea culturii
de țesut primar.
 Argumentul esențial în favoarea utilizării liniilor celulare diploide pentru fabricarea vaccinurilor
umane a fost faptul că acestea sunt non-tumorale. Prin contrast, liniile celulare continue (CCL)
timp de mulți ani nu au fost considerate a fi substraturi adecvate pentru producerea
medicamentelor. CCL pot avea o durata de viata foarte lunga , ca atare, au potențial tumorigen.
Cu toate acestea, pe măsură ce s-au dezvoltat noi tehnici în domeniul imunologiei, virologiei și
biologiei moleculare, a fost posibil să se examineze substraturile celulelor vaccinului viral pentru
caracteristicile potențialelor proprietăți oncogene într-o manieră mai critică. Pe baza datelor
dintr-un număr de studii, în 1986, un grup de studiu al OMS a recomandat crearea unor linii
celulare bine caracterizate, care să pot ajuta autoritățile naționale de control precum și pe
producătorii biologici. În urma acestei recomandări, OMS a dezvoltat o bancă de celule principale
pentru celule Vero, o linie celulară continuă. Această linie celulară a fost înființată în 1962 de
către Yasumura și Kawikata la Universitatea Chiba (Japonia) din rinichii unei maimuțe normale
adulte africane verzi. Motivul pentru selectarea acestei linii celulare a fost acela că a oferit
perspectiva imediată de a fi utilizată pentru un număr de diferite vaccinuri produse în alte
sisteme. Studiile de colaborare efectuate în zece laboratoare cu privire la sterilitate, agenți
adiționali, au arătat că OMS Bank Vero a îndeplinit cerințele OMS pentru CCL-urile utilizate pentru
producția biologică. O atenție deosebită a fost acordată aspectelor de siguranță asociate cu ADN
rezidual și proteina celulară Vero. Cu toate acestea, dimensiunea fragmentului ADN-ului rezidual
trebuie de asemenea caracterizată pentru a asigura o degradare adecvată în timpul etapelor
procesului de purificare.
 Tabelul 1 reprezintă
rezultatele unui
program de
screening pentru o
bancă de celule
Master Vero,
efectuată recent în
scopul licențierii
unui vaccin gripal
derivat din celulă
Vero și care se
conformează acestor
cerințe de
reglementare
diferite
 Celulele Vero au fost utilizate pentru prima dată pentru vaccinurile umane cu
producția de IPV(vaccinul inactivat al poliovirusului) de către Montagnon și colegi
de la Institutul Merieux (Lyon, Franța) la începutul anilor 1980, iar acest lucru a
fost urmat de utilizarea sa ca vaccin inactivat împotriva rabiei. Celulele Vero au
fost, de asemenea, utilizate timp de mulți ani pentru producerea de vaccinuri cu
virus poliovirus oral. Un alt avantaj major al liniei celulare Vero pentru producerea
de vaccin este acela că poate fi crescut și cultivat în bioreactoare pentru a
permite producerea pe scară largă a vaccinurilor
 Această tehnologie a fost dezvoltată în continuare pentru a permite producerea pe
scară largă a unui număr de vaccinuri utilizând un mediu fără ser. Astfel de
procese au fost dezvoltate pentru a permite amplificarea unei fiole unice de
celule de 1 ml pentru a obține o cultură de celule la o scară de 6000 l în decurs de
8 săptămâni. Aceast proces poate fi efectuat fără pierderea productivității sau a
viabilității celulelor cu rezultate extrem de consecvente. Tabelul 2 demonstrează
că densitatea celulară nu a fost redusă în timpul unui proces tipic de trecere de la
scara de 15 la 6000 l.
Evoluții recente în vaccinurile derivate
din celule Vero Rotavirus
Două vaccinuri cu rotavirus derivate din celulă Vero au fost recent licențiate și
reprezintă o îmbunătățire majora a perspectivelor de protecție a nou nascutilor
împotriva infecției cu rotavirus după retragerea unui vaccin anterior, RotaShield®
(Wyeth), din cauza preocupărilor legate de siguranță. Rotavirusul este principala
cauză a bolii diareice severe la sugari și copii mici, cu 600.000 de decese care apar la
nivel mondial în fiecare an. Stratul exterior al virusului este compus din două
proteine, care reprezintă țintele pentru anticorpi neutralizanți. Utilizarea culturilor
celulare Vero a fost aplicată cu succes în două abordări diferite ale dezvoltării unui
vaccin cu rotavirus:
 Vaccinul RotaTeq® (Merck) care conține patru rotavirusuri care exprimă proteina
VP7 umană si proteina VP4 (P7) a virusului bovin, exprimă proteina VP4 umană
(P1A). Vaccinul a fost licențiat în SUA în 2006 și, până în prezent, cererile de
licențiere au fost depuse în peste 100 de țări.
 Un al doilea vaccin rotavirus derivat din celula Vero, Rotarix® (GlaxoSmithKline), a
fost licențiat în 2007. Vaccinul este un rotavirus uman monovalent, atenuat, care
conține cel mai comun antigen anti-rotavirus VP4 și VP7, P1A și G1.
Vaccinurile anti-Flavivirus. Encefalita
japoneza.

Encefalita japoneză (JE) este o boală inflamatorie a SNC provocată de țânțari,

raspandita in Asia de Sud-Est. Incidența anuală maximă a fost de 50.000 de
cazuri, cu o rată a mortalității de aproximativ 30%. Un vaccin inactivat cu
formalină, produs din virusul crescut în creierul de soarece, a fost dezvoltat în
anii 1930, ceea ce a redus treptat incidența bolii în Japonia si Coreea.
 Pentru a satisface nevoile călătorilor, a fost dezvoltat un nou vaccin JE
derivat din cultura de celule vero-inactive, Ixiaro® (Intercell). Vaccinul se
bazează pe o tulpină atenuată de JEV, SA14-14-2, care a fost adaptată să
crească pe celule Vero. Vaccinul a primit recent licenta UE.
Febra Dengue
Febra Dengue este o boală virală cu manifestări clinice variind de la o infecție
gripală ușoară până la rare cazuri de febra hemoragica si septicemie. Anual,
aproximativ 100 de milioane de infecții noi apar în regiunile subtropicale și
tropicale din întreaga lume. Nu există vaccin licențiat până în prezent în ciuda
încercărilor multiple din ultimii ani. Un motiv pentru această situație este
existența a patru serotipuri care necesită utilizarea unui vaccin tetravalent
capabil să inducă o imunitate echilibrată între serotipuri. Două vaccinuri vii
atenuate pe bază de celule Vero reprezintă cea mai bună abordare pentru
vaccinarea sigură și eficientă împotriva infecției cu virusul Dengue. Avantajele
acestora fiind costul scăzut, posibilitatea imunizării rapide în timpul epidemiilor
și inducerea unei imunități de lungă durată similară celei găsite după infecție
naturală, care ar trebui să reducă riscul de a induce febra / șocul hemoragic.
Encefalita provocata de virusul West Nile
 Deși a fost izolat pentru prima dată în Uganda în 1937, până în anii 1990, virusul
prezinta o amenințare gravă la om, cai și păsări domestice. El este o cauză
frecventă de boală febrilă fără afectarea SNC dar, ocazional, determină meningita
aseptică și encefalită severă. Aceste infectii grave sunt deosebit de frecvente in
randul copiilor si batranilor. În 1996, virusul West Nile sau un virus inrudit, a
determinat peste 300 de cazuri de boli ale SNC, cu o mortalitate de 10%, în
campiile Dunarii, inclusiv în București. Sindromul de febra - mialgii determinat de
virusul West Nile se deosebește de alte astfel de sindroame prin apariția frecventă
a unei erupții maculopapulare, concentrată pe trunchi, și a unei adenopatii.
Cefaleea, durerile oculare, durerile faringiene, greata si varsaturile, si artralgiile
(dar nu artritele) sunt simptome de acompaniament frecvente. in plus, virusul a
fost implicat in necroze hepatice severe si fatale in Africa centrala. Primul focar
de virus WN din SUA a fost înregistrat în statul New York în 1999 și infecția sa
răspândit rapid, atât în America de Nord, cât și în Caraibe și America de Sud.
 ChimeriVax-WN02 este cel mai avansat vaccin WNV, este cultivat în celulele Vero.
Vaccinul ChimeriVax-WN02 a fost bine tolerat și a determinat o rată de eficientă
de 97% după o singură vaccinare.
Virusul Chikungunya

 Virusul chikungunya este transmis cu usurinta la oamenii din zonele urbane de

catre Aedes aegypti (tantarul febrei galbene). Boala este endemica in
zonele rurale ale Africii, iar epidemii intermitente au loc in orasele din Africa
si Asia.Boala completa este mai frecventa in randul adultilor. Debutul brusc
urmeaza unei perioade de incubatie de 2-3 zile. Febra si artralgiile severe
sunt insotite de frisoane si simptome precum cefalee, fotofobie, congestie
conjunctivala, anorexie, greață si dureri abdominale. Unii pacienti mai in
varsta continua sa sufere din cauza anchilozei, durerilor articulare si
revarsatelor articulare timp de mai multi ani; aceasta persistenta poate fi
deosebit de frecnta la pacientii cu HLA - B27. A fost produs un vaccin viu
atenuat experimental, dar acesta necesita testari ulterioare.
Sindromul respirator acut sever

 Sindromul respirator sever acut a apărut în China la sfârșitul anului 2002 și sa

răspândit rapid în întreaga lume. Epidemia a avut ca rezultat peste 8000 de
infecții și aproape 800 de decese. Deși nu au existat rapoarte despre infecțiile
cu SARS uman dobândite în comunitate începând cu ianuarie 2004, este încă
posibilă reapariția bolii și amenințarea concomitentă cu privire la sănătatea
globală, deoarece virusul încă circulă în populațiile de animale de rezervă.
 Un vaccin impotriva acestui sindom a fost produs pe celulele Vero utilizând
sistemul de cultură micropurtător de celule Vero (Baxter) fără
proteine animale. Vaccinul cu virusul întreg, inactivat s-a dovedit a fi extrem
de imunogen și eficace în modele preclinice.
Variola.

 Virusul variolei ar putea fi folosit ca armă biologică, deoarece imunitatea la

virus va scădea odată cu încetarea vaccinării. Ca răspuns, guvernul american
a înlocuit stocul inițial de Vaccin varicel DryVax® care a fost inițial utilizat ca
măsură de protectie împotriva unei reapariții neașteptate a variolei. Un nou
vaccin realizat din culturi celulare Vero, ACAM2000 (Acambis), a fost ales ca
bază pentru stocul nou, deoarece metoda inițială utilizată pentru producerea
materialului DryVax este acum considerată incompatibila cu bunele practici
de fabricație. S-a demonstrat că vaccinul derivat din celule Vero este foarte
imunogen, determinând eficacitate la până la 96% dintre subiecții testati.
Gripa

 Vaccinurile inactivate pentru gripa au fost disponibile începând cu anii 1940. Vaccinurile
actuale sunt trivalente și conțin un subtip H1N1 și un subtip H3N2 al tulpinilor de gripă A și o
tulpină de influență B. Cu toate acestea, până în prezent, toate aceste vaccinuri sunt produse
în ouă embrionate de gaină. Spre deosebire de virusurile gripale crescute în ouă, virusul
propagat exclusiv în culturi de țesut derivate de la mamifere a fost raportat ca fiind
reprezentativ pentru virusul natural.
 Pe lângă epidemiile sezoniere, pandemiile de gripă apar la intervale imprevizibile. Se crede că
răspândirea continuă a tulpinilor înalt patogene ale gripei H5N1 la populațiile de păsări
sălbatice și domestice, plus transmisia adesea fatală din păsări infectate la om, fac ca acest
virus să fie sursa cea mai probabilă a următoarei pandemii de gripă. Majoritatea vaccinurilor
antigripale pandemice produse până în prezent se bazează pe virusuri atenuate. Acestia sunt
generați utilizând genele hemaglutininei și neuraminidazei ale virusului de tip sălbatic circulant
și celelalte șase gene ale virusului uman H1N1 tulpina A / Puerto Rico / 8/34, o tulpină care
asigură în mod normal un randament ridicat al virusului în ouăle de găină embrionate. Virusul
H5N1 este atenuat prin ștergerea situsului de clivare polibazică, ceea ce conferă virulența prin
extinderea considerabilă a gamei de celule gazdă pentru virus.
 Bibliografie
 1.Enders J, Weller T, Robbins F. Cultivation of the Lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science 109, 85–87 (1949).

 2 Plotkin SL, Plotkin SA. A short history of vaccination. In: Vaccines (5th Edition). Plotkin SA, Orenstein WA, Offit PA (Eds). Saunders Elsevier, PA, USA 1–16 (2008).

 3 Plotkin SA, Vidor E. Poliovirus vaccine – inactivated. In: Vaccines (5th Edition). Plotkin SA, Orenstein WA, Offit PA (Eds). Saunders Elsevier, PA, USA 605–629 (2008).

 4 Dang-Tan T, Mahmud SM, Puntoni R, Franco EL. Polio vaccines, Simian v September irus 40, and human cancer: the epidemiologic evidence for a causal association.
Oncogene 23, 6535–6540 (2004).

 5 Hayflick L, Moorehead PS. The serial cultivation of human diploid cell substrates. Exp. Cell. Res. 25, 585–621 (1961)

 . 6 Plotkin SA. Rabies vaccine prepared in human cell cultures: progress and perspectives. Rev. Infect. Dis. 2, 433–448 (1980).

 7 US Department of Health, Education and Welfare, Public Health Service. Regulation for the Manufacture of Biological Products, title 42, part 73. DHEW pub. No. (NIH)
71–161, formerly PHS publ. No. 437, revised 1971–1976.

 8 Cells, Products, Safety. Backgrounds papers from the WHO Study Group on Biologicals. Dev. Biol. Standard. 68, 1–90 (1987).

 9 Yasumura Y, Kawakita Y. Study of SV40 in tissue culture. Nippon Rinsho. 21, 1201–1205 (1963).

 10 Horaud F. Absence of viral sequences in the WHO-Vero cell bank a collaborative study. Dev. Biol. Standard. 76, 43–46 (1992).

 11 Levenbook IS, Petricciano JC, Elisberg BL. Tumorigenicity of Vero cells. J. Biol. Stand. 12, 391–398 (1984).

 12 Furesz J, Fanok A, Contreras G, Becker B. Tumorigenicity testing of various cell line substrates for production of biologicals. Dev. Biol. Stand. 70, 233–243 (1989).

 13 Vincent-Falquet JC, Peyron L, Souvras M, Moulin JC, Tektoff J, Patet J. Qualification of working cell banks for the Vero cell line to produce licensed human vaccines.
Dev. Biol. Stand. 70, 153–156 (1989).
 14 Montagnon BJ, Vincent-Falquet JC, Saluzzo JF. Experience with Vero cells at Pasteur Mérieux Connaught.
Dev. Biol. Stand. 98, 137–140 (1999).
 15 WHO. Biological Substances No. 37. Requirements for continuous cell lines used for biologicals
production. WHO technical report series, No. 745, 1987, Annex 3.
 16 European Pharmacopoeia. Cell substrates for the production of vaccines for human use 2005: 50203
(2005).
 17 US Department of Health and Human Services FDA. Guidance for industry: characterization and
qualification of cell substrates and other biological starting materials used in the production of viral
vaccines for the prevention and treatment of infectious disease (2006).
 18 ICH Guidance Q5D: Derivation and characterization of cell substrates used for production of
biotechnological/biological products. 63 FR 50244; 21 September, 1998.
 19 Palache AM, Brands R, van Scharrenburg GJM. Immunogenicity and reactogenicity of influenza subunit
vaccines produced in MDCK cells or fertilized chicken eggs. J. Infect. Dis. 176, 20–23 (1997).
 20 Pau MG, Ophorst C, Koldijk MH, Schouten G, Mehtali M, Uytdehaag F. The human cell line PER-C6
provides a new manufacturing system for the production of influenza vaccines. Vaccine 19, 2716–2721
(2001).
 21 Montagnon BJ, Fanget B, Nicolas