Capitol Ul 5

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus
Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i

Bacillus
Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu
Universitatea din Bucureti, Facultatea de Biologie Splaiul Independenei 91-95, 76201
Bucureti
Bacteriile aparinnd genurilor Bacillus i Streptomyces sunt cunoscute ca fiind
productori ai unor game largi de compui biologic activi, dintre care unii au aplicaii n
agricultur i industria farmaceutic. Dac n cazul bacililor cunotinele sunt mai avansate, iar
aplicaiile practice concentrate mai ales asupra enzimelor, la streptomicete cele mai multe
cunotine au fost dobndite n urma studiilor asupra producerii de antibiotice. Scopul acestei
lucrri este de a sintetiza datele referitoare la biosinteza de enzime i de compui cu efect
inhibitor, utili pentru diferite procese biotehnologice. De asemenea, sunt prezentate unele date
referitoare la genele ce codific biosinteza unor substane importante din punct de vedere
biotehnologic.
Actinomicetele reprezint un grup de microorganisme procariote cu numeroase
asemnri cu fungii microscopici, alturi de care constituie un exemplu clasic de evoluie
convergent. Relevante n acest sens sunt: morfologia i organizarea micelial a coloniilor lor ca
i sistemul lor de reproducere. Se poate specula c aceste asemnri rezult dintr-o adaptare
comun n sensul desfurrii tuturor funciilor metabolice n condiiile absenei apei n imediata
lor vecintate.
Ciclul de viaa al streptomicetelor, cel mai important gen din cadrul grupului
actinomicetelor, crescute pe mediu solid implic formarea (diferenierea) a dou tipuri diferite de
miceliu: miceliul de substrat care crete n si pe mediul de cultur solid; miceliul aerian care
crete pe primul i pe care se formeaz sporii (Figura 1).
In timpul creterii miceliului de substrat se remarc o cretere simultan a greutii uscate
care ns ncetinete semnificativ odat cu formarea miceliului aerian.
Figura 1. Reprezentarea schematic a celor dou tipuri de miceliu (dup Zarnea, 1982).
123
Un aspect interesant este acela c, la multe dintre speciile de streptomicete, ncetinirea

ratei de cretere este nsoit de producerea de substane antibiotice sau cu alte funcii (metabolii
secundari), astfel c n timpul formrii miceliului aerian se remarc o foarte intens activitate
antibiotic. Acest fapt vine n sprijinul ipotezei asupra rolului antibioticelor produse de
streptomicete i anume acela de a proteja miceliul de substrat care se lizeaz mpotriva altor
bacterii existente n sol care l-ar putea folosi ca surs de carbon i azot, pstrndu-l astfel pentru
creterea miceliului aerian (Chater i Merrick, 1979).
Diferenierea celular evideniat la streptomicete pare a fi un proces controlat de unele
substane autoreglatoare cum sunt factorii A i B al cror mecanism de aciune, cel puin n cazul
unor specii de streptomicete care au fost studiate mai intens, este asemntor mecanismului de
aciune al hormonilor de la eucariote, implicnd prezena unor receptori specifici (Beppu, 1986).
Acest tip de reglaj mpreun cu observaiile legate de asemnrile structurale ale factorului B cu
AMPc de la eucariote sugereaz ideea c anumite substane evideniate la streptomicete ar putea
fi semnale universale sau mesageri pentru funcii celulare nu numai la procariote ci i la
eucariote.
Ca rezultat al activitii lor metabolice, att streptomicetele ct i bacilii, formeaz mai
multe categorii de compui care includ, pe lng constituenii structurali ai celulei, enzime intrai extracelulare, produi finali de metabolism precum i o serie de produi cu importan practic
deosebit incluznd metaboliii primari i pe cei secundari.
Metaboliii primari sunt compui cu greutate molecular n general mic, reprezentnd
produi intermediari sau finali ai metabolismului intermediar necesari microorganismului
productor i care includ : aminoacizi, acizi organici, nucleotide, vitamine, enzime etc (Zarnea,
1984). Aceti compui sunt sintetizai n cursul trofofazei (perioadei de multiplicare rapid i
acumulare de biomas celular), n medii bogate n substane nutritive i condiii fizice
corespunztoare. Dup aceast etap urmeaz idiofaza n cursul creia creterea i multiplicarea
nceteaz dar celulele rmn metabolic active sintetiznd o categorie special de substane cu
structur chimic variat, denumite metabolii secundari. Numrul metaboliilor secundari este
foarte mare iar efectele lor sunt de asemenea foarte variate. Diversitatea neobinuit a efectelor
farmacodinamice i a structurii lor chimice este ilustrat de numeroasele clase de compui
organici la care pot aparine i care includ: glucide aminate, chinone, cumarine, epoxizi,
alcaloizi, glicozide, derivai indolici, lactione, macrolide, naftalene, nucleozide, terpenoizi i
tetracicline (Berdy, 1974).
Sinteza metaboliilor secundari se face printr-o mai mare varietate de ci dect aceea a
metaboliilor primari, pe seama compuilor cu greutate molecular mic folosii n timpul
creterii exponeniale pentru sinteza constituenilor celulari normali i este rezultatul acumulrii
n mediu a unor substane cu rol de inductor. De asemenea, declanarea sintezei metaboliilor
secundari se poate datora i epuizrii unor substane cu funcie de represor (Vining, 1990). In
contrast cu diversitatea cilor de biosintez i a produilor finali, cei mai muli dintre metaboliii
secundari sunt asamblai pornind de la civa metabolii cheie. In plus, spre deosebire de
metabolismul primar n care procesele de biosintez se desfoar ntotdeauna cu mare
specificitate (se utilizeaz un singur substrat i rezult un singur produs), n metabolismul
secundar proporia fiecrui component depinde de factori genetici i de mediu, probabil datorit
specificitii sczute a enzimelor implicate n desfurarea sa.
Majoritatea metaboliilor secundari au aciuni antibiotice dar exist i compui cu aciuni
diferite. In general ei au mrime redus chiar dac nu sunt monomeri ci oligomeri; ei sunt de
obicei excretai n mediul extern fie sub form solubil n ap fie ca produi insolubili care
formeaz agregate amorfe sau cristaline asociate cu celulele productoare (Vining, 1990).
124
1. Functiile
metabolitilor secundari produi de bacili i

streptomicete
1.1. Activitatea antibiotic a metaboliilor secundari

Printre bacterii, actinomicetele i n special cele din genul Streptomyces sunt cunoscute
ca fiind principalii productori de antibiotice, sintetiznd 3/4 dintre toi produii cunoscui de
acest tip. Antibioticele produse de streptomicete au structur chimic variat putnd fi clasificate
n diferite tipuri n timp ce compuii cu funcii similare elaborai de bacteriile din genul Bacillus
sau din alte grupe (bacterii lactice, enterobacterii, Pseudomonas sp.) sunt n majoritate peptide
sau peptide modificate.
Membrii genului Bacillus (Figura 2) sunt capabili s produc antibiotice ca metabolii
secundari n faza de cretere logaritmic trzie sau la nceputul fazei staionare. Au fost semnalai
mai mult de 169 de astfel de metabolii. De exemplu, B subtilis poate produce 68 tipuri de
antibiotice, n timp ce la B.brevis au fost identificate numai 23 asemenea tipuri de substane.
(Katz i Demain 1987).
Figura 2. Aspect electronomicroscopic al celulelor de Bacillus subtilis (dup Zarnea, 1984).
Multe dintre antibioticele produse de bacili sunt active mpotriva bacteriilor Gram
pozitive, dar exist i excepii. Aa cum s-a menionat deja, majoritatea antibioticelor produse de
bacili sunt peptide, dar unele aparin altor clase de compui chimici (de exemplu, leutirosin este o
amiloglicozid, iar protacin este o trien fosforic).
Exist o controvers n ceea ce privete funcia acestor antibiotice la bacteriile din genul
Bacillus. Ele apar, de obicei, n timpul sporutrii, de aceea se crede c antibioticele respective
constituie un factor important ce apare la tranziia de la starea vegetativ la spori (Katz i
Demain,1987).
Multe dintre tulpinile de bacili productoare de compui cu aciune antimicrobian au
fost supuse unor analize speciale de cartare molecular, de identificare i clonare a genelor
codificate. Datele obinute pn n prezent sunt prezentate n Tabelul 1. Metaboliii secundari
datoreaz activitatea antibiotic capacitii lor de a inhiba procesele metabolice primare. Cei mai
muli acioneaz ca antimetabolii deoarece asemnarea lor funcional cu metaboliii normali le
permite legarea la situsuri int i s interfere cu activitatea normal. Produii generai de o
anumit cale metabolic inhib de obicei o alt cale metabolic, activitatea lor depinznd n
ntregime de configuraia antibioticului i de distribuia gruprilor funcionale la nivelul lor.
Tabelul 1. Substane antibiotice produse de bacteriile genului Bacillus
125
Specie
Antibiotic
Aciune inhibitoare
B.subtilis
Subtilin
Surfactin
Bacilysin
Difficidin
Oxydificidin
Bacillomycin F
Mycobacillin
Iturin
Gramicidin S
Tyrocidin
Bacitracin
Proticin
Pumilin
Tetain
Esperin
Polymyxin
Colistin
Octopytin
Baciphelecin
Circulin
Butirosin
Laterospuramine
Laterosporin
Biorin
Cerexin
Bacterii Gram +
B. brevis
B. licheniformis
B. pumilus
B. mesentericus
B. polymyxa
B.tyaminoliticus
B. circulans
B.laterosporus
B. cereus
Harta
genetic
+
+
+
-
Gene
clonate
+
-
Bacterii Gram +
Bacterii Gram +
Bacterii Gram +
Bacterii Gram Bacterii Gram Bacterii Gram +
Bacterii Gram +
Bacterii Gram Bacterii Gram +
Bacterii Gram +
+
+
+
-
+
+
+
-
Bacterii Gram +
Bacterii Gram +
Spectru larg de aciune
Spectru larg de aciune
Antifungic
Antifungic
Antifungic
Bacterii Gram +
Bacterii Gram +
Bacterii Gram +
Deoarece nu exist o corelaie strict ntre intele antibioticului i cile metabolice n care
el este format, este riscant s se spun c toi metaboliii secundari manifest o anumit activitate
biologic, mai ales dac inem cont de faptul c de multe ori aceti compui au semnificaie
numai pentru om i mai puin pentru organismul productor.
Dei cercetrile asupra utilitii medicale a antibioticelor s-au referit n special la
activitatea antibacterian, n prezent sunt studiate aciunile unor asemenea substane i asupra
unor alte tipuri de celule, eucariote. Un exemplu n acest sens l constituie monensinul, identificat
iniial n culturi de Streptomyces cinnamonensis i care n prezent este utilizat pe scar larg ca i
coccidiostatic sau ca stimulator al creterii animalelor (Vining, 1990).
O problem care se pune n cazul producerii de substane antibiotice este aceea a
modalitilor n care bacteriile productoare rezist la aciunea acestor substane care de obicei
inhib creterea sau alte procese biochimice eseniale. Pentru a elimina efectul de inhibare a
creterii, bacteriile productoare pot prezenta mai multe mecanisme de rezisten: modificarea
situsului int al antibioticului, modificarea permeabilitii membranare sau inactivarea
metabolitului toxic (Cundliffe, 1989). Deoarece antibioticele sunt rapid eliminate n exteriorul
celulei pe msur ce el este produs, inactivarea celular nu afecteaz eficiena produsului
extracelular.
Un studiu efectuat asupra rezistenei la antibiotice a tulpinilor bacteriene sensibile ("int") a
evideniat faptul c antibioticele excretate n mediu i care acioneaz n vecintatea
organismului productor au semnificaia unor factori implicai n competiia pentru resurse.
Rezistena la antibioticele obinute a fost observat la multe tulpini bacteriene de colecie,
126
izolate nainte de introducerea acestor antibiotice n practica medical ceea ce sugereaz ideea c
populatiile bacteriene vin n contact cu asemenea compui n mediul lor natural de via. De
asemenea, unii metabolii toxici chiar dac nu au o valoare antibiotic mare, ei pot potena
activitatea altor antibiotice fa de care s-a instalat rezistena la numeroase tulpini bacteriene.
Acesta este cazul acidului clavulanic produs de tulpini de S.clavuligerus care are o slab
activitate antibiotic dar care determin o sporire a aciunii unor antibiotice -lactamice cum este
cefamicinul prin inhibarea -lactamazelor pro-duse de tulpina bacterian int.
Antibioticele descoperite pn n prezent i utilizate mai mult sau mai puin intens n
practica medical pot fi clasificate innd cont de diferite criterii: modul de aciune, natura
chimic, spectru de aciune etc.
O abordare recent a structurii unor antibiotice consider c acestea, alturi de un numr
mare de metabolii sintetizai att de ctre bacterii ct i de fungi sau plante, pot fi grupate ntr-o
familie de compui denumii poliketide (Hopwood i Sherman 1990). Toi aceti compui au n
comun prezena unor grupri keto la nivelul unor atomi de carbon foarte variai ca poziie n
molecula respectiv. Printre compuii inclui n aceast familie menionm: tetraciclinele,
antraciclinele, eritromicina, rifamicinele, granaticinul, avermectinul (toate sintetizate de ctre
streptomicete), aurantininul (sintetizat de Bacillus sp.) mupirocin (elaborat de Pseudomonas sp.)
precum i ale substane elaborate de celule eucariote: micotoxine, flavonoizi, fitoalexine etc.
1.1.1. Antibiotice care inhib sinteza peretelui celular
Dup descoperirea penicilinei de ctre Fleming n 1929, un numr mare de antibiotice
nrudite cu aceasta au fost izolate, ele avnd n comun structura chimic (sunt -lactami) i
modul de aciune (inhibarea sintezei peretelui celular bacterian).
Dei penicilinele au fost descoperite ca fiind produse de ctre fungi, s-a dovedit c
asemenea antibiotice pot fi sintetizate i de ctre unele specii de streptomicete cum ar fi:
S.clavuligerus, S.lipmanii, S.lactamgens, S.cattleya (Martin i Liras, 1989; Matsushima i Baltz,
1989; Srinivasan i colab.,1991).
Pe lng antibioticele -lactamice au mai fost izolai i caracterizai i ali compui care
afecteaz funciile membranei plasmatice. Un exemplu l constituie nistatinul, antifungic produs
de unele specii ale genului Streptomyces. Un alt grup este reprezentat de polimixine, bacitracine
i gramicidine, antibiotice polipeptidice produse de bacterii aparinnd genului Bacillus
(B.polymixa, B.licheniformis, B.brevis). Aceti compui determin creterea permeabilitii
membranei plasmatice ceea ce are drept consecin ieirea masiv a unor aminoacizi sau a unor
derivai purinici i pirimidinici din bacterie, conducnd n final la moartea celulei. De asemenea,
bacitracina acioneaz asupra sintezei peretelui celular, determinnd inhibarea biosintezei
peptidoglicanului unor bacterii Gram negative.
1.1.2. Antibiotice care inhib sinteza proteinelor
Dintre antibioticele care afecteaz sinteza proteinelor, un loc important este ocupat de
aminoglicozide, tetracicline i cloramfenicol, toate cele trei grupe fiind sintetizate de specii ale
genului Streptomyces..
Aminoglicozidele reprezint un grup foarte important de antibiotice care au drept
component principal unele glucide aminate. Primul antibiotic din acest grup care a fost
descoperit n 1944 este streptomicina produs de S.griseus, dup care au fost izolate numeroase
alte aminoglicozide de la bacterii aparinnd n principal genurilor Streptomyces i
Micromonospora: gentamicina produs de specii de Micromonospora, neomicina produs de
S.fradiae, ribostamicina produs de S.ribosidificus, kanamicina sintetizat de tulpini de
S.kanamyceticus, butirozina produs de B.circulans etc.(Okuda i Ito, 1982).
Aminoglicozidele sunt antibiotice cu spectru larg de aciune utilizate de obicei pentru
tratarea unor infecii produse de tulpini de E.coli, Klebsiella sp., Proteus sp., Enterobacter sp.
127
Mecanismul prin care aceste antibiotice omoar celulele sensibile nu este pe deplin elucidat.
Exist numeroase date experimentale care evideniaz c situsul primar de aciune al acestor
antibiotice ar fi ribosomii, ceea ce determin afectarea sintezei proteinelor. Efectele pleiotropice
ale aminoglicozidelor asupra bacteriilor sunt considerate a fi consecina interaciunii lor cu
ribosomii. Alturi de interferena cu sinteza proteic, aminoglicozidele induc distrugeri ale
membranei plasmatice, afecteaz respiraia celular, acumularea de ARN i determin n final
moartea celulelor. In ceea ce privete mecanismul rezistenei bacteriilor productoare la aciunea
acestor antibiotice s-a evideniat faptul c acestea prezint strategii diferite cum ar fi producerea
unor enzime ce inactiveaz antibioticul sau modificarea situsului de aciune al acestuia
(Cundliffe, 1989). Spre exemplu, bacteriile productoare de aminoglicozide sintetizeaz n
acelai timp i enzime ce modific antibioticele respective: aminoglicozid-fosfotransferaza
(APH) i acetiltransferaza (AAC). De asemenea, bacteriile respective (S..kanamyceticus,
S.tenebrarius) pot produce simultan i enzime ce modific unele situsuri de aciune ale
antibioticului (de exemplu, situsurile ribosomale) prin metilarea ARNr.
Tetraciclinele reprezint un grup destul de heterogen de antibiotice produse n special de
bacterii din genul Streptomyces ele avnd n comun o structur chimic de baz dar variind n
funcie de gruprile chimice care se leag de aceast structur: oxitetraciclina (produs de
S.rimosus), tetraciclina (produs de S. viridofaciens), clortetraciclina (sintetizat de
S.aureofaciens). Tetraciclinele prezint un spectru destul de larg de aciune fiind bacteriostatice
pentru diferite bacterii Gram pozitive i Gram negative (cu excepia tulpinilor de Salmonella,
Proteus i Pseudomonas) i bactericide n concentraii mari. Tinta principal de aciune a acestor
antibiotice este sinteza proteic, ele neavnd efecte evidente asupra ADN, ARN sau asupra
sintezei peretelui celular. Modalitatea exact a legrii tetraciclinelor la ribosomi nu este nc pe
deplin cunoscut. Se pare c ele se leag puternic de subunitatea 70S a ribosomilor ceea ce
determin efectul inhibitor al antibioticelor. De asemenea, tetraciclina se leag slab de
subunitatea 30S ceea ce are drept consecin blocarea legrii aminoacil-ARNt la aceast
subunitate i deci a alungirii lanurilor polipeptidice. Autorezistena bacteriilor productoare
poate include modificarea situsurilor int normale, inactivarea intracelular a antibioticului sau
eliminarea sa rapid din celul (Cundliffe, 1989).
Cloramfenicolul este un antibiotic cu spectru destul de larg de aciune, el fiind izolat n
1947 din filtrat de cultur de S.venezuelae. Aciunea cloramfenicolului const n mpiedicarea
ARNm s se lege la ribosomi ceea ce se concretizeaz prin inhibarea sintezei proteice (a formrii
legturilor peptidice) (Pongs, 1979).
1.1.3. Antibiotice care inhib replicarea i transcrierea informaiei genetice
Dintre antibioticele care mpiedic replicarea ADN i sinteza ARNm menionm
novobiocina, coumermicina i rifamicinele.
Novobiocina este un antibiotic cu o structur complex produs de S.sphaeroides cu
efect, de obicei, bacteriostatic asupra bacteriilor, mai ales n mediu acid. Similar ca aciune este
coumermicina A, un antibiotic izolat din culturi de S.rishinensis i S.hazeliensis. La concentraii
mai mici de novobiocin i cumermicin A este afectat doar replicarea ADN din celulele
sensibile, nu i procesul de transcriere. Cele dou antibiotice pot afecta aciunea ADN girazei,
enzim ce determin suprarsuciri ale moleculei de ADN, ceea ce explic inhibarea replicrii i
transcrierii informaiei genetice (Ryan, 1979). Rezistena la novobiocin a bacteriei productoare
S.sphaeroides este determinat de gena gyrB al crei produs, ADN giraza B este rezistent la
aciunea acestui antibiotic (Cundliffe, 1989).
Rifamicinele, avnd ca reprezentat tipic rifampicina reprezint un grup de antibiotice
macrociclice care acioneaz, n special, asupra micobacteriilor i bacteriilor Gram pozitive.
Mecanismul lor de aciune se refer la inhibarea procesului de transcriere a informaiei genetice
prin blocarea aciunii enzimei ARN-polimeraza.
128
Un alt antibiotic cu aciune inhibitoare asupra acizilor nucleici este granaticinul,

antibiotic de tip quinonic, izolat din culturi de S.olivaceus i S.violaceoruber. Aciunea sa in
vitro se manifest, att la procariote ct i la eucariote, asupra sintezei de ADN, ARN, dar i de
proteine. De aceea, granaticinul are efect antitumoral, mpotriva leucemiei P388 i efect citotoxic
pentru celulele KB (Ogilvie i Kersten, 1979).
1.2. Aciuni asupra celulelor animale
Numeroase substane antibiotice nu au fost utilizate n practica medical datorit aciunii
lor toxice asupra celulelor animale. Acest efect toxic rezult din aciunea direct asupra uneia
dintre cile metabolismului primar, ci care sunt universale, de obicei, asupra producerii de
energie sau exprimrii genelor. Totui, toxicitatea asupra celulelor animale nu rezult ntotdeauna
din inhibarea aceleiai reacii care este int la microorganisme. Spre exemplu, amfomicina care
interfer cu transportul membranar al intermediarilor mureinei la bacterii, la celulele eucariote
determin o blocare a glicozilrii.
Unele antibiotice care au evideniat o activitate de inhibare a creterii mai multor tipuri de
organisme au nceput s fie utilizate ca substane antitumorale datorit toxicitii lor asupra
celulelor ce prolifereaz rapid. Printre aceste substane, un loc important l ocup antraciclinele i
bleomicina substane care sunt produse de specii ale genului Streptomyces (Tsukagoshi i
colab.,1986). Descoperite iniial ca ageni antibacterieni, s-a dovedit ulterior c cele dou familii
de substane se leag specific, prin intercalare, la moleculele de ADN iar bleomicina, n plus,
poate determina scindarea catenelor de ADN. Citotoxicitatea selectiv a bleomicinei rezult din
scderea activitii unei enzime de inactivare din celulele tumorale.
Un alt tip de produi antimicrobieni sau inhibitori enzimatici cu activitate antitumoral
este reprezentat de proteine de dimensiuni mici, cum ar fi: macromicinul, actinoxantinul,
forfenicin sau bestatin, ce conin o grupare prostetic cromofor ce se intercaleaz n
macromoleculele de ADN, modificndu-le structura(Aoyagi i colab.,1978).
Unii metabolii secundari manifest aciune farmacologic specificp asupra animalelor;
n acest caz ei nu prezint o citotoxicitate general, dar aciunea lor farmacologic i poate face
uneori extrem de toxici. Un exemplu l constituie aciunea vasodilatatoare a unui compus (WS
1228A, B) izolat de la S. aureofaciens care ns nu este nsoit i de toxicitate sau activitate
antibiotic. Un alt compus, MY-336a, izolat din culturi de S. gabonae exercit aciune antagonic
cu receptorii -adrenergici, avnd deci o aciune farmacologic selectiv, netoxic (Kase, 1986).
In cazul amicourmamicinei A izolate de la B. pumilis s-a evideniat iniial o aciune antibiotic,
dup care s-a dovedit a avea i o activitate antiinflamatorie asupra animalelor testate (Itoh i
colab., 1981).
De asemenea, printre substanele izolate iniial n experimentele de screening pentru
activitatea antibiotic au fost descoperite unele care au aciune de modulare a rspunsului imun.
Spre exemplu, substana IC201 izolat de la S.cirratus i S fimbriatus ca agent antitumoral, s-a
dovedit a avea aciune activatoare i asupra macrofagelor. Un alt compus, macrolidul FK 506
izolat de la S.tsukubaensis n cursul unor experimente de selecie a unor substane care s inhibe
producerea de interleukin-2 s-a dovedit a avea aciune imunosupresoare.
1.2.1. Activitate insecticid
S-a evideniat c numeroi metabolii secundari produi de streptomicete n special au
aciune insecticid. Unii dintre ei, cum ar fi unele antibiotice macrolidice polienice, blocheaz
respiraia celular sau inhib sinteza proteic la eucariote, fiind astfel ageni nespecifici. Ali
metabolii secundari, de tipul nikamicinei au aciune specific inhibnd chitin-sintetaza i deci
acioneaz asupra peretelui celular chitinos al insectelor. Un alt antibiotic, mibelmicina produs
129
de S. hygroscopicus subsp. aureolacrimosus, nu are efect antibacterian dar acioneaz selectiv

asupra insectelor avnd n plus i efect antihelmintic i acaricid.
Intr-un studiu recent, Fabre i colab.(1988) au izolat n urma unui complex proces de
selecie realizat asupra a 6280 de culturi de actinomicete, o nou substan cu aciune insecticid.
O important aciune insecticid este datorat biosintezei de ctre unele tulpini bacteriene a
chitinazei care acioneaz direct asupra nveliurilor insectelor patogene.
1.3. Activitate asupra celulelor vegetale
Unii metabolii secundari produi de bacteriile din genul Streptomyces au aciune
fitotoxic i uneori antifungic. Spre exemplu, herbicidinele produse de S.sagonensis sunt
nucleozide cu aciune fitotoxic pentru plantele dicotiledonate. Ele inhib, de asemenea, i
dezvoltarea fungilor. Alte substane, cum ar fi herbimicinele produse de S.hygroscopicus au o
foarte slab activitate antibiotic, n schimb sunt toxice pentru celulele vegetale. In plus,
herbimicina A inhib dezvoltarea virusului mozaicului tutunului i are aciune antitumoral
pentru celulele animale (Yamashita i colab., 1989). O alt substan, homoalanozina, produs de
S. galileus este un antimetabolit al acidului aspartic i acidului glutamic, ea exercitnd aciune
insecticid i herbicid (Fushimi i altii,1989).
De asemenea, numeroi cercettori (Backman 1995, Baker 1985, Bachow 1995) au
publicat date referitoare la capacitatea unor specii aparinnd genului Bacillus de a inhiba
dezvoltarea unor ciuperci fitopatogene (Tabelul 1). In majoritatea cazurilor combaterea
biologic a fungilor fitopatogeni implic folosirea factorilor biotici existeni n mediul
plantelor. Studiile efectuate pn n prezent au evideniat capacitatea unor tulpini de Bacillus
subtilis de a combate diferite ciuperci fitopatogene, cum ar fi : Macrophomina phaseolina
patogen la mazre (Siddiqui 1995), Rhizoctomia solani - patogen la mazre (Bochow 1994),
fasole i semine de gru (Lazzareti 1994), Fusarium oxysporum i Phytyum ultinacere
patogeni la tomate (Sadders 1996).
Cele mai frecvente specii ale genului Bacillus care au prezentat capacitatea de a
preveni i combate evoluia unor boli determinate de ciuperci fitopatogene sunt: Bacillus
subtilis (Figura 3), Bacillus licheniformis, Bacillus polymyxa, Bacillus cereus.
Figura 3. Aciunea inhibitoare a tulpinii B.subtilis B2 asupra fitopatogenului Sclerotinia sclerotiorum.
Studiile privind oportunitatea utilizrii acestor specii bacteriene n combaterea

biologic s-au bazat pe proprietatea de a produce spori cu nalt rezisten i longevitate n
condiii naturale de mediu, acesta determinnd posibilitatea obinerii i comercializrii lor
ntr-o manier similar cu fungicidele chimice.
In lupta pentru nutrieni microorganismele au la dispoziie un ntreg arsenal de
compui chimici care inhib organismele competitive. Muli din aceti compui au origine
peptidic i pot fi sintetizai ribozomal sau neribozomal. Multe dintre tulpinile de Bacillus
130
subtilis produc o serie de substane de natur lipooligopeptidic din gama iturinului, care au
activitate antifungic, hemolitic precum i proprieti antibiotice. Structura chimic a acestor
substane a fost determinat prin diverse metode (spectrometrie de mas (MS), gel
cromatografie, cromatografie n strat subire (TLC), lichid cromatografie (HPLC)).
Componenta proteic a acestor substane este reprezentat de oligopeptide alctuite din apte
aminoacizi, iar componenta lipidic conine acizi grai cu catena carbonic lung (C14-C16).
Astfel, iturin AL conine o heptapeptid (2 D-Asp, 1 L-Asp, 1 L-Glu, 1 L-Pro, 1 L-Ser,
1 D-Tir) i un amestec de -amino acizi grai cu caten lung C14-C16. Iturin D i iturin E
conin o heptapeptid (3 Asp, 1 Glu, 1 Pro, 1 Ser, 1 Tyr) i un amestec de -amino acizi grai
cu caten C14-C16, diferind de iturin A prin prezena unei grupri carboxil la iturin D i o
grupare carboximetil la iturin E. Mycosubtilin, o substan din gama iturinului, conine o
heptapeptid ciclic (Asn, Tyr, Asn, Gln, Pro, Ser, Asn) legat de un -amino acid gras. Tot
din gama iturinului fac parte surfactinul i fengycinul care conin un -hidroxiacid gras i
bacillomycinul care conine un -amino acid gras.
Studii mai intense au fost efectuate cu o substan produs de mai multe specii de
Streptomyces (S. hygroscopicus, S. viridochromogenes) i care a primit denumirea de bialafos
(fosfinotricin-alanil-alanina). Aceasta substan a fost iniial selectat pentru activitatea sa
antibiotic dup care s-a observat c ea are, de fapt, o aciune mult mai complex. Componentul
activ al bialafosului este fosfinotricinul care inhib glutamin-sintetaza din celulele vegetale, ceea
ce i confer bialafosului o puternic aciune herbicid (Lea i colab., 1984).
Muli dintre metaboliii secundari produi de diverse microorganisme au fost testai
pentru eventuala lor aciune asupra unor enzime. Atunci cnd sistemul test a inclus enzime cheie
n procesele farmacologice de la animale, numeroi metabolii secundari au fost detectai ca
avnd activiti fiziologice "in vivo". Muli dintre aceti compui au fost descoperii a fi inhibitori
proteazici, acionnd asupra pepsinei, papainei, tripsinei, chimiotripsinei, catepsinei, elastazelor,
aminopeptidazei B i leucin-aminopeptidazei (Umezawa, 1982). Printre inhibitorii proteazici
izolai de la actinomicete unii acioneaz asupra reninei sau asupra unei zinc-exopeptidaze care
convertete angiotensina I n angiotensin II.
Cercetrile efectuate asupra culturilor microbiene au permis izolarea unor inhibitori i ai
altor enzime. Acesta este cazul inhibitorilor pentru glucozidaze (Muller, 1986), pentru cAMP
(reticulol), pentru kinaze etc.
2. Determinismul
genetic al biosintezei unor antibiotice si a altor

metaboliti secundari
In urma experimentelor de cartare a genelor implicate n metabolismul secundar la

procariote s-a evideniat faptul c acestea sunt grupate formnd "clusteri". Localizarea acestor
gene este, n majoritatea cazurilor, cromosomal dar, exist cazuri cnd acestea sunt localizate pe
plasmide (Hopwood, 1978; Kinashi i colab.,1987). Spre exemplu, genele implicate n sinteza
oxitetraciclinei de ctre S.rimosus sunt grupate n doi "clusteri" cromosomali (Binnie i colab.,
1989). La fel i genele care determin sinteza actinorhodinului i undecilprodigiozinului de ctre
tulpini de S. coelicolor (Rudd i Hopwood, 1979), a eritromicinei de ctre Saccharopolyspora
erythraea (Weber i altii, 1985) sau avermectinei de ctre Streptromyces avermectilis (Ikeda i
colab., 1987). In plus, evidenierea faptului c aceste grupuri de gene includ i elemente
reglatoare ca i determinani genetici de rezisten la produsul antibiotic respectiv sugereaz
existena unui sistem foarte bine organizat, cu funcionare complex. Nu este ns stabilit cu
exactitate dac aceast organizare a genelor exist i n cazul altor metabolii secundari, fr
131
activitate antibiotic, cum ar fi unii pigmeni, alcaloizi, reglatori ai celulei vegetale etc. (Martin
i Liras, 1989).
In ceea ce privete localizarea plasmidial a unor gene implicate n biosinteza unor
antibiotice, datele referitoare la acest aspect sunt mai puine. Un exemplu l constituie genele
pentru biosinteza metilenomicinei care se gsesc plasate pe plasmida SCP1 de la S. coelicolor
(Wright i Hopwood, 1978; Chater i Bruton, 1985). De asemenea, de la bacteriile din genul
Streptomyces au fost izolate o serie de plasmide lineare cu dimensiuni variate, ntre 5,4-17 Kb
pn la 350-520 Kb (Chardon-Loriaux, 1985; Kinashi i colab., 1987). Evidenierea plasmidelor
lineare uriae la ase tulpini de Streptomyces productoare de antibiotice i examinarea corelaiei
dintre prezena lor i sinteza de antibiotice a dus la concluzia c, cel puin n cazul
metilenomicinei, genele implicate n sinteza sa sunt plasate pe aceste plasmide care reprezint
aproximativ 5 % din cantitatea total de ADN celular. Sunt ns necesare studii suplimentare
pentru a stabili dac i n alte cazuri genele care determin sinteza unor antibiotice sunt localizate
pe plasmide similare.
2.1. Organizarea i exprimarea genelor pentru unii metabolii secundari sintetiza i de
specii de Bacillus
Cea mai mare parte a metaboliilor secundari produi de bacteriile din genul Bacillus sunt
homo- sau heteropeptide. Spre exemplu, gramicidina S este un decapeptid ciclic format din
dou uniti de D-Phe-L-Pro-L-Val-L-Orn-L-Leu, fiind produs de tulpini de B. brevis, ca de
altfel i tirocidinele. Familia bacitracinelor cuprinde peptide alctuite din 12 aminoacizi, produse
de tulpini de B. licheniformis. Studiile cu extracte celulare au evideniat c aminoacizii
constitueni ai acestor compui sunt activai i legai n subunitile respective de ctre mai multe
tipuri de peptid-sintetaze (Kleinkauf i Van Dohren, 1987).
Experimentele de clonare n E. coli a genelor pentru sinteza gramicidinei i tirocidinei au
evideniat faptul c n cazul tirocidinei sunt implicate trei enzime multifuncionale, n timp ce la
producerea gramicidinei S particip cel puin 2 sintetaze (GS1 i GS2) codificate de dou gene
diferite grsA i grsB.
2.2. Organizarea i exprimarea genelor pentru unele antibiotice sintetizate de bacteriile din
genul Streptomyces
In cazul streptomicetelor au fost evideniai numeroi metabolii secundari, dar numai
puini au o structur peptidic. Unul dintre acetia, bialafosul prezint importan practic
deosebit, deoarece manifest activitate herbicid. Recent, Nakajima i colaboratorii (1991) au
izolat de la S.hygroscopicus un nou compus cu activitate herbicid, care a primit denumirea de
hidantocidin. Bialafosul, care a fost mai intens studiat, este sintetizat pornind de la piruvat sau
fosfoenolpiruvat, printr-o cale metabolic care cuprinde cel puin 13 etape (Thompson i Anzai,
1987). Experimentele de clonare cu genele implicate n sinteza acestui compus au evideniat
faptul c n acest proces sunt implicate mai multe gene (cel puin 7) grupate, alturi de care se
afl i gena pentru rezistena la bialafos (bar). Astfel, au fost obinute dou grupe de clone
derivate de la mutante neproductoare i care au fost transformate cu plasmida pIJ61
recombinant (coninea diferite gene de la S.hygroscopicus). Un grup de asemenea plasmide
recombinante restabilete productivitatea mutantelor care prezint modificri ale etapelor 5, 6, 12
i 13 ale cii metabolice, n timp ce un alt grup restabilea producerea de bialafos de ctre
mutantele blocate la nivelul etapelor 1, 3 i 4. In plus, a fost realizat transferul unui segment de
16 Kb, care restabilea productivitatea tuturor celor 7 tipuri de mutante. Acest segment de ADN
coninea i gena bar care, de altfel, a permis i identificarea clonelor transformate. Totui, acest
fragment nu determin o producie semnificativ de bialafos la mutantele neproductoare, ceea
132
ce sugereaz existena unor gene suplimentare aflate n afara segmentului de 16 Kb, necesare
exprimrii complete a operonului pentru sinteza bialafosului.
De asemenea, n urma experimentelor de clonare a genelor bar (de rezisten la bialafos)
n diferite celule gazd, inclusiv n celulele vegetale s-a evideniat faptul c pentru funcionarea
normal a genelor pentru biosinteza bialafosului sunt necesare nc trei gene diferite care
determin adenilarea la diferite etape ale biosintezei. Aceste noi date conduc la presupunerea c
genele implicate n biosinteza acestui compus se gsesc localizate la nivelul unui fragment de
ADN de peste 34 Kb.
Experimentele lui Anzai si ale colaboratorilor (1987) au evideniat faptul c prin clonarea
unui fragment de ADN de 5,9 Kb, care conine gena brpA are loc activarea transcrierii att a
genei bar ct i a cel puin altor 6 gene structurale bap. De asemenea, aceti autori au artat c
att la S.viridochromogenes, ct i la S. hygroscopicus organizarea genetic a genelor implicate
n sinteza bialafosului este identic.
Un alt grup de metabolii secundari peptidici, actinomicinele (cromopeptide) este
sintetizat n urma aciunii unei enzime, fenoxazinon-sintetaza (PHS). Prin clonarea genei pentru
PHS de la S. antibioticus n S. lividans (Jones i Hopwood, 1984) s-au obinut mai multe tipuri
de clone: unele care conineau gena structural pentru PHS, iar altele care prezentau activitate
PHS, dar care a rezultat n urma activrii unei gene "tcute" (silent gene) endogene de ctre
fragmentul de ADN exogen transformant. Fenomenul este frecvent ntlnit n cazul
streptomicetelor, el fiind semnalat i n cazul tulpinilor productoare de ali metabolii secundari.
Un exemplu l constituie clonarea genelor pentru producerea cefamicinei de la S.cattleya la
S.lividans, clonele productoare rezultnd n urma activrii unor gene endogene silenioase
(Martin i Liras, 1989).
Muli dintre metaboliii secundari produi de streptomicete au o structur de tip
macrolidic n care inelul macrociclic derivat de la poliketide este nchis printr-o legtur
lactonic. La acest inel macrociclic sunt, de obicei, ataate glucide bazice sau neutre. Spre
exemplu, eritromicina produs de Saccharopolyspora erythraea (Streptomyces erythraeus)
conine un inel lactonic (eritronolid) i 2 glucide specifice, dezozamina i cladinoza, sinteza sa
realizndu-se n aproximativ 30 etape enzimatice Prin clonarea n S.lividans a unor fragmente de
ADN cromosomal izolate de la tulpini de S.erythraea productoare de eritromicin s-a stabilit c
trei dintre genele implicate n biosinteza antibioticului, eryA, eryB i eryC sunt grupate i
localizate ntr-o unic regiune a cromosomului bacteriei productoare. Utiliznd un vector de
clonare integrativ (care se poate integra n cromosomul gazdei) s-a stabilit c alturi de genele
care determin sinteza antibioticului se afl i gena pentru rezistena la eritromicin, ermE (gen
care determin sinteza unei metilaze pentru ARNr) (Stanzak i colab., 1986). De asemenea, Mc
Alpine i colab. (1987) au comunicat obinerea unui antibiotic hibrid care a primit denumirea de
2-noreritromicin, n urma clonrii ntr-o mutant de S.erythraea, care avea blocat ultima etap
a sintezei eritromicinei a unui fragment de ADN de 30-35 Kb izolat de la S.antibioticus
productor de oleandomicin.
Un alt antibiotic, tilozina produs de tulpini de S.fradiae prezint o structur chimic
asemntoare eritromicinei, avnd un inel macrociclic, tilanolid i trei glucide mai puin
rspndite: micaminoza, micaroza i micinoza. Studiile referitoare la organizarea genelor
implicate n sinteza acestui antibiotic au evideniat faptul c genele tyl (aproximativ 9 gene) sunt
grupate, alturi de ele aflndu-se i gena de rezisten (tlrB), precum i o secven de ADN
amplificabil flancat de 2 secvene repetate direct (Baltz i Seno, 1988). De asemenea, s-a stabilit
c pentru exprimarea genei tylF, care codific enzima ce controleaz ultima etap a cii
metabolice de sintez a antibioticului este necesar o protein reglatoare (efector pozitiv)
produs de gena tylG. O situaie asemntoare prezint i genele care codific sinteza
carbomicinei i rezistena la acest antibiotic (Martin i Liras, 1989).
133
Un alt grup de antibiotice derivate de la poliketide este reprezentat de tetracicline i

antracicline, antibiotice intens studiate datorit importanei lor practice deosebite. In urma
examinrii mai multor tipuri de mutante incapabile de a sintetiza oxitetraciclina s-a dovedit c
genele care codific producerea acestui antibiotic se afl localizate n dou grupe plasate opus pe
cromosomul bacterian. Prin clonarea n S.griseus a unor fragmente de ADN izolate de la
S.rimosus s-a reuit identificarea a dou gene responsabile de rezistena la tetraciclin (Ohnuki i
colab., 1985): gena tetA care codific un polipeptid care interfer cu sinteza proteinelor la nivel
ribosomal i gena tetB care determin o acumulare intracelular redus a antibioticului n
celulele productoare. Nu este, ns, clar dac aceste gene se afl localizate la nivelul celor dou
grupuri de gene sau au o alt dispunere. Au mai fost clonate i alte gene de rezisten la
tetraciclin, otcRI i otcRII, dar nu s-a stabilit nc dac aceste gene sunt sau nu identice cu cele
anterioare. Recent, Butler i colab. (1989) i Binnie i colab. (1989), au realizat o serie de
clonri a unor gene implicate n sinteza i rezistena la acest antibiotic i au sugerat faptul c cel
puin o parte, dac nu chiar toate genele structurale care codific sinteza oxitetraciclinei sunt
linkate cu genele de rezisten otcRI i otcRII, formnd, astfel, un singur "cluster".
O grupare asemntoare prezint i genele implicate n biosinteza/rezistena
tetracenomicinei C, un antibiotic antraciclinic produs de S.glaucescens.
Aminoglicozidele reprezint un alt grup de antibiotice intens studiat datorit importanei
practice deosebite. Din acest grup streptomicinei i s-a acordat cea mai mare atenie. Astfel, la
S.griseus, cel mai cunoscut productor al acestui antibiotic, cel puin 13 gene sunt implicate n
biosinteza i rezistena la streptomicin, ele fiind localizate ntr-un singur "cluster" cromosomal
(Mansouri i altii, 1989) (Figura 4).
Figura 4. Reprezentarea schematic a genelor implicate n biosinteza streptomicinei la dou specii de streptomicete:
S.griseus i S.glaucescens.
Ohnuki i colaboratorii (1985) au artat c la S.griseus grupul de gene str este format din
cel puin 4 gene: strR, strA, strB i strC. Gena strA codific enzima streptomicin-6'fosfotransferaza care asigur rezistena la acest antibiotic; strB complementeaz o mutaie la o
tulpin care prezenta deficien n legarea streptidin-6-fosfatului de dihidrostreptoz; strR este o
gen reglatoare care codific un efector pozitiv necesar exprimrii complete a genelor strA i
strB. Rezultate similare au obinut Distler i colab.(1987), care au evideniat c la S.griseus
genele necesare sintezei streptomicinei sunt linkate cu gena aphD care codific pentru enzima
streptomicin 6-fosfotransferaza, gen similar genei sph pentru enzima hidroxi-streptomicin134
fosfotransferaza de la S.glaucescens. Analizele de restricie i studiile de hibridizare a

fragmentelor de ADN de la S.griseus i S.glaucescens au relevat existena, n ciuda unei
omologii de aproximativ 75 % a genelor implicate n biosinteza streptomicinei, a unor diferene
majore, ceea ce sugereaz faptul c, n cursul evoluiei a avut loc o separare a genelor de
biosintez n dou seturi distincte repartizate doar la speciile de Streptomyces (Martin i Liras,
1989).
2.3. Organizarea i exprimarea genelor de biosintez a unor pigmeni de ctre
streptomicete
Streptomicetele pot sintetiza pe lng diferite antibiotice i ali metabolii secundari, cum
ar fi pigmenii, unii dintre acetia manifestnd i o uoar activitate antibiotic. Dintre acetia cel
mai mult studiat este actinorhodinul, un pigment de tip izocromanequinonic, produs de
S.coelicolor printr-o cale poliketidic tipic (Floss, 1981). Pigmentul respectiv produs de
bacteriile cultivate pe mediul R2YE este rou i nedifuzibil la pH neutru dar, dup expunere la
vapori de amoniac devine albastru i difuzibil. In urma cercetrilor efectuate pe diferite tulpini
mutante de S.coelicolor s-a realizat o grupare a acestora n mai multe clase (7) n funcie de
variaiile de exprimare a genelor care alctuiesc "clusterul" act. Rezultatele obinute au permis
elaborarea unei ipoteze referitoare la sinteza unor metabolii secundari de tip poliketidic, innd
cont de marea varietate de asemenea metabolii (macrolide, poliene, polieteri, tetracicline,
antracicline, ansamicine, isocromaquinone etc). Se pare c la toi metaboliii secundari de tip
poliketidic, esterii acil-CoA i -cetoacizii condenseaz mpreun printr-un mecanism de
polimerizare de tip cap-coad, ceea ce conduce la obinerea unor lanuri alifatice de diferite
dimensiuni. Aceste lanuri sufer, ulterior, modificri suplimentare, care le asigur specificitatea
(Hopwood i Sherman, 1990). Dac reacia de condensare realizat prin intervenia unei enzime
de tip -ceto-acil-tioester-sintetaza ("enzima de condensare") este comun tuturor metaboliilor
secundari poliketidici, atunci ar nsemna c ntre secvenele care codific poliketid-sintetazele la
diferite organisme productoare exist o mare omologie care este conservat. Pornind de la o
asemenea ipotez, Malpardita i colab.(1987) au utilizat genele act de la mutantele din clasele I
i III ca probe de ADN n experimentele de hibridizare i au observat c ntre acestea i ADN de
la 14 dintre cei 18 productori de poliketide se produce hibridizare cu intensitate variat, deci
exist omologie. Probele nu au hibridizat cu ADN izolat de la tulpinile care produc tetraciclin,
eritromicin, candicidin i curamicin. Aceste rezultate demonstreaz o corelaie, incomplet,
ntre producerea de poliketide i prezena de secvene de ADN care sunt parial omoloage cu
actinorhodin poliketid-sintetaza. Aceast strategie de hibridizare poate fi extins prin utilizarea
unor probe de ADN a unor secvene care codific diferite sintetaze izolate de la tulpini bacteriene
variate, ceea ce ar permite recunoaterea unor productori criptici ai unor clase de metabolii
secundari particulari. Prin alterarea specificitii de substrat a unor sintetaze specifice utiliznd
mutageneza direct sau recombinarea"in vitro" a genelor care codific pentru aceste enzime pot
fi obinute noi antibiotice cu proprieti speciale.
Alte dou tipuri de pigmeni, metilenomicin produs de tulpini de S.coelicolor i
S.violaceoruber sau undecilprodigiozin produs de S.coelicolor A3(2) au fost studiate cu o
intensitate mai sczut, rezultatele obinute sugernd i n aceste cazuri o grupare a genelor
implicate n biosinteza produilor respectivi (Malpardita i colab., 1990).
Gruparea n "clusteri a genelor care codific ci ale metabolismului secundar reprezint
un fenomen comun pentru numeroase tipuri de substane. In cazul "clusterilor" pentru sinteza
tetra-cenomicinei i actinorhodinului s-a evideniat o subgrupare special a genelor componente
care controleaz momentul apariiei fiecrei enzime n calea metabolic respectiv, astfel nct
intermediarii apar n anumite etape ale reaciilor biochimice. Formarea secvenial a enzimelor
135
este binecunoscut n cile de biosintez a metaboliilor secundari la fungi i streptomicete

(Martin i Liras, 1989). Cuplarea strns a proceselor de transcriere/traducere la streptomicete i
la alte procariote, precum i faptul c genele structurale sunt grupate i ordonate permite ca
enzima obinut n urma acestor fenomene s acioneze asupra produsului enzimei anterioare
(Motamedi i Hutchinson, 1987).
O aciune mai eficient a enzimelor poate rezulta n urma gruprii enzimelor n complexe
enzimatice, fenomen ntlnit n cazul biosintezei gramicidinei,tirocidinei i bacitracinei.
Poliketidele i metaboliii secundari polienici sunt formai prin aciunea unor complexe
enzimatice care cuprind sintetaze specifice.
2.4. Coordonarea exprimrii genelor de biosintez i rezisten
Deoarece genele implicate n biosinteza i rezistena la antibiotice sunt grupate este foarte
probabil s existe o coordonare a exprimrii genelor pentru a nu produce disfuncii. Dac un
metabolit secundar este activ fa de tulpina productoare, mecanismele de protecie (inactivarea
antibioticului sau sporirea eliminrii lui) trebuie s fie induse naintea acumulrii metabolitului
respectiv.
Exist numeroase exemple referitoare la inducerea exprimrii genelor de rezisten la
antibiotice la bacteriile din genul Streptomyces. Astfel, exprimarea genelor de rezisten la
tetraciclin, tetA i tetB de la S.rimosus i S.griseus a fost indus de adugarea de tetraciclin n
mediul de cultur (Ohnuki i colab., 1985). Nivelul rezistenei a crescut de 2 ori atunci cnd s-a
mrit cantitatea de tetraciclin adugat (de la 5 la 50g/ml). Aceasta sugereaz faptul c
inducerea genelor de rezisten protejeaz tulpinile productoare fa de creterea nivelului
antibioticului n timpul cultivrii.
Gena de rezisten la streptomicin (strA sau aphD) de la S.griseus se afl plasat alturi
de genele pentru biosinteza antibioticului i se gsete sub un control dublu, pozitiv i negativ. Ea
este indus de streptomicin, dar nu i de streptavidin. Exprimarea genei strA se afl sub un
control negativ exercitat de o protein represor de 40 KDa codificat de o secven (ORF)
plasat n apropierea acestei gene. De asemenea, ea este stimulat de produsul genei strR care
activeaz n acelai timp i gena strB (gen structural care codific o amidinotransferaz)
(Ohnuki i colab., 1985) (Figura 5).
Figura 5. Model ipotetic al transcrierii genelor implicate n sinteza i rezistena la streptomicin (dup Piepersberg i
colab., 1988).
In mod similar, gena de rezisten la kanamicin clonat de la bacteria productoare

S.kanamyceticus se exprim dup inducere n noile gazde (S.lividans, S.lavendulae sau
S.parvulus) (Nakana i colab., 1984).
S-a dovedit c multe dintre tulpinile de Streptomyces productoare de antibiotice prezint
dou sau mai multe mecanisme de rezisten la antibioticele pe care le produc, probabil ca o
136
modalitate de protecie fa de antibiotice nrudite. Spre exemplu, n cazul tulpinilor de

S.kanamyceticus exist dou mecanisme de rezisten la kanamicin: una este modificarea
ribozomilor, iar cealalt presupune inactivarea antibioticului de ctre o enzim specific (6'-Nacetiltransferaza) (Nakano i colab., 1988). La S.fradiae, la o tulpin industrial au fost
identificate cel puin trei gene diferite care asigur rezistena la tilozin, gene care sunt linkate la
genele de biosintez.
In unele situaii, enzima codificat de gena de rezisten poate ndeplini i alte funcii
catalitice n cadrul cii metabolice de biosintez a antibioticului respectiv. Acesta este cazul
genelor de rezisten la puromicin sau bialafos, care se pare c sunt implicate i n unele dintre
etapele intermediare ale sintezei metabolitului respectiv, ceea ce nseamn c exprimarea genelor
de biosintez i rezisten se afl sub acelai mecanism de reglare.
2.5.
Reglarea exprimrii genelor implicate n metabolismul secundar
Metabolismul secundar este o form de difereniere biochimic a microorganismelor.

Reglarea desfurrii sale este realizat prin diferite mecanisme. Astfel, factorul A este o protein
reglatoare cu efecte pleiotropice care stimuleaz att biosinteza i rezistena la streptomicin, ct
i sporularea la S.griseus i S.bikinensis. Au fost identificate, astfel, mai multe gene ai cror
produi de transcriere controleaz diferite procese. Un exemplu este reprezentat de gena afsA ("A
factor synthesis"), care a fost izolat de la S.bikinensis, i apoi clonat n diferite gazde. O alt
gen, afsB a fost izolat de la S.coelicolor i s-a dovedit c ea codific o protein reglatoare care
stimuleaz att producerea de factor A, ct i a unor pigmeni cum ar fi actinorhodinul i
undecilprodigiozinul.
O situaie interesant o prezint gena saf ("secondary metabolism-acting factor") izolat
de la S.griseus, gen care este implicat ntr-un mecanism de control comun pentru diferenierea
celular, pentru producerea a cel puin patru enzime extracelulare i pentru formarea de pigment
(Martin i Liras, 1989). Secvena aminoacizilor pe care i conine produsul genei saf indic faptul
c acesta interacioneaz cu ADN, secvena respectiv coninnd un domeniu tipic de legare la
ADN. Aceasta nseamn fie c polipeptidele de legare la ADN interacioneaz specific cu
secvene reglatorii ale genelor implicate n metabolismul secundar, fie c ele controleaz
exprimarea genelor care determin formarea factorului A sau a altor efectori pleiotropici,
influennd, astfel, exprimarea grupurilor de gene care codific enzimele metabolismului
secundar.
Genele implicate n biosinteza metabolismului secundar nu sunt exprimate, de obicei, n
culturile cu o rat mare de cretere. Astfel, numeroase sintetaze aparinnd metabolismului
secundar sunt fie inhibate fie represate de nivelul surselor de carbon, fosfor, sau azot n timpul
fazei de cretere a productorilor (Martin, 1989).
Un alt mecanism de coordonare a exprimrii genelor, evideniat iniial la B.subtilis,
E.coli, dar i la alte bacterii, este producerea unor factori sigma sau a altor proteine care modific
specificitatea ARN polimerazei, conducnd la o exprimare selectiv a unor seturi speciale de
gene. Si n cazul streptomicetelor a fost evideniat o heterogenitate a ARN polimerazelor
(Westpheling i col.ab, 1985). Spre exemplu, dou holoenzime de ARN polimeraz (E 35 i E
49) de la S.coelicolor recunosc doi promotori bine definii de la B.subtilis. Promotorii de la
streptomicete sunt destul de variai: unii care prezint conservate regiunile -10 i -35 par a fi
similari celor de la E.coli, n timp ce alii sunt complet diferii (Jansen i colab, 1985). Distana
dintre cele dou regiuni conservate, -10 i -35, este un factor important al determinrii triei
promotorului. Astfel, o distan de aproximativ 17 perechi de baze este corelat cu o activitate
optim a promotorului, n timp ce o distan mai mic de 15pb sau mai mare de 20pb este
asociat cu o scdere a activitii sale.
137
Date recente (Buttner i colab., 1988) indic faptul c gena pentru agaraz (dagA) de la
S.coelicolor care conine patru promotori diferii este transcris de cel puin trei forme diferite
(holoenzime) de ARN polimeraz. Similar, genele galE i galK de la S.lividans sunt transcrise de
dou ARN polimeraze de la nivelul a doi promotori, galP1 i galP2.
Dei existena mai multor factori sigma este bine cunoscut, semnificaia fiziologic a
diferitelor holoenzime de ARN polimeraz rmne nc neclar. La streptomicete multe dintre
secvenele aflate naintea regiunii start a transcrierii unor gene conin doi sau mai muli
promotori dar nu este clar dac toi promotorii funcioneaz "in vivo" (Tomich, 1988).
Recunoaterea difereniat a promotorilor aranjai n tandem de ctre diferite ARN polimeraze
poate explica exprimarea selectiv a anumitor seturi de gene n timpul creterii i diferenierii
morfologice i a altor gene n timpul desfurrii metabolismului secundar. Aranjarea genelor
implicate n biosinteza antibioticelor n grupuri ("clusteri") este deci de mare interes n legtur
cu exprimarea difereniat a genelor.
2.6. Seminificaia biologic a metaboliilor secundari
Semnificaia biologic a metaboliilor secundari produi de diferite microorganisme nu
este nc foarte clar. Sinteza lor ar reprezenta rezultatul unor "erori de metabolism" fr
importan pentru fiziologia microorganismului productor. In legtur cu rolul metaboliilor
secundari au fost avansate numeroase propuneri pornind de la studiul n laborator al activitii
acestor compui. Vining (1990) consider c funciile metaboliilor secundari pot fi grupate n
dou categorii: unele care privesc direct productorul (funcii intrinseci) i altele care asigur
anumite beneficii productorului prin aciunea n exterior, n mediu (funcii extrinseci). In cadrul
funciilor intrinseci, unii metabolii secundari pot fi precursori ai unor componente structurale
cum ar fi de exemplu streptomicina care, se sugereaz c ar fi un constituent al nveliului
mureinic (Szabo i colab., 1989). De asemenea, ali metabolii secundari joac un rol important
n sporulare i n germinarea sporilor la actinomicete i la bacili ca i n diferenierea celular
(Chater, 1989; Maplestone i colab.,1992).
Atunci cnd activitatea metaboliilor secundari este direcionat asupra altor organisme
din mediul nconjurtor, aceste substane pot fi considerate ca "ageni ecologici" asigurnd productorilor supravieuirea n cadrul competiiei cu alte organisme ce populeaz aceeai ni
ecologic. De asemenea, datele obinute pn n prezent n urma analizei secvenei de nucleotide
sprijin conceptul c metabolismul secundar a rezultat n urma modificrilor cilor existente ale
metabolismului primar. Dei secvena de aminoacizi identificat deductiv din secvena de
nucleotide a genelor corespunztoare este suficient pentru a indica o origine comun, pentru ca
datele s fie mai concludente ar fi necesar o comparare a genelor de la specii diferite dect de la
aceeai specie. Informaiile obinute n acest fel sugereaz c transferul natural de gene ntre
diferite organisme a reprezentat un important factor n evoluia metaboliilor secundari. Multe
dintre cile metabolismului secundar pot avea o origine foarte veche, modificrile care apar la
nivelul lor putnd rezulta n urma achiziiilor mai recente de material genetic exogen la nivelul
unor microorganisme productoare.
Pe baza cunotinelor acumulate n domeniu, Vining (1992) stabilete o serie de
caracteristici clare ale metabolismului secundar:
1. metaboliii secundari nu sunt eseniali pentru cretere i tind s fie specifici de tulpin;
2. aceti compui au o mare varietate de structuri chimice i activiti biologice;
3. metaboliii secundari deriv din intermediari ai metabolismului primar prin ci de
biosintez unice. Aceste ci sunt deseori lungi i complexe; reaciile biochimice sunt catalizate
de enzime cu specificitate de substrat diferit de cea a enzimelor echivalente ale metabolismului
primar;
138
4. formarea metaboliilor secundari este determinat de seturi de gene asociate supuse

unui mecanism de reglare care se refer att la nivelul exprimrii genelor ct i la momentul
declanrii acesteia;
5. mecanismele de control este bine integrat cu fiziologia organismului productor.
Relativ recent, Davies (1990) a propus ideea c metaboliii secundari sunt substane cu
origine foarte veche i c muli dintre ei exercit activiti biologice cunoscute (cum sunt
antibioticele) datorit interaciunii cu anumite situsuri vechi, conservate ale diferitelor
macromolecule. Aceasta nseamn c metaboliii secundari au jucat un rol important n evoluia
reaciilor biochimice, nainte ca enzimele s fie disponibile. Spre exemplu, reaciile de biosintez
erau catalizate sau modulate de molecule cu greutate molecular mic care erau prezente n
atmosfera Pmntului sau erau produse n "supa primordial". Odat ce sistemul de traducere a
evoluat iar proteinele au nceput s fie produse i s exercite diferite funcii, rolul produilor cu
greutate molecular mic a fost nlocuit de mecanisme mai complexe n care sunt implicate
polipeptidele, dar acetia i-au meninut capacitatea de a interaciona cu anumite situsuri
receptoare din macromolecule (acizi nucleici sau proteine).
Conceptul rolului cheie primordial al moleculelor cu greutate molecular mic ca efectori
(stimulatori) ai biosintezelor sugereaz o nou abordare a modalitilor de screening pentru
diferite activiti farmacologice. In locul urmririi exclusive a efectelor inhibitorii este necesar s
se studieze activitatea stimulatoare fie a unor celule ntregi fie a unor extracte celulare
(Murakama i colab.,1989). Numeroase organisme (poate chiar toate) produc compui cu
greutate molecular mic cu activitate antibiotic, cum ar fi de exemplu defensinele (Gabai i
colab., 1989). In acest sens, microorganisme de tipul streptomicetelor sunt neobinuite n sens
evolutiv deoarece ele i-au dezvoltat i meninut cile necesare pentru a produce o gam foarte
larg de compui cu greutate molecular mic atunci cnd sunt cultivate n mod corespunztor.
Aciunea acestor compui este foarte variat, ei inhibnd de obicei desfurarea unor procese
biochimice diferite. Studii mai amnunite asupra activitii acestor substane antibiotice a
evideniat ns c multe dintre ele au efect stimulator asupra transferului de gene
(aminoglicozidele, penicilinele, tetraciclinele), asupra transpoziiei (tetraciclina), transcrierii
(eritromicina, tiostreptonul), creterii celulare (kanamicina, streptomicina, eritromicina) sau
mutagenezei (streptomicina). Pornind de la aceste observaii, Davies (1990) propune c efectorii
cu greutate molecular mic i situsurile lor de aciune dateaz dinaintea stabilirii rolului
proteinelor, dei aciunea lor este mai puin eficient i are o specificitate sczut. Odat ce
organismele devin din punct de vedere genetic i biochimic mai evoluate, rolul efectorilor cu
greutate molecular mic este preluat de proteine care asigur o eficien i specificitate de
aciune ridicat.
3. Enzime produse de bacteriile din genurile Bacillus si

Streptomyces
Dei streptomicetele produc mai mult de 60% dintre antibioticele cunoscute, exist
relativ puine date referitoare la echipamentul enzimatic al acestor bacterii. Tinnd cont de faptul
c streptomicetele sunt microorganisme din sol unde exist o mare varietate de posibile
substraturi nutritive, este logic de presupus c aceste bacterii prezint o mare varietate de ci
metabolice putnd sintetiza unii intermediari prin ci diferite. Cile metabolice alternative fac
posibil utilizarea eficient a celor mai multe substrate disponibile (Behal, 1986).
In ultimii ani bacteriile din genul Streptomyces constituie un serios subiect de studiu din
punctul de vedere al enzimelor pe care le produc, multe dintre ele fiind de importan
biotehnologic (proteaze, amilaze, glucoz-izomeraze, celulaze, hemicelulaze, endonucleaze,
chitinaze etc. Mai mult, s-a dovedit c cel puin unele dintre aceste enzime sunt produse simultan
cu unele antibiotice (tabelul 2) (Pokorny i Vitale, 1980).
139
Unele dintre enzimele sintetizate de ctre streptomicete sunt sau pot fi folosite n practica
medical fie n stabilirea unor diagnostice fie n terapie. Acesta este cazul colesterol-oxidazei
produs de unele specii de Streptomyces i Nocardia care este utilizat pentru dozrile de
colesterol din ser, sau al urat-oxidazei produs de S.cyanogenus care poate fi utilizat pe scar
larg pentru detectarea enzimatic a acidului uric (Srinivasan i colab., 1991).
Producerea enzimelor hidrolitice de ctre streptomicete depinde n mare msur de
substratul pe care acestea sunt cultivate astfel c datele prezentate n Tabelul 2 pot fi completate
i cu alte tipuri de enzime. Uneori ns, datorit scopului n care enzimele ar putea fi utilizate (de
exemplu n industria alimentar) se prefer utilizarea unor tulpini bacteriene productoare care
ns s nu sintetizeze substane toxice sau potenial toxice (cum sunt de altfel antibioticele)
Tabelul 2. Enzime entracelulare produse de unele bacterii productoare de antibiotice
Specia bacterian
S.griseus
S.rimosus
S.aureofaciens
S.fradiae
S.antibioticus
S.venezuelae
B.licheniformis
B.subtilis
Antibioticul
streptomicina
oxitetraciclin
tetraciclina
neomicina
oleandomicina
cloramfenicol
Bacitracina
Bacitracina
Enzimele detectate
proteaze, elastaze, amilaze, peptidaze
proteaze, elastaze,
proteaze, amilaze
proteaze, elastaze, keratinaze
proteaze, amilaze
Proteaze
Proteaze
Proteaze
De asemenea, studii recente au demonstrat posibilitatea utilizrii bacteriilor din genul

Streptomyces pentru clonarea unor gene cu origine diferit i pentru producerea proteinelor
corespunztoare (Erpicum i colab., 1990). In plus, metaboliii secundari ai acestor bacterii ofer
avantajul exprimrii (sintezei) prelungite a unui produs i dup faza iniial de cretere a culturii
(Gardner i Cadman, 1990).
In cazul enzimelor produse de bacteriile din genul Bacillus, aplicaiile practice sunt bine
cunoscute, ele fiind prezentate pe scurt n Tabelul 3.
Tabelul 3. Tipuri de enzime hidrolitice produse de bacili i principalele aplicaii ale acestora
Enzima
Proteaze alcaline
Tipul enzimei
Extracelulare
Proteaze neutre
Extracelulare
-amilaze
Extracelulare
-amilaz
Extracelulare
Celulaze
Extracelulare
Specia productoare
B. subtilis
B. pumillus
B. amylosacchariticus
B. licheniformis
B.subtilis
B. amyloliquefaciens
B. thermoproteolyticus
B. amylosacchariticus
B. stearothermophilus
B. cereus
B. subtilis
B.licheniformis
B.coagulans
B. stearothermophilus
B. cereus var.mycoides
B. polymyxa
B.circulans
B. megatherium
B. cereus var.mycoides
B.subtilis
B.polymyxa
140
Utilizri
detergeni
industria alimentar
industria pielriei
Industria berii
Industria alimentar
Industria alimentar
degradarea amidonului
industria alimentar
degradarea amidonului
Industria alimentar
Industria textil
B. licheniformis
B. cereus
Industria celulozei i hrtiei

Zootehnie
Tratarea deeurilor agricole
Datorit acestor considerente o trecere n revist a principalelor tipuri de enzime (cu

posibil valoare biotehnologic) este nu numai interesant ci i necesar.
3.1. Proteaze
Proteazele microbiene constituie un grup complex de enzime hidrolitice, care difer
prin specificitatea de substrat, mecanism de reacie, dependena activitii enzimatice i
stabilitii n funcie de pH i temperatur. Aciunea lor poate fi blocat, activat, sau inhibat
ntr-o anumit proporie de ageni fizici, chimici sau biologici. Producia i caracteristicile
enzimelor microbiene pot fi influenate prin selecia tulpinii productoare i alegerea
condiiilor de cultivare ale acesteia.
Enzimele din categoria proteazelor hidrolizeaz majoritatea proteinelor comune cum
ar fi: caseina, hemoglobina, gelatina, albumina de ou, glutenul, proteina din soia i alte
proteine vegetale i animale. Condiiile de hidroliz precum i randamentul operaiei n sine
depind ns de natura, caracteristicile i gradul de puritate al preparatului proteolitic utilizat.
Numeroasele utilizri ale enzimelor proteolitice, n cele mai diferite domenii de activitate
(industria alimentar, farmaceutic, agricultur, industria detergenilor, medicin) au
determinat demararea cercetrilor n vederea obinerii acestora pe cale biotehnologic innd
seama n acelai timp de avantajele pe care le ofer utilizarea microorganismelor ca surs
biologic, precum i de proprietile enzimelor microbiene.
Proteazele reprezint un grup de enzime hidrolitice, de obicei extracelulare, care
scindeaz molecula proteic n fragmente polipeptidice formate din civa aminoacizi unii prin
legturi peptidice. Aceste polipeptide pot fi n continuare degradate de ctre peptidaze pn la
aminoacizii componeni. Peptidazele, n funcie de modul lor de aciune sunt de dou tipuri:
endopeptidaze i exopeptidaze. La rndul lor exopeptidazele pot fi: aminopeptidaze care i ncep
aciunea de la nivelul extremitii NH2 libere a polipeptidului, activitatea lor depinznd de
prezena unor ioni metalici; carboxipeptidaze care i ncep atacul de la captul COOH liber al
peptidului (Scriban, 1988).
Clasificarea enzimelor proteolitice se face, conform recomandrilor International Unit of
Biochemistry n ase familii, diferenele dintre ele datorndu-se secvenelor de aminoacizi care
alctuiesc situsul activ (Tabelul 4) (Neurath, 1989).
Tabelul 4. Familii de enzime proteolitice (dup Neurath, 1989)
Familia
Proteaze reprezentative
Resturi caractiristice de
aminoacizi ale situsului activ
Serin proteaze I
Chimiotripsina, tripsina, elastaza,
Asp102Ser195His57
kalikreina,pancreatina
Serin proteaze II
Subtilizina
Asp32Ser221His64
Cistein proteaze
Papaina, actinidin, catepsina B i H de
Cys25His159Asp158
la obolan
Aspartic proteaze
Penicilopepsin, renina, proteaze acide
Asp33Asp213
de la Rhizopus sp.
Metaloproteaze I
Carboxipeptidaza A bovin
Zn, Glu270 Try248
Metaloproteaze II
Termolizina
Zn Glu143His231
Membrii fiecrei familii se crede c au rezultat dintr-o form ancestral comun, n urma
unui proces evolutiv divergent. Din datele prezentate n tabelul 2 se remarc faptul c serin
141
proteazele includ dou familii distincte: serin-proteazele de la mamifere i cele de origine

bacterian. Dei prezint un mecanism enzimatic comun, cele dou familii de serinproteaze
difer ca secven de aminoacizi i ca structur tridimensional.
In mod similar, metalopreoteazele includ i ele tot dou familii n funcie de originea lor
i de structura chimic: de la mamifere i de la bacterii. Exist i alte enzime proteolitice
identificate la diferite grupe de organisme care nu pot fi ncadrate nc n nici una dintre grupele
de mai sus deoarece mecanismul lor de aciune i situsul activ nu este cunoscut cu exactitate.
Acesta este cazul colagenazelor i aminopeptidazelor.
Proteazele bacteriene produse de tulpini de Bacillus subtilis sunt amestecuri de
proteaze alcaline (subsubclasa 3.4.21, proteaze serinice) i proteaze neutre (subsubclasa
3.4.24, metaloproteaze).
Proteazele serinice au n centrul lor activ serina i histidina. Acest grup a fost divizat
de Morihara n alte 4 subgrupe:
proteaze similare tripsinei;
proteaze alcaline;
proteaze Myxobacter -litice;
proteaze stafilococice.
Proteazele similare tripsinei cuprind, n afar de tripsin i chimotripsin, enzime
produse de specii de Streptomyces, care hidrolizeaz legturile Arg22 Gly23 i Lys 29 Ala30
din lanul -insulinic, aceast specificitate de substrat fiind trstura distinctiv.
Aceste enzime acioneaz la pH 8,0, au temperatura optim de cataliz 50C, sunt
inhibate de diizopropilfluorfosfat (DIFP), pcloromercurilbenzoic (PCMB), tosyl-L-lizinclorometilceton (TLCK), tripsin-inhibitorul din soia. Activitatea lor nu este influenat de
etilendiaminotetraacetat (EDTA) i acid iod-acetic (IAA), n plus prezint i activitate
esterazic i amidazic.
A doua grup de proteaze serinice sunt proteazele alcaline; acestea pot fi produse de
bacterii, drojdii i fungi fiind prezente i n esuturile animale. n aceast grup se ncadreaz
i proteazele alcaline produse de unele tulpini de B.subtilis i cele fungice din Aspergillus
oryzae.
Aceste proteaze au aciune specific fa de resturile de aminoacizi aromatici sau
hidrofobi care particip cu gruparea carboxil la legtura care se scindeaz; valoarea optim a
pH este cuprins ntre pH 9 i pH 11, dar enzimele rmn active n domeniul de pH 59; aceste
proteaze sunt inhibate de DIFP, de PMSF fiind ns rezistente a aciunea EDTA sau
ortofenantrolinei. Din acest grup fac parte proteazele cunoscute sub denumirea de subtilizine
sau subtilopeptidaze. S-a constatat c aceste proteaze nu sunt exclusiv produse de B.subtilis ci
n general de bacterii ale genului Bacillus astfel nct s-a propus numele generic de
bacilopeptidaze. Respectivele enzime pot fi clasificate n dou grupe:
Bacilopeptidaze A care cuprind subtilizina Carlsberg (proteaza alcalin produs de
tulpini de B.licheniformis) i proteaza alcalin produs de B.pumilis;
Bacilopeptidaze B care includ subtilizina NOVO (proteaz alcalin sintetizat de
B.subtilis NRRL B3411) i subtilizina BNP (Bacterial Protease Nagarse), proteaz
alcalin din B. subtilis var. amylosacchariticus.
Metodele de examinare a amestecurilor de enzime produse de diferii bacili au artat
c bacteriile productoare de bacilopeptidaze A nu sintetizeaz proteaze neutre sau amilaz, n
timp ce bacteriile productoare de bacilopeptidaze B sintetizeaz n acelai timp i proteaze
neutre i amilaz n acelai timp.
Metaloproteazele sunt proteaze activate de ionii metalici legai de centrul activ al
enzimei (Ca2+, Zn2+, Mg2+, Fe2+). Ele pot fi metaloproteaze neutre i metaloproteaze alcaline.
Proteazele neutre conin de obicei Zn i prezint specificitate fa de aminoacizii hidrofobi
142
implicai cu gruparea amino n legtura peptidic. Ele au un pH optim de aciune cuprins ntre
pH 7 i pH 8, sunt inhibate complet de EDTA (care complexeaz atomul de Zn din structur)
fiind sensibile la concentraii de EDTA sub 10-3M, orto-fenantrolin, nefiind afectate de DIFP
i PCMB.
Metaloproteazele alcaline conin, de asemenea, un ion metalic implicat n mecanismul
de reacie catalitic. Ele i manifest activitatea optim n domeniul de pH 79, fiind mai
puin inhibate de EDTA dect proteazele neutre, necesitnd concentraii mai ridicate de 10 -2 M
pentru inactivare.
Proteazele neutre produse de Bacillus subtilis var. amylosacchariticus sunt diferite de
proteazele neutre produse de Bacillus subtilis NRRL B3441 i din acest motiv este necesar
specificarea exact a provenienei proteazei neutre respective. Producerea lor este supus
represiei exercitate de prezena n mediul de incubare a unor aminoacizi n cantitate mai mare
(Bawden i colab.,1987). Aceste enzime sunt folosite n prezent la fabricarea detergenilor la
tratarea pieilor n industria pielriei, frgezirea crnii, eliminarea depozitelor proteice din
buturile fermentate (Sasson, 1988). La aceste bacterii s-au realizat i numeroase studii
referitoare la determinismul genetic i controlul producerii i excreiei acestor enzime n scopul
obinerii prin clonare a unor tulpini superproductoare (Mc Connell i colab., 1986).
S-a dovedit faptul c producerea de proteaze este supus unor mecanisme reglatoare
complexe, ntre care un rol cheie este jucat de sistemul DegS-DegU precum i de factorii de
reglare DegR and DegQ (Nagami and Tanaka, 1986; Tanaka et al., 1987; Ogura et al., 1994).
Aceti factori reglatori se pare c sunt implicai n superproducia de proteaze cel puin n
cazul unor tulpini de B.subtilis. De asemenea, relativ recent, Ogura et al (1994) au caracterizat
alte dou gene: proB (ce codific sinteza -glutamil kinazei) i proA (codific sinteza
glutamil--semialdehid dehidrogenaza) ale cror produi par a fi implicai n sporirea
capacitii de biosintez a exoproteazelor la o tulpin de B.subtilis. Astfel, cele dou gene au
fost clonate ntr-un vector e clonare (pLC1) i apoi introduse, mpreun cu un alt vector
(pNC61) ce conine gena reglatoare prtR (degR) ntr-o tulpin de B.subtilis. Transformanii
obinui au prezentat o activitate proteolitic mai mare dect a tulpinii parentale.
Date fiind aplicaiile practice ale acestor enzime extracelulare, preocuprile
cercettorilor vizeaz sporirea nivelului de biosintez ca i mrirea stabilitii enzimelor n
diferite condiii experimentale. Aceste deziderate se pot realiza pe mai multe ci, printre care
cele ce utilizeaz metodele clasice de ameliorare a microoganismelor (prin tratament cu ageni
mutageni) i cele moderne, de inginerie genetic (fuziunea de protoplati i tehnologia ADN
recombinant).
Conform datelor de literatur, mutagenii cei mai eficieni sunt nitrosometiluree,
nitrosoguanidina, dietilsulfatul, precum i ageni fizici de tipul radiaiilor X sau a radiaiilor .
Astfel, prin mutagenez s-a reuit ridicarea nivelului de biosintez a tulpinilor de B.subtilis de
aproximativ 8-10 ori.
n cel de-al doilea caz, majoritatea tulpinilor superproductoare de proteaze care
prezint anumite caracteristici s-au obinut prin inginerie genetic. Astfel, sunt foarte
cunoscute rezultatele obinute de cercettorii japonezi care, pornind de la tulpini slbatice de
B.thermoproteolyticus i B.stearothermophilus au reuit obinerea de tulpini productoare de
termolizin, o proteaz foarte diferit de celelalte proteaze neutre n ceea ce privete
termostabilitatea i mecanismul de aciune. n prezent, cunoscndu-se structura termolizinei
precum i genele rspunztoare de caracteristicile sale deosebite, se ncearc obinerea de
tulpini de B.subtilis, B.stearothermophilus modificate genetic, capabile s produc proteaze
termostabile sau stabile la valori diferite ale pH sau la aciunea unor ageni inhibitori.
In cazul bacteriilor din genul Streptomyces examinarea lichidelor de cultur a unor tulpini
productoare de antibiotice a dus la evidenierea prezenei unui amestec de enzime dintre care,
143
un loc important din punct de vedere cantitativ l ocup proteazele (neutre i alcaline) i
peptidazele (aminopeptidaze) (Pokorny i Vitale, 1980).
Vitale i colab.(1980) au reuit izolarea din filtrat de cultur de S.rimosus a unei serin
proteaze care a prezentat un pH optim de aciune cuprins ntre 7 i 9 i al crei substrat de aciune
este reprezentat de proteine sau de peptide mari, hidroliznd n general esterii terminali simpli.
Recent, Renko i colab.(1989) au prezentat particularitile unei proteaze de tip tripsinic
("trypsin-like proteinase") izolat tot din filtrat de cultur de S.rimosus evideniind faptul c
aceasta este o proteaz alcalin, sensibil la aciunea inhibitorului proteazic PMSF (specific
pentru serin-proteaze) ca i la cea a -antitripsinei. Aceste enzime au activitate arginilaminopeptidazic att asupra proteinelor ct i asupra peptidelor mai mici. Enzime similare au
fost izolate i caracterizate i de la alte specii de Streptomyces: S.fradiae, S.paromomycinus,
S.moderatus, S.hygroscopicus etc. O situaie oarecum special o prezint S.griseus care produce
un amestec de proteaze neutre i alcaline, produsul obinut fiind denumit pronaz, el fiind studiat
mai intens n scopul elucidrii mecanismului de aciune i a omologiei sale cu tripsinele
vertebratelor (Read i colab.,1984).
Aceste studii au importan att teoretic prin contribuiile aduse la nelegerea unor
aspecte evolutive, a taxonomiei serin-proteazelor dar i practic, aceste enzime putnd nlocui
tripsina n anumite reacii biochimice.
S-a dovedit de asemenea c unele specii de streptomicete, cum ar fi de pild S.rimosus,
pot produce i o alt categorie de proteaze: metaloproteaze (Vitale i colab.,1987). Aceste enzime
sunt fie bazice fie neutre, fiind activate de ionii de calciu, mangan sau zinc, stabilizate de ionii de
calciu i inhibate de EDTA. Metaloproteazele alcaline acioneaz doar asupra proteinelor, nu i
asupra peptidelor n timp ce metaloproteazele neutre degradeaz n egal msur proteinele i
peptidele. In cazul acestora din urm aciunea enzimatic se manifest la extremitatea COOH,
ceea ce permite ncadrarea lor printre dipeptidil-carboxipeptidaze. De asemenea, s-a reuit
izolarea de la mai multe specii de Streptomyces (S.rimosus, S.fradiae, S.peptidofaciens,
S.griseus) a unor peptidaze care, pe baza proprietilor specifice (specificitatea de substrat,
inhibarea de ctre EDTA, activare de ctre ionii de calciu, magneziu, prezena leucinei la captul
NH2 terminal) au fost identificate ca fiind leucin-amino-peptidaze (Vitale i colab.,1986).
Tinnd cont c n ultima vreme streptomicetele au nceput s fie utilizate drept gazde
pentru clonarea de material genetic heterolog, este interesant de tiut dac tulpinile utilizate de
obicei drept acceptori elaboreaz sau nu proteaze. Producerea unor asemenea enzime la aceste
tulpini constituie un serios impediment n obinerea produsului dorit. Pornind de la aceast idee,
Aretz i colab.(1989) au studiat prezena enzimelor proteolitice la tulpina S.lividans TK24,
tulpin recombinat obinut pentru prelucrarea i secretarea unei proteine de fuziune (ntre
inhibitorul -amilazei de la S.tendae i proinsulina de la maimua Macacca fascicularis). Dup
purificarea prin cromatografie pe schimbtori de ion au fost separate mai multe tipuri de enzime
proteolitice: alanin-aminopeptidaze, leucin-aminopeptidaze, proteaze de tip tripsinic i proteaze
de tip chimiotripsinic. Dintre acestea, proteazele de tip chimiotripsinic ("chemo-trypsin-like")
sunt cele care degradeaz proteina de fuziune dar aceast aciune poate fi inhibat prin adugarea
n mediul de cultura unor sruri de zinc sau nichel.
Dac n cazul bacililor au fost izolate i clonate genele ce codific sinteza a dou
subtilizine i a unei proteaze neutre (Mc Connell i colab.,1986), n cazul bacteriilor din genul
Streptomyces studiile referitoare la determinismul genetic al producerii de proteaze sunt mult mai
puine. Astfel, Duez i colab.(1987) au reuit izolarea, clonarea i secvenierea genei pentru o
peptidaz extracelular de la Streptomyces sp.R61 la S.lividans, iar Henderson i colab.(1987) au
caracterizat genele pentru proteazele A i B de la S.griseus.
In cazul unor tulpini de streptomicete au fost evideniate unele enzime proteolitice care
degradeaz preferenial colagenul ("collagenase-like")(Mukhopadhyay i Chandra, 1987). Dei
nu au fost izolate i purificate (s-au utilizat filtrate de cultur) enzimele de tip colagenaze de la
144
Streptomyces au evideniat o activitate specific pe colagen din tendon bovin i piele de viel, la
280 C i pH 7,2-7,5, fiind inhibate de EDTA i azid de sodiu. Dei neobinuit, producerea unor
asemenea enzime de ctre streptomicete nu este surprinztoare dac ne gndim la multitudinea
de substrate nutritive pe care aceste bacterii le pot gsi n sol.
3.2. -Amilazele
-Amilazele (1,4--D-glucan-glucanhidrolaza, EC 3.2.1.1.) sunt larg rspndite n rndul
microorganismelor, att la fungi ct i la bacterii, mai ales la specii ale genurilor Bacillus i
Streptomyces, aciunea lor constnd n hidroliza legturilor -1,4-glicozidice de la nivelul
amidonului, elibernd maltoza. Cel mai mult studiate i utilizate n practic sunt -amilazele
produse de speciile de Bacillus (B.amilolyquefaciens, B.licheniformis, B.stearothermophilus,
B.subtilis etc). Aceste bacterii produc dou tipuri de -amilaze: de lichefiere a amidonului
(degradarea amidonului pn la maltodextrine) i de zaharificare (convertesc maltoza la
glucoz). -Amilazele produse de tulpinile de B.licheniformis prezint un interes special datorit
rezistenei lor la temperaturi ridicate (85-1150C). In general, enzimele respective sunt utilizate n
practic n lichefierea amidonului n industria distilatelor ca i n industria textil (Zarnea i
colab.,1980).
O serie de studii genetice realizate prin experimente de mutagenez sau prin clonri de
gene au evideniat faptul c gena pentru -amilaz de la B.subtilis se afl sub un control genetic
complex care este ns puin cunoscut la nivel molecular (Mc Connell i colab.,1986). Se pare
ns c exist mai multe gene reglatoare cu efecte pleiotropice (sacU, sacQ, prtR) care intervin n
exprimarea genei pentru -amilaz, levansucraz, serin proteaz, proteaze neutre i -glucanaz
(Priest, 1987).
In cazul streptomicetelor au fost izolate i caracterizate -amilaze de la mai multe specii,
acest tip de enzime prnd a fi sintetizat practic de majoritatea bacteriilor aparinnd acestui
grup. O atenie special a fost acordat -amilazei produs de S.hygroscopicus (Hoshiko i
colab.,1987), S.limosus (Virolle i Bibb, 1988) i S.venezuelae (Virolle i colab.,1988) la aceste
specii fiind studiat i genele ce codific sinteza i reglarea sintezei acestor enzime. De asemenea,
s-au efectuat experimente de clonare a genelor respective n diferite gazde (E.coli, S.lividans) n
scopul obinerii unor tulpini superproductoare de interes industrial. Pe lng aspectul practic al
cercetrilor de acest tip, ele mai pot oferi o serie de informaii referitoare la modul de exprimare
i reglare a funciilor genelor de la streptomicete (n particular a genelor pentru -amilaz). Mai
mult, rezultatele obinute au permis o comparare a enzimelor de tip -amilaz produse de
streptomicete cu cele produse de alte organisme, n special cu cele produse de eucarioate (Mac
Gregor, 1988).
S-a dovedit c S.hygrosopicus produce o -amilaz care degradeaz amidonul pn la
maltoz, aciunea sa fiind de tip endoglucanolitic (taie legturile -1,4 glicozidice din interiorul
lanului polizaharidic). Compararea secvenei de aminoacizi pe care aceast enzim o conine cu
cele ale altor enzime de acest tip, fie de la procariote (de la bacili) fie de la eucariote (de la
Aspergillus oryzae, A.nidulans, Hordeum vulgare, Drosophila melanosgaster etc) a evideniat
faptul c exist trei regiuni care sunt conservate la toate aceste enzime, indiferent de origine
(Ihara i colab.,1985). Cu toate acestea, -amilaza de la S.hygroscopicus este unic deoarece
conine triptofan la nivelul celei de-a treia regiuni conservate (Mac Gregor, 1988).
Experimentele de clonare a genei amy de la S.hygroscopicus n alte gazde cum ar fi
E.coli i S.lividans au evideniat faptul c, dei transferul genei s-a realizat eficient, exprimarea
sa variaz n funcie de gazd i de numrul de copii ale genei respective (efectul de dozare a
genei). Hoshika i colab. (1987) utiliznd cartarea cu o nucleaz specific ("mung bean
nuclease") au determinat faptul c gena amy de la S.hygroscopicus prezint trei situsuri de
145
iniiere a transcrierii (trei promotori): amyP1, amyP2 i amyP3, care au asemnri mai mult sau
mai puin extinse cu promotorii altor gene de la Streptomyces (endoH, ermP1, aphP1).
Studii similare au fost fcute i cu gena pentru -amilaz (aml) de la S.limosus i
S.venezuelae. In cazul tulpinilor de S.venezuelae analizate s-a observat c exprimarea genei aml
este represat puternic de glucoz n timp ce asupra exprimrii genei similare de la S.limosus
glucoza nu are efect. Exprimarea acestei gene este ns influenat (represat) puternic de
manitol (Virolle i colab.,1988). Interesant este c prin clonarea genei aml de la S.limosus n
S.lividans exprimarea genei este puternic represat de glucoz n noua gazd (Virolle i Bibb
1988). Acesta nseamn c rezistena la aciunea glucozei evideniat la tulpinile de S.limosus
analizate este mai degrab o particularitate a bacteriei dect a genei pentru -amilaz. De
asemenea, n urma comparrii secvenei de aminoacizi a acestei proteine cu proteine similare de
la eucariote s-a observat o omologie ridicat cu -amilaza produs de Drosophila melanogaster
(>40%), Mus musculus (36,8%), Aspergillus nidulans (36,1%) i mai mic cu enzimele similare
de la B.subtilis (22,6%) i B.amylolyquefaciens (16,1%)(Long i colab.,1987).
3.3. Glucoz-izomeraza
In ultimii ani, de mare interes n Japonia, SUA i Frana este obinerea siropurilor cu
coninut ridicat de fructoz din hidrolizate de amidon n urma aciunii glucoz-izomerazei (xilozoizomeraza, EC 5.3.1.5.). Printre productorii recunoscui de asemenea enzime se numr i
unele specii de streptomicete: S.violaceoniger i S.olivochromogenes. Suekane i Iizuka (1982),
n cadrul unor cercetri legate de producerea de glucoz-izomeraz de ctre streptomicete au
evideniat faptul c abilitatea de a converti glucoza la fructoz este larg rspndit ntre bacteriile
acestui gen. Localizarea acestei enzime este att intracelular (cea mai mare parte) dar i
extracelular.
Experimentele lui Szentirmai i colab.(1986) au evideniat faptul c, cel puin n cazul
S.matensis, glucoz-izomeraza intracelular difer de cea extracelular din punctul de vedere al
greutii moleculare. De asemenea, s-a observat c utilizarea ca surs de azot a unei combinaii
de glicocol i sulfat de amoniu i adugarea xilozei i a ionilor de cobalt (de magneziu sau
mangan n cazul altor specii bacteriene) duce la stimularea producerii de enzim la
S.olivochromogenes, S.flavogriseus sau S.violaceoniger (Chen i colab.,1979; Sicard i colab.,
1990).
Park i Toma (1974) au observat c la unele tulpini de streptomicete exist o interrelaie
ntre producerea de glucoz-izomeraz i cea de xilanaz, n funcie de sursa de carbon utilizat
pentru cultivarea bacteriilor respective. Utilizarea unui mediu de cultur ce conine fie xilan fie
glucoz ca surs de carbon determin producerea de glucoz-izomeraz n timp ce xilanaza este
produs doar de bacteriile crescute pe mediu cu xilan, nu i pe cel ce conine glucoz.
Datorit importanei practice deosebite a acestei enzime, n ultimii ani au fost realizate
studii referitoare la determinismul genetic al sintezei glucoz-izomerazei ca i la controlul acestei
sinteze, scopul fiind acela al obinerii prin tehnici de inginerie genetic a unor tulpini capabile de
a sintetiza noi tipuri de glucoz-izomeraze cu proprieti modificate, cu aciunea mai eficient.
Utilizarea D-xilozei ca surs de carbon de ctre bacterii se realizeaz pe o cale metabolic
ce presupune transportul prin membrana plasmatic, izomerizarea la D-xiluloz i apoi
fosforilarea acesteia cu ajutorul xiluloz-kinazei cu formarea de D-xiluloz-5-fosfat. Intermediarul
fosforilat este apoi metabolizat fie pe calea pentozo-fosfailor fie pe calea Embden-Meyerhoff.
Pornind de la aceste date s-a determinat faptul c operonul xyl de la streptomicete (de la
S.violaceoniger n particular) este alctuit din cel puin trei gene: xylA care codific pentru
sinteza xiloz-izomerazei, xylB care codific xiluloz-kinaza i xylX care determin sinteza unei
proteine reglatoare. In cazul acestor bacterii s-a evideniat o situaie interesant: genele xylA i
xylB plasate apropiat una de cealalt pe cromosomul bacterian prezint o orientare diferit,
146
exprimarea lor datorndu-se unor promotori divergeni plasai n regiunea dintre cele dou gene
(Tiraby i colab.,1989). Produsul genei xylX pare a fi o protein reglatoare care controleaz att
exprimarea celor dou gene cu orientare opus ct i propria sa sintez.
Experimentele de clonare care se realizeaz n diferite laboratoare ncearc, pe de o parte
stabilirea cu precizie a genelor ce alctuiesc operonul xyl la streptomicete i modul de reglare a
exprimrii lor att n tulpina de origine ct i n diferite tulpini gazd n care genele respective au
fost clonate, i, pe de alt parte s se construiasc "in vitro" tulpini recombinate genetic capabile
de a sintetiza glucoz-izomeraz cu proprieti ameliorate (de exemplu termostabil) (Sicard i
colab, 1990). Rezultatele obiute pn n prezent sunt promitoare, cercetrile fiind continuate
pe direciile menionate mai sus.
3.4. Celulazele
Biomasa vegetal reprezint sursa major de carbon n ecosistemele terestre astfel c este
fireasc presupunerea c multe dintre microorganismele care populeaz aceste ecosisteme s fie
capabile s degradeze aceste substrate, deci s sintetizeze enzime de timpul celulazelor i
hemicelulazelor. Actinomicetele i n mod special bacteriile din genul Streptomyces constituie un
grup important care intr n alctuirea populaiilor microbiene respective (Mc Carthy i
Williams, 1992).
Celuloza este un polimer neramificat de glucoz compus din uniti de anhidro Dglucoz unite prin legturi 1,4--D-glucozidice. Aceste legturi pot fi hidrolizate de ctre
enzimele celulozolitice. De obicei celuloza este foarte rezistent la hidroliz datorit gradului
ridicat de cristalinitate, rezultatul unei conformai lineare (paralele) care permite realizarea unor
puternice legturi de hidrogen ntre gruprile OH ale lanurilor paralele vecine. In fibrele de
celuloz regiunile cu structur nalt cristalin coexist cu regiunile cu structur amorf iar cele cu
un raport favorabil zonelor cristaline prezint o rezisten crescut la aciunea enzimatic.
Celuloza, aa cum se gsete n natur este un homopolimer cu greutate molecular mare,
insolubil i adesea n asociere intim cu lignina, hemiceluloza la nivelul peretelui celular vegetal
fapt ce o face puin accesibil degradrii enzimatice (Robson i Chambliss, 1989).
Toate organismele care degradeaz celuloza cristalin secret sisteme enzimatice mai
mult sau mai puin complexe care sunt alctuite din enzime cu diferite modaliti de aciune,
specificitate de substrat i care acioneaz de obicei sinergic pentru a hidroliza celuloza. Cel mai
bine studiat sistem celulazic este cel de la fungi (de la Trichoderma reesei), enzimele care l
alctuiesc fiind grupate n trei categorii:
- exo--1,4-glucanaze sau celobiohidrolaze (EC 3.2.1.91.)
- endo--1,4-glucanaze sau endocelulaze (endoglucanaze)(EC 3.2.1.4.)
- -glucozidaza sau celobiaza (EC 3.2.1.21.)
Aceste trei grupe de enzime acioneaz sinergic ducnd la hidroliza celulozei cristaline.
Endoglucanazele determin ruperea legturilor interne ale lanului de celuloz, atacul fcndu-se
la ntmplare i ducnd la formarea de oligozaharide. Efectul direct al acestui tip de enzime este
fragmentarea lanului de celuloz cuplat cu o cretere slab a cantitii de zaharuri reductoare
eliberate. De obicei, n complexele celulozolitice sunt cuprinse mai multe endoglucanaze care
pot prezenta afiniti diferite pentru celo-oligozaharide cu lungimi variate. Spre deosebire de
aceste, exoglucanazele (celobiohidrolazele) acioneaz la nivelul extremitilor nereductoare ale
lanului de celuloz, elibernd glucoz sau celobioz (zaharuri reductoare) n cantitate crescut,
lungimea lanului celulozic nefiind modificat semnificativ.
Acionnd individual, att endoglucanazele ct i celobiohidrolazele pot degrada regiuni
restrnse ale lanului celulozic (cele cu structur amorf). Pentru a determina hidroliza regiunilor
147
cu structur cristalin este necesar ca n amestecul enzimatic s fie prezente ambele tipuri de
enzime.
In ceea ce privete -glucozidazele, acestea determin hidroliza celobiozei n dou
uniti de glucoz. Dei aceste enzime nu sunt propriu-zis celulaze, ele particip la mbuntirea
randamentului degradrii celulozei prin eliminarea inhibrii prin feedback a celulazelor realizat
de obicei de celobioz (Robson i Chambliss, 1989).
Utilizarea a numeroase substrate i diverse tehnici de evideniere a activitii
celulazice a dus la o comparare dificil a sistemelor celulozolitice de la diferite organisme.
Mai mult, deoarece celulazele aflate n extracte brute prezint o suprapunere parial a
specificitii de substrat, un studiu corect trebuie realizat n condiiile purificrii acestor enzime.
In ultima vreme au fost obinute o serie de substrate celulozice care ar putea fi folosite ca
substrate mai mult sau mai puin specifice pentru fiecare dintre componentele sistemului
celulazic (Wood i Bhat, 1988). Cel mai utilizat procedeu de determinare a activitii enzimatice
este msurarea cantitii de zaharuri reductoare eliberate n urma aciunii enzimelor asupra
substratului. Astfel, substratele celulozice cu structur amorf sau cele modificate chimic cum
sunt celuloza-azur, carboximetilceluloza(CMC), celuloza tratat cu acizi ("acid-swollen
cellulose") sau trinitrofenil-carboximetilceluloza (TNP-CMC) sunt degradate n mod
semnificativ i specific de ctre endoglucanaze dar, n unele situaii i celobiohidrolazele le pot
hidroliza de i cu o eficien mai mic. In cazul utilizrii drept substrat a celulozei cu structur
cristalin de tipul Avicelului (celuloz microcristalin), bumbacului sau hrtiei de filtru, pentru
degradarea lor eficient este necesar un sistem celulazic complet, care s conin att
endoglucanaz ct i celobiohidrolaz. De obidei, pentru a determina prezena ntr-un preparat
enzimatic brut a ambelor tipuri de enzime se determin eliberarea de zaharuri reductoare n
funcie de substrat. Astfel, endoglucanazele cauzeaz o cretere rapid a fluiditii (reducerea
vscozitii) carboximetilcelulozei dar o eliberare sczut de zaharuri reductoare. In contrast,
celobiohidrolazele nu modific fluiditatea substratului dar conduce la eliberarea unei cantiti
mai mari de zaharuri reductoare. Cu toate acestea este dificil de precizat dac o celulaz este sau
nu celobiohidrolaz deoarece nu exist un substrat specific pentru aceasta. Deshpande i colab.,
(1988) au artat ns c hidroliza unor compui cum ar fi metil-umbeliferil-celobiozid (MUC)
sau p-nitrofenil--D-celobiozid (pNPC) ar fi un indiciu al activitii exo--1,4-glucanazice.
Exist n prezent numeroase date referitoare la bacterii celulozolitice dar muli autori
consider c bacteriile produc doar endoglucanaze i nu un sistem celulazic complet. Dei cea
mai acceptat teorie referitoare la modul de degradare a celulozei este cea bazat pe rezultatele
cercetrilor efectuate asupra fungilor i care presupune c hidroliza eficient a substratelor
celulozice se realizeaz n urma aciunii sinergice a endo- i exoglucanazelor, ea nu este aplicat
bacteriilor. La acestea, modelul de degradare sugerat presupune c endoglucanazele care au ca
substrat specific celo-oligozaharidele cu lungimi variate pot determina hidroliza celulozei
cristaline dac ele se afl n concentraie mare sau dac se leag de fibrele de celuloz sau sunt
grupate n imediata vecintate a acestora ("celulosomi") (Robson i Chambliss, 1989). Reuita
unor laboratoare din lume de a izola i caracteriza celobiohidrolaze de la bacterii vine s
contrazic n cazul speciilor respective teoria enunat mai sus (Creuzet i colab.,1983; Mac
Kenzie i colab.,1984; Gardner i colab., 1987; Beguin, 1990; Ruttersmith i Daniel, 1991).
Printre bacteriile considerate a avea sisteme celulazice complexe, tipice se numr
genurile Clostridium, Cellulomonas, Bacillus, Thermomonospora, Ruminococcus, Bacteroides,
Erwinia i Acetobacter. De asemenea, tulpini celulozilitice au fost identi-ficate i n cadrul altor
genuri de bacterii: Streptomyces, Rhizobium, Cellvibrio, Pseudomonas, Microbispora etc. In
studiul de fa ne vom referi doar la sistemele celulazice de la dou genuri de bacterii Gram
pozitive, Bacillus i Streptomyces.
148
La bacteriile din genul Bacillus s-a evideniat faptul c ele produc doar endoglucanaza i
nu snt capabile de o degradare eficient a celulozei cristaline. Studiile referitoare la celulazele de
la Bacillus au fost sprijinite i de faptul c aceste bacterii pot fi uor manipulate genetic
(genomurile de la mai multe specii fiind destul de bine caracterizate) i de caracterul extracelular
al acestor enzime. Printre speciile care produc celulaze se numr B.subtilis, B.polymyxa,
B.licheniformis, B.cereus etc.
Studiile referitoare la celulazele de la Bacillus se refer att la caracterizarea biochimic a
enzimelor ct i la identificarea i secvenierea genelor implicate n producerea acestor enzime ca
i n clonarea i exprimarea lor n diferite gazde. In prezent se cunoate secvena de nucleotide a
mai multor endoglucanaze de la Bacillus (tabelul 5) i deci secvena de aminoacizi a proteinelor
corespunztoare, realizndu-se astfel comparaii ntre enzimele secretate de diferite specii de
bacili.
Tabelul 5. Genele pentru celulazele de la Bacillus
Tulpina
Gena
Mrimea
proteinei
produse (aminoacizi)
B.circulans
378
B.subtilis DLG
499
B.subtilis N-24
463
B.subtilis PAP 115
499
B.lautus
celB
536
Bacillus N-4
celA
384
celB
465
celC
>800
B.polymyxa
365
Bacillus 1139
celF
770
Bacillus sp.KSM 635
912
S-a stabilit astfel c enzimele produse de diferite tulpini de Bacillus prezint un grad nalt
de omologie, poriunile cu omologie ridicat fiind localizate, n general, n regiunea
aminoterminal, ceea ce sugereaz c situsul catalitic activ al enzimelor se afl plasat n aceast
zon. Aceast supoziie este sprijinit de observaiile c poriunea de la captul carboxiterminal
al endoglucanazei respective nu este necesar pentru activitatea celulozolitic, regiunea
respectiv putnd fi deletat experimental fr pierderea actibvitii (Nakamura i colab. 1991).
Recent, Henrissat i colab.(1989) analiznd gruprile ("clusterii") hidrofobe ale diferitelor
enzime au clasificat celulazele, inclusiv pe cele de la Bacillus, n ase familii. Din acest punct de
vedere, endoglucanazele de la B.subtilis i B.ciculans sunt incluse n familia A, subfamiliile A2 i
A4 (Beguin, 1990; Gilkes i colab.,1991).
De asemenea, rezultatele de pn acum referitoare la genele pentru enduglucanazele de la
Bacillus sugereaz ideea c ele ar deriva dintr-o gen ancestral comun.
In ceea ce privete particularitile biochimice ale endoglucanazelor de la bacteriile din
genul Bacillus acestea au o greutate molecular ce variaz, de obicei, ntre 35 i 46 kDa, dar
poate atinge, la unele tulpini alcalofile, pn la 92 kDa (Fukumori i colab., 1986), sunt n
general termostabile, activitatea optim realizndu-se la 50-60oC.
Reglarea producerii de endoglucanaze de ctre bacteriile din genul Bacillus variaz nu
numai de la specie la specie ci chiar i de la tulpin la tulpin. Spre exemplu, tulpini de B.cereus,
Bacillus sp.N-4, B.subtilis AU1, B.licheniformis sintetizeaz enzima n mod constitutiv n timp ce
la alte tulpini, B.polymyxa, B.subtilis DLG, Bacillus sp.1139, aceasta pare a fi inductibil. De
asemenea, nivelul glucozei i al celobiozei influeneaz diferit producerea englucanazei de ctre
149
tulpinile bacteriene studiate. Dac n cazul tulpinii B.subtilis AU1 att glucoza ct i celobioza
inhib sinteza enzimatic la concentraii mai mari de 2%, n cazul tulpinii alcalofile Bacillus
sp.1139 glucoza inhib, iar celobioza stimuleaz producerea de enzim. La alte tulpini de
Bacillus, B.subtilis DGL, B.cereus, B.licheniformis, ambele zaharuri reductoare stimuleaz
sinteza endoglucanazei.
In urma experimentelor de clonare a genelor pentru endoglucanaz n diferite gazde (fie
tulpini auxotrofe de E.coli fie alte tulpini de B.subtilis) au fost obinute informaii interesante
referitoare la exprimarea genelor respective n gazde heterologe ca i la reglarea exprimrii
acestora. De obicei, celulazele ale cror gene au fost clonate n E.coli sunt sintetizate iniial sub
forma unor compui de dimensiuni mari, activi din punct de vedere enzimatic, cu localizare
intracelular. Aceti compui sufer o "prelucrare" n urma creia dimensiunea enzimei se
micoreaz, sub aceast form ea fiind exportat n spaiul periplasmic (Cantwell i Mc Connel,
1983; Robson i Chambliss, 1989). In cazul utilizrii drept gazda pentru clonare a unor tulpini
mutante de Bacillus s-a observat un fenomen similar de "procesare intracelular" a precursorului
enzimatic n urma cruia dimensiunia enzimei se apropie de cea a enzimei produs de tulpina de
origine (Robson i Chambliss, 1989). De asemenea, Nakamura i colab.(1991) au observat c
utilizarea drept gazd a unei tulpini mutante de B.subtillis care nu produce proteaze a condus la
obinerea unei cantiti superioare de enzim de la tulpina recombinat. Aceast cretere poate fi
de cel puin 9 ori dac n noua gazd este clonat suplimentar i gena sacQ.
Dei cele mai multe informaii referitoare la degradarea substratelor celulozice de ctre
actinomicete sunt legate de bacteriile din genul Thermomonospora (T.fusca, T.curvata)(Wilson,
1992), n ultimii ani au fost realizate i studii referitoare la sistemul celulazic al bacteriilor din
genul Streptomyces.
Tulpinile de streptomicete capabile de a degrada celuloza aparin la mai multe specii cum
ar fi: S.antibioticus (Enger i Mc Coy, 1965), S.thermodiastaticus (Crawford i Mc Coy, 1972),
S.flavogriseus (Ishaque i Kluepfel, 1980), S.olivochromogenes (Mac Kenzie i colab.,1987),
S.reticuli (Wachinger i colab., 1989), S.lividans (Theberge i colab., 1992), S.flavovirens SfG3
(Cornea i colab., 1993), dar lista poate continua dac inem cont de tulpinile de Streptomyces
care nu au fost ncadrate pn acum ntr-o specie anume.
Primele lucrri referitoare la sistemul celulazic de la streptomicete au evideniat faptul c
acesta este complex, enzimele componente fiind capabile de a degrada substrate foarte variate:
CMC, hrtie de filtru, bumbac, celuloz microcristalin, celobioz dar i paie, tre sau alte
deeuri celulozice. Studiind complexul celulazic de la S.flavogriseus, Ishaque i Kluepfel (1980)
au stabilit c aceste bacterii produc enzime extracelulare capabile de a degrada, cu o rat diferit,
carboximetilceluloza, hrtia de filtru i fibrele de bumbac. De asemenea, tulpina respectiv
produce i -glucozidaz dar aceast enzim rmne n cea mai mare parte localizat
intracelular. Cercetrile ulterioare realizate asupra unor tulpini aparinnd aceleiai specii
(S.flavogriseus) au condus la precizarea c aceste bacterii produc att endoglucanaze ct i
exoglucanaze (celobio-hibrolaze)(Mac Kenzie i colab.,1984). Rezultate asemntoare au fost
comunicate i de ali autori n cazul unor specii diferite de Streptomyces: S.reticuli (Wachinger i
colab., 1989) sau Streptomyces sp.SD16 (Cornea i colab.,1992) (Figura 6).
In ceea ce privete stabilirea condiiilor optime de aciune a acestor enzime, exist o
oarecare variaie n funcie de tulpina bacterian studiat i de autor. Astfel, n cazul tulpinilor de
S.flavogriseus analizate, testarea aciunii enzimelor pe CMC se realizeaz la 50 0C, n tampon
fosfat 50mM pH 6 (Mac Kenzie i colab.,1984) sau n tampon citrat-fosfat 50mM pH 7 (Ishaque
i Kluepfel, 1980), n timp ce activitatea enzimatic pe hrtie de filtru sau pe celuloz
microcristalin (Avicel) se realizeaz la 40 0C fie n tampon fosfat 50mM pH 6 (Mac Kenzie i
colab.,1984) fie n tampon citrat 50mM pH 5,6 (Ishaque i Kluepfel, 1980). La o alt specie,
S.reticuli, testarea activitii celulazelor s-a realizat la 45 0C n tampon Tris HCl pH 7,5
150
(Wachinger i colab., 1989). Ali autori (Godden i colab., 1989) testeaz activitatea
endoglucanazic a filtratului de cultur de la o tulpin de Streptomyces n tampon fosfat de
potasiu 100mM, pH 8 la 500C. Recent, Theberge i colab.(1992) au caracterizat o endoglucanaz
de la S.lividans 66 care prezenta o activitate optim la p 5,5 la 50 0C. O situaie particular a fost
evideniat la o tulpin alcalofil de Streptomyces tulpin capabil de a sintetiza trei
endoglucanaze diferite, cu pH optim de aciune ce variaz ntre 6 i 8,5 (Nakai i colab.,1988).
Figura 6. Selecia unor noi tulpini de Streptomyces sp. productoare de celulaze.
In cadrul unor exprimente realizate cu o tulpin de Streptomyces sp.SD16 izolat

n Institutul de Biologie Bucureti, Cornea i colab. (1992) au nregistrat o activitate
endoglucanazic maxim la pH 6,4 la 500C n tampon fosfat de potasiu 50mM. In cazul utilizrii
drept substrat a hrtiei de filtru au fost obinute valori maxime de degradare (eliberare de
zaharuri reductoare) la 400C n tampon fosfat de potasiu 50mM la pH 5,8 i pH 8 (Figura 7).
Figura 7. Activitatea enzimatic a unor tulpini de streptomicete izolate din sol (dup Cornea i colab., 1992).
Streptomicetele, ca multe alte bacterii, sitetizeaz celobiaz (-glucozidaz) dar n mod

normal nu o excret n mediul de cultur ci ea rmne localizat intracelular. Studii mai
amnunite asupra acestui tip de enzime au fost realizate la tulpini de S.granaticolor (Jiresova i
151
colab.,1987) la care s-a ncercat izolarea i caracterizarea enzimei, ca i la S.thermodiastaticus

(Ozaki i Yamada, 1991). La aceast ultim specie a fost obinut o tulpin care produce o glucozidaz a crei sintez nu este afectat de glucoz, enzima fiind purificat i caracterizat.
Alturi de aceast enzim rezistent la aciunea glucozei, de la aceeai tulpin bacterian au mai
fost izolate nc dou enzime de acelai tip (-glucozidaze) dar a cror sintez este supus
inhibrii de ctre glucoz.
Un aspect interesant al cercetrilor referitoare la celulazele produse de bacteriile din
genul Streptomyces este izolarea i purificarea componentelor acestui sistem. Spre deosebire de
bacteriile din genul Thermomonospora la care au fost bine caracterizate cinci endoglucanaze
diferite (E1-E5) dintre care E3 prezint sinergism att cu alte endoglucanaze ct i cu o
celobiohidrolaz izolat de la Trichoderma reesei (Wilson, 1992), la streptomicete asemenea
rezultate sunt mai puine.
Nakai i colab.(1987) au purificat i caracterizat de la o tulpin alcalofil de
Streptomyces (Streptomyces sp.KSM9) trei celulaze diferite care degradeaz preferenial CMC i
care au fost notate CMC-aza I, CMC-aza II i CMC-aza III. Greutile moleculare ale acestor
enzime variaz ntre 32 kDa (CMC-aza I), 32,5 kDa (CMC-aza II) i 92 kDa (CMC-aza III).
Purificarea i separarea celor trei enzime s-a realizat prin cromatografie pe schimbtori de ioni,
prin trecerea pe o coloan de DEAE-Toyopearl 650M a unui preparat celulazic brut, rezultat prin
precipitarea cu sulfat de amoniu (70%) a proteinelor din filtratul de cultur i eluarea lor cu un
gradient linear de NaCl (0,05-0,4M). Ali autori (Wachinger i colab.,1989) au fracionat
celulazele de la S.reticuli prin gel filtrare pe Superose 12 i au obinut cel puin dou CMC-aze
precum i mai multe proteine cu activitate pe celuloza microcristalin. CMC-azele, notate CMCaza 1 de 40 kDa i CMC-aza 2 de 48 kDa prezint un pH optim de aciune ce variaz ntre 5,5 i
7,5 la o temperatur de 45-500C. De asemenea ele nu sunt inhibate de tamponul fosfat i nu sunt
stimulate de adugarea de ioni de calciu n amestecul de reacie. Spre deosebire de acestea,
preparatul enzimatic ce prezint activitate specific pe Avicel, supus electroforezei n gel de
poliacrilamid n condiii de denaturare a evideniat prezena a mai multor benzi cu greuti
moleculare ce au variat ntre 42 i 120 kDa (42, 56, 70, 120). Preparatul enzimatic obinut prin
gel filtrare a avut o temperatur optim de aciune la 45-500C la un pH optim 7. Activitatea
celulazic pe substrat de Avicel este redus semnificativ n tampon fosfat, dar este stimulat de
adugarea de CaCl2 40mM i de asemenea ea este pierdut rapid, n decursul a ctorva zile prin
pstrare la 40C, n timp ce CMC-azele sunt mult mai stabile. Proprietile avicelazei de la
S.reticuli sunt foarte asemntoare celor descrise pentru exoglucanaza de la Ruminococcus albus
care a fost izolat sub forma unui complex de 230 kDa, alctuitdin monomeri de 118 kDa
(Gardner i colab., 1987).
Recent, Theberge i colab.(1992) au purificat i caracterizat o endoglucanaz de la
S.lividans 66 dup cultivarea bacteriilor pe mediu cu xiloz ca surs de carbon. Aceasta este o
glicoprotein cu greutatea molecular de 46 kDa, cu pI la 3,3 i cu o activitate maxim asupra
CMC la 500C la pH 5,5. Interesant este c prin cultivarea bacteriilor n mediu cu Avicel sau
celobioz ca surs principal de carbon s-a obinut un preparat enzimatic alctuit din mai multe
proteine de dimensiuni variate, dar active pe oligozaharide i care au interacionat pozitiv cu
anticorpii anti-endoglucanaz. Fenomenul respectiv a fost observat la celulazele de la
Trichoderma reesei i de la Clostridium thermocellum, el datorndu-se n cazul fungilor fie unui
grad diferit de glicozilare a proteinelor fie unor modificri proteolitice. In cazul bacteriilor
fenomenul s-ar putea explica prin formarea unor complexe enzimatice specifice, celulosomi,
doar n prezena substratelor microscristaline. Autorii presupun ns c apariia fragmentelor
endoglucanazice la S.lividans 66 s-ar datora mai degrab unei serii de fenomene proteolitice
dect unei glicozilri difereniate sau formrii celulosomilor. In orice caz, activitatea specific a
endoglucanazei de S.lividans comunicat de autori a fost de 539 IU/mg protein, ceea ce
reprezint una dintre cele mai mari valori raportate n literatur (Theberge i colab.,1992).
152
Rezultate interesante au fost obinute i de Mac Kenzie i colab.(1984) care au reuit,

printre puinii cercettori de altfel, izolarea i caracterizarea unei exoglucanaze de la o tulpin de
S.flavogriseus. Aceasta s-a realizat prin cromatografie pe DEAE Bio-Gel A a unui preparat brut
obinut prin concentrarea de 100 ori a filtratului de cultur (prin ultrafiltrare). Eluarea enzimelor
s-a fcut cu un gradient linear de NaCl (0-0,2M) obindu-se mai multe "peak-uri" cu activitate
celulazic. Cinci dintre acestea au prezentat activitate CMC-azic iar unul a evideniat o
activitate enzimatic complex (avicelazic, CMC-azic, xilanazic i proteazic). Fraciile care
au prezentat cea mai mare activitate avicelazic au fost supuse gel filtrrii pe Bio-Gel P60
reuindu-se separarea avicelazei de CMC-az. Fraciile active au fost apoi trecute pe o coloan
de Concanavalin A-Sefaroz 4B, fiind recuperat o protein de 46 kDa care nu a prezentat
afinitate pentru coloana respectiv (pentru lectina imobilizat). Aceast protein prezint pI la
4,15, determin n special hidroliza celulozei tratate cu acizi ("acid-swollen cellulose"), produii
de hidroliz fiind celobioza i celotrioza (n cea mai mare parte).
Datele obinute la streptomicete, n special de la tulpinile de S.flavogriseus evideniaz
faptul c mecanismul de aciune al celulazelor de la aceste bacterii este mai degrab asemntor
celui descris la fungi la care degradarea substratelor celulozice se datoreaz aciunii sinergice a
endoglucanazelor, exoglucanazelor i -glucozidazei. De asemenea, glicozilarea unora dintre
componentele sistemului celulazic de la streptomicete (a endoglucanazelor, de exemplu),
fenomen care este destul de puin rspndit la bacterii dar frecvent la fungi poate sugera un
comportament asemntor al celulazelor de la streptomicete cu cel al unor fungi. In ceea ce
privete semnificaia glicozilrii, dei unii autori atribuie glucidului un rol n funcionarea
enzimei, ea rmne nc neclar (Knowles i colab.,1987).
Cu toate acestea explicarea mecanismului de aciune a celulazelor de la streptomicete
este complicat de faptul c la unele tulpini bacteriene, la S.reticuli de pild, au fost identificate
celulaze legate de miceliu ("mycelium buond cellulase") care amintesc de formarea
celulosomilor de la Clostridium thermocellum (Lamed i Bayer, 1988; Wachinger i
colab.,1989). O organizare a celulazelor n celulosomi similar celei evideniate la clostridii a
fost descris i la Thermomonospora curvata dei studiile au fost n special de microscopie
electronic (Figura 8).
Figura 8. Aspect electronomicroscopic al suprafeei celulelor de T.curvata cultivate pe fibre de celuloz (dup Bond
i Stutzberger, 1989).
Modificarea aspectului suprafeei celulelor de streptomicete cultivate n mediu de cultur

ce conine celuloz drept unic surs de carbon a fost observat la tulpinile Streptomyces
sp.SD16 i Streptomyces sp.P216 (Figura 9) (Cornea, 1996). Aceste rezultate sugereaz c
fenomenul complexrii sistemului celulazic este comun mai multor tipuri de bacterii iar
153
mecanismul de degradare a celulozei este mai complicat dect s-a presupus iniial (Ljungdahl
1989).
Figura 9. Aspect electronomicroscopic al celulelor Streptomyces sp.SD16 cultivate n mediu minimal ce conine
celuloz.
In ceea ce privete determinismul genetic al producerii enzimelor celulozolitice, datele

referitoare la streptomicete sunt destul de puine i incomplete. In general, clonarea i
secvenierea unei gene structurale pentru o enzim este util nu numai pentru determinarea
secvenei de aminoacizi pe care proteina i conine ci i pentru a obine proteina n cantitate mai
mare ca i pentru studii de mutagenez care s determine rolul anumitor secvene de aminoacizi
n funcionarea enzimei. Clonarea prezint interes mai ales pentru celulaze deoarece prezena
mai multor gene care codific aceste enzime la majoritatea microorganismelor celulozolitice
face dificil att obinerea de mutante ct i studiul rolului fiecrui component n parte.
Pn n prezent s-a reuit izolarea, secvenierea i clonarea n diferite tulpini mutante de
S.lividans (care nu produc celulaze) sau n E.coli a trei gene implicate n sinteza celulazelor la
streptomicete: gena casA ce codific CMC-aza I de la o tulpin alcalofil de Streptomyces sp.
(Nakai i colab.,1988), gena celA ce codific o endoglucanaz de la S.lividans 66 (Theberge i
colab.,1992) i gena celA1 ce codific o endoglucanaz de la S.halstedii (Fernandezabalos i
colab.,1992). De asemenea, Shareck i colab.(1987) au realizat clonarea ntr-o tulpin mutant de
S.lividans (care nu producea celulaze) a unei secvene de ADN care a determinat nu numai
restabilirea capacitii de a degrada celuloza ci i o sporire de peste 800 ori a activitii
enzimatice comparativ cu tulpina slbatic. Interpretarea rezultatelor n acest caz rmne dificil
deoarece genele clonate nu au fost analizate astfel c nu se poate preciza dac secvenele de
ADN clonate conin gene ce codific celulaze (endoglucanaze) sau proteine reglatoare.
Secvenierea genelor casA i celA a relevat prezena unei secvene de 14 pb repetate
inversat, plasat naintea regiunii ce codific proteinele respective, secven identificat i la
nivelul genelor celE2, celE4 i celE5 de la Thermomonospora fusca (Wilson, 1992; Theberge i
colab., 1992). De asemenea, din examinarea secvenelor de aminoacizi deduse din examinarea
secvenelor de nucleotide ale genelor casA i celA i compararea lor cu secvenele de aminoacizi
ale altor celulaze au fost evideniate elementele structurale ale celulazelor respective, aa cum au
fost ele propuse de Gilkes i colab.(1991): domeniile catalitice, domeniile de legare la celuloz,
linkerii ce unesc asemenea domenii i secvenele repetate de aminoacizi. Spre exemplu,
endoglucanaza produs de S.lividans 66 (codificat de gena celA) este alctuit din dou domenii
(domeniul catalitic i domeniul de legare la celuloz) conectate de un linker scurt, extremitatea
amino-terminal evideniind un grad nalt de omologie cu domeniul de legare la celuloz
154
("cellulose-binding domain") al endoglucanazei CenA de la Cellulomonas fimi, iar regiunea din

mijlocul proteinei prezint omologie extins cu celulaza E5 de la T.fusca i alte endoglucanaze
de Bacillus (Theberge i colab., 1992).
Conform propunerilor lui Henrissat i colab.(1989) i Gilkes i colab.(1991) de grupare a
celulazelor n familii pe baza secvenelor de aminoacizi de la nivelul domeniilor catalitice
conservate la mai multe microorganisme i a analizei regiunilor ("clusteri") hidrofobe,
endoglucanazele ale cror gene au fost clonate i secvenializate (casA i celA) pot fi ncadrate n
familia A (celA), alturi de endoglucanaze de la Clostridium thermocellum, B.subtilis, Bacillus
sp., Erwinia chrosanthemi, Ruminococcus albus, Clostridium cellulolyticum etc, i n familia B
(casA) alturi de endoglucanaze de la Cellulomonas fimi, Microbispora bispora i o
celobiohidrolaz de la Trichoderma reesei.
Reglarea activitii celulazelor reprezint un alt aspect al cercetrilor cu aceste enzime, n
scopul stabilirii condiiilor optime de producere i aciune a acestora. La fel ca i n cazul
mecanismului de degradare a substratelor celulozice, mecanismul de reglare a sintezei i
activitii celulazelor este destul de neclar. O ipotez general susine c microorganismele
celulozolitice produc celulazele la un nivel bazal care este ns suficient pentru a asigura
hidroliza celulozei insolubile, rezultnd produi de degradare care pot funciona ca inductori
determinnd sinteza unor cantiti crescute de celulaze (Robson i Chambliss, 1989). Ca i alte
enzime hidrolitice extracelulare i celulazele se sintetizeaz ca rspuns la prezena inductorului,
ele fiind represate de obicei de produii finali de degradare. In cazul actinomicetelor exist mai
multe date referitoare la reglarea celulazelor la bacteriile din genul Thermomonospora. Astfel,
sinteza celulazelor de ctre T.fusca este reglat att prin inducere ct i prin represie (Liu i
Wilson, 1987). Wilson (1992) a artat c tulpina T.fusca YX cultivat pe celuloz a evideniat o
activitate celulazic de 100 ori mai mare dect cea obinut prin cultivarea n mediu cu glucoz
ca surs unic de carbon. Ali autori (Fennington i colab.,1984) au obinut o tulpin mutant de
T.curvata capabil de a rezista la aciunea inhibitoare a glucozei. Liu i Wilson (1988) au reuit
izolarea unei tulpini mutante de T.fusca YX care sintetiza n mod constitutiv celulaze, dar sinteza
lor era supus n continuare represiei produse de glucoz. Spre deosebire de bacteriile din genul
Thermomonospora, la streptomicete exist foarte puine date referitoare la reglarea sintezei
celulazelor iar cele care exist sunt oarecum contradictorii. Astfel, Mac Kenzie i colab.(1984) au
artat c activitatea celulazelor de la S.flavogriseus este inhibat de concentraii mai mari de
glucoz i celobioz, n timp ce Ball i Mc Carthy (1988) susin c n cazul unor tulpini de
Streptomyces izolate de ei glucoza i xiloza nu exercit efect inhibitor asupra enzimelor implicate
n degradarea deeurilor celulozice de tipul paielor. In orice caz, cultivarea bacteriilor pe mediu
ce conine celuloz pulbere sau CMC are drept consecin inducerea sintezei doar a enzimelor
celulazice n timp ce prin cultivarea bacteriilor pe medii mai complexe (cu paie, xilan sau tre
de gru) are loc inducerea unei game mai largi de enzime hidrolitice: att celulaze ct mai ales
hemicelulaze (Mac Kenzie i col., 1987, Godden i colab., 1989). Spre exemplu, Godden i
colab. (1989) utiliznd pentru testri o tulpin de Streptomyces sp. a evideniat faptul c
endoglucanazele i -glucozidazele sunt induse specific prin cultivarea pe mediu cu CMC ca
surs de carbon. Celobioza a evideniat o slab aciune de inducere a sintezei endoglucanazelor,
dar induce -glucozidaza n timp ce celotrioza i celotetraoza induc slab endoglucanazele.
Obinerea unei activiti celulazice specifice ridicate n filtratele de cultur rezultate prin
cultivarea bacteriilor pe substratele celulozice naturale (de exemplu paie) se datoreaz probabil
unei cooperri dintre diferiii inductori rezultai din aciunea componentelor complexului
lignocelulozic. Mai mult, inducerea sintezei celulazelor este inhibat de adugarea a 50 g/ml
cloramfenicol ceea ce ar sugera c , cel puin n cazul tulpinii analizate, inducerea enzimelor este
mai degrab o sintez "de novo" (Godden i colab. 1989).
155
3.5. Hemicelulazele
Alturi de celuloz i lignin, hemicelulozele reprezint componente de baz ale peretelui
celular vegetal, degradarea lor n natur realizndu-se destul de greoi, prin cooperarea unor
sisteme enzimatice de origini foarte diferite. Intre microorganismele productoare de
hemicelulaze un loc important este ocupat de streptomicete datorit sintezei unei game foarte
variate de asemenea enzime.
Hemicelulozele sunt polizaharide care conin diferite tipuri de resturi de zaharuri (xiloz,
manoz, galactoz, arabinoz sau glucoz) ce alctuiesc polimeri lineari sau ramificai.
Clasificarea acestor substane se face n funcie de coninutul n zaharuri. Dintre acestea, -1,4D-xilanii reprezint grupul major de hemiceluloze fiind alctuii din resturi de D-xilopiranozil
unite prin legturi de tip -1,4. In muli xilani resturile de D-xilopiranozil sunt ntocmite de
arabinozil, glucuronozil sau diferite grupri acetil, n funcie de planta de origine. Un alt grup de
hemiceluloze, mananii snt constituii din resturi de D-manopiranozil unite tot prin legturi de tip
-1,4. Si n cazul acestor polimeri unitile specifice de D-manopiranozil pot fi nlocuite de Dgalactozil sau grupri acetat (Zimmermann, 1989). Hemicelulozele reprezint un important
component al peretelui celular vegetal, ele putnd fi linkate la compui fenolici sau pot prezenta
legturi cu lignina.
Sistemul enzimatic pentru degradarea hemicelulozelor const n enzime care cliveaz
legturile din interiorul macromoleculei (endoenzime) i n exoenzime care taie resturile de
zaharuri de la extremitile nereductoare ale polimerului. Prezena unor substitueni variai
influeneaz puternic hidroliza enzimatic. De aceea, pentru hidroliza complet a
hemicelulozelor sunt necesare enzime care s taie n diferite puncte de ramificaie. In sistemul
xilanolitic, aceste enzime acioneaz n cooperare cu xilanazele pentru hidroliza complet a
xilanilor (Biely, 1985).
Tinnd cont de habitatul natural al streptomicetelor i de prezena n acesta a unei mari
cantiti de materiale celulozice i lignocelulozice, bacteriile respective pot fi considerate ca o
surs potenial de enzime hemicelulozolitice (Zimmermann i colab., 1992).
Sistemul enzimatic de degradare a xilanului de la diferite tulpini de Streptomyces a fost
studiat n detaliu. La aceste bacterii au fost identificate mai multe tipuri de hemicelulaze:
xilanaze, -xilozidaze, -L-arabinofuranozidaze, -4-O-metil-glucuronidaze, acetil-xilan
esteraze, ferulic i cumaric esteraze, enzime ce degradeaz mananii (mananaze). Dintre acestea,
1,4--D-xilanazele (EC 3.2.1.8.) au fost mai mult studiate, ele fiind detectate la numeroase
tulpini de Streptomyces (Ball i Mc Carthy, 1988). De asemenea, s-a evideniat faptul c aceeai
tulpin poate produce mai multe xilanaze distincte. Spre exemplu, S.ostreogriseus i S.exfoliatus
produc cte 5 asemenea enzime n timp ce S.lividans produce o singur asemenea xilanaz
(Sreenath i Joseph, 1982; Morosoli i colab.,1986). Recent, Lumba i Penninchx (1992) au
caracterizat mai multe forme de -xilanaz izolate de la o tulpin de Streptomyces cultivat pe
lignoceluloz. Interesant ns c n cazul acestei tulpini, formele de -xilanaz evideniate nu
acioneaz sinergic pentru hidrolizarea substratului ceea ce ar constitui o redundan a crei
semnificaie nu este clar.
Pentru purificarea i caracterizarea xilanazelor de la diferite streptomicete (Tabelul 6) sau utilizat filtrate de cultur din care enzimele au fost precipitate cu sulfat de amoniu i apoi
supuse unor tratamente speciale: ultrafiltrare, cromatrografie pe schimbtori de ioni, gel filtrare i
focusare izoelectric ("isoelectric focusing")(Sreenath i Joseph, 1982; Morosoli i colab., 1986;
Mac Kenzie i colab., 1987; Yasui i colab., 1988).
Cele mai multe dintre aceste enzime au pH ntre 5 i 6,5 iar punctul lor izoelectric variaz
ntre 5,2 i 10,3 (Zimmermann, 1989). Xilanazele determin hidroliza xilanilor prin ruperea
156
legturilor interne -1,4, determinnd eliberarea de xilotrioz, xilobioz sau xiloz (Yasui i
colab., 1988). Un alt tip de hemicelulaze produse de streptomicete, exo--1,4-xilozidazele (1,4-D xylan xylohydrolase, EC 3.2.1.37) hidrolizeaz xilanii prin atac la extremitile nereduc
toare ale lanului de polimer.
Tabelul 6. Proprietile unor xilanaze izolate din diferite tulpini de streptomicete.
Tulpina
pH optim
t0 optim
pI
S.xylophagus
S.flavogriseus
CD45-2
S.exfoliatus
Streptomyces sp.
KT23
S.lividans
Streptomyces sp.E86
6,5
6,5
55-60
50
greutate
molecular (kDa)
-
5,5
5,5
50
55
6,9
43
5,5-6,5
5,5-6,2
55-65
55-60
5,2
7,3
40
Eliberarea de resturi -L-arabinoz din arabinoxilani, arabinani i arabinogalactani se

datoreaz aciunii specifice a -L-arabinofuranozidazelor, enzime evideniate la unele specii de
Streptomyces (S.rubiginosus, S.purpurascens, S.massasporus) (Zimmermann, 1989). Alte
enzime, -4-O-metilglucironidaze, evideniate la S.flavogriseus i S.olivochromogenes (Mac
Kenzie i colab., 1987) determin clivarea legturilor -1,2 dintre acidul glucuronic i resturile
de xiloz, acionnd sinergic cu xilanazele n procesul de hidroliz a xilanilor. Pe lng aceste
tipuri de hemicelulaze, unele tulpini de Streptomyces mai pot sintetiza i alte enzime care
hidrolizeaz alte specii de xilani. Acetil-xilan esterazele produse de S.olivochromogenes i
S.rubiginosus particip alturi de xilanaze la hidroliza acetil-xilanilor n timp ce alte tulpini de
Streptomyces (S.viridosporus) pot produce ferulic esteraze care elibereaz acid ferulic din
arabinixilanii aflai n cantiti mai mari n peretele celular al gramineelor (Mac Kenzie i colab.,
1987; Deobald i Crawford, 1987).
O categorie mai puin studiat de hemicelulaze produse de streptomicete (innd cont de
literatura de specialitate) este reprezentat de mananaze (1,4--D-manan mananohidrolaza, EC
3.2.1.78.) evideniate la unele tulpini de S.olivochromogenes sau la alte specii.
Utilizarea tehnicilor de biologie molecular i implicit a celor de inginerie genetic n
studiul hemicelulazelor de la streptomicete a permis izolarea i caracterizarea genelor implicate
n producerea unor asemenea enzime. Astfel, Mondou i colab.,(1986) au raportat clonarea unei
gene pentru endoxilanaz de la S.lividans ntr-o tulpin mutant neproductoare. Clonele ce
conineau un fragment de ADN de 2kb au evideniat o cretere de peste 60 ori a producerii de
xilanaz comparativ cu tulpina slbatic . De asemenea, Iwasaki i colab.(1986) au realizat
transferul genei pentru xilanaz izolat de la o tulpin de Streptomyces n alte dou tulpini de
streptomicete - S. lividans i S. kasugaensis - la care s-a observat o cretere a nivelului de sintez
a enzimei respective prin achiziionarea unui fragment de ADN de 1,04kb. Alturi de clonrile de
gene, fuziunile de protoplati constituie o metod relativ simpl dar eficient de a obine tulpini
recombinate genetic, capabile de o mai bun degradare a substratelor complexe. Astfel, Pettey i
Crwford (1984) au obinut o mbuntire a capacitii de degradare a hemicelulozelor i ligninei
de ctre o tulpin recombinat obinut prin fuziunea interspecific de protoplati de la
S.viridospurus T7A i S.setonii 75 Vi2. Rezultate asemntoare au for prezentate de Cornea i
colab.(1992) care, n urma fuziunii protoplatilor de S.flavovirens SfG3 cu protoplati izolai de
la Streptomyces sp.SD16 au obinut mai multe tulpini recombinate genetic care prezentau o
157
capacitate crescut de degradare a substratelor celulozice i hemicelulozice comparativ cu

tulpinile parentale (Figura 10).
Uneori, enzimele produse de diferite tulpini de streptomicete (preparate brute sau enzime
purificate) au fost studiate n privina aciunii lor asupra peretelui celulei vegetale sau al unor
fungi. Astfel, Cornea i colab.(1992) au evideniat faptul c prin utilizarea unui filtrat de cultur
de Streptomyces sp.SD16 s-au putut obine n condiii experimentale specifice protoplati
vegetali de Nicotiana tabacum. Acest rezultat sugereaz faptul c filtratul de cultur conine o
mare varietate de enzime asemntoare celulazelor, hemicelulazelor dar i alte enzime care
coopereaz n degradarea peretelui celular vegetal.
Figura 10. Comparaie ntre activitatea enzimatic (celulozolitic) a unor tulpini de streptomicete de tip slbatic
(P216, SD16 i SFG3) i a unor recombinani obinui prin fuziune triparental de protoplati.
In ceea ce privete aciunea pe peretele celular fungic, s-a dovedit c printre enzimele
sintetizate de unele tulpini de Streptomyces se numr i chitinazele, enzimele ce degradeaz
componenta chitinic (dominant) a peretelui celular fungic ducnd la formarea protoplatilor
(Tagawa i Okazaki, 1991). Okazaki i Tagawa (1991) au izolat i caracterizat o chitinaz
produs de S.cinereoruber dup cultivarea pe un mediu ce coninea ca surs de carbon perei
celulari de Aspergillus niger. Enzima respectiv are o greutate molecular de 19 kDa i un pI 8,6
iar pH optim se situeaz n domeniul acid (4,0-5,0) la 500C.
Beyer i Diekeman (1984) au caracterizat enzime de tip laminarinaz de la Streptomyces
sp.ATCC11238 ca i un complex de enzime ce degradeaz eficient chitina i laminarina, fiind
active asupra a peste 50 specii de ascomicete. Fracionarea chitinazei prin gel filtrare i
cromatografie pe schimbtori de ioni a condus la evidenierea unei exo-chitinaze i a unei -Nacetil-glucozoaminidaze ce elibereaz N-acetil glucozamina din crusta chitinoas de crab (Beyer
i Diekman, 1985). In mod asemntor, Billich i colab.(1988) au obinut protoplati de
Fusarium scirpi prin utilizarea unui preparat enzimatic de S.tsushimaensis.
Datele prezentate n aceast lucrare reflect particularitile deosebite ale bacteriilor din
genurile Streptomyces i Bacillus i importana pe care acestea o au att din punct de vedere
teoretic ct i practic, fie pentru obinerea unor compui cu aplicaii in medicin, industria
alimentar, a detergenilor etc. fie n natur, ca verigi importante ale mecanismelor de degradare
i reciclare a unor resturi organice existente de obicei n sol. Cunoaterea echipamentului lor
enzimatic, al potenialului lor de biosintez ca i al determinismului genetic al acestuia corelat
cu tehnicile moderne de biologie molecular i cu cele de fuziuni celulare asigur, pe de o parte,
o mai bun studiere a caracteristicilor acestor bacterii, inclusiv a taxonomiei grupului iar, pe de
158
alt parte, poate conduce la obinerea unor tulpini recombinate genetic capabile de a sintetiza sau
degrada cu o eficien crescut anumii compui cu importan practic deosebit.
Bibliografie selectiv
1. Aretz, W., Koller, K. P., Riess, G., 1989, Proteolytic enzymes from recombinant
Streptomyces lividans TK24, FEMS Microbiol. Letts., 65, p.31-36.
2. Ball, A. S., Mc Carthy, A. J., 1988, Saccharification of straw by actinomycetes enzymes, J.
Gen. Microbiol., 134, p.2139-2147.
3. Baltz, R. H., Seno, E. T., 1988, Genetics of Streptomyces fradiae and tylosin biosynthesis,
Ann. Rev. Microbiol., 42, p. 547-574.
4. Bayer, E. A., Setter, E., Lamed, R., 1985, Organization and distribution of the cellulosome in
Clostridium thermocellum, J. Bact., 163, p.552-559.
5. Beguin, P., 1990, Molecular biology of cellulose degradation, Ann. Rev. Microbiol., 44,
p.
219-248.
6. Beyer, M., Diekman, H., 1985, The chitinase system of Streptomyces sp. ATCC 11238, Appl.
Microbiol. Biotechnol., 23, p. 140-146
7. Billich, A., Keller, U., Kleinkauf, H., Zocher, K., 1988, Production of protoplasts from
Fusarium scirpi by lytic enzymes from Streptomyces tsusimaensis, Appl. Microbiol.
Biotechnol., 28, p.442-444
8. Binnie, C., Warren, M., Butler, M. J., 1989, Cloning and heterologous expression in
S.lividans of S.rimosus genes involved in oxytetracycline biosynthesis, J. Bact., 171, p. 887895
9. Bond, K., Stutzenberger, F., 1989, A note on the localization of cellulosome formation in
Thermomonospora curvata, J. Appl. Bacteriol., 67, p. 605-609.
10. Bonner, M. A., Stutzenberger, F., 1988, Cell surface changes in Thermomonospora curvata
during cellulase induction and repression, Letts. Appl. Microbiol., 6, p.59-63.
11. Buttner, M. J., Smith, A. M., Bibb, M. J., 1988, At least three different RNA polymerase
holoenzymes direct transcription of the agarase gene (dagA) of S.coelicolor A3(2), Cell, 52,
p. 599-607.
12. Chardon-Loriaux, I., Charpentier, M., Percheron, F., 1986, Isolation and characterization of a
linear plasmid from Streptomyces rimosus, FEMS Microbiol.Letts., 35, p.151-155.
13. Chater,K., Bruton,C.J., 1985, Resistance, regulatory and production genes for the antibiotic
methylenomycin are clustered, EMBO.J., 4, p.1893-1900.
14. Cornea, 1996, Obinerea unor bacterii cu importan biotehnologic prin fuziunea i
transformarea genetic a protoplatilor, Tez de doctorat, Universitatea Bucureti.
15. Cornea, C. P., Coglniceanu, G., Brezeanu, A., Vatafu, I., Savu, L., Popescu, I., Pop, A.,
1992, Obinerea protoplatilor de tutun prin utilizarea unui preparat enzimatic brut de
Streptomyces sp. SD16, St. Cercet. Biol., 44, p. 85-88.
16. Cornea, C. P., Vatafu, I., Pop, A., Brezeanu, A., Savu, L., Dobrot, S., 1993, Interspecific
protoplast fusion in Streptomyces, Rev. Roum. Biol., 38, p. 49-53.
17. Cornea, C. P., Vatafu, I., Savu, L., 1994, Plasmid transfer by protoplast fusion, Microbiol.
Ind. Biotehnol., 8, p. 145-148.
18. Coughlan, B. P., 1988, Staining techniques for the detection of the individual components of
cellulolytic enzyme system, Methods in Enzymology, 160, p. 135-145.
19. Cundliff, E., 1989, How antibiotic-producing organims avoid suicide, Ann. Rev. Microbiol.,
43, p. 207-233.
20. Damude, H. G., Gilkes, N. R., Kilburn, D. G., Miller, R. C., Warren, R. A., 1993,
Endoglucanase Cas A from alkalophilic Streptomyces strain KSM-9 is a tipical member of
family B of -1,4-endoglucanase, Gene, 123, p. 105-107.
159
21. Davies, J., 1990, What are antibiotics? Archaic functions for modern activities, Molec.
Microbiol. , 4 (8), p. 1227-1232.
22. Deobald, L. A., Crawford, D. L., 1987, Activities of cellulase and other extracellular
enzymes during lignin solubilization by Streptomyces viridosporus, Appl. Microbiol.
Biotechnol., 28, p. 158-163.
23. Dimcev, A., 1988, Protoplast from antibiotic-producing actinomycetes. Application in the
biotechnology, Biotechnol. Bioeng., 4, p. 12-19.
24. Doyle, R. J., 1994, Introduction to lectins and their interactions with microorganisms, in
Lectin-Microorganism Interaction, Eds. R.J.Doyle si M.Slifkin, Marcel Dekker Inc., p. 1-65.
25. Duitman, E., Hamoen, L., Rembold, M., Vater, L., 1999, The mycosubtilin synthetase of
Bacillus subtilis ATCC6633: A multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an
amino transferase, and a fatty acid synthase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 96 (23), 1329413299.
26. Felix, C. R., Ljungdahl, L. G., 1993, The cellulosome: the exocellular organelle of
Clostridium, Ann. Rev. Microbiol., 47, p. 791-819.
27. Fernandez-Abalos, J. M., Sanchez, P., Coll, P. M., Villanueva, J. R., Perez, P., Santamaria, R.
I., 1992, Cloning and nucleotide sequence of celA1, an endo--1,4-glucanase-encoding gene
from Streptomyces halstedii JM8, J. Bacteriol., 174, p. 6338-6376.
28. Ghangas, G. S., Wilson, D. B., 1988, Cloning of the Thermomonospora fusca endoglucanase
E2 gene in Streptomyceslividans: affinity purification and functional domains of the cloned
gene product, Appl. Envir. Microbiol., 54, p. 2521-2526.
29. Gilbert, H. J., Hazlewood, G. P., 1993, Bacterial cellulases and xylanases, J. Gen. Microbiol.,
139, p. 187-194.
30. Godden, B., Legon, T., Helvenstein, P., Penninckx, M., 1989, Regulation and production of
hemicellulolytic and cellulolytic enzymes by a Streptomyces sp. growing on lignocellulose, J.
Gen. Microbiol., 135, p. 285-292.
31. Gokhale, D. V., Deobagkar, D. N., 1989, Differential expression of xylanase and
endoglucanase in the hybrid derived from intergeneric protoplast fusion between
Cellulomonas sp. and Bacillus subtilis, Appl. Envir. Microbiol., 55, p. 2675-2680.
32. Gormley, E. P., Cantwell, B. A., Barker, P. J., Mc Connell, D. J., 1988, Secretion and
processing of the Bacillus subtilis endo--1,3-14-glucanase in Escherichia coli, Molec.
Microbiol, 2, p. 813-819.
33. Horikoshi, K., Nakao, M., Kurono, Y., Sashihara, N., 1984, Cellulases of an alkalophilic
Bacillus strain isolated from soil, Can. J. Microbiol., 30, p. 774-779.
34. Imanaka, T., 1986, Application of recombinant DNA technology to the production of useful
biomaterials, Adv. Biochem. Eng., 33, p. 1-27.
35. Ishaque, M., Kluepfel, D., 1980, Cellulase complex of a mesophilic Streptomyces strain,
Can. J. Microbiol., 26, p. 183 189.
36. Kakoniova, D., Labudova, I, Liskova, D., 1987, Callus culture as substrate for the production
of specific cell wall degradind enzymes for derived protoplast isolation, Biotechnol. Letts., 9,
p. 721-724.
37. Kinashi, H., 1988, Giant linear plasmids in Streptomyces and antibiotic production, in
Biology of Actinomycetes '88, Japan Scientific Societies Press, p. 117-122.
38. Kinashi, H., 1989, Giant linear plasmids in various methylenomycin-producing strains of
Streptomyces species, in Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, Ed.
C. L. Hershberger, S. W. Queener, G. Hegeman, ASM, p. 141-146.
39. Kirby, R., Hopwood, D. A., 1977, Genetic determination of methylenomycin biosynthesis
by the SCP1 plasmid of Streptomyces coelicolor A3(2), J. Gen. Microbiol., 98, p. 239-252.
40. Kluepfel, D., Shareck, F., Mondou, F., Morosoli, R., 1986, Characterization of cellulase and
xylanase activities of Streptomyces lividans, Appl. Microbiol. Biotechnol., 24, p. 230-234.
160
41. Lamed, R., Naimark, J., Morgenstern, E., Bayer, E. A., 1987, Specialized cell surface
structures in cellulolytic bacteria, J. Bacteriol., 169, p. 3792-3800.
42. Mansouri, K., Pissowotzki, K., Distler, J., Ebert, A., Piepersberg, W., 1989, Genetics of
streptomycin production, n Genetics and molecular biology of industrial microorganisms,
Ed. Hershberger, C. L., Queener, S. W., Hegeman, G., ASM, p. 61-67.
43. Martin, J. F., 1989, Molecular mechanisms for the control by phosphate of the biosynthesis
of antibiotics and other secondary metabolites, n Regulation of secondary metabolism in
Actinomycetes, Ed. S. Shapiro, Boca Raton, CRC, p. 230-251.
44. Martin, J. F., Liras, P., 1989, Organization and expression of genes involved in the
biosynthesis of antibiotics and other secondary metabolites, Ann. Rev. Microbiol., 43, p. 173206.
45. Mc Carthy, A. J., Williams, S. T., 1992, Actinomycetes as agents of biodegradation in the
environment - a review, Gene, 115, p. 189-192.
46. Nakano, M. N., Butsuya, I., Ogawara, H., 1989, Expression of the kanamycin resistance gene
in a kanamycin-producing strain of S. kanamyceticus, J. Antib., 42, p. 423-430.
47. Nakano, M. N., Mashiko, H., Ogawara, H., 1984, Cloning of the kanamycin resistance gene
from a kanamycin producing Streptomyces species, J. Bact., 157, p. 79-83.
48. Okanishi, M., Katagiri, K., Furumai, T., Takeda, K., Kawagichi, K., Saitoh, M., Nabeshima,
S., 1983, Basic techniques for DNA cloning and conditions required for streptomycetes as
host, J. Antib., 36, p. 99-108.
49. Okuda, T., Ito, Y., 1982, Biosynthesis and mutasynthesis of aminoglycoside antibiotics, n
Aminoglycoside antibiotics, Ed. Umezawa, H., Hooper, I. R., Springer Verlag., p. 111-203.
50. Omich, P. K., 1988, Streptomyces cloning: useful recombinant DNA systems and a
summation of cloned genes, Antim. Ag. Chemoth., 32, p. 1465-1471.
51. Peberdy, J. F., Illing, G. T., 1985, Genetic manipulation of antibiotic producer strains, in The
Scientific Basis of Antimicrobial Chemotherapy, Ed. D. Greenwood, F. O' Grady, p.283-322.
52. Pettey, T. M., Crawford, D. L., 1984, Enhancement of lignin degradation in Streptomyces
spp. by protoplast fusion, Appl. Envir. Microbiol., 47, p. 439-440.
53. Pokorny, M., Vitale, L., 1980, Enzymes as by-products during biosynthesis of antibiotics, n
Industrial and Clinical Enzymology, Ed. Vitale, L., Simeon, V., Pergamon Press Oxford, p.
13-25.
54. Pongs, O., 1979, Cloramphenicol, n Antibiotics, Ed.Hahn, F. E., Springer Verlag, 5,
p.
26-42.
55. Ramachandra, M., Crawford, D. L., Pometta, A. L., 1987, Extracellular enzyme activities
during lignocellulose degradation by Streptomyces spp.: a comparative study of wild-type
and genetically manipulated strains, Appl. Envir. Microbiol., 53, p. 2754-2760.
56. Robson, J. M., Chambliss, G. H., 1989, Cellulases of bacterial origin, Enzyme Microbiol.
Technol., 11, p. 626-644.
57. Schlochtermeier, A., Miemeier, F., Schrempf, H., 1992, Biochemical and electron
microscopic studies of the Streptomyces reticuli cellulase (avicelase) in its myceliumassociated and extracellular forms, Appl. Environ. Microbiol., 58, p. 3240-3248.
58. Schlochtermeier, A., Walter, S., Schroder, J., Moorman, M., Schrempf, H., 1992, The gene
encoding the cellulase (avicelase) Cel1 from Streptomyces reticuli and analysis of protein
domains, Molec. Microbiol., 6, p. 3611-362.
59. Srinivasan, M. C., Laxman, R. S., Deshpande, M. V., 1991, Physiology and nutritional
aspects of actinomycetes: an overview, World J. Microbiol. Biotechnol., 7, p. 171-184.
60. Tiraby, G., Bejar, S., Reynes, J. P., Sicard, P. J., Farber, G. K., Ringe, D., Petsko, G. A., 1989,
Genetic, enzymatic and crystallographic studies of the glucose isomerase of two
Streptomyces species, n Genetics and molecular biology of industrial microorganisms, Ed.
Hershberger, C. L., Queener, S. W., Hegeman, G., ASM, p. 119-126.
161
61. Vining, L. C., 1990, Functions of secondary metabolites, Ann. Rev. Microbiol., 44, p. 395427
62. Vining, L. C., 1992, Secondary metabolism, inventive evolution and biochemical diversity: a
review, Gene, 115, p. 135-140.
63. Wachinger, G., Bronnenmeier, K., Staudenbauer, W. L., Schrempf, H., 1989, Identification
of mycelium-associated cellulase from Streptomyces reticuli, Appl. Environ. Microbiol., 55,
p. 2653-2657.
64. Wilson, D. B., 1992, Biochemistry and genetics of actinomycete cellulase, Crit.Rev.
Biotechnol., 12, p. 45-63.
65. Winkelmann G., Allgaier H., Lupp R., Jung G., Iturin AL- a new long chain iturin a
possessing an unusual high content of C16--amino acids, J Antibiot (Tokyo) 1987 Apr.,
40(4): 437-42.
66. Wood, T. M., Bhat, K. M., 1988, Methods for measuring cellulase activities, Methods
Enzymol., 160, p. 87-112.
67. Zarnea, G., 1984, Tratat de microbiologie general, 1, Ed. Academiei.
68. Zimmermann, W., 1989, Hemicellulolytic enzyme systems from actinomycetes, n Enzyme
systems for lignocellulose degradation, Ed. Coughlan, M. P., Elsevier Applied Science, p.
167-181.
69. Zimmermann, W., Davis, B., Winter, B., Shou,W., 1992, Actinomycetes and their enzymes
for applications in the pulp and paper industry, n Biotechnology in Pulp and Paper Industry,
Ed. Kuwahara, M., Shimada, M., Uni Publishers, Co. LdT, p. 145-150.
162

Capitol Ul 5

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Capitol Ul 5

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Un aspect interesant este acela c, la multe dintre speciile de streptomicete, ncetinirea

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

metabolitilor secundari produi de bacili i

1.1. Activitatea antibiotic a metaboliilor secundari

Figura 2. Aspect electronomicroscopic al celulelor de Bacillus subtilis (dup Zarnea, 1984).

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Un alt antibiotic cu aciune inhibitoare asupra acizilor nucleici este granaticinul,

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

de S. hygroscopicus subsp. aureolacrimosus, nu are efect antibacterian dar acioneaz selectiv

Figura 3. Aciunea inhibitoare a tulpinii B.subtilis B2 asupra fitopatogenului Sclerotinia sclerotiorum.

Studiile privind oportunitatea utilizrii acestor specii bacteriene n combaterea

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

genetic al biosintezei unor antibiotice si a altor

In urma experimentelor de cartare a genelor implicate n metabolismul secundar la

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Un alt grup de antibiotice derivate de la poliketide este reprezentat de tetracicline i

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

fosfotransferaza de la S.glaucescens. Analizele de restricie i studiile de hibridizare a

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

este binecunoscut n cile de biosintez a metaboliilor secundari la fungi i streptomicete

In mod similar, gena de rezisten la kanamicin clonat de la bacteria productoare

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

modalitate de protecie fa de antibiotice nrudite. Spre exemplu, n cazul tulpinilor de

Reglarea exprimrii genelor implicate n metabolismul secundar

Metabolismul secundar este o form de difereniere biochimic a microorganismelor.

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

4. formarea metaboliilor secundari este determinat de seturi de gene asociate supuse

3. Enzime produse de bacteriile din genurile Bacillus si

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

De asemenea, studii recente au demonstrat posibilitatea utilizrii bacteriilor din genul

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Industria celulozei i hrtiei

Datorit acestor considerente o trecere n revist a principalelor tipuri de enzime (cu

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

proteazele includ dou familii distincte: serin-proteazele de la mamifere i cele de origine

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Figura 6. Selecia unor noi tulpini de Streptomyces sp. productoare de celulaze.

In cadrul unor exprimente realizate cu o tulpin de Streptomyces sp.SD16 izolat

Streptomicetele, ca multe alte bacterii, sitetizeaz celobiaz (-glucozidaz) dar n mod

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

colab.,1987) la care s-a ncercat izolarea i caracterizarea enzimei, ca i la S.thermodiastaticus

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rezultate interesante au fost obinute i de Mac Kenzie i colab.(1984) care au reuit,

Modificarea aspectului suprafeei celulelor de streptomicete cultivate n mediu de cultur

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

In ceea ce privete determinismul genetic al producerii enzimelor celulozolitice, datele

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus