Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

CAP. 3. INGINERIE GENETIC BACTERIAN

Ingineria genetic cuprinde tehnici efectuate n vitro cu gene, cromozomi sau celule ntregi n
scopul construirii unor structuri reprogramate genetic. Cuprinde o inginerie genetic celular
reprezentat de fuziunea de protoplati i o inginerie genetic molecular reprezentat de tehnologia
ADN recombinant. Tehnologia ADN recombinant reprezint un ansamblu de metode prin care se
realizeaz n vitro, molecule de ADN recombinante, permitnd, clonarea unor gene de origini diferite,
att n celula procariot ct i n celula eucariot. Realizarea acestei tehnologii presupune construirea
unor vectori de clonare, izolarea unor gene de interes (denumite iniial ADN pasager, n prezent, ADN
heterolog) i utilizarea unui echipament enzimatic corespunztor: endonucleaze de restricie, ADN
ligaze, polimeraze, exonucleaze, fosfataze alcaline, revertranscriptaze, terminaltransferaze, etc.
3.1. Vectori utilizai n clonarea genetic la Escherichia coli
Vectorii reprezint molecule de ADN n interiorul crora se introduc fragmentele de ADN de
studiat (ADN pasager, heterolog), ce poate fi de origine pro- sau eucariot.
Vectorii pot fi clasificai n funcie de diferite criterii:
a) posibilitatea studierii exprimrii fragmentelor de ADN pasager, vectorii se mpart n:
vectori de clonare - nu au n structur secvene de tip promotor i, ca atare, permit doar clonarea
unor fragmente de ADN pasager, dar nu i analiza exprimrii acestora, i vectori de exprimare
(implicit i de clonare) - au n structur secvene de tip promotor, permind att clonarea, ct i
analiza exprimarii fragmentului clonat.
b) tehnica de clonare folosit, vectorii pot fi: vectori de clonare inserional - ADN
pasager este clonat prin inserie la un situs unic de restricie din vector i vectori de clonare prin
inlocuire (substituie) - ADN clonat inlocuiete un fragment din vector, n urma digestiei cu 2
endonucleaze de restricie.
c) structura i modul de funcionare, vectorii se mpart n: vectori plasmidiali (sunt
derivai din, i au structur de plasmide); vectori virali (sunt derivai din, i au structura de genom
viral ); vectori hibrizi - fagimide (au structur hibrid, de genom de fag filamentos i de plasmid) i
cosmide (au structur hibrid, de genom de fag i de plasmid).
d) spectrul de gazde, exist vectori: vectori congenerici (pot fi folosii doar la tulpini ale
aceluiai gen taxonomic) i vectori shuttle (navet, suveic) - se replic stabil n, i pot fi folosii n
tulpini aparinnd la dou genuri microbiene, de exemplu: Escherichia/Pseudomonas,
Escherichia/Saccharomyces etc.
3.1.1. VECTORI DE CLONARE PLASMIDIALI
Proprietile plasmidelor ca vectori de clonare
Pentru a putea fi folosite ca vectori de clonare, plasmidele necesit o serie de caracteristici:
a) S nu conin gene tra, deci s nu genereze proces de conjugare bacterian i, ca atare,
s nu fie autotransmisibile. Aceast caracteristic este esenial att, pentru diversele etape de
cercetare, ct i pentru securitatea cercettorului (foarte muli vectori de clonare plasmidiali prezint
ca markeri de selectie gene de rezistent la antibiotice, iar dac vectorii ar fi autotransferabili ar
exista/crete riscul ca gene de antibiorezistent s ajung n diverse microorganisme patogene).
b) S conin situsuri unice pentru un numr ct mai mare de endonucleaze de restricie (la
acest nivel se efectueaz insertia ADN pasager).
c) Situsul de inserie s nu fie localizat n genele implicate n replicarea i partiia plasmidului.
d) S prezinte markeri genetici abseni n celula receptoare.
e) S aiba o greutate molecular mic, pentru a fi uor de izolat i de manipulat.
f) S prezinte ct mai multe copii per celul.
Primul plasmid natural care a fost folosit n experimente de clonare genetic este plasmidul Col E1
de la Escherichia coli (Fig.3.1.) Acest plasmid are o greutate molecular de 4.6 x 106 Da, este
neconjugativ, produce colicina E1 i confer gazdei imunitate la aceast colicin. Selecia celulelor
transformate (care au primit plasmidul) pe baza acestui marker (imunitatea la colicina) este o tehnic
dificil i, n final, reprezint un dezavantaj al folosirii acestui plasmid n experimentele de clonare
genetic. Pe de alt parte, plasmidul Col E1 poart i gene mob care i confer capacitatea de
transfer n trans, n prezena unui alt conjugon. Ca urmare, exist riscul diseminarii necontrolate a
plasmidului Col E1 recombinat.

Cap. 3-1 Vectori de clonare

Ulterior, au fost folosite alte plasmide naturale pSC101 i pRS2124 - care, datorit genei de
rezisten la tetraciclin i, respectiv, rezisten la
ampicilin, permit o selecie mai uoar a
transformanilor.
n urma unor asemenea testri a plasmidelor
naturale, s-a concluzionat c este necesar
construcia unor plasmide artificiale, destinate
exclusiv experimentelor de clonare.
n cele ce urmeaz vom prezenta cteva asemenea
plasmide artificiale utilizate ca vectori de clonare.

Fig.3.1. Plasmidul Col E1.

Vectorul pBR322
Fig.3.2. Vectorul pBR322.

Vectorul pBR322 (Fig.3.2.) este un vector plasmidial

cu o lungime de 4361 bp (2.6 x 106 D). n construcia
lui s-au folosit genele de replicare plasmidial din
ColE1, fapt pentru care acest vector desfoar o
replicare pe acelai model cu ColE1: replicare
realizat de ADN polimeraza I (i nu ADN polimeraza
III, ca n cazul replicrii cromosomului bacterian), n
control relaxat, cu reglaj realizat de molecule de ARN
antisens stabilizate de proteina Rop. Acest sistem
prezint avantajul c, atunci cnd tulpin gazd este
cultivat n prezen unei concentraii mari de
cloramfenicol (170 g/ml) - antibiotic ce inhib
ntreaga proteosintez din celula respectiv replicarea cromosomului bacterian este blocat (ntruct necesit biosinteza continu de ADN polimeraza
III), dar se poate desfaura replicarea vectorului,
proces realizat de ADN pol I (aceast enzim este
prezent n mod continuu n celula n cantitate foarte mare). n acest mod, are loc de fapt o amplificare
genetic prin creterea numrului de copii plasmidiale per echivalent molar cromosomial.
Vectorul are 2 markeri genetici - 2 gene de rezisten la ampicilin i, respectiv, la tetraciclin, ce sunt
transcrise n direcie invers una de cealalt.
Situsurile de restricie importante pentru experimentele de clonare sunt:
Pst I - n gena Apr
Hind III, BamH I, Sal I - n gena Tcr
Strategia de clonare n vectorul pBR322 i derivaii si (Fig.3.3.)
1 - Insertia ADN pasager construcia vectorului recombinat
ADN pasager va fi inserat ntr-unul din situsurile de restricie din cele 2 gene de antibiorezistent (Apr,
Tcr) : (1) ambele molecule (vector i ADN pasager) se supun digestiei cu o aceeai enzima de
restricie, ceea ce va conduce la obinerea de capete complementare; (2) se amestec cele 2 tipuri de
molecule (n anumite proporii molare) astfel digerate (n prealabil, vectorul linearizat este tratat cu
fosfataz alcalin pentru a evita recircularizarea lui); (3) se adaug i o ADN ligaza (de E.coli sau de
T4, funcie de tipul de capete obinute - netede sau coezive) ce va reface legturile fosfodiesterice
rezultnd vectorul recombinat .
n funcie de endonucleaza de restricie folosit la digestie, vectorul pBR322 recombinat va avea una
din cele 2 gene de rezisten (Tcr sau Apr) inactiv. Prin aceast inactivare inserional pot fi
deosebite moleculele de vector nerecombinat, fr ADN pasager (Apr Tcr) de moleculele de vector
recombinat, cu ADN pasager inserat (Apr Tcs sau Aps Tcr).
2 - Propagarea vectorului recombinat n tulpini de E.coli i selecia celulelor transformate
Vectorul recombinat se introduce (prin tehnici de transformare genetic n vitro) ntr-o tulpin
bacterian ce trebuie s prezinte sensibilitate la ambele antibiotice (Aps Tcs). Celulele transformate vor
prezenta fenotip Apr Tcs sau Aps Tcr.
2

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

Fig.3.3. Schema clonarii moleculare n

vectorul pBR322.

n ultimii ani, principalele

tendine n construcia vectorilor
plasmidiali sunt: (I) reducerea la
maximum a dimensiunii vectorilor
i mrirea capacitii lor de a
accept ADN heterolog; (II)
creterea numrului de situsuri de
restricie i distribuirea lor ntr-un
cluster = PolyCloning Site (PCS);
(III) ncorporarea n vectori a unor
secvene ce permit identificarea
celulelor cu vectori reconbinani
prin teste ct mai simple i mai
rapide : selecie direct (sisteme
ce permit numai creterea clonelor
recombinate) sau selecie prin
teste
histochimice;
(IV)
introducerea n vectori a unor
secvene ce permit generarea de
molecule monocatenare necesare
tehnicilor de secveniere sau de
construcie de sonde ADN; (V)
introducerea n vectori a unor
secvene
de
tip
promotori,
terminatori, enhanceri,ce permit
transcrierea n vitro a ADN clonat
(pasager).

Vectorii pUC 18/19

pUC 18/19 (Fig.3.4.) sunt vectori doar de clonare, nepermind i exprimarea ADN clonat. Au o
dimensiune de 2.69 kb.
Fig.3.4. Vectorul pUC 18/19.

Aceti vectori au regiunea ori din Col E1, cu

diferena ca a fost scoas gena rop. Ca atare,
aceti vectori sunt prezeni n mod obinuit ntr-un
numr foarte mare de copii per celul i prezint
un potenial crescut de amplificare prin tratament
cu cloramfenicol.
Aceti vectori au 2 tipuri de markeri genetici:
gena Apr - caracter pe care se bazeaz
selecia iniial (screeningul) a celulelor ce poart
vector;
gena lacZ- este o gen defectiv ce
al
exprim
doar
captul
NH2-terminal
galactozidazei;
Aceast gen incomplet este
capabil de complementaie intra-alelic cu o alt
form defectiv a genei lacZ (ce codific captul
COOH-terminal al -galactozidazei) dintr-o gazd
bacterian adecvat. n urma procesului de
complementaie, tulpina bacterian defectiv dar purttoare a vectorului nerecombinat este capabil
s refac integral galactozidaza. Sub inducia IPTG (isopropil-tio-D-galactosid, care este un
inductor al genei lacZ), o asemenea tulpin formeaz colonii albastre pe un mediu ce contine X-gal
(5-Br-4-Cl-3-indolil-D-galactosid).
3

Cap. 3-1 Vectori de clonare

Inseria unui ADN heterolog n situsul de policlonare (PCS, MCS) - care este inclus n
promotorul lui lacZ - determin imposibilitatea exprimrii genei lacZ i, ca atare, gena lacZ defectiv
din cromosomul gazdei nu mai este complementat de cea din vectorul recombinat i, ca urmare, nu
se mai formeaz galactozidaza activ care s scindeze complexul X-gal cu formarea compusului
indolic albastru. Coloniile ce poarta vectorul recombinat au culoarea alb. Este cea mai folosit
variant histochimic de selectie a clonelor recombinate.
Vectorii pUC18/19 reprezint prima familie de vectori de clonare la care situsurile pentru
endonucleazele de restricie au fost grupate ntr-o singura zon a vectorului, denumita situs de
policlonare (PCS = PolyCloning Site ; MCS = MultiCloning Site). n pUC18/19, PCS contine situsuri
pentru 10 endonucleaze de restricie i pentru 3 enzime izoschizomere. PCS este n orientare invers
n pUC19 fa de pUC18.
Clonarea n acest situs determin tot o inactivare insertional (o gen din vector nu se mai exprim),
diferen ns fa de vectorii de clonare anteriori (pBR322, pBR325, pUB110) constnd n
posibilitatea identificrii rapide, directe, a clonelor recombinate, pe baza diferenei de culoare dintre
colonii (colonii albastre = celule ce poart vector nerecombinat ; colonii albe = celule ce poart vector
recombinat).
Vectorii a cror derivai recombinai se bazeaz pe acest sistem de identificare histochimic
(complementaia intra-alelica ntre 2 gene defective lacZ, una cromosomial i cealalt pe vector),
necesit a fi introdui n gazde bacteriene adecvate, care s aibe pe cromosom o gen lacZ defectiv
ce codific capul COO - terminal al galactozidazei.
Strategia de clonare n vectorii pUC18/19 i derivaii si
a Inseria ADN heterolog n situsul de policlonare se realizeaz prin aceleai etape ca i n cazul
vectorilor anteriori: digestia vectorului i a ADN heterolog cu aceeai endonucleaz de restricie (sau
cu enzime izoschizomere), amestecarea fragmentelor i, respectiv, adugarea unei ADN-ligaze;
b - Introducerea vectorului recombinat n tulpini bacteriene adecvate (au pe cromosom o gena lacZ
defectiv ce complementeaz gena lacZ .
Selectarea clonelor celulare cu vector recombinat se realizeaza n 2 etape:
1 - cultivare pe mediu cu Ap i screeningul clonelor ce poart vector (Apr)
2 - cultivarea acestor clone celulare pe mediu cu IPTG i X-gal i selecia coloniilor ce poart vector
recombinat (= colonii albe)

VECTORII pGEM
Fig.3.5. Vectorul pGEM 3/4.

Vectorii pGEM (Fig.3.5., Fig.3.6.) sunt vectori

plasmidiali de exprimare care confer, deci, i
posibilitatea analizei exprimrii ADN heterolog. n
structura lor intr urmtoarele regiuni:
(1) regiunea ori din plasmidul Col E1, ce
controleaz replicarea vectorului;
(2) Apr = gena de rezistena la ampicilin, pe
baza creia sunt selecionai transformanii;
(3) regiunea PCS care conine situsuri pentru
10 endonucleaze de restricie + 3 enzime
izoschizomere;
(4) doi promotori, din fagii SP6 i T7, care
flancheaz regiunea PCS i care sunt n
orientare invers unul fat de celllt,
permind transcrierea ambelor catene ale
ADN heterolog.
Vectorii pGEM 3/4 (Fig.3.5.) au o dimensiune de
2.87 kb i difer intre ei prin orientarea situsurilor de restricie n cadrul regiunii PCS. Vectorii pGEM
3Z/4Z (Fig.3.6.) conin n plus fa de variantele 3/4 i o gen defectiv lac Z identic cu cea din
vectorii pUC 18/19, permind deci selecia histochimic a clonelor recombinate.

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

Fig.3.6. Vectorul pGEM 3Z/4Z.

3.1.2. VECTORI DERIVAI DIN FAGI FILAMENTOI

Fagii filamentoi (M13, f1, fd, Pf1) au genomul format dintr-o molecul ADN m.c. circular nchis, cu
greutate molecular medie de 2 x 106 D. Dup ptrunderea n celula bacterian, ADN fagic iniiaz
ciclul de replicare cu ajutorul unei forme intermediare de replicare dublu catenare. Replicarea se face
dupa modelul cercului rotativ i are ca rezultat formarea unui mare numar de catene ADN, notate prin
conventie - catene (catena infectant este notat cu +). Aceste catene vor servi ca matria n
transcrierea genelor fagice.
M13 este un fag filamentos specific pentru Escherichia coli. Are genom ADN m.c. (6.4 kb) cu
omologie mare cu genomul fagilor f1 i fd. 90% din genom este reprezentat de gene ce codific
proteine. Aceste gene sunt separate ntre ele doar prin cteva nucleotide, singurele regiuni intergenice
mai extinse sunt ntre genele VIII i III (IG 2), i respectiv, ntre II i IV (IG 1). Replicarea fagului M13
are loc pe modelul descris mai sus i este realizat de ADN polimeraza I a gazdei bacteriene. Dup
sinteza catenei (i, deci, formarea intermediarului dublu catenar de replicare), catena + este
nickat i, n continuare, este sintetizat catena + pe matri . Ceea ce rezult este o caten +
foarte mare, un concatemer format dintr-un mare numr de genomuri fagice. Ulterior, aceast
molecul va fi scindat n genomuri individuale.
Toate genele din fagii filamentosi sunt eseniale i, ca atare, vectorii derivai din acesti fagi trebuie s
prezinte toate genele fagilor slbatici. Exista totui o regiune de 500 nucleotide, situat intre genele II
i IV, n care poate fi inserat ADN heterolog.
Vectorii din seria mp (dintre care cei mai folositi sunt M13 mp 18/19 - 7.5 kb, Fig.3.7.) sunt derivai
dintr-un fag M13 recombinant (M13 mp1), care are un mic fragment de ADN din vectorul pUC 18/19
inserat n principala regiune intergenica (IG 1). Acest fragment de ADN de E.coli cuprinde :
1. gena lac I = gen ce codific represorul operonului Lac
2. gena lac Z = gena lac Z defectiv, ce codific captul NH4-terminal al galactozidazei
3. situsul PCS = situs de policlonare
Aceste secvene permit identificarea clonelor celulare infectate cu vector recombinat folosind acelai
sistem histochimic, bazat pe complementaia intra-alelica a celor 2 gene lac Z defective (una pe
cromosom, cealalt pe vector) i, respectiv, pe blocarea transcrierii de la promotorul lac prin inseria
ADN heterolog.
Diferena ntre M13 mp 18 i varianta 19 const n orientarea situsurilor de restricie n cadrul PCS.
n procesul de infectare a unei celule bacteriene de catre un fag M13 este esenial etapa de
interaciune dintre fag i pilii de sex ai celulei bacteriene. Ca atare, n experimentele de introducere a
unui vector M13 - derivat recombinat ntr-o tulpin bacterian este necesar folosirea tulpinilor
bacteriene F +, iar de regul se folosesc tulpini F . n afar de acest caracter, tulpinile bacteriene
folosite trebuie s mai aib urmatoarele caractere :
(I)
lacZM15 = o gen lac Z mutant n care a fost deletat regiunea ce codific capul NH4terminal al galactozidazei. Astfel, secvena lacZM15 codific pentru capul COO 5

Cap. 3-1 Vectori de clonare

terminal al galactozidazei i este capabil s desfoare complementaie cu gena lac Z

de pe vector, restaurnd activitatea normal a acestei enzime.
(II)
(lac-proAB) = deleia unui segment cromosomal ce include celelalte gene ale operonului
Lac, precum i genele proAB implicate n biosinteza prolinei. Genele proAB exist ns
pe episomul F, complementnd deleia cromosomal i asigurnd meninerea episomului
F n celula respectiv.
(III)
(III) lac I q = o gen lac I mutant ce sintetizeaz de aproximativ 10 ori mai mult represor
Lac I dect forma salbatic, represnd astfel i mai mult exprimarea operonului Lac, care
este oricum la un nivel sczut de transcriere n absena inductorilor. }i aceast gen este
de regul localizat pe episomul F .
(IV)
(IV) hsdR17 i hsdR4 = mutaii ce conduc la pierderea activitaii de restricie a ADN strin
de celula respectiv, dar nu i a activitaii de modificaie desfaurat de sistemele
enzimatice de restricie/modificaie de tip I. Astfel, ADN heterolog nemodificat (nemetilat)
clonat direct n vectori derivai din fagul M13 i propagat n tulpini bacteriene ce poart
asemenea mutaii va fi modificat (metilat) de ctre enzimele gazdei i, deci, protejat
mpotriva proceselor de restricie n cazul clonrilor ulterioare n alte tulpini hsd +.
Cteva exemple de asemenea tulpini bacteriene sunt: E.coli JM 105, 107, 109, 110, XL1-Blue.
Strategia de clonare n vectorii M13 mp 18/19
n experimentele de clonare n aceti vectori, de regul, un
fragment de ADN heterolog este clonat n ambele variante:
i M13 mp 18, i M13 mp 19.
1- Inseria ADN heterolog n vector
- forma replicativ (RF), dublu-catenara, a
vectorilor M13, mp 18 i 19, se supune digestiei cu 2
endonucleaze de restricie; vectorii astfel linearizai nu se
pot recirculariza dect cu capete compatibile cu cele
aleADN heterolog.
- ADN heterolog se supune i el digestiei
succesive cu aceleai 2 enzime de restricie;
- ADN heterolog se amesteca separat cu fiecare
din cei 2 vectori linearizai i se adaug o ADN-ligaza;
Rezult 2 tipuri de vectori recombinani, care au ADN
heterolog inserat n orientari opuse.
Fig.3.7. Vectorul M13 mp 18/19.

3.1.3. VECTORI DE CLONARE HIBRIZI DE TIP FAGIMIDE

Fagimidele sunt vectori hibrizi ce combin caractere de plasmide cu caractere de fagi filamentoi.
Caracterele de plasmide: au o origine a replicrii din ColE1, segment ce asigur replicarea de tip cerc
rotativ i meninerea vectorului n forma plasmidial; au o gen de rezisten la antibiotic, caracter
selectabil n tulpinile bacteriene ce poart acest vector.
Caractere de fag filamentos: au regiunea intergenica majora (IG 1) dintr-un fag filamentos. Aceast
regiune conine toate secvenele necesare n cis pentru ntreaga replicare a vectorului pe modelul
replicrii fagilor filamentosi i pentru morfogeneza particulelor virale.
Datorit acestor caractere duale, fagimidele pot fi propagate i meninute n forma plasmidial n
tulpin bacterian gazd atunci cnd aceasta este cultivat n condiii obinuite, standard. Cnd
celulele gazd sunt infectate cu un fag filamentos helper, atunci modul de replicare a vectorului se
schimb sub aciunea produsului genei II (endonucleaza II) codificat de virusul helper. Acest produs
interactioneaz cu regiunea intergenic din vector, iniiind replicarea pe modelul fagilor filamentoi i
genernd astfel monocatene ADN ce vor fi apoi clivate, circularizate i mpachetate n particule fagice.
ADN m.c. purificat din aceste particule n experimente de secveniere sau pentru obinerea de sonde
ADN m.c.
Actualmente se folosesc ca virusuri helper n asemenea experimente, virusuri cu genom modificat prin
manipulri genetice (de exemplu, M13 K07), astfel nct nu pot genera propriile particule fagice i au
gena II mutant ce acioneaz mai bine pe IG din fagimid dect pe IG propriu.
Cei mai reprezentativi vectori de clonare de tip fagimide sunt pUC 118/119 i pBluescript.

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

Vectorii pUC 118/119

Fig.3.8. Vectorul pUC 118/119.

Aceti vectori (Fig.3.8.) au o dimensiune de 3.2 kb

i sunt, de fapt, vectori hibrizi din categoria
fagimidelor. Fagimidele sunt vectori hibrizi ce au 2
origini de replicare: una (ori-Col E1) care genereaz
replicare de tip plasmidial (de regul, mecanismul
rolling circle) i una (dintr-un fag filamentos, oriM13 sau f1) care genereaz replicare de tip fag
filamentos,
adic
genereaz
monocatene.
Monocatenele sunt ulterior folosite n experimentele
de secveniere ADN, sau ca sonde ADN m.c.
ADN clonat n fagii filamentoi s-a dovedit a fi
instabil n timp (cu ct este mai mare fragmentul, cu
att mai instabil), suferind deleii i rearanjamente.
Astfel, avantajul major al fagimidelor l reprezint
posibilitatea pstrrii ADN heterolog inclus ntr-un
ADN circular i, ca atare, ADN clonat este mult mai
stabil (nu apar deletii, rearanjamente). Pe de alt
parte, pUC 118/119 pot accepta ADN heterolog
mult mai mare dect pUC 18/19.
Ca i pUC 18/19, varianta 118/119 au ori-Col E1 fr gena rop. Poart gena Apr pentru screeningul
clonelor transformate i gena lacZ pentru selecia histochimic a clonelor recombinate.
Situsul PCS este inclus n promotorul genei lacZ (Plac) i, ca urmare, clonarea va bloca transcrierea
genei lacZ.
Strategia de clonare n vectorii pUC 118/119
a - Insertia ADN heterolog n vector se realizeaz dup aceleai etape ca i la vectorii anterior
prezentai.
c - Introducerea vectorului recombinat n celule bacteriene se efectueaza tot prin tehnici de
transformare genetic microbian. Screeningul i selecia clonelor recombinate se efectueaza n
acelai mod ca i n cazul vectorilor pUC 18/19.

Fig.3.9. Vectorul pBluescript.

Vectorul pBluescript
Vectorii din seria pBluescript (Fig.3.9.) sunt vectori de tip
fagimide, multifuncionali, construii pentru a simpifica
clonarea molecular i analiza genetic. Asemenea
vectori ofera urmtoarele avantaje n experimentele de
clonare : clonare multipla n PCS (Tab.3.1); selectie
histochimic a clonelor recombinate (colonii albe);
transcriere n vitro a ADN heterolog, mediat de
promotorii T3 i T7; obinere de monocatene ADN;
exprimarea de proteine de fuziune (cu galactozidaz)
1. Replicarea vectorului
pBluescript (Fig.3.9.) are 2 origini de replicare: una din
plasmidul Col E1 (de la Escherichia coli) i cealalt din
fagul filamentos f1. Originea din Col E1 controleaza
replicarea vectorului prin mecanismul cercului rotativ i,
deci, permite meninerea vectorului sub forma de
molecule ADN d.c. circular covalent inchis (CCC).
Originea din fagul f1 este activat n trans de proteine
codificate de genomul unui alt fag (M13), introdus ca fag
helper, cu genom modificat, astfel inct acesta nu se
poate replica.

Cap. 3-1 Vectori de clonare

2. Situsul PCS
Regiunea de policlonare din pBluescript conine situsuri pentru 20 de endonucleaze de restricie: Sac
I, Bst XI, Sac II, Not I, Eag I, Xba I, Spe I, BamH I, Sma I, Pst I, EcoR I, EcoR V, Hind III, Cla I, Sal I,
Acc I, Hinc II, Xho I, Apa I, Dra II, Kpn I, oferind astfel un set foarte bogat de enzime pentru clonare.
Exist diverse variante de vectori pBluescript - SK, KS funcie de orientarea situsurilor de restricie
(Sac I Kpn I sau Kpn I Sac I).
Regiunea este ncadrata de promotorii T3 i T7 i ntreg acest complex este flancat de cte un situs
pentru endonucleaza de restricie BssH II (situs extrem de rar n genomuri), cu ajutorul creia poate fi,
deci, excizat.
3. Transcriere n vitro (Fig.3.10.)
Situsul de policlonare este ncadrat de promotorii T3 i T7 care permit desfurarea unui proces de
transcriere n vitro. Din multitudinea de promotori disponibili la bacterii i bacteriofagi au fost alei
aceti 2 promotori din fagii T3 i, respectiv, T7, datorit faptului c ei sunt recunoscui foarte specific
de ARN polimeraz cognat, astfel nct se elimin riscul ca aceasta enzim s desfaoare proces de
transcriere de la alt promotor.
Acesti 2 promotori se gsesc n orientare invers unul fa de cellalt i, ca atare, ADN heterolog
clonat poate fi transcris pe oricare din cele 2 catene, funcie de orientarea pe care o are n molecula
de vector recombinat.
Procesul de transcriere n vitro permite obinerea de molecule ARN ce pot fi apoi folosite ca sonde
moleculare n experimente de hibridizare molecular.
Pe de alt parte, dupa transcriere n vitro poate fi realizat i un proces de traducere n vitro, ceea ce
conduce la obtinerea de proteine care pot fi ulterior analizate.
4. Obtinerea de monocatene ADN (Fig.3.11.)
Dupa clonarea n PCS, vectorul recombinat (care se afl n form CCC) se introduce, prin
transformare genetic, n celule bacteriene. Pentru a obtine monocatene, tulpin bacterian n care se
afl deja vectorul recombinat, se infecteaz cu un fag M13 defectiv (M13 K07) care are gena II
mutant, astfel inct produsul ei va aciona preferenial asupra secvenei ori-f1 din fagimid,
declannd replicarea ADN pe modelul fagilor filamentoi i, deci, obinerea de monocatene. n funcie
de orientarea regiunii ori-f1 n fagimid (f1+ sau f1-) monocatena va conine catena sens sau cea
antisens a genei lac Z.
Pentru a putea infecta gazd bacterian cu un fag M13 este necesar ca tulpin bacterian folosit s
aib un plasmid F integrat n cromosom, astfel inct s prezinte pe suprafaa celular pili de sex.
Procesul de infectare a unei gazde bacteriene de ctre un fag filamentos presupune ca etapa iniiala
ataarea fagului la pilii de sex ai celulei.
pBluescript II KS

pBluescript II SK

pBluescript I SK

BssH II
T7
Sac I
Bst XI / Sac II
Not I / Eag I
Xba I
Spe I
BamH I
Sma I
Pst I
EcoR I
EcoR V
Hind III
Cla I
Sal I / Acc I / Hinc III
Xho I
Apa I
Dra II
Kpn I
T3
BssH II

BssH II
T7
Kpn I
Dra II
Apa I
Xho I
Sal I / Acc I / Hinc II
Cla I
Hind III
EcoR V
EcoR I
Pst I
Sma I
BamH I
Spe I
Xba I
Not I / Eag I
Bst XI / Sac II
Sac I
T3
BssH II

T7
Kpn I
Dra II
Apa I
Xho I
Sal I / Acc I / Hinc II
Cla I
Hind III
EcoR V
EcoR I
Pst I
Sma I
BamH I
Spe I
Xba I
Not I / Eag I
Bst XI / Sac II
Sac I
T3

Tab.3.1. Componena n situsuri de restricie a regiunii PCS n 3 variante ale fagimidului pBluescript.

5. Obinerea de proteine de fuziune

Pentru obinerea unei cantiti suficiente din proteina heterolog, sub o forma molecular neatacabil
de ctre proteazele celulare, se poate realiza un proces de transcriere i traducere n vitro pornind de
la promotorul lac. ADN heterolog fiind clonat n PCS, deci, n interiorul lui LacP, n urma traducerii se
va obine o protein de fuziune - proteina heterolog plus -galactozidaza.

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

Fig.3.10. Obinerea de molecule ARN prin

proces de transcriere n vitro a unui fragment
de ADN heterolog clonat n fagimidul
pBluescript.

Fig.3.11. Obinerea de monocatene ale

ADN heterolog clonat n fagimidul
pBluescript.

Cap. 3-1 Vectori de clonare

3.1.4. VECTORI DERIVAI DIN GENOMUL BACTERIOFAGULUI

De cnd a fost folosit pentru prima dat ca vector de clonare (Murray i Murray 1974),
bacteriofagul (se citete lambda) a ocupat un rol central n experimentele de clonare. Pe baza
analizelor de genetic i fiziologie a acestui virus, n prezent, au fost construii i sunt comercializai o
serie de vectori suficient de sofisticai.
Genomul fagului , prezentnd dimensiuni mari, nu poate fi utilizat ca atare ca vector de
clonare. Cu att mai mult cu ct ADN-ul su conine multe situsuri pentru enzime de restricie n gene
eseniale pentru ciclul litic al fagului. Pe de alta parte, particulele fagice nu pot prelua o cantitate mult
mai mare de ADN dect propriul genom.
Totui, toate aceste impedimente au fost depite :
1. regiunea central a genomului viral (ce reprezint aproximativ 1/3 din genom) nu este esenial
pentru creterea litic i, ca atare, poate fi nlocuit de ADN heterolog; aceast regiune a fost
denumit stuffer
2. prin manipulare genetic situsurile de restricie au fost eliminate din regiunile eseniale
3. mai mult dect att, folosind oligonucleotide sintetice, situsurile de restricie au fost plasate exact n
poziiile cele mai favorabile
Toate aceste metode au condus la dezvoltarea unui mare numr de vectori ce pot accepta i
propaga fragmente de ADN heterolog, folosind un set foarte larg de enzime de restricie.
n funcie de tehnica de inserare a ADN heterolog, vectorii derivai dinfagul se clasific n :
a) vectori inserionali - se caracterizeaz prin faptul c prezint un unic situs pentru o anumita
endonucleaz de restricie, situs la nivelul cruia se insera ADN heterolog, fr a nlocui vreo regiune
din vector;
b) vectori de substituie (nlocuire) prezint 2 situsuri pentru o aceeasi endonucleaza de restricie,
cele 2 situsuri flancnd o regiune neeseniala a vectorului (regiunea stuffer); aceasta regiune va fi
inlocuit cu ADN heterolog, genernd vectorul recombinat.
Alegerea vectorului adecvat
Nici unul din vectorii derivai din fagul nu sunt adecvai pentru toate experimentele de clonare
moleculara. Ca urmare, este necesar alegerea vectorului cel mai adecvat scopului urmrit i, n
consecin trebuie luai n considerare 3 factori:
2. enzima (sau enzimele de restricie) ce vor fi folosite;
3. dimensiunea fragmentului de ADN heterolog ce urmeaz a fi clonat;
4. dac vectorul va fi folosit i pentru exprimarea ADN heterolog n E.coli.
Construcia de vectori ce conin situsuri multiple de clonare a simplificat foarte mult mecanismele
de clonare molecular n vectori derivai din fagul Totui, dimensiunea insertului ramne nca un
factor important de luat n considerare. Aproape 60% din genomul viral (braul stng - 20 kb
incluznd genele capsidei i genele cozii - de la A pna la J i braul drept - 8-10 kb - de la PR pna la
cos) este necesar pentru ciclul litic al fagului Deci, treimea central a genomului viral poate fi
nlocuit de ADN heterolog. Cu toate acestea, viabilitatea bacteriofagului descrete simitor atunci
cnd dimensiunea total a genomului este n afara limitelor de 78-105% fa de fagul slbatic.
Sisteme de selecie a vectorilor -derivai recombinanti
1) folosirea unor sisteme genetice ce se gsesc n regiunea de nlocuit (stuffer). De exemplu, exist
vectori derivai din i care poart n regiunea stuffer o gena lac Z (ce codific pentru
galactozidaz). Atunci cnd sunt introdui n gazde bacteriene lac , iar acestea cultivate n prezena
substratului cromogen X-gal, formeaz plaje de liza de culoare albastru inchis. Introducerea n acesti
vectori de substituie a unui fragment de ADN heterolog, conduce la eliminarea genei lac Z i, ca
urmare, vectorii recombinati vor forma plaje de liza incolore.
2) n cazul vectorilor de inserie - de exemplu, gt10 - care conine un unic situs pentru EcoRI localizat
n gena cI, se recomand folosirea unei tulpini de Escherichia coli mutant - care are o mutaie hfl
(high frequency of lysogenisation). n asemenea mutante, produsul genei fagice cII se acumuleaz n
cantiti foarte mari, acest produs fiind de fapt un reglator pozitiv al genei cI, care, la rndul ei,
determin represia ciclului litic i intrarea n ciclul lizogen. Ca urmare, vectorii nerecombinai vor intra
automat n ciclul lizogen i, deci, nu vor produce plaje de liz.
Introducerea ADN heterolog prin inserie la situsul Eco RI din gena cI va inactiva aceast gen i, ca
urmare, toate genomurile fagice recombinate vor intra n ciclul litic. Aceast metod este extrem de
folositoare pentru screningul unor banci de gene clonate n vectorul gt10.

10

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

3) un alt tip de selecie se bazeaz pe faptul ca multiplicarea fagului slbatic este restrictat n
gazde ce poart profagul P2. Acest fenotip este denumit Spi+ (sensibil la interferena cu P2). Totui,
tulpinile de fag ce nu au genele implicate n recombinare (red i gam) pot crete bine n gazde
lizogene pentru P2 i prezint, deci, fenotip Spi .
Pe baza acestor constatri au fost construii o serie de vectori derivai din ( DASH, EMBL) care
au genele red i/sau gam n regiunea stuffer. Inlocuirea acestei regiuni cu un ADN heterolog
conduce la obtinerea de vectori recombinati ce prezint fenotip Spi i care, deci, cresc eficient n
tulpini de E.coli lizogene pentru P2.
4) n anumite condiii, meninerea genelor red i/sau gam n vectorii fagici recombinati prezint o serie
de avantaje. Produsul genei red este implicat n evenimentele de recombinare timpurii din timpul
ciclului litic, evenimente ce resolva ADN viral replicativ (de forma theta) n molecule CCC. Ulterior,
aceste molecule devin matrie pentru replicarea de tip cerc rotativ, formndu-se oligomeri lineari ai
ADN viral ce vor fi mpachetai n particulele fagice mature.
Produsul genei gam inactiveaz exonucleaza V a gazdei codificat de genele recB i recC ale
gazdei bacteriene. n absena produsului genei gam, exonucleaza V (RecBC) degradeaz moleculele
lineare concatenate ale ADN viral produse prin replicare de tip cerc rotativ. Astfel, ntr-o bacterie
infectat cu un fag gam , exist foarte puine molecule virale disponibile pentru mpachetare. Ca
urmare, fagii red i gam trebuie propagai n gazde recA+ (RecA este protein major a recombinrii
n Escherichia coli).
5) Un ultim factor genetic ce trebuie luat n considerare n alegerea unui vector derivat din fagul este
prezena situsului chi. Bacteriofagul slbatic nu conine nici un situs chi. Situsurile chi sunt situsurile
preferate pentru recombinarea mediat de enzima RecBC a gazdei. Mutantele ce poart o secvena
chi octanucleotidic supreseaza fenotipul Spi ce apare n mod normal la fagii red gam n tulpini
slbatice de E.coli. Aceast supresie poate fi explicat prin faptul c, n prezena situsurilor chi,
procesul de recombinare ce d nastere la molecule virale mpachetabile este crescut, astfel inct
plajele de liz formate sunt aproape la fel de mari ca i n cazul fagilor red+ gam+.
Majoritatea vectorilor au aceste 2 gene (red i gam) n regiunea stuffer, astfel inct atunci
cnd n vector este introdus ADN heterolog, vectorii recombinai prezint fenotip red gam. Totui,
ADN heterolog eucariot conine foarte frecvent secvene ce mimeaz situsuri chi i, ca urmare, vectorii
recombinati vor avea fenotip Spi+ i, deci, nu vor putea fi selectati pe baza acestui sistem genetic.
Astfel de vectori se recomand a fi propagati n gazde recBC pentru a putea fi selectai prin sistemul
Spi/Spi+.
Mai recent au fost construii i vectori care permit nu numai clonare i propagarea ADN
heterolog, dar i exprimarea acestuia n gazde bacteriene (de exemplu, gt11).
Vectorii CHARON
Vectorii Charon sunt vectori de clonare (nu i de exprimare). Ei sunt n general folosii ca
vectori de nlocuire, dar prezint i situsuri unice pentru endonucleaze de restricie, fapt ce permite i
clonarea unui ADN heterolog prin mecanisme de inserie. n seria vectorilor Charon, de la Charon 3A
pna la Charon 40, crete dimensiunea ADN heterolog ce poate fi clonat.
Aceti vectori sunt folosii cu precdere ca vectori suport pentru bncile de gene.
Vectorul CHARON 4A
Vectorul Charon 4A permite clonare att prin substituie, ct i prin inserie, dar de regul este
folosit ca vector de substituie pentru bnci genomice ale ADN eucariot. Dimensiunea acestui vector
este de 45.4 kb i accept ADN heterolog de 0-6 kb (n clonarea prin inserie) sau de 7-20 kb (n
clonarea prin substitutie). n regiunea central, neesential, acest vector poart o gena lac Z, ceea ce
permite identificarea recombinantilor de inserie prin fenotip Lac+, i o gena bio, ceea ce permite
cresterea gazdelor bio.
Caracteristici genetice
Substituie
Inserie
Statusul red/gam al vectorului
Statusul red/gam al recombinanilor
Situs chi n recombinani
Propagare n gazde recA
Selecie Spi

lac5, bio256, QSR80

Da
red gam
red gam
probabil
Nu
Nu

Situsuri de clonare
Situs
EcoRI
XbaI

11

Inserie/
Substituie
Substituie
inserie

Dimensiune (kb)
Braul
stng
19.5
24.8

insertul
7-20
0-6

bratul
drept
11.0
20.5

Fenotipul
recombinantilor
Lac Bio
+
+
Lac Bio

Cap. 3-1 Vectori de clonare

Vectorul CHARON 40

Fig.3.12. Vectorul Charon 40.

Acest vector (Fig.3.12.) este

numai vector de nlocuire,
ntru-ct nici unul din situsurile
de restricie nu este unic.
Prezinta
2
situsuri
de
policlonare (PCS) ce conin
cte 16 situsuri de restricie.
Cei 2 PCS se afl n orientare
invers.
Regiunea
stuffer
(POLYSTUFFER)
are
o
secven unic pentru Charon
40 i conine o secven repetat de aproximativ 80 de ori. Aceast secven cuprinde operatorul lac
i un fragment de ADN de adenovirus. Fiecare unitate de repetare are un situs pentru endonucleaz
de restricie Nae I. Prin digestie cu aceast enzim, regiunea polystuffer este digerat n multe
fragmente mici ce pot fi ndepartate prin precipitare cu PEG (polietilenglicol). Aceast structur a
stuffer-ului permite o foarte bun ndepartare a regiunii de nlocuit.
Vectorul Charon 40 poate accepta fragmente de ADN heterolog cu dimensiuni cuprinse ntre 9.2 i
24.2 kb.
Acest vector are gena gam+ n braul stng i nu n regiunea de nlocuit, astfel inct att vectorul
nerecombinat, ct i cel recombinat se pot propaga n tulpini de E.coli recA.
Caracteristici genetice
Substituie
Inserie
Statusul red/gam al vectorului
Statusul red/gam al recombinailor
Situs chi n recombinai
Propagare n gazde recA
Selecie Spi

regiunea polystuffer
Nu
+
red gam
+

red gam
Absent
Da
nu

Situsuri de clonare
Situs
EcoRI, ApaI, XbaI,
SfiI, SacI, AvrII, SalI,
SpeI, HindIII, XhoI,
BamHI, NaeI, KpnI,
NotI, SmaI, XmaIII

Inserie/
Substituie

Dimensiunea (kb)
Braul
insert
stng

Braul
drept

substitutie

19.2

9.6

9.2-24.2

Fentipul recombinantilor

Majoritatea plajelor
sunt recombinante.
Regiunea stuufer este
indepartata eficient

Strategia de clonare n Charon 40

1) Inserarea ADN heterolog n vector
- att vectorul ct i ADN heterolog se supun digestiei cu o aceeai endonucleaz
de restricie
- vectorul digerat se supune n continuare unei digestii cu endonucleaza de
restricie Nae I ce va cliva regiunea polystuffer n fragmente mici; aceste
fragmente sunt apoi ndepartate prin precipitare cu PEG
- vectorul astfel tratat se amestec cu ADN heterolog i se adaug o ADN-ligaz
vector recombinat
2) Introducerea vectorului recombinat ntr-o tulpin bacterian
- se recomand o tulpin recA de Escherichia coli F+
- pentru infectare se amestec suspensia bacterian cu vectorul recombinat i se
incubeaz timp variabil la 37oC
(de fapt, este vorba de un amestec ce conine att molecule recombinate,
ct i molecule nerecombinate)
3) Selecia moleculelor de vector recombinat
- dupa infectare, suspensia bacteriana se amestec cu agar moale i se toarn ca
strat n placi Petri cu mediu adecvat
- dup incubare, se aspir cu o micropipet stratul de agar moale corespunztor
unei plaje de liz mari (de altfel, majoritatea plajelor formate sunt
determinate de fagi recombinai); ulterior, particulele fagice se purific din
acest agar moale.

12

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

VECTORII EMBL
Sunt vectori de clonare, de nlocuire, ce pot integra ADN heterolog de pna la 20 kb.
Regiunea stuffer este ncadrat de 2 situsuri de policlonare (PCS) ce conin cte 3 situsuri de restricie
i sunt n orientare invers. De exemplu, la EMBL 4 aceast zona are urmtoare structur :
EcoRI , BamHI , SalI - STUFFER - SalI , BamHI , EcoRI
Vectorii din seria EMBL sunt foarte utili pentru clonarea fragmentelor de digestie parial cu
endonucleaza de restricie Sau3AI, datorit faptului c n vector situsul BamHI este flancat de EcoRI i
SalI i, ca urmare, fragmentele clonate pot fi excizate din recombinani prin digestie cu EcoRI sau cu
SalI.
In regiunea stuffer, vectorii EMBL au genele red i gam i, deci, prezint fenotip Spi+ atunci cnd
infecteaz tulpini bacteriene lizogene pentru bacteriofagul P2. Recombinaii au fenotip Spi i astfel
pot fi selectai pe gazde lizogene cu profag P2.
Vectorul EMBL 4 (Fig.3.13.)
Caracteristici genetice
Substituie
Inserie
Statusul red/gam al vectorului
Statusul red/gam al recombinanilor
Situs chi prezent n recombinani
Selecie Spi

red, gam trpE

Nu
+
+
red gam

red gam
Probabil
Da

Situsuri de clonare
Situs
SalI
BamHI
EcoRI

Inserie/
Substituie

Dimensiune (kb)
Braul
stng

insert

Braul
drept

Fenotipul
recombinanilor

substitutie

19.9

7-20

8.8

Spi

Fig.3.13. Vectorul EMBL 4

VECTORII gt
Vectorii din seria gt sunt vectori de clonare i/sau exprimare folosii pentru clonarea unor
fragmente mici de ADN (6 kb) ntr-un situs unic pentru endonucleaza de restricie EcoRI, situs
localizat n regiunea de imunitate (imm). Ca atare, acesti vectori sunt vectori inserionali.
Datorit localizrii situsului de inserie n regiunea de imunitate, vectorii nerecombinanti au fenotip cI+
i, deci, lizogenizeaz n tulpini bacteriene hfl. Vectorii recombinani au fenotip cI i, ca urmare, n
bacterii hfl intr n ciclul litic i formeaz plaje de liz, putnd astfel s fie selectai prin acest sistem.
Vectorul gt10 (Fig.3.14.)
Caracteristici genetice
Substituie
Inserie
Statusul red/gam al vectorului
Statusul red/gam al recombinanilor
Situs chi prezent n recombinani
Propagare n gazde recA
Selectie Spi

13

da (regiunea imm)
nu
+
+
red gam
+
+
red gam
nu
da
nu

Cap. 3-1 Vectori de clonare

Situsuri de clonare
Situs
EcoRI

Inserie/
Substituie
inserie

Dimensiunea (kb)
Braul
stng
32.7

insert
0-6

Braul
drept
10.6

Fenotipul
recombinanilor
cI

Fig.3.14. Vectorul gt 10.

Fig.3.15. Vectorul gt 11.

Vectorul gt 11
Vectorii din seria gt11 i gt18-23 sunt tot vectori de inserie, dar nu sunt numai pentru
clonare molecular, ci permit i exprimarea ADN heterolog inserat, sub forma unei proteine de fuziune
cu -galactozidaza i, ca urmare, recombinanii sunt Lac (atunci cnd fragmentul de -galactozidaza
este complexat cu proteina heterolog el nu mai poate complementa cu fragmentul de galactozidaza codificat de cromosomul gazdei). Deseori, aceti vectori sunt folosii n experimente de
screening imunologic, fie al plajelor, fie al coloniilor bacteriene.
Vectorul gt 11 (Fig.3.15.) este folosit de regul pentru screening imunologic. Fragmentele de ADN (
de pna la 7.2 kb) sunt clonate n unicul situs pentru EcoRI localizat n gena lacZ, permitnd astfel
exprimarea unei proteine de fuziune dac secvena clonat este n-frame cu gena lacZ.
Caracteristici genetice
Substituie
Inserie
Statusul red/gam al vectorului
Statusul red/gam al recombinanilor
Situs chi prezent n recombinani
Propagare n gazde recA
Selecie Spi

nu
da (gena lacZ)
+
+
red gam
+
+
red gam
nu
da
nu

Situsuri de clonare
Situs
EcoRI

Inserie/
Substituie
inserie

Dimensiunea (kb)
Braul
insert
stng
19.5
0-7.2

Braul
drept
24.2

Fenotipul
Recombinanilor
Lac

14

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

Vectorul DASH

Fig.3.16. Vectorul DASH.

Vectorul DASH (Fig.3.16.) este un

vector de substituie la care
regiunea stuffer conine genele
red, gam i bio. Aceast regiune
este flancat de 2 situsuri de
policlonare (PCS) constituite din
cte 7 situsuri de restricie (XbaI,
SalI, EcoRI, BamHI, SacI, XhoI). n
interiorul celor 2 situsuri de
policlonare se gsesc i promotorii
T3 i T7 care permit sinteza de
sonde ARN sau chiar de proteine
heterologe fr o prealabil
subclonare a ADN heterolog.
Prezena genelor red i gam n regiunea inlocuit de ADN heterolog face ca vectorii nerecombinani
s aib fenotip red+gam+(Spi+), iar cei recombinani, fenotip red gam (Spi ).
Caracteristici genetice
Substituie
Inserie
Statusul red/gam al vectorului
Statusul red/gam al recombinanilor
Situs chi prezent n recombinani
Propagare n gazde recA
Selecie Spi

da (genele red, gam i bio)

nu
+
+
red gam
red gam
probabil
nu
da

Situsuri de clonare
Situs
XbaI, SalI,
EcoRI, BamHI, HindIII,
SacI, XhoI

Inserie/
Substituie

Dimensiunea (kb)
Braul
insert
stng

Braul
drept

Fenotipul
Recombinanilor

substitutie

20

Spi

9-22

VECTORII ZAP
Fig.3.17. Vectorul ZAP II
Vectorul
ZAP
(Fig.3.17.) este un vector de
inserie complex. n regiunea
central, neesential, n locul
genelor fagice, conine vectorul
fagimid pBluescript SK (M13).
n regiunea amino-terminal a
genei lac Z din acest fagimid
se gsete un situs de
policlonare (PCS) n interiorul
cruia se inser de fapt ADN
heterolog.
Vectorul plasmid din interiorul lui ZAP are rolul de a facilita experimentele de secveniere
ADN i ARN, precum i obinerea de sonde ARN cu ajutorul promotorilor T3 i T7 ce flacheaz ADN
heterolog clonat. Totodat, un asemenea sistem genetic permite obinerea de proteine de fuziune cu
galactozidaza.
ADN corespunztor vectorului pBluescript SK (M13) poate fi excizat (Fig.3.18. i Fig.3.19.) n
prezena fagilor helper f1 sau M13. ZAP conine 2 secvene semnal necesare pentru iniierea exciziei
(I) i pentru terminarea acesteia (T).
Caracterisiticile genetice
Substituie
Inserie
Statusul red/gam al vectorului
Statusul red/gam al recombinanilor
Situs chi prezent n recombinani
Propagare n gazde recA
Selecie Spi

15

da (de la T pna la I)
nu
+
+
red gam
+
+
red gam
probabil
da
nu

Cap. 3-1 Vectori de clonare

Situsuri de clonare
Situs
SacI, NotI,
XbaI, SpeI,
EcoRi, XhoI

Inserie/
Substituie

Dimensiunea (kb)
Braul
insert
stng

Braul
drept

Fenotipul
Recombinanilor

inserie

21.8

8.1

Lac

0-10

Fig.3.18. Schema clonrii n ZAP II.

Fig.3.19. Tranziia vectorului ZAP II recombinat prin

diverse forme moleculare.

3.1.5. VECTORI DE CLONARE HIBRIZI DE TIP COSMIDE

Cosmidele sunt vectori hibrizi ce conin ADN plasmidial i situsul cos din genomul fagului
Prezentnd secvena ori din plasmidul Col E1 i gena de rezisten la ampicilin (Apr), cosmidele se
pot replica i menine n celula bacterian n forma pasmidial (CCC) i permit selecia
transformanilor pe mediu cu ampicilin.
Situsul cos permite mpachetarea n vitro a vectorului recombinat (obtinere de particule fagice
mature) i, implicit, propagarea sa prin transducie sau transfecie.
Dintre cele 2 forme moleculare, plasmid i genom fagic, cea de-a doua form este cea care
permite meninerea si propagarea stabil a unui ADN heterolog de dimensiuni mari.
Aceti vectori permit clonarea unor fragmente mari de ADN genomic, de aproximativ 45 kb, permind
astfel propagarea unor gene eucariote n intregime ntr-o singur molecul de ADN recombinant.
Insertul acceptat de cosmide este mult mai mare dect n cazul vectorilor derivai din fagul
(aproximativ 24 kb), ceea ce reprezint un avantaj n realizarea bncilor genomice la eucariote.
O alt utilizare a cosmidelor este clonarea i analiza unei regiune de ADN genomic ce face
parte dintr-o familie de gene. De exemplu, genele mamaliene pentru globine, care sunt cuprinse ntr-o
regiune de 75 kb, pot fi clonate n doar 2 specii moleculare de cosmide.
COSMIDE pentru PROPAGAREA ADN heterolog eucariot n E.coli
Asemenea cosmide au o singur secvena de control al replicrii, ori din Col E1, permind astfel
replicarea doar n celul bacterian.

16

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

Cosmidul pJB8 (Fig.3.20.)

Acest vector are 5.4 kb i conine urmtoarele secvene:
5. ori din plasmidul Col E1, care i permite replicarea de tip
plasmidial n celule de E.coli
6. gena de rezisten la ampicilin (Apr) ce reprezint
markerul de selecie a transformanilor pe mediu cu acest
antibiotic
7. situsul cos (derivat din vectorul Charon 4A) care permite
mpachetarea vectorului recombinat n particule fagice
mature
8. regiunea PCS care conine situsuri pentru 4
endonucleaze de restricie (BamH I, EcoR I, Cla I, Hind
III)

Fig.3.20. Cosmidul pJB8.

Strategia de clonare n pJB8 (Fig.3.21.)

1) Se realizeaz 2 experimente separate de digestie enzimatic a moleculelor de cosmid cu Hind III
i, respectiv, Sal I. Se obin molecule lineare de vector cu capete coezive Hind III i, respectiv, Sal I.
2) Ambele tipuri de molecule lineare se supun apoi (tot separat) unei digestii cu BamH I, rezultnd,
deci, molecule lineare cu capete coezive de BamH I; din moleculele digerate anterior cu Sal I, rezult
n urma digestiei cu BamH I, 2 tipuri de fragmente: unele ce conin ori i Apr i, altele ce conin cos;
pentru etapele urmtoare ale clonrii se aleg fragmentele ce conin situsul cos.
3) ADN genomic eucariot se diger cu endonucleaz de restricie Mbo I, aceasta enzim fiind
izoschizomer cu BamH I.
4) fragmentele lineare de vector obinute n urma digestiei cu BamH I se amestec cu fragmentele
lineare de ADN genomic obinute prin digestia cu Mbo I i se adaug T4-ADN-ligaz. Rezult
molecule lineare, recombinate, ce contin: cos-ori-Apr-ADN heterolog-cos.
5) Aceste fragmente sunt supuse unui proces de mpachetare n vitro, proces n care etapa iniial
este realizat de enzima terminaza A - o endonucleaz ce recunoate specific situsurile cos, rupnd
legturile fosfodiesterice n ambele catene de la acest nivel. Rezultatul mpachetarii l reprezint
particule fagice mature,
capabile de transducie
sau transfecie, particule
ce nu conin nsa genom,
ci cosmidul recombinat.
6) Poate fi efectuat o
infecie a unei tulpini
bacteriene
cu
aceste
particule
fagice,
n
interiorul
celulelor
infectate
realizndu-se
circularizarea vectorului
recombinat i reformarea
structurii plasmidiale.
Pstrarea ns intact i
stabil n timp a ADN
heterolog clonat
este
obinut
doar
n
particulele fagice.

Fig.3.21. Schema clonrii

moleculare n cosmidul pJB8.

17

Cap. 3-1 Vectori de clonare

Cosmidul c2RB (Fig.3.22.)

Acest cosmid are o dimensiune de 6.8 kb i conine urmtoarele secvene:
- gena de rezistena la ampicilin (Apr)
- gena de rezistena la kanamicin (Kmr)
- secvena ori din plasmidul Col E1
- regiunea PCS ce conine 4 situsuri de restricie:
BamH I, EcoR I, Cla I, Hind III
- 2 situsuri cos ce flancheaza gena Kmr
n timpul mpachetrii se pierde un fragment de 1.7 kb, ce
conine un situs cos i gena Kmr, ca atare, recombinanii
vor fi Kms.
Strategia de clonare n c2RB (Fig.3.23.)
1) Se realizeaz o digestie dubl a cosmidului c2RB, cu 2
endonucleaze de restricie, BamH I i Sma I, ceea ce
sparge vectorul n 2 tipuri de fragmente:
S - parte din gena Kmr - cos - parte din PCS - B
B - parte din PCS - gena Apr - ori - cos - parte din gena
Kmr - S
fiecare fragment avnd un cap coeziv creat de enzima
Fig.3.22. Cosmidul c2RB.
Sma I (S) i un cap coeziv creat de enzima BamH I (B)
2) ADN genomic eucariot se diger cu endonucleaza de restricie Mbo I, aceast enzim fiind
izoschizomer cu BamH I.
3) Fragmentele de ADN genomic se adaug la fragmentele de vector i, n prezena ADN-ligazei de
fag T4, are loc refacerea legturilor fosfodiesterice la situsurile specifice pentru BamH I/Mbo I,
rezultnd o molecul linear (vector recombinat) ce are inserat n PCS un fragment de ADN eucariot.
4) Moleculele lineare de vector recombinat se supun unui proces de mpachetare n vitro n particule
mature cu care apoi,
5) Se infecteaz celule de Escherichia coli i se selecteaz clonele recombinate ce au fenotip AprKms.
Din aceste celule se pot recupera molecule circulare ale vectorului recombinat, constatndu-se c n
timpul mpachetrii s-a pierdut un fragment de 1.7 kb ce coninea gena Kmr i unul din cele 2 situsuri
cos.

Fig.3.23. Schema clonrii

moleculare n cosmidul c2RB.

18

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

COSMIDE pentru transfecia CELULELOR MAMALIENE

Au fost construite o serie de cosmide pentru clonare de gene n celule mamaliene. Aceti vectori
difer unul de cellalt prin 2 tipuri de regiuni:
9. markerii selectabili n celule pro- i eucariote
10. situsurile de restricie ce pot fi folosite n clonare
Cosmidele pWE 15 i pWE 16 (Fig.3.24 i 3.25)
Aceste 2 cosmide au fost construite pentru a simplifica procesul de cutare (walking = scanare) de
la o clona cosmidial la alta.
Regiunea PCS este organizat astfel:
EcoR I - Not I - T3 - BamH I - T7 - Not I - EcoR I
Fragmentele de ADN eucariot se cloneaz n situsul BamH I.
Replicarea vectorului n celule procariote este asigurat de secvena sori-Col E1t, iar bacteriile
transformate sunt selectate pe baza markerului Apr.
Replicarea vectorului n celule mamaliene este asigurat de sori-SV 40t, iar celulele transformate
sunt selectate pe baza markerului:
gena de rezisten la neomicina (Neor) prezent n pWE 15
ntr-o forma (SV2-neo) ce poate fi exprimat n celule mamaliene
gena murin dihidrofolat-reductaza (DHFR) prezent n pWE 16
Cei 2 promotori T3 i T7 sunt folosii pentru procese de transcriere n vitro, ceea ce conduce la
obinerea de sonde ARN, sau i de traducere n vitro, ceea ce conduce la obtinerea de proteine
heterologe.
Sondele ARN astfel obinute sunt, de regul, folosite pentru identificarea clonelor suprapuse din
cadrul unei biblioteci de cosmide, proces ce poarta numele de scanare (walking) a unei biblioteci de
cosmide.

Fig.3.24. Cosmidul pWE 15.

Fig.3.25. Cosmidul pWE 16.

19