Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Bacteriologie LP Popa Copy T
Bacteriologie LP Popa Copy T
47. Diagnosticul
48. Diagnosticul
Rickettsiaceae
49. Diagnosticul
50. Diagnosticul
Mycoplasma
51. Diagnosticul
Un tabel nominal al personalului, date tehnice despre fiecare membru precum i date care s permit
contactarea unei anume persoane n caz de necesitate
O list cuprinznd toate formularele utilizate n laborator precum i descrierea fiecrui formular n parte,
inclusiv recomandri privind modul de completare al formularelor
Un plan al laboratorului
Cele menionate mai sus sunt valabile pentru laboratoarele de microbiologie, dar n parte, se pot aplica oricrui
tip de laborator clinic.
3.
n mod necesar, periodic, n cadrul laboratorului trebuie organizate scurte ntlniri care s permit
schimbul de opinii ntre membrii personalului de laborator, prezentarea unor referate alctuite dup materiale
de specialitate aprute n literatura naional sau internaional, discutarea unor aspecte legislative legate de
activitatea de laborator etc.
4.
O modalitate obiectiv a controlului intern de calitate este reprezentat de solicitarea (de ctre eful de
laborator, care va efectua i verificarea rezultatelor) realizrii unor teste avnd la dispoziie probe oarbe,
rezultatul corect fiind cunoscut numai de ctre cel care a pregtit proba respectiv i respectiv de ctre eful de
laborator.
5.
n protocolul de lucru, pentru fiecare test n parte, este notificat utilizarea unui control pozitiv i
respectiv a unui control negativ (spre exemplu n cazul testului susceptibilitii la bacitracin, controlul pozitiv
va fi reprezentat de o tulpin de Streptococcus pyogenes iar controlul negativ va fi reprezentat de o tulpin de
Streptococcus agalactiae), astfel putndu-se valida rezultatele obinute.
n mod complementar, controlul de calitate extern ar trebui s condiioneze autorizaia eliberat pentru
funcionarea oricrui laborator de microbiologie clinic, att n sistemul public ct i n cel privat. Din punct de
vedere operaional, fiecare laborator ar trebui s primeasc:
un numr de cod, care este cunoscut de laboratorul respectiv i de ctre instituia care organizeaz
controlul extern de calitate
periodic, un numr de probe, al cror rezultat va fi verificat (pentru examene bacteriologice, micologice
i serologice)
nainte de a ncheia aceast destul de sumar prezentare, dorim s subliniem nc o dat c aceste noiuni ar
trebui cunoscute i aplicate deopotriv n sistemul public i privat.
Controlul intern i extern de calitate trebuie s reprezinte o prioritate absolut pentru sistemul naional de
sntate iar elementele legate de acesta ar trebui s fie cunoscute nc din perioada de pregtire de baz a
oricrui medic, biolog sau asistent medical.
stabilirii prezenei sau dovedirii absenei unor anumite bacterii la nivelul unui anumit substrat
studierii bacteriilor izolate pentru identificarea genului, grupului, speciei, tipului (de la caz la caz) avnd
la baz o serie de caractere ale bacteriilor, precum
caracterele morfotinctoriale
caracterele de cultur
caracterele biochimice (pigmentogeneza, sinteza altor factori care pot fi evideniai macroscopic, sinteza
unor enzime, sinteza de bacteriocine, capacitatea de a fermenta un anumit substrat, capacitatea de a folosi un
anumit substrat drept unic surs de carbon etc)
caracterele de patogenitate
sensibilitatea fa de bacteriofagi
caractere legate de sinteza anumitor metabolii sau structuri moleculare identificabile spre ex. prin tehnici
de cromatografie
Fiecare ncpere a laboratorului de bacteriologie trebuie s aib o destinaie precis iar planul laboratorului n
ansamblu trebuie s prevad un anumit flux, pe ct posibil ntr-un sens unic n vederea prevenirii
contaminrii preparatelor de laborator i respectiv prevenirea ntlnirii dintre materialele contaminate i
materialele sterile.
Laboratorul de bacteriologie medical include ncperi (spaii) n vederea desfurrii corespunztoare a
urmtoarelor activiti:
prelucrarea probelor n vederea cultivrii, identificrii bacteriilor implicate etiologic, prin diferitele
tehnici bacteriologice
sticlrie
reactivi
structura prezentat pentru laboratorul de bacteriologie nu difer n mod esenial de structura unui
laborator de microbiologie n general
n structura laboratorului este de dorit s fie incluse (n msura posibilitilor i n funcie de nivelul
laboratorului, de exemplu n cazul unui laborator de spital universitar) spaii n care s se poat desfura
activiti de nvmnt i pregtire teoretic i practic, spaii n care ar putea avea loc i diferite ntlniri
tehnice ntre membrii personalului de laborator
1.
Este strict interzis accesul persoanelor strine n laborator. Tinerii medici sau viitori medici vor accede n
laborator i vor participa la desfurarea lucrrilor practice numai dup audierea i nsuirea (dovedit prin
semntura pe un proces verbal pregtit n acest sens) regulilor de protecie a muncii.
2.
Toate produsele biologice vor fi considerate ca potenial infectante.
3.
Este obligatorie purtatea echipamentului de protecie; halatul de protecie reprezint nivelul minim
acceptat. Halatul trebuie s fie curat i corect ncheiat. n anumite situaii se va recomanda utilizarea mnuilor,
ochelarilor, mtii, bonetei, orului, nclmintei de protecie. Se recomand ca echipamentul de protecie s
fie pstrat separat de hainele utilizate n exterior.
4.
Nu se vor purta mnui de latex n momentul manipulrii becului Bunsen.
5.
Mncatul i butul sunt interzise n sala de lucrri practice de microbiologie. Fumatul este interzis,
conform legii, n orice instituie medical din Romnia i cu att mai mult nu este acceptat ntr-un laborator de
microbiologie.
6.
Se interzice aplicarea de cosmetice, lcuirea unghiilor, purtarea de unghii false, manipularea lentilelor de
contact etc.
7.
Este interzis introducerea n gur a oricrui obiect.
8.
Pipetarea cu gura este strict interzis. n vederea pipetrii se vor utiliza dispozitive de pipetare adecvate.
9.
Nu este permis depozitarea obiectelor de uz personal pe masa de lucru (haine, geni, serviete, caiete etc).
Se recomand ca hainele s fie lsate la garderob sau ntr-un spaiu special amenajat.
10. Manipularea materialului contaminat se va realiza cu maxim precauie pentru evitarea rspndirii
microorganismelor. Activitile se vor desfura n vecintatea becului Bunsen aprins.
11. nsmnrile se efectueaz la flacr. Se vor flamba gurile tuturor recipientelor (tub, eprubet, flacon de
sticl etc) utilizate, att la deschidere ct i la nchidere.
12. Ansa bacteriologic se va steriliza la rou, att bucla ct i firul ansei (iar portansa se va flamba) nainte i
dup folosire. Atunci cnd s-a terminat lucrul cu ansa ncrcat cu produs patologic, n vederea sterilizrii bucla
ansei va fi introdus iniial la baza flcrii unde temperatura este mai sczut, pentru a preveni mprocarea
cu particule infecioase. Atunci cnd se lucreaz ntr-un laborator de analize se vor lua preacauii suplimentare.
13. Se vor utiliza anse bacteriologice corect i complet nchise i cu o bucl cu diametrul mai mic de 3
milimetri pentru a se evita descrcarea spontan. Nu se vor face micri brute atunci cnd ansa este ncrcat
cu produs patologic. Se vor evita gesturile ample i se va menine un permanent control asupra micrilor
efectuate n laboratorul de microbiologie.
14. Recomandm ca toate activitile care pot fi efectuate n laborator s fie nscrise i detaliate n manualul
tehnic al laboratorului. nainte de nceperea oricrui test sau a oricrei manevre, trebuie s avem n minte toi
paii pe care urmeaz s i facem (conform protocolului de lucru) astfel nct s avem un control mental
permanent al fiecrei manevre pe care urmeaz s o executm.
15. Nu este permis fuga i nici mersul rapid prin laborator.
16. Pipetele contaminate (pipete Pasteur, pipete gradate etc) nu se vor decontamina la flacr, ci vor fi introduse
(evitnd producerea de stropi potenial infectani) n flaconul cu dezinfectant (lichidul dezinfectant trebuie s
depeasc nivelul pn la care a ajuns produsul contaminant), unde vor fi meninute pentru circa 24 ore (n
funcie de substana dezinfectant utilizat). Flaconul cu amestec dezinfectant este obligatoriu. Tot n amestecul
dezinfectant vor fi introduse cu aceleai precauii lamele de sticl folosite.
17. Toate celelalte obiecte contaminate (exceptnd ansele bacteriologice, pipetele i lamele) se vor introduce la
finalul activitii practice, cu precauie, ntr-un recipient (ex. o gleat din metal, cu capac) care va fi
autoclavat.
18. Se va restrnge pe ct posibil utilizarea obiectelor ascuite, tietoare i neptoare.
19. Pentru ndeprtarea obiectelor ascuite de unic ntrebuinare recomandm utilizarea de cutii sigure n
care acestea s fie colectate. Aceste cutii vor fi ulterior incinerate.
20. n cazul n care are loc accidental contaminarea unei suprafee cu produse patologice sau culturi, n cazul n
care acest eveniment se datoreaz unui tnr medic sau viitor medic aflat n pregtire, n primul rnd trebuie
anunat fr ntrziere asistentul responsabil cu pregtirea respectivei grupe de lucru. Se recomand acoperirea
cu o pnz a suprafeei contaminate dup care se toarn o soluie dezinfectant care se va menine pe loc n
funcie de recomandrile productorului, dar nu mai puin de 30 minute. Ulterior se poate trece (dup caz) la
curirea locului.
21. La sfritului lucrului n laborator se vor spla minile cu ap i spun.
22. n afar de aceste msuri, se vor avea n vedere toate cele necesare evitrii oricrui risc care ar putea rezulta
n urma utilizrii unor substane caustice, manipulrii diferitelor aparate electrice etc.
n ceea ce privete utilizarea cabinetelor de siguran biologic (hote, boxe, nie), vor fi prezentate unele
noiuni n capitolul al 3-lea.
Respectarea acestor norme de protecie este strict necesar.
Trebuie s avem n vedere i faptul c recomandrile i directivele Uniunii Europene n domeniul biosecuritii
au fost adoptate de ctre ara noastr.
Sterilizarea reprezint distrugerea sau ndeprtarea tuturor microorganismelor patogene sau nepatogene, forme
vegetative sau spori, de pe o suprafa sau dintr-un mediu (lichid sau solid).
Septic nseamn contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de exemplu infecia unei plgi).
Aseptic nseamn lipsit de microbi, indiferent dac microbii sunt patogeni sau nepatogeni.
Asepsia reprezint ansamblul de metode prin care evitm contaminarea mediului ambiant cu germeni
microbieni sau prin care putem menine sterilitatea esuturilor, mediilor de cultur, medicamentelor
injectabile etc.
Dezinfecia reprezint distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori i a sporilor) din anumite medii
(lichide, solide) sau de pe suprafee. Se realizeaz cu ajutorul unor ageni fizici sau cu ajutorul substanelor
dezinfectante.
Antisepsia reprezint nlturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe tegumente, mucoase sau
din plgi. Se realizeaz cu ajutorul substanelor antiseptice.
Sterilizarea
Toate materialele utilizate n laboratorul de microbiologie trebuie s fie sterile nainte de utilizare. Exist o
mare diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel nct i metodele de sterilizare sunt destul de variate,
dup cum urmeaz:
1.
Metode de sterilizare prin cldur
cldura uscat
cldura umed
2.
Metode de sterilizare prin filtrare
3.
Metode de sterilizare utiliznd radiaiile
4.
Metode chimice de sterilizare.
Metodele de sterilizare care utilizeaz radiaiile (cu excepia radiaiilor ultraviolete) i metodele chimice de
sterilizare (ex. cu oxid de etilen) sunt utilizate rareori n laboratorul de microbiologie.
Sterilizarea va fi ntotdeauna precedat de pregtirea materialului care urmeaz s fie sterilizat:
verticale
orizontale
verticale
orizontale.
n continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, vertical, la care vaporii
provin din apa aflat n cazanul de presiune i ajung n camera de sterilizare de jos n sus. Presiunea din
interiorul cazanului este nregistrat de un manometru. Pentru punerea n funciune a autoclavului, n dotare
exist 2 robinete: unul superior (robinetul de aer i vapori, care permite legtura ntre cazan i mediul exterior)
i unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita accidentele exist o supap de
siguran care se deschide i permite evacuarea vaporilor atunci cnd, accidental, presiunea vaporilor depete
limita de siguran. n momentul de fa pentru evitarea riscului de a veni n contact cu vapori de ap fierbini
aflai sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului pn cnd
presiunea din interior nu o egalizeaz pe cea din exterior. Cazanul de presiune este inclus ntr-un perete exterior
solid care la partea inferioar are un spaiu n care se afl sursa de cldur.
n partea inferioar a cazanului de presiune se afl un suport pe care se aeaz o plac de metal perforat. Pe
suport se aeaz materialele care trebuie sterilizate iar faptul c placa este perforat permite trecerea vaporilor
de ap produi dup nclzirea apei. n vederea sterilizrii se procedeaz astfel:
verificm nivelul apei din partea inferioar a cazanului, care trebuie s fie pn la o distan de 2-3
centimetri de suport; dac nivelul a sczut, se completeaz (recomandabil se va utiliza ap distilat)
nchidem etan capacul, folosind sistemul special de etaneizare cu care este dotat autoclavul pe care l
avem la dispoziie
deschidem robinetul pentru evacuarea aerului i vaporilor (dac rmne aer n cazanul cu presiune
eficiena sterilizrii va scdea considerabil; vaporii de ap fiind mai uori, vor nclzi n special partea
superioar a cazanului n timp ce aerul, care va atinge temperaturi inferioare, fiind mai greu, va rmne n
partea inferioar a cazanului)
nchidem robinetul dup evacuarea aerului i apariia unui jet continuu de vapori
presiunea din cazan ncepe s creasc i este urmrit cu ajutorul manometrului; atunci cnd presiunea
atinge valoarea dorit (de ex. 1 atmosfer), reglm sursa de cldur n aa fel nct aceast presiune s fie
meninut pentru toat durata sterilizrii (de ex. 30 minute)
dup trecerea celor 30 minute ntrerupem sursa de cldur i lsm autoclavul s se rceasc pn cnd
presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice
atunci cnd temperatura ajunge la circa 80C putem scoate materialele sterilizate.
Prin autoclavare putem steriliza diferite substane n soluie, sticlrie (cu excepia pipetelor i lamelor),
materiale contaminate din laborator, instrumentar chirurgical (metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de
cultur, aparate de filtrat etc.
2. Tindalizarea (sterilizarea fracionat) este o metod de sterilizare prin cldur umed care evit depirea
unei temperaturi de 100C. Substanele de sterilizat se menin la 56-100C timp de 30-60 minute, 3 pn la 8
zile succesiv. Astfel, utiliznd medii care permit germinarea, dup prima nclzire timp de 30-60 minute sunt
distruse formele vegetative iar dup rcire are loc germinarea sporilor. n ziua urmtoare sunt distruse prin
nclzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar dup rcire are loc germinarea sporilor care nu
au germinat n prima zi etc.
Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la care se va menine permanent deschis robinetul de vapori
(i astfel nu se va depi n interior temperatura de 100 C), bi de ap sau bi de nisip.
Prin tindalizare se pot steriliza alimente, unele medii de cultur etc.
Pasteurizarea i fierberea nu reprezint metode de sterilizare, dar sunt utilizate n anumite situaii.
Pasteurizarea folosete cldura umed i are aplicaii n conservarea pentru scurt durat a unor alimente
(lapte, bere etc). Exist o pasteurizare joas (30 minute la 56-65C), o pasteurizare medie (15 minute la 6575C) i o pasteurizare nalt (2-5 minute la 85-90C). Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile n form
vegetativ dar nu i sporii. Fierberea poate fi utilizat atunci cnd nu dispunem de alte metode eficiente de
sterilizare. Fierberea timp de 30 minute distruge bacteriile n form vegetativ, fungii i virusurile, dar nu i
sporii bacterieni. Timpul se nregistreaz dup ce apa a nceput s fiarb. Eficiena acestei metode poate fi
crescut prin adugarea de carbonat de sodiu 1-2%.
Sterilizarea prin filtrare
Microorganismele pot fi reinute mecanic i electrostatic n porii unui filtru. Trecerea unui lichid printr-o
substan prevzut cu pori care va reine microorganismele din lichidul respectiv poart numele de sterilizare
prin filtrare.
De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porelan, sticl poroas, azbest impregnat cu
caolin, pmnt de infuzori). Actualmente se folosesc din ce n ce mai frecvent membrane filtrante din acetat de
celuloz cu poroziti ntre 8 i 0,025 mm. n vederea filtrrii sunt necesare o serie de piese precum: un
recipient n care se introduce lichidul care urmeaz a fi filtrat, un recipient n care se va colecta lichidul
sterilizat, o plnie care se monteaz etan ntre cele 2 recipiente, o pomp de vid care va aspira lichidul din
primul n al doilea recipient, prin membrana filtrant. Toate aceste piese sunt sterilizate prin autoclavare nainte
de nceperea filtrrii.
Exist i alte variante tehnice. Cu o importan practic particular ar fi de menionat filtrele pentru sterilizarea
aerului din cabinetele de siguran biologic (clasa II i clasa III), filtrele HEPA (High Efficiency Particulate
Air Filters).
Sterilizarea prin filtrare este utilizat pentru decontaminarea aerului, a unor medii de cultur (care nu se pot
steriliza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la temperaturile atinse n cazul sterilizrii prin
cldur etc.
Sterilizarea prin intermediul radiaiilor
Radiaiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc) au efecte bactericide prin ruperea legturilor de hidrogen,
oxidarea legturilor duble etc.
Radiaiile UV sunt utile n sterilizarea suprafeelor de lucru (pentru repartizarea mediilor de cultur, alte
manevre aseptice etc) n cazul n care nu exist cabinete de siguran biologic cu flux laminar. Lmpile cu UV
sunt numite lmpi germicide.
Radiaiile ionizante se pot utiliza n sterilizri industriale (pentru alimente, medicamente, seringi de unic
ntrebuinare etc).
Antisepsia i Dezinfecia
Antisepticele i dezinfectantele sunt substane cu aciune antimicrobian neselectiv, alternd structuri i funcii
comune microorganismelor i organismelor superioare. Antisepticele pot fi utilizate pe tegumente i mucoase,
dezinfectantele pot fi utilizate numai pe suprafee i structuri care nu sunt vii.
Clasificare n funcie de mecanismul de aciune
a). Substane care denatureaz proteinele (au n general efect bactericid): acizii, bazele, alcoolii (de exemplu
alcoolul etilic de 70, folosit pentru antiseptizarea tegumentelor).
b). Substane care oxideaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): hipermanganatul de
potasiu 1 , util n antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen, soluie 3 % n ap, utilizat n
antiseptizarea plgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) i derivaii lor (hipoclorii, cloramine, soluii iodurate etc) n
concentraii corespunztoare etc.
c). Substane care blocheaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): metale grele [srurile de
mercur, preparatele organomercuriale (exemplu merthiolat de sodiu), srurile de argint, compui de argint
coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide], gruprile alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei,
oxidului de etilen etc.
d). Substane care lezeaz membranele celulare: fenolii [acidul fenic are utilizri limitate datorit proprietilor
caustice i toxicitii sale; este etalonul fa de care se msoar activitatea antimicrobian a antisepticelor i
dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc],
detergenii [anionici (spunuri, perlan etc), cationici (sruri cuaternare de amoniu, de exemplu bromocet),
amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu propilenglicolul)].
e). Substane care altereaz acizii nucleici: coloranii bazici (violet de genian, albastru de metilen, fucsin
bazic etc), derivaii de acridin, de exemplu rivanolul.
n continuare vom prezenta pe scurt cteva dintre substanele dezinfectante, innd cont de faptul c nu exist
nici un dezinfectant ideal. Exist numeroase substane i numeroi productori de antiseptice i dezinfectante.
Hipocloriii:
soluiile de hipoclorit se prepar periodic (se inactiveaz dup mai mult de 24 ore)
concentraia n clor activ este diferit n funcie de scopul urmrit (ex. 2.500 ppm clor activ pentru
dezinfectarea pipetelor contaminate)
au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, sporilor bacterieni, fungilor (100 ppm n o
or), virusurilor (200 ppm n 10 minute)
efectul este diminuat considerabil n prezena substanelor organice (n special proteine), maselor plastice,
detergenilor
Derivaii fenolici:
concentraia poate fi diferit n funcie de scopul urmrit (de obicei este de 2-5%)
au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, fungilor, unor virusuri (ex. HIV e inactivat de
soluia 0.5%)
are efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ (n cazul mycobacteriilor este necesar un
timp mai lung de expunere), fungilor, virusurilor
datorit faptului c nu corodeaz metalele (aa cum se ntmpl n cazul substanelor prezentate mai sus)
se poate folosi i la dezinfectarea suprafeelor metalice
nu poate fi folosit pentru suprafee, datorit vaporilor iritani i timpului mare de expunere; ideal pentru
dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o perioada mai mare de timp n containere
meninute nchise
Iodoforii:
au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, unor spori bacterieni, fungilor, unor virusuri
(ex. virusuri cu nveli lipidic)
exercit activiti bactericide prin alkilarea acizilor nucleici i prin nlocuirea hidrogenului labil printr-o
grupare hidroxietil (-CH2CH2OH)
acest tip de sterilizare se utilizeaz pentru materiale care nu rezist atunci cnd sunt supuse aciunii
temperaturii sau radiaiilor (ex. materiale din cauciuc, plastic, echipament electronic etc)
etilenoxidul poate exploda; variantele pentru evitarea exploziei includ: 1. utilizarea etilenoxidului n
camere speciale care permit meninerea unei presiuni negative 2. combinarea cu CO2 n camere de oel speciale
3. combinarea cu hidrocarburi fluorinate
exist o serie de inconveniente n ceea ce privete acest tip de sterilizare (efecte carcinogenetice, efecte la
nivelul sistemului nervos etc)
sterilizarea este n principiu influenat de: concentraia etilenoxidului, temperatur, umiditatea relativ i
timpul de expunere (spre ex. o dublare a concentraiei va reduce la jumtate timpul necesar pentru sterilizare).
spp., pe frotiu vom observa aspecte morfologice diferite, de la aspecte cocobacilare pn la forme
filamentoase). n cazul levurilor, aspectul este cocobacilar, Gram-pozitiv, dar de dimensiuni mai mari.
b) Caractere de cultur: se vor examina coloniile izolate aprute pe mediile de cultur solide i care pot fi de tip
S pentru majoritatea germenilor studiai inclusiv pentru levuri, de tip R n cazul Corynebacterium diphteriae,
Mycobacterium tuberculosis i Bacillus anthracis, de tip M n cazul bacteriilor capsulate, de exemplu
Klebsiella pneumoniae i respectiv un aspect pufos n cazul mucegaiurilor(detalii privind aspectele coloniilor
microbiene sunt prezentate n capitolele dedicate fiecrui gen n parte).
c) Caractere biochimice: acestea pot fi foarte variate de la o specie microbian la alta i pot fi foarte utile spre
exemplu n cazul diferenierii enterobacteriilor (introducerea n practic a mediilor multi-test permite
evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile TSI, MIU, sistemele API etc). n cazul fungilor sunt
utilizate auxanograma sau zimograma.
d) Caractere antigenice: caracterele antigenice vor fi examinate bazndu-ne pe structura i antigenicitatea
microorganismelor i pe specificitatea reaciilor antigen-anticorp. Vom utiliza anticorpi cunoscui pentru a
identifica antigenele microbiene necunoscute. Spre exemplu, prin reacii de aglutinare direct, pe lam, se pot
identifica antigenele i respectiv speciile i tulpinile din genul Shigella, Salmonella, Vibrio etc). Reacii de
aglutinare indirect se pot utiliza pentru detectarea n p.p. a streptococilor de grup A sau B etc., pentru
detectarea unor enterotoxine, pentru detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans,
Aspergillus spp.) etc.
e) Caractere de patogenitate: putem examina capacitatea unui microorganism de a elabora anumite substane cu
rol n patogenitate (ex. coagulaza produs de Staphylococcus aureus) sau infecia experimental a unui animal
de laborator (ex. izolarea pneumococilor de la un pacient cu pneumonie dup inocularea sputei la oarecele alb;
n cazul n care n sput exist pneumococi, animalul va muri n 24-48 de ore, iar din sngele lui se va izola o
cultur pur de Streptococcus pneumoniae).
f) Sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific (lizotipie);
g) Alte caractere (identificate de ex. prin metode ale biologiei moleculare sau alte metode moderne) (vezi anexa
nr. 7).
5. Antibiograma i respectiv antifungigrama (testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice antibacteriene
i antifungice, n vederea stabilirii tratamentului) se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. n cazul
unor infecii grave, antibiograma difuzimetric trebuie s fie completat de determinarea concentraiei minime
inhibitorii (CMI) i respectiv bactericide (CMB). n infecii grave, cu potenial fatal, poate fi necesar
determinarea nivelului de eficien pentru antibioticul utilizat, respectiv stabilirea nivelul de eficien
inhibitorie (NEI) i nivelului de eficien bactericid (NEB) (vezi i capitolul 7).
5. 2. Diagnosticul de laborator imunologic
Diagnosticul de laborator imunologic poate fi serologic i / sau imunobiologic.
n cadrul diagnosticului de laborator serologic se va determina prezena (sau se va dovedi absena)
anticorpilor, n serul pacientului investigat, utiliznd antigene cunoscute. n diagnosticul serologic ne bazm pe
specificitatea reaciilor antigen-anticorp i utiliznd diferite tehnici trebuie s putem rspunde la minim trei
ntrebri eseniale, i anume:
- exist anticorpi n serul pacientului investigat?
- care este titrul anticorpilor?
- cum evolueaz n dinamic (n timp) acest titru; n acest sens se vor realiza minim dou determinri diferite la
un interval de 7-10 zile; aceast analiz ne va permite s difereniem situaia unei afeciuni acute (titrul
anticorpilor este mai crescut la a doua determinare, n mod clasic de 4 ori), de situaia n care pacientul este deja
n convalescen (titrul anticorpilor la a doua determinare va fi mai sczut) sau de situaia unui pacient cu o
afeciune cronic (titrul anticorpilor va fi asemntor sau foarte apropiat la cele dou determinri succesive). n
vederea identificrii unei infecii acute, o variant posibil n majoritatea situaiilor este determinarea
anticorpilor specifici de tip IgM.
n cadrul diagnosticului de laborator imunobiologic se va studia, de exemplu, reactivitatea pacientului fa de
un anumit antigen inoculat. Intradermoreacia la tuberculin (PPD, preparat proteic purificat) sau la candidin
reprezint exemple clasice, n acest sens. Tehnica intradermoreaciei este folosit n mai multe scopuri i
trebuie s avem n vedere c n funcie de scopul urmrit i respectiv n funcie de antigenul inoculat (i de
mecanismul implicat), modul de citire al rezultatelor va fi diferit (vezi anexa nr. 3).
Considerm c pentru orice medic, indiferent de specialitate, multe dintre principiile microbiologiei sunt foarte
utile, merit s fie nelese i aplicate corespunztor.
Pentru cei care se dedic microbiologiei sau bolilor infecioase, aceste noiuni reprezint o baz obligatorie,
care poate fi completat utiliznd pe de o parte diferitele tratate medicale n domeniu dar i experiena
personal dezvoltat att din punct de vedere teoretic ct i practic.
5. 3. Povestiri adevrate
1. Despre diagnostic i tratament n infeciile urinare
Problema luat n discuie este a unei colege mai tinere, student ntr-un an mare la medicin, dar de fapt, ca
i urmtoarea, poate fi considerat o problem care poate fi a unui sistem i nu a unui caz particular.
n urm cu mai mult de un an, colega noastr primete diagnosticul de litiaz renal i recomandarea de
eliminarea a calculilor prin litotripsie [manevr care const n mrunirea calculilor urinari, fragmentele fiind
apoi eliminate n mod natural prin urin; accesul la calculi se face pe cale endoscopic i sub control
endoscopic; pulverizarea calculilor poate s fie realizat cu ajutorul unei pense (litotripsie mecanic), cu
ajutorul ultrasunetelor (litotripsie ultrasonic), prin unde de oc repetate (litotripsie electrohidraulic) sau cu
ajutorul unei fibre laser (litrotripsie cu laser)]. Manevra este executat, cu succes (conform protocolului
operator).
Dup 5 luni, n anul urmtor, semnele clinice i analizele de laborator (n special urocultura nsoit de testarea
sensibilitii la antibiotice) permit punerea diagnosticului de infecie urinar (ITU) cu Escherichia coli. Viitorul
medic primete norfloxacin, timp de 10 zile. Pentru c la 3 sptmni de la primul diagnostic simptomatologia
persist, primete un nou tratament, de aceast dat cu amoxicilin + acid clavulanic. La ncheierea celui de al
doilea tratament, simptomatologia persist i colega ni se adreseaz solicitnd un sfat, menionnd i c medicul
urolog i-a recomandat s nceap un tratament cu cefuroxim (cefalosporin de generaia a II-a) i Uro-vaxom,
timp de 20 de zile, apoi s refac analizele. Tulpina de E. coli identificat la ultimul examen bacteriologic
prezenta sensibilitate la: acid nalidixic, ceftazidim, cefuroxim, cotrimoxazol, fosfomicin, gentamicin,
rezisten la: amoxicilin i la amoxicilin + acid clavulanic i era intermediar la norfloxacin (cu alte
cuvinte, putem remarca evoluia sub tratament a tulpinii, iniial sensibil la norfloxacin i amoxicilin + acid
clavulanic, rezisten ctigat n trepte).
La recomandarea noastr, colega se prezint din nou la un control echografic, conform cruia se pun n eviden
elemente litiazice. Este cunoscut faptul c litiaza renal reprezint unul dintre factorii de risc pentru apariia
i persistena ITU.
Opinia noastr a fost ca, n acest caz, analizele de laborator s se realizeze n INCDMI Cantacuzino i pentru
c era nc vacan iar reedina nu era n capital, colega noastr a respectat recomandarea n a doua jumtate a
lunii septembrie. Din discuiile pe cale electronic am aflat c medicul urolog a afirmat c este vorba de o
boal de tub renal i c n aceste condiii trebuie s evite ITU, care pot fi factor de agravare. Colega noastr era
deja ngrijorat datorit rezistenei la tratament a infeciei cu E. coli.
Dup administrarea de Uro-vaxom, urocultura realizat la Bucureti n luna septembrie a fost steril, situaie
conform cu statusul clinic (lipsa semnelor sau simptomelor).
Totui, dup circa 2-3 sptmni, semnele i simptomele revin i colega ni se adreseaz din nou, pentru un sfat,
menionnd i rezultatele obinute la testarea sensibilitii la antibiotice pentru tulpina de E. coli (menionate
mai sus) i cernd s i recomandm unul dintre antibioticele din list pentru a ncepe un nou tratament.
Aa cum nici diagnosticul i prescrierea tratamentului la telefon nu reprezint un bun exemplu n medicin, nici
utilizarea cii electronice nu poate s substituie examenul clinic i analizele de laborator. Avnd n minte
aceste recomandri pe care le-am nvat, la rndul nostru, n vremea studeniei sau n timpul rezideniatului,
singurul sfat pe care l-am putut exprima a fost: refacerea analizei de laborator, tot la INCDMI Cantacuzino.
Sfatul a fost urmat iar diagnosticul a fost ITU cu Klebsiella pneumoniae, ceea ce a contrariat-o pe colega
noastr (totui, rezultatul nu a fost surprinztor).
Pentru c toat aceast discuie se purta, din nou, pe cale electronic (colega noastr se ntorsese n localitatea
de reedin) i pentru c nu tiam unde fusese realizat ultimul examen de laborator, n primul rnd am solicitat
aceast informaie. Aflnd att laboratorul ct i medicul care a pus diagnosticul, aceasta a reprezentat pentru
noi o certitudine c ultimul diagnostic este i el corect i, n context, existau dou posibiliti de prim
intenie:
infecie cu un alt germen din flora proprie, n condiiile litiazei renale;
infecie dubl, att la nivel urinar ct i n alt sediu, care trebuie tratat simultan, urmnd ca situaia
litiazei renale s fie rezolvat ulterior.
Recomandarea a fost de realizare a unui nou examen bacteriologic. Apelnd la unul dintre cei mai
experimentai colegi, unul dintre puinii i adevraii profesori din catedra de microbiologie (ajuns / scos la
pensie), n final a fost dovedit o dubl infecie, ITU i la nivel genital, cu Klebsiella pneumoniae. Tratamentul
infeciei la nivelul ambelor sedii a dus la vindecarea infeciei, dispariia semnelor i simptomelor i primirea
mulumirilor de rigoare, prin email.
2. Cu privire la lipsa diagnosticului microbiologic i urmrile acestei lipse
Un alt coleg mai tnr, de aceast dat n primii ani de studiu, a relatat dup momentul n care am discutat i
rezolvat o situaie particular, medical, c n vremea copilriei a primit de foarte multe ori antibiotice, de
regul n cadrul unei auto-medicaii stabilit n familie.
Cele mai frecvente probleme, ca i la muli ali copii (dac nu chiar la toi) erau legate de nas-gt-urechi
(ORL), iar medicamentele antimicrobiene primite s-au repetat anual i de mai multe ori pe an pn spre
vrsta de 13-14 ani.
Se pare c un moment important a fost legat de o infecie de acelai tip, cu manifestri ceva mai serioase, care
au determinat familia s se prezinte mpreun cu tnrul nostru la medicul de familie; acesta, analiznd automedicaia propus a concluzionat c respectivul medicament n cantitatea propus reprezenta un risc pentru
pacient i n acest context, pacientul a neles c nu trebuie s mai accepte medicaia ca atare (chiar dac era
minor, la acea dat). Totui, colegul nostru a concluzionat: oricum a fost suficient de mult timp s iau pastile
aiurea.
ns, toate aceste probleme s-au artat a fi minore, fa de ceea ce a urmat.
ntr-o toamn, la nceput de liceu, ntr-o vineri (majoritatea problemelor importante/grave se pot petrece
vinerea, n week-end, noaptea, la sfrit de program etc), tnrul coleg a revenit acas cu dureri foarte mari n
zona articulaiei coxo-femurale, dup o lovitur aparent minor, n cursul unui meci de fotbal. Una dintre erori a
fost, probabil, faptul c prima reacie acas a fost o baie fierbinte (dar realmente fierbinte).
Dup 36-48 de ore durerile s-au intensificat foarte mult i copilul (avea totui numai 15 ani) nu s-a mai putut
deplasa fr ajutorul unuia dintre prini sau a unui cadru metalic.
Au nceput peripluri prin uniti sanitare, iniial la un spital cu profil de urgene copii, ulterior la un spital de
urgen pentru aduli, la o secie de ortopedie (imaginile radiologice nu sugerau nimic, se pare). La cel de al
doilea spital s-au administrat medicamente calmante, s-au efectuat noi radiografii plus recomandarea de a
reveni luni, pentru noi analize.
n timpul week-end-ului durerile s-au intensificat i a fost nregistrat febra (peste 38,5C); copilul nu mai putea
pune pe pmnt membrul inferior drept.
La recomandarea unor cunotine, familia s-a ndreptat iniial ctre cel de al treilea spital (cu profil de copii).
La acest spital, n tot cursul dimineii respective, nimeni nu a gsit timpul necesar pentru a l consulta pe copil
care menioneaz, din amintiri: nimeni nu s-a uitat la mine, eu m ineam de perei i mama alerga ..., motiv
pentru care au plecat de la al treilea spital i s-au ndreptat spre cel de al doilea, cel cu profil de aduli.
Analizele efectuate au fost remarcabile prin intensitatea inflamaiei (tradus prin valorile nalte ale reactanilor
de faz acut) i sugerarea unei infecii. Medicul a luat legtura cu un coleg de la un al patrulea spital (cu profil
de copii), suspicionnd, se pare, un proces tumoral localizat osteo-articular.
Din amintirile de copil am putea remarca ntre timp trecuser cam 5 zile, poate chiar o sptmn, urlam de
durere cnd ncercam s merg, abia mai puteam s m dau jos din pat i daca eram ajutat urlam de durere pentru
c nu mai suportam s fiu atins; devenise un chin s merg la baie pentru c oricum dura mult i acolo nu prea
mai puteam s stau ... mi s-au fcut analize, radiografii; analizele indicau o infecie care cretea" n comparaie
cu analizele trecute ... radiografiile nu spuneau nimic.
Medicii, dup un timp, au indicat tratament cu oxacilin, 12g / zi, iar ntre diagnosticele difereniale luate n
discuie s-au aflat: cancer osos (cel mai frecvent discutat), tuberculoz osoas, reumatism i ... n cel mai bun
caz, o infecie (copilul, actualul nostru coleg, i amintete c dup mult timp a aflat de la prini c a existat i
suspiciunea de cancer, dar prinii au tiut acest lucru de la nceput; i i mai amintete i alte aspecte, pe care
nu le putem discuta n materialul de fa).
Dup circa 1 sptmn de la internare, pacientul se deplasa cu mare greutate, circa 15 metri n 30 de minute,
ca s ajung la baie (noroc cu nite biei care stteau cu mine n salon i m ajutau). A primit n continuare
oxacilin 12 g/zi, a fost examinat repetat, radiologic (se pare c s-au executat 20-25 de radiografii de bazin de la
nceput i pn n timpul acestei internri), semnele de laborator (reactanii de faz acut) au nceput s
stagneze sau s evolueze pozitiv; durerile au continuat, la fel i impotena funcional.
La sfaturile unor prieteni, prinii au decis s transfere pacientul n al cincilea spital, cu profil de aduli,
transfer care nu a fost realizat cu foarte mult uurin, dar, se pare c acest ultim transfer a fost salutar.
Actualul nostru coleg poart i astzi un deosebit respect celor care s-au ocupat de el n clinica de ortopedie a
spitalului, att efului de clinic dar i unui coleg, care la acea vreme era mai tnr i pe care avem plcerea s
l cunoatem i noi. Datorit suspiciunii de cancer osos, au urmat alte analize, o tomografie computerizat i o
scintigrafie osoas (din fericire infirmnd respectiva suspiciune); tratamentul anti-infecios a fost continuat
iniial cu oxacilin 2g / zi n asociere cu gentamicin 2mg/kg/corp (de 2 ori pe zi) timp de 2 sptmni, urmat
de tratament cu oxacilin 2g / zi.
Tnrul nostru coleg i mai amintete c, nainte de transferul la al cincilea spital tratamentul a fost administrat
intra-venos cnd am plecat de la ... deja artam ca un drogat; aveam pe mini foarte multe vene sparte,
cheaguri pe branule ... iar n momentul n care a auzit pentru prima dat c a existat suspiciunea de cancer osos
a slbit circa 4 kg n 2 zile.
n final, pacientul a fost externat, vindecat, dup o lung perioad de suferin.
Din discuia cu tnrul nostru coleg i din amintirile acestuia, nu am remarcat vreo ncercare de diagnostic
microbiologic, vreo recoltare de produs patologic care s fie transmis spre analiz (nainte de administrarea
antibioticelor sau chimioterapicelor), vreo recoltare de snge pentru hemoculturi.
Nu putem meniona toate impresiile pe care copilul, pacientul, tnrul coleg le-a acumulat pe parcursul acestei
experiene de via. Totui, amintim o dorin exprimat de acesta de fiecare dat cnd trebuie s merg la
spital, m rog s dau de un OM.
3. Despre unele teoreme din timpul facultii sau rezideniatului
Foarte mult timp, la cursuri n timpul studeniei sau n timpul rezideniatului am fost nvai c IDR cu PPD
(vezi i anexa nr. 3) nu are nici o valoare, n Romnia, pentru c toi copiii sunt vaccinai la natere, pentru c
tuberculoza este endemic etc.; n aceste condiii toi cetenii romni au IDR pozitiv i o nou testare nu va
aduce nici o informaie util. Am suspicionat de mult timp c aceast teorem nu are acoperire real.
n ultimii doi ani, prin colaborare cu o serie de studeni entuziati (sigur, studiile trebuie continuate i este
necesar realizarea unor observaii pe un lot semnificativ statistic), am nceput infirmarea acestor supoziii,
transmise, din pcate, multor generaii de studeni, rezideni etc. Din cei peste 60 de studeni care au dorit s
participe la studiu, n 40,9% dintre cazuri valoare citirii la 48 i 72 de ore a fost 0 (zero) milimetri n timp ce n
19,7% valoarea induraiei a fost de peste 10 i pn la 22 milimetri. ntr-un caz, consultul cu medicul de
specialitate pneumo-ftiziolog a dus la recomandarea administrrii de hidrazid a acidului izonicotinic, pentru
prevenirea unei tuberculoze manifeste, ceea ce probabil a fost salutar pentru respectivul, mai tnr, coleg.
este recomandabil ca recoltarea i stabilirea modalitii de transport a p.p. s fie fcut de medic sau sub
ndrumarea unui medic de specialitate
prelevarea p.p. trebuie s aib loc nainte ca pacientul s fi primit antibiotice sau chimioterapice
acest deziderat este ndeplit din ce n ce mai rar ceea ce creaz multe probleme n diagnosticul
microbiologic contribuind i la selectarea microorganismelor rezistente la medicamentele antimicrobiene
eforturile privind ndeplinirea lui trebuie s aparin att pacientului ct i medicilor implicai (medic de
familie, medic de alt specialitate)
chiar dac boala este grav iar tratamentul antibiotic pare urgent, trebuie reinut c pentru recoltarea
p.p. care poate duce la un diagnostic care ar putea salva viaa pacientului sunt necesare numai cteva minute;
dup recoltarea p.p. se poate administra prima doz de antibiotic sau chimioterapic, ales empiric, pe criterii
de probabilitate
n cazul n care evoluia sub tratament antibiotic este nefavorabil, diagnosticul microbiologic va permite
(ntre timp) izolarea agentului etiologic i stabilirea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice astfel nct
schimbarea tratamentului se va putea face n mod riguros, tiinific
alternativele sunt reprezentate de schimbarea tratamentului n mod mai puin raional sau chiar
iraional, cu posibile urmri nefaste pentru pacient sau apelarea la cocteil-ul (asocieri) de antibiotice cu
riscurile de rigoare
n cazul n care (dintr-un motiv sau altul) tratamentul cu antibiotice a fost nceput nainte de prezentarea
la spital / laborator, n funcie de boala suspectat se pot recomanda urmtoarele abordri
oprirea, dac este posibil, tratamentului pentru 24 - 48 ore, cu recoltarea p.p. i nceperea diagnosticului
microbiologic
diluarea inoculului (mai ales dac pacientul a primit un tratament bacteriostatic) n mediul de cultur fr
antibiotic
notificarea n formularul n care se solicit analiza de laborator i care nsoete p.p. precum i n
buletinul de analiz, a tuturor datelor privitoare la tratamentul primit de ctre pacientul investigat
recoltarea i transportul p.p. trebuie s se realizeze ct mai aproape de debutul bolii, dar trebuie ales
momentul cel mai potrivit (optim), respectiv momentul n care este cea mai mare probabilitate ca agentul
etiologic s se gseasc n produs
n funcie de evoluia bolii (de ex. coprocultura n febra tifoid se va efectua dup prima sptmn de
evoluie)
n funcie de specificul fiziopatologic al bolii respective (de ex. se recomand efectuarea hemoculturii n
accesul febril)
produsul patologic din care estimm c vom putea izola agentul etiologic al bolii suspicionate va fi ales
n funcie de maladie i va putea fi reprezentat spre exemplu de
o secreie de la nivelul presupusei pori de intrare (ex. secreie nazal sau faringian n difterie, secreie
genital n cazul unei boli veneriene etc)
un produs de la nivelul cilor de rspndire n organism (ex. snge, esut recoltat prin biopsie de la
nivelul ganglionilor limfatici)
un produs de la nivelul cilor de eliminare din organism (ex. urin n infeciile tractului urinar, materii
fecale ntr-o boal diareic acut etc)
un produs de la nivelul focarului infecios (ex. lichid cefalo-rahidian / LCR n meningit, sput n
pneumonie etc)
n vederea alegerii produsului care urmeaz a fi recoltat este necesar cunoaterea patogeniei, evoluiei i
elementelor clinice legate de bolile infecioase, ceea ce este esenial n cazul practicrii cu adevrat a
microbiologiei clinice
periodicitatea cu care se realizeaz recoltarea de p.p. poate influena rezultatul n anumite cazuri, spre
exemplu
n suspicionarea unui sepsis (denumirea acceptat actual pentru septicemie) se recomand recoltarea a 23 probe de snge n 24 ore, pentru hemocultur
n suspicionarea unei boli diareice acute se recomand recoltarea a cte unei probe de materii fecale, trei
zile consecutiv, pentru coprocultur
n suspicionarea unei tuberculoze pulmonare se recomand recoltarea a cte unei probe de sput, trei zile
consecutiv etc
ceea ce a fost prelevat i transmis pentru examinare trebuie s reprezinte cu adevrat p.p. (acel produs
care conine cu mare probabililtate microorganismul infectant), spre exemplu
n cazul n care este suspicionat diagnosticul de meningit i a fost recoltat LCR, n cazul n care
meningita este de etiologie bacterian sau fungic, microorganismul implicat patogenic va putea fi identificat n
cursul diagnosticului microbiologic
n schimb, dac n cazul n care este suspicionat tuberculoza pulmonar se vor trimite spre examinare
saliv sau secreii de la nivelul arborelului respirator superior n loc de sput, diagnosticul microbiologic este
imposibil etc
din p.p. se vor preleva i utiliza n cursul diagnosticului microbiologic poriunile cele mai reprezentative,
respectiv acele poriuni n care sunt cele mai mari anse de identificare / vizualizare prin microscopie / cultivare
i izolare a microorganismului infectant, spre exemplu n cazul recoltrii de materii fecale (suspiciune de boal
diareic acut) se vor selecta poriunile muco-purulente (eventual muco-sanguinolente)
este necesar s se recolteze o cantitate de p.p. suficient pentru efectuarea diagnosticului microbiologic
(preparate proaspete, frotiuri, cultivri pe medii de cultur, inoculri la animale de experien, reluarea unor
manevre n cazul c este necesar
recoltarea i transportul p.p. trebuie s se realizeze n condiii stricte de asepsie, pentru prevenirea
contaminrii celui care recolteaz, pentru prevenirea supra-infectrii pacientului i pentru prevenirea
contaminrii p.p.
se va evita, pe ct posibil, contaminarea p.p. cu microorganisme care aparin florei microbiene normale
(spre ex. prin tehnica de recoltare / vezi recoltarea urinei sau prin manevre invazive care unteaz cile naturale
prin care sunt eliminate microorganismele / vezi recoltarea sputei prin lavaj bronhoalveolar)
instrumentele pentru recoltare trebuie s fie nu numai sterile dar i adecvate, de ex. foarte frecvent este
utilizat tamponul de vat, ns recoltarea cu tampon ar trebui s fie recomandat doar recoltrii i transportului
p.p. = secreie de la suprafaa mucoaselor i tegumentelor cu leziuni
microorganismele i leucocitele rmn n proporie mare pe vat i nu pot fi uor transferate pe frotiu,
mediu de cultur
pentru anumite microorganisme (ex. Bordetella pertussis) utilizarea tamponului cu vat este
contraindicat
recipientele pentru recoltare i transport trebuie s fie nti curate (dar prin cltire s fie eliminate orice
substane chimice cu posibil efect antimicrobian) i apoi sterilizate, preferabil prin autoclavare; nchiderea
recipientelor trebuie s fie perfect, pentru a preveni orice contaminare pe parcursul transportului
recipientele pentru recoltare i transport trebuie s fie marcate corespunztor n aa fel nct s nu fie
posibil apariia unor confuzii; ceea ce se noteaz pe recipient trebuie s corespund cu ceea ce a fost notat pe
formularul de solicitare a respectivei analize
registrul unitii sanitare / seciei / clinicii care solicit analiza respectiv (n cazul n care recoltarea
produsului patologic se face n afara laboratorului)
pentru simplificare, un singur formular poate include att partea corespunztoarea solicitrii analizei ct
i buletinul de analiz microbiologic
o alt modalitate de simplificare ar putea fi reprezentat de nregistrarea electronic a datelor i
utilizarea metodelor moderne de transmitere a lor; exist doar cteva uniti sanitare n Romnia unde sunt
utilizate aceste metode
pentru reducerea cantitii de date i respectiv asigurarea confidenialitii, se recurge la numrul unic de
identificare, un grup de cifre i litere care permit codificarea i asocierea a cte unui astfel de numr fiecrui
pacient n parte
cu toate c nregistrarea datelor pare pentru majoritatea celor implicai n actul medical o simpl i
inutil birocraie, aceast modalitate de apreciere este complet eronat; nregistrarea datelor i fluxul
informaiilor n sistemul sanitar sunt extrem de importante i este necesar s fie depuse toate eforturile n
vederea efecturii lor n mod corespunztor (din pcate orele de studiu dedicate acestor aspecte sunt mult prea
reduse att pe parcursul studeniei ct i n cursul rezideniatului)
elemente importante care trebuie notificate atunci cnd se solicit o analiz de laborator microbiologic
pentru identificarea produsului patologic care urmeaz a fi prelucrat se vor nota numele, prenumele,
vrsta pacientului (sau numrul unic de identificare), data i locul recoltrii (unitate sanitar, clinica, secia,
salonul)
pentru facilitarea alegerii celei mai potrivite modaliti pentru prelucrarea p.p. se vor nota diagnosticul
prezumtiv, natura p.p., examenul solicitat, data debutului bolii, ce medicaie antimicrobian a fost administrat
respectivului pacient (antibiotic sau asociere de antibiotice, data nceperii administrrii, doze, durat)
n acelai sens se vor nota data i ora recoltrii, data i ora recepionrii n laborator, cine i cum a fcut
recoltarea, cum a fost asigurat transportul p.p.
subliniem faptul c, cel mai adesea venim n contact cu formulare incomplete / completate indescifrabil /
completate cu erori i chiar dac ar putea prea incredibil, formulri de genul nume X, prenume Y, prob Z,
rugm toat bateria de analize sunt nc mult prea frecvente i ar trebui ca de fiecare dat s conduc la o
discuie ferm cu expeditorul pn cnd asemenea comportamente vor fi eliminate, n beneficiul pacienilor.
sput care de fapt conine saliv i secreii din tractul respirator superior
urin recoltat cu mai mult de 60 de minute n urm (care nu a fost meninut la +4C)
exsudat faringian, exsudat nazal, sput, urin, materii fecale etc pentru care se solicit izolarea i
identificarea germenilor anaerobi
produse patologice pentru care este evident contaminarea (de ex. datorit unui recipient de colectare
necorespuztor) etc.
este necesar meninerea condiiei iniiale a produsului patologic (coninut microbian, citologie etc)
pentru a putea nregistra o imagine ct mai apropiat de ceea existent la nivelul procesului infecios
microorganismele din flora asociat se pot multiplica n cursul transportului (de regul mai lesne dect
microorganismele patogene)
este necesar prevenirea contaminrii p.p. precum i prevenirea contaminrii mediului extern sau a
personalului care asigur recoltarea, transportul i ulterior prelucrarea p.p.
pentru foarte multe dintre p.p. se poate accepta un timp de transport de 1-2 ore (repetm propoziia de
mai sus: p.p. trebuie s ajung n laborator n cel mai scurt timp posibil)
n cazul n care timpul de transport al p.p. nu poate respecta ceea ce este indicat se poate recurge la
conservarea acestuia dup cum urmeaz
meninerea la temperatur sczut (container izoterm cu ghea la 0C sau frigider la +4C); de menionat
c Neisseria meningitidis, Neisseria gonorhoeae, Haemophilus influenzae etc nu rezist la aceste temperaturi
utilizarea unui mediu de transport (Cary Blair, Stuart etc / vezi capitolul 9)
adugarea de penicilin, streptomicin i cloramfenicol atunci cnd se urmrete izolarea unui fung
(agenii etiologici ai micozelor cutanate superficiale pot rezista mpachetate n hrtie steril i introduse ntr-o
cutie Petri pn la 48 de ore fr s necesite adugarea de antibiotice)
aspirarea p.p. lichid n sering, cu eliminarea rapid a bulelor de aer i nchiderea seringii cu ajutorul
unui dop de cauciuc steril n care introducem imediat acul (atenie la manevrarea acului de sering n condiiile
recoltrii unui produs patologic uman / risc de nepare i transmiterea altor infecii ex. HIV) atunci cnd
urmrim izolarea unei bacterii anaerobe care ar putea supravieui n acest caz circa 30 de minute etc
iar n cazul n care p.p. trebuie expediat prin pot se vor respecta normativele legale n vigoare precum i
recomandrile speciale recunoscute la nivel internaional dintre care cele mai utilizate sunt elaborate de World
Health Organization (WHO), Center for Diseases Control and Prevention (CDC) sau National Committee for
Clinical Laboratory Standards (NCCLS) cu meniunea c primele 2 pot fi obinute n mod gratuit.
utilizm tampoane cu vat obinuite uor umezite cu soluie salin fiziologic steril, ceva mai mici dect
n cazul recoltrii exsudatului faringian
tamponul trebuie ncrcat ct mai bine cu p.p. (l rotim relativ ferm pe suprafeele unde este prezent p.p.)
este de preferat utilizarea imediat a p.p. iar n cazul n care acest lucru nu este posibil, tamponul va fi
trimis ctre laborator n mediu de transport
2. Exsudatul faringian
ne aezm puin lateral fa de pacient pentru a evita contaminarea cu picturi eliminate n cursul unui
eventual acces de tuse (de preferin vom purta masc i ochelari)
deprimm baza limbii cu ajutorul unui apstor de limb steril i n condiii de iluminare adecvat
examinm faringele posterior, pilierii, amigdalele pentru a sesiza care sunt zonele inflamate (roii, cu depozite,
ulceraii etc) i eventualele depozite purulente
solicitm pacientului s pronune vocala A i printr-o micare de tergere, circular, ferm, recoltm
secreia de la nivel faringian, amigdalian insistnd n zonele unde exist ulceraii, depozite (n cazul n care se
remarc prezena unei false membrane o detam cu grij nspre periferie i recoltm secreia care exist sub
aceast structur)
este de preferat utilizarea imediat a p.p., sau n cel mult 1-3 ore; n cazul n care acest lucru nu este
posibil, tamponul va fi trimis ctre laborator n mediu de transport
3. Sputa
n diagnosticul microbiologic al infeciilor acute ale cilor respiratorii inferioare (IACRI) se pot examina
prelevate care se pot contamina n cursul recoltrii cu flora bacterian normal: sput, tampon nazal /
faringian, aspirat nazal / faringian, aspirat hipofaringian, produs recoltat prin bronhoscopie simpl etc i / sau
prelevate care permit evitarea contaminrii orofaringiane: aspirat transtraheal, aspirat transtoracic, aspirat
bronhoscopic prin cateter protejat cu canule telescopate / lavaj bronhoalveolar, biopsie transbronic, biopsie
pulmonar pe torace deschis, aspirat pleural, hemoculturi
cu toate c este contaminat cu flora normal orofaringian, sputa reprezint produsul patologic recoltat
cel mai frecvent, n majoritatea IACRI. Se pot obine probe calitativ corespunztoare n momentul n care
pacientul se prezint n unitatea sanitar (este recomandabil s se recolteze prima sput eliminat matinal i n
nici un caz sputa din 24 de ore). Pacientul trebuie s neleag diferena dintre "a expectora" i "a tui i scuipa".
naintea prelevrii se recomand periajul simplu al dinilor, cltirea energic a gurii i gargara cu ap (sau
cu soluie salin fiziologic)
dac proba apare constituit n principal din saliv, trebuie s solicitm imediat pentru prelevarea unei noi
probe care s permit ulterior definitivarea diagnosticului. n IACRI o prob mucopurulent n volum de 2-3 ml
ar putea fi suficient.
stimularea expectoraiei prin inhalarea de aerosoli calzi cu soluie salin (3%) ofer, de regul, probe
citologic nesatisfctoare (sputa indus ar putea fi util n izolarea Pneumocystis carinii). n cazul n care se
presupune o infecie mycobacterian sau fungic este recomandat recoltarea i prelucrarea a 3 produse, n 3
zile consecutive.
splarea sputei intens mucopurulente (n 3 bi succesive de soluie salin izoton) reduce contaminarea
orofaringian fr a influena semnificativ concentraia bacteriei infectante prins n trama fibrinoas a probei.
Fluidifierea (de ex. cu N-acetil-L-cistein) permite omogenizarea produselor patologice; se realizeaz n cteva
minute.
n cazul suspicionrii unei infecii fungice, probele fluide se concentreaz prin centrifugare 20 de minute
la 3000 rot/min., apoi se examineaz sedimentul. Din probele bioptice se disec mici fragmente suspecte cu
volume de circa 1 mm care sunt apoi examinate la stereomicroscop (mrire 30). esutul cazeos, fibros i
grsimea ascund n mod frecvent hifele iar tratarea cu KOH nu clarific preparatul fiind necesar disocierea i
omogenizarea probei.
produsele patologice recoltate pentru diagnosticul microbiologic trebuie transmise prompt ctre laborator
(preferabil n maxim 1 or, acceptabil n 1-2 ore)
produsele recoltate ntr-un recoltor steril de 50-200 ml, cu capac care permite o nchidere etan, sunt
etichetate i expediate imediat la laborator pentru a fi examinate. Nu exist modaliti optime de conservare a
probelor. Meninerea la o temperatur de 4C previne multiplicarea contaminanilor, conserv unii patogeni, dar
scade pn la anulare ansa de izolarea a altora (ex. H. influenzae, N. meningitidis).
utilizarea unui mediu de transport perturb raportul dintre bacterii i reperele citologice ale probei,
eseniale pentru apreciare calitii probei i interpretarea rezultatelor sputoculturii, dar n cazul n care se
apreciaz c se va depi timpul de transport recomandat se poate utiliza mediul Stuart sau Amies. n cazul n
care se urmrete, spre exemplu, izolarea M. pneumoniae, cultivarea trebuie fcut ct mai rapid; produsul
patologic poate fi conservat maxim 4 ore n lipsa unui mediu special i pn la maxim 24 de ore dac se
utilizeaz mediul de transport pentru molicute. n cazul n care ar fi necesar o conservare prelungit, este
necesar utilizarea unei temperaturi de 70C (n nici un caz temperatura congelatorului obinuit).
4. Puroiul
exist numeroase condiii clinice n care apar supuraii (superficiale sau profunde) iar tehnica de recoltare
variaz n funcie de originea puroiului (arsuri i plgi suprainfectate, abcese, flegmoane, fistule etc)
este recomandat ca pentru recoltare s folosim tampoane cu vat sterile numai n cazul n care nu avem o
alt soluie
puroiul poate fi recoltat cu ansa bacteriologic, pipeta Pasteur, prin biopsiere, chiuretare sau, atunci cnd
este vorba de colecii profunde, prin puncie i aspirare
n special pentru situaiile n care vom recolta p.p. dintr-o colecie profund, colaborarea ntre clinic i
laborator trebuie s fie foarte bun
atunci cnd suspicionm o infecie cu microorganisme anaerobe sunt necesare pregtiri speciale i cel
puin utilizarea seringii care se nchide cu dop (vezi mai sus); exist germeni anaeobi care pot fi distrui n
cteva secunde de contact cu oxigenul
transportul ctre laborator se va realiza utiliznd medii de transport sau containere speciale (pentru
asigurarea anaerobiozei); p.p. trebuie s fie prelucrat n 1-2 ore
5. Materiile fecale (vezi capitolul 28)
6. Urina (vezi capitolul 29)
7. Sngele (vezi capitolul 31)
8. Lichidul cefalo-rahidian
se recolteaz n cazul suspicionrii prezenei unui sindrom meningeal, dup examinarea fundului de ochi
(verificm presiunea n artera central a retinei, semne de staz papilar)
suspiciunea este ridicat de medicul de specialitate (boli infecioase, neurologie, medicin intern etc) iar
recoltarea se va face la patul bolnavului de ctre medicul care are competena de a executa aceast manevr (ex.
prin puncie lombar)
tehnicile de asepsie trebuie s fie riguroase n toate situaiile, dar n cazul recoltrii LCR atenia trebuie s
fie i mai sporit
chiar dac acest manual de lucrri practice se adreseaz numai infeciilor bacteriene i fungice, trebuie s
privim lucrurile n ansamblul lor i drept exemplu, s nu uitm c exist meningite infecioase i meningite
neinfecioase iar meningitele infecioase pot fi fungice, bacteriene, parazitare, virale, prionice; n plus, pentru
elucidarea etiologiei unei meningite este necesar efectuarea unor examinri biochimice adiacente celor
citologice i microbiologice astfel nct este de dorit recoltarea (la adult) a unei cantiti de 5-10 ml LCR;
recoltarea p.p. este invaziv i va trebui s fim n stare s executm toate testele necesare fr a solicita
repetarea punciei lombare
recomandm recoltarea LCR n 2-3 tuburi sterile (2 tuburi vor fi centrifugate iar din al treilea tub se vor
realiza testele biochimice i alte teste utile pentru a sugera etiologia); dac LCR este franc purulent, examenul
microscopic direct se face fr centrifugare
n mod ideal, LCR trebuie prelucrat imediat, cu alte cuvinte recoltarea i procesarea p.p. trebuie s
nceap la patul bolnavului; recomandm ca pe lng trusa necesar manevrei de recoltare s avem la
dispoziie o spirtier, stative pentru eprubete, medii de cultur diverse (agar-snge, Lwenstein, Sabouraud etc)
dac LCR urmeaz a fi transportat, transportul trebuie s se fac ct mai rapid i la o temperatur
apropiat de temperatura corpului uman (n nici un caz la +4C; att Haemophilus influenzae ct i Neisseria
meningitidis, ageni etiologici recunoscui ai meningitelor bacteriene sunt distrui prin refrigerare)
un al motiv n favoarea unui transport i o prelucrare foarte rapid a LCR este reprezentat de studiul
citologic al p.p. i mai precis de numrarea leucocitelor polimorfonucleare care ncep s fie distruse n numr
semnificativ nc din primele 30-60 minute dup recoltare
exist mai multe tipuri de secreii care ar putea fi recoltate n funcie de manifestarea clinic; n
materialul de fa vom discuta doar o parte dintre acestea
recoltarea p.p. trebuie s se fac dimineaa, nainte de miciune, sau la cel puin 2 ore dup aceasta; n
cazul n care pacientul nu se prezint dimineaa i nu este respectat condiia de mai sus iar dup 2 ore de la
micionare secreia este n cantitate prea mic, i vom recomanda s consume ct mai puine lichide n restul
zilei i s revin n dimineaa urmtoare, nainte de miciune
sunt necesare tampoane de vat sterile (un tampon pentru examenul microscopic i al doilea pentru
cultivare) sau, alternativ o ans bacteriologic steril; este recomandabil ca ansa s aib firul i bucla de platin
(sau ar putea fi o ans bacteriologic de unic ntrebuinare)
dac exist secreie uretral, aceasta este recoltat cu tamponul (sau cu ansa)
n cazul n care nu se evideniaz secreie uretral n mod spontan, cu mna protejat de o mnu de
latex, exprimm uretra utiliznd degetul mare i indexul i recoltm secreia care apare
dac nici prin aceast manevr nu putem obine p.p. vom recurge la recoltarea intrauretral cu tamponul
(sau cu ansa)
n acest scop sunt necesare tampoane de dimensiuni mai mici, preferabil din alginat de calciu (sau dacron
n suspiciunea unei infecii cu Chlamydia spp. sau Mycoplasma spp.); dup introducerea blnd, pe circa 2
centimetri lungime i rotirea intrauretral a primului tampon, al doilea tampon va fi inserat cu aproximativ 1
centimetru mai profund
n suspiciunea de gonoree se recomand cultivarea imediat dup recoltare pe mediul de cultur nclzit la
37C; n cazul n care acest lucru nu se poate realiza, tamponul cu p.p. va fi transmis laboratorului n mediu de
transport (ex. mediul Stuart pentru Neisseria gonorhoeae sau alte variante pentru Chlamydia spp. sau
Mycoplasma spp.)
recoltarea se va face preferabil n primele 10 zile dup ciclul menstrual, pe masa ginecologic, dup
introducerea valvelor ginecologice i examinarea vizual a vaginului i colului uterin
dac se remarc o secreie purulent, cu ajutorul unor comprese sterile se ndeprteaz secreia de la
nivelui colului extern
folosim 3 tampoane sterile introduse i rotite uor 1-2 centimetri n colul uterin (2 dintre tampoane le
vom utiliza pentru frotiuri Gram i Giemsa iar al treilea pentru cultivare procednd aa cum am menionat mai
sus).
10. Diferite p.p. recoltate n suspiciunea unor infecii fungice
dup antiseptizarea leziunii cu alcool medicinal (70) raclm tegumentul i utilizm pentru examinare
scuamele produse
att scuamele ct i alte structuri (fire de pr, fragmente de unghie etc) se mpacheteaz n hrtie steril
care se introduce ntr-o cutie Petri i se trimite pentru prelucrare i examinare n laborator (n maxim 48 de ore)
recoltm p.p. i l transmitem ctre laborator avnd grij s prevenim deshidratarea produsului
se recomand prelucrarea i examinarea imediat (unii fungi sunt fragili; este de dorit s putem evalua
situaia fungilor foarte aproape de momentul recoltrii pentru a putea nelege care a fost situaia in vitro)
iar n caz contrar adugm penicilin, streptomicin i cloramfenicol pentru inhibarea multiplicrii
bacteriene i meninem p.p. la +4C (supravieuirea la aceast temperatur depinde de fungul implicat i poate
varia de la ore la 2 sptmni, aa cum se ntmpl n cazul unor fungi dimorfi).
Aa cum am menionat, datele prezentate nu cuprind toate posibilitile i variantele. Am ncercat s dm doar
cteva exemple care sunt orientative. Pentru cei interesai exist manuale dedicate exclusiv recoltrii i
transportului produselor patologice, n microbiologie.
Pentru trei dintre p.p. am ales o alt modalitate de prezentare. Recoltarea urinii, materiilor fecale i sngelui va
fi discutat n partea special.
Microorganismele studiate au dimensiuni foarte mici, de ordinul micronilor, astfel nct pentru examinarea lor
este necesar o mrire de circa 1.000X, aa cum vom discuta i n capitolul urmtor. Exist diferite tehnici prin
care se poate pune n eviden prezena unor microorganisme ns, de mare utilitate este examenul microscopic
care se poate adresa unor preparate microscopice proaspete (umede, ntre lam i lamel) sau unor frotiuri
fixate i colorate n funcie de suspiciunea diagnostic, p.p. examinat etc.
n schema general de diagnostic microbiologic (direct) vom examina microscopic produsul patologic (etapa a
2-a) sau colonia aprut pe mediul de cultur (etapa a 4-a, punctul b, identificarea pe baza caracterelor
morfotinctoriale).
Uneori examenul microscopic este decisiv pentru diagnostic, alteori are un rol orientativ, ns, chiar din al
doilea an de studiu ar fi bine ca viitorii medici s neleag, rein i ulterior s aplice cele nvate, indiferent de
specialitatea pe care o vor urma.
este de preferat s folosim lame i lamele noi supuse urmtoarelor proceduri succesive (imersare n
amestec sulfo-cromic cteva zile, splare, cltire, pstrare n alcool 50%)
lamele se usuc (folosim o crp curat) apoi se degreseaz suplimentar prin flambare (trecere de cteva
ori prin flacra becului Bunsen)
dac produsul patologic are consisten lichidian (ex. urin, sediment urinar, materii fecale, LCR,
serozitate din ancru presupus sifilitic etc) va fi utilizat ca atare; pentru o mai bun vizualizare putem aduga
albastru de metilen, lugol, tu de India, nigrozin etc
dac cultura este realizat n mediu lichid (ex. pentru Leptospira spp.) se va utiliza ca atare
dac vrem s studiem spre exemplu mobilitatea microorganismelor care au format colonii pe un mediu
solid vom descrca o ans din colonie ntr-o pictur de soluie salin fiziologic, ap distilat sau bulion
dac p.p. este recoltat ntr-o suspiciune de micoz superficial, pe lama de microscop se va depune o
pictur dintr-o soluie 10-20% KOH-glicerol n care se va descrca i dispersa p.p
dac vrem s studiem aspectul fungilor filamentoi (mucegaiuri) dintr-o colonie, pe lam se va depune o
pictur de soluie lactofenol-albastru coton n care vom descrca un fragment din periferia coloniei respective
cel mai frecvent presm uor lamela pentru a elimina eventualele bule de aer
n cazul p.p. recoltat ntr-o suspiciune de micoz superficial, nclzim uor preparatul prin trecere cu
grij, de 2-3 ori, pe deasupra flcrii becului Bunsen
dac vrem s studiem aspectul fungilor filamentoi (mucegaiuri) dintr-o colonie, nu trebuie s micm
sau s presm lamela
n microscopia optic pe cmp luminos aezm preparatul pe platina microscopului i examinm iniial
cu obiectivul 10, apoi cu obiectivul 20 sau 40 (nu folosim obiectivul de imersie); se pot folosi i alte tehnici
microscopice.
este de preferat s folosim lame i lamele noi supuse urmtoarelor proceduri succesive (imersare n
amestec sulfo-cromic cteva zile, splare, cltire, pstrare n alcool 50%)
lamele se usuc (folosim o crp curat) apoi se degreseaz suplimentar prin flambare (trecere de cteva
ori prin flacra becului Bunsen)
Executarea frotiurilor din p.p. cu consisten fluid sau din culturi microbiene realizate n mediu de
cultur lichid
ntindem prin micri de dute-vino (de haurare) pe axul lung al lamei produsul prelevat, n strat ct
mai subire, avnd grij s nu ne apropiem de marginile lamei / ntinderea se poate face i prin micri
circulare, excentrice
lsm lama s se usuce lng becul de gaz (nu grbim uscarea prin eventuale treceri ale frotiului prin
flacr) n cazul n care avem n dotare un dispozitiv n care lama se poate aeza i usca la +70C, vom utiliza
aceast metod
fixm frotiul; exist metode chimice de fixare, ns cel mai frecvent folosim fixarea prin cldur,
distrugnd n acelai timp i microorganismele (care prezint o afinitate tinctorial mai mare dect celulele vii)
n acest scop, trecem frotiul prin flacr (aa cum am procedat i pentru flambarea lamei, nainte de
executarea frotiului) ns de aceast dat partea pe care am ntins p.p. sau cultura este orientat n sus; ca o
modalitate de control, atingem dosul minii cu lama flambat iar temperatura atins prin flambare nu trebuie s
fie mai mare dect pe care o putem suporta
Executarea frotiurilor din p.p. cu consisten solid sau din culturi microbiene realizate n mediu de
cultur solid
cu ajutorul flaconului cu picurtor sau cu ansa bacteriologic sterilizat i rcit depunem n centrul lamei
o pictur de soluie salin fiziologic sau ap distilat
prelevm aseptic p.p. / un fragment din colonie i depunem produsul n pictura de fluid de pe lam
flambm lama
lama se poate aplica i pe suprafaa de seciune a unor prelevate bioptice sau obinute prin necropsie
Colorarea frotiurilor
Exist foarte numeroase metode de colorare a frotiurilor. Dintre acestea vom prezenta doar cteva dintre
coloraiile folosite mai frecvent.
n vederea colorrii avem nevoie de o trus pentru colorare (stativ de colorare, colorani conform reetei de
colorare, ap distilat sau ap curent pentru splare, stativ de uscare).
Pentru colorarea frotiurilor din produs patologic folosim cel mai frecvent coloraiile cu albastru de metilen
(A.M.), Giemsa, Gram i dup caz, Ziehl-Neelsen. n funcie de suspiciunea diagnostic i p.p. examinat se pot
folosi i alte coloraii (de ex. coloraia Gimenez pentru depistarea rickettsiilor pe amprente de organ de la
animale infectate experimental sau coloraia cu albastru de toluidin pentru evidenierea Pneumocystis carinii).
n cazul multora dintre coloraiile uzuale au fost realizate diferite modificri n funcie de experiena autorilor i
scopul urmrit. De ex. coloraia cu A.M poate avea urmtoarele variante:
albastru de metilen Lffler pentru cele mai multe coloraii simple sau ca un al doilea colorant n coloraia
Ziehl-Neelsen
albastru de metilen policrom pentru evidenierea Bacillus anthracis n p.p., pentru corynebacterii sau
nlocuind coloraia de mai sus
albastru de metilen (varianta Wayson) pentru p.p., cu o sensibilitate mai bun dect utilizarea A.M.
Lffler etc.
n cursul lucrrilor practice precum i n manualul de fa se va discuta numai cte o variant cu referire la
principalele coloraii folosite n microbiologie. Cei interesai au la dispoziie pentru studiu un bogat material
teoretic iar dup ncheierea antrenamentului personal n ceea ce privete realizarea de frotiuri i coloraii,
fiecare va putea alege o variant, aplicabil n funcie de situaie.
Pentru colorarea frotiurilor obinute din cultur vom folosi n special coloraiile Gram, Ziehl-Neelsen i alte
coloraii specifice, dup caz (coloraii pentru cili, capsul, spori etc).
Coloraia cu albastru de metilen
acoperim frotiul cu soluie de albastru de metilen, pentru 3-4 minute (nu are rost s acoperim cu colorant
lama n ntregime)
aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim uscarea prin tamponare cu sugativ sau
hrtie de filtru
fixarea frotiului nu se face la cald ci chimic, cu alcool metilic (de ex. timp de 1 minut)
acoperim frotiul cu soluie May-Grnwald (diluat n pri egale cu tampon fosfat), pentru 3 minute
ateptm ca frotiul s se usuce i examinm cu un obiectiv intermediar; dac colorarea celulelor este mai
slab dect cea ateptat acoperim din nou frotiul cu soluie Giemsa, nc 10 minute
aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim uscarea prin tamponare cu sugativ sau
hrtie de filtru
acoperim frotiul cu violet de metil sau cristal violet (violet de genian din punct de vedere istoric),
pentru 1-3 minute (nu are rost s acoperim cu colorant lama n ntregime)
ndeprtm colorantul
ndeprtm lugolul
acoperim frotiul cu un amestec de alcool-aceton (1 parte aceton / 3 pri alcool de 96) pentru un timp
foarte scurt, 7-8 secunde
aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim uscarea prin tamponare cu sugativ sau
hrtie de filtru
trecem becul de gaz aprins pe sub lama acoperit de fucsin, pn ncepe emiterea de vapori (nu atingem
temperatura de fierbere). n cazul n care lama nu mai este acoperit complet cu fucsin, adugm colorant.
Timpul de lucru este de 10 minute, perioad n care repetm de 3 ori operaia de nclzire a lamei pn la
emiterea de vapori.
adaugm amestecul decolorant acid-alcool (3 ml acid clorhidric concentrat / 97 ml alcool etilic 90-95),
pentru 2-3 minute
aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim uscarea prin tamponare cu sugativ sau
hrtie de filtru
picurm soluie de fucsin fenicat Kinyoun pn cnd hrtia de filtru se mbib complet i ateptm 5
minute
ndeprtm hrtia de filtru
acoperim lama cu amestecul decolorant acid-alcool pentru circa 30 secunde; vrsm amestecul decolorant
i repetm operaia pentru nc 30 secunde
acoperim frotiul cu albastru de metilen, pentru 1 minut (nu are rost s acoperim cu colorant lama n
ntregime)
aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim uscarea prin tamponare cu sugativ sau
hrtie de filtru
colorm cu soluie de auramin O (amestec de auramin O, alcool etilic, fenol, ap distilat), pentru 15
minute
splm cu ap distilat
splm cu ap distilat
aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim uscarea prin tamponare cu sugativ sau
hrtie de filtru
ndeprtm xilolul
ndeprtm alcoolul
acoperim frotiul cu soluia de fucsin fenicat preparat dup reeta Gimenez, pentru 1-2 minute, fucsina
se picur pe frotiu printr-o plnie prevzut cu o hrtie de filtru
Microscopul optic este un instrument care permite observarea obiectelor mai mici dect cele care pot fi vzute
cu ochiul liber (sau cu lupa). Microscopul formeaz imagini virtuale, mrite i rsturnate ale obiectului cu
ajutorul unui sistem de lentile obiectiv i de lentile ocular.
Distana minim dintre dou puncte ale unui obiect care mai pot fi vzute separat unul de celalalt prin
microscop este:
unde l reprezint lungimea de und a radiaiei folosite, n este indicele de refracie al mediului strbtut de
radiaie ntre obiect i ocular iar u este unghiul dintre axa optic i razele cele mai ndeprtate de ax care mai
ptrund nc n obiectiv. Pentru a micora aceast distan i respectiv pentru a mbunti performanele
microsopului exist mai multe metode dintre care vom meniona dou, utilizate i n studiul microbiologic:
utilizarea unor radiaii cu lungime de und l ct mai mic (de ex. pentru radiaia ultraviolet se pot
distinge obiecte cu dimensiuni de 0,15 mm)
mediul transparent dintre obiect i obiectiv s aib un indice de refracie n ct mai mare (aa cum se
procedeaz n cazul microscopului cu imersie).
n microscopia optic pe cmp luminos lumina este transmis de-a lungul axului optic al instrumentului, prin
preparat, n aceste condiii obinndu-se un cmp vizual puternic luminat, n care obiectele, pentru a putea fi
vzute, se disting pe fondul luminos fie prin opacitate, fie prin culoarea lor (n special dup utilizarea unor
tehnici de colorare - a se revedea capitolul 7).
Pot fi realizate i msurtori cu ajutorul micrometrelor (utile mai mult n diagnosticul parazitologic);
micrometrele sunt plcue de sticl pe care sunt marcate scale fin divizate, de dimensiuni cunoscute, a cror
imagine se poate suprapune peste imaginea obiectului de cercetat.
sediment urinar / putem vizualiza: celule epiteliale (malpighiene, vezicale, uretrale etc), celule sanguine
(leucocite, hematii), cilindrii urinari (hialini, leucocitari, eritrocitari, epiteliali, granulari etc), cristale urinare,
levuri (eventual nmugurite, cu blastoconidii), Trichomonas vaginalis etc; examenul sedimentului urinar este
foarte util
preparat montat n soluie KOH / putem vizualiza: levuri (numr, form, dimensiuni), blastoconidii,
atroconidii, pseudohife, microorganisme asociate
preparat colorat cu tu de India (coloraie negativ) / putem vizualiza: levuri capsulate, nconjurate de
un halou clar pe fondul ntunecat al preparatului, ex. Cryptococcus neoformans
n cazul n care se urmrete mobilitatea microorganismelor, trebuie s putem deosebi micarea real de
micarea brownian (oscilaie pe loc a particulelor); urmrim reperele aflate n vecintatea microorganismelor
etc.
2. Examinarea unui preparat fixat i colorat
Frotiul se aeaz pe platina microscopului i se fixeaz cu ajutorul cavalerilor.
Centrm zona pe care dorim s o examinm. Procedm ca mai sus utiliznd obiectivul 40x; alegem cmpul pe
care l vom examina ulterior cu obiectivul cu imersie (de ex. un cmp n care sesizm prezena leucocitelor).
Ridicm tubul microscopului, punem o pictur de ulei de cedru pe lam, n zona pe care urmeaz s o
examinm. Condensatorul este ridicat pn sub platina microscopului i are diafragmul deschis.
Privind din lateral, folosim macroviza i coborm obiectivul cu imersie (90x sau 100x) pn atingem suprafaa
lamei realiznd contactul i cu uleiul de cedru. Manevra trebuie realizat cu grij pentru a nu sparge frotiul.
Privim prin oculare i rotim foarte ncet macroviza ridicnd foarte ncet tubul microscopic, pn prindem
imaginea cmpului. Cu ajutorul microvizei punem la punct imaginea.
Se pot examina: morfologia celulelor din produsul patologic, prezena leucocitelor i dac acestea sunt
modificate, prezena bacteriilor i dispunerea acestora (ex. intra sau extra-leucocitar), morfologia bacteriilor,
morfologia unor parazii, morfologia levurilor, aspectul frotiurilor de snge etc
frotiu colorat cu albastru de metilen (A.M.) / putem vizualiza: bacterii colorate n albastru nchis, n cazul
bacteriilor capsulate, aceast structur va aprea ca un halou necolorat, celule diferite (n funcie de sediul
recoltrii) i celule inflamatorii pentru care nucleul apare ntr-o culoare albastru mai nchis n timp ce
citoplasma apare cu nuane de albastru; coloraia cu A.M. permite o mai bun difereniere a detaliilor
structurale
frotiu colorat Giemsa / putem vizualiza: hematii (roz-roii), polimorfonucleare neutrofile (citoplasm roz,
granulaii brune, nucleu violaceu), polimorfonucleare eozinofile (citoplasm roz, granulaii brune, nucleu
violaceu), limfocite i macrofage (citoplasm albastr, nucleu violaceu), bacterii colorate n violet, forme
trofice de Pneumocystis carinii (nucleu rou, citoplasm albastr), Histoplasma capsulatum n citoplasma
celulelor fagocitare (levuri colorate n rou), incluziuni de Chlamydia trachomatis (corpusculii reticulai apar
albatri, corpusculii elementari apar roii) etc
n cazul n care frotiul a fost realizat din cultur pur putem vizualiza microorganisme cu aceeai form,
aceleai dimensiuni (excepie Proteus spp.), o anumit dispoziie, cu sau fr capsul (halou necolorat), gram
pozitive (colorate n violet) sau gram negative (colorate n rou), levurile se coloreaz n violet
n cazul n care frotiul a fost realizat din produs patologic putem vizualiza celule diferite (n funcie de
sediul recoltrii) i celule inflamatorii pentru care nucleul i citoplasma apar n diverse nuane de rou, bacterii
gram pozitive i / sau gram negative, fibrin i levuri care se coloreaz n violet etc
frotiu colorat Ziehl-Neelsen sau Kinyoun / putem vizualiza: bacili de culoare roie, relativ fini (n cazul
prezenei BAAR), alte bacterii (ne-AAR), celule diferite (n funcie de sediul recoltrii) i celule inflamatorii de
culoare albastr (toate structurile ne-AAR apar colorate albastru) etc; n cazul colorrii unui frotiu din cultur
pur vom evidenia numai bacili de culoare roie.
ntreinerea microscopului
Dup terminarea examenului microscopic trebuie efectuate urmtoarele proceduri:
coborm condensatorul
preparatele fixate (pe care urmeaz s le pstrm) se introduc ntr-un container cu xilol (1-2 minute) apoi,
dup evaporarea xilolului se pun ntr-o cutie
tergem lentila obiectivului cu imersie cu pulpa degetului sau cu o hrtie moale, special, pentru a o
cura de uleiul de cedru (periodic, vom terge lentila acestui obiectiv cu un tifon foarte curat mbibat n xilol)
acoperim microscopul cu o hus de plastic sau pnz, pentru a-l feri de praf
pentru a preveni efectul nedorit al multiplicrii unor fungi asupra sistemului optic, o recomandare ar fi
meninerea microscopului ntr-un ambalaj de polietilen mpreun cu o substan desicant, spre exemplu
silicagel.
lichidul clar recoltat i ancrul sifilitic trebuie examinat n maxim 20 minute dup recoltare; putem
vizualiza spirochete luminoase, fine, lungi, cu spire regulate, capete efilate, cu micri de nurubare, flexie,
translaie, pe fond negru
n preparatul proaspt care conine leptospire putem vizualiza filamente luminoase, spiralate, foarte
mobile, cu micri de nurubare i flexie, pe fond negru.
Faptul c aceste preparate nu sunt fixate i colorate permite examinarea unor caracteristici care ar putea fi
alterate n cursul acestor procese. Se pot examina structuri citoplasmatice, morfologia celular, dar i structuri
bacteriene sau fungice.
Microscopul cu fluorescen
Microscopul cu fluorescen trebuie s fie dotat cu urmtoarele piese speciale: sursa de radiaii (de ex. o lamp
din sticl de cuar cu vapori de Hg care emite radiaii ultraviolete), setul de filtre (caloric, de excitaie, de baraj),
condensatorul pentru fond ntunecat.
Filtrele au urmtoarele roluri. Filtrul caloric absoarbe radiaiile calorice emise de lamp (sursa de radiaii emite
att radiaii ultraviolete ct i radiaii luminoase i calorice). Filtrele de excitaie permit numai radiaiilor cu
lungime de und mic (ex. ultraviolete) s accead ctre preparatul microscopic. Aceste radiaii reprezint
radiaii de excitaie. Filtre de baraj sunt de fapt filtre de protecie pentru c nu permit trecerea radiaiilor de
excitaie nocive s treac spre ocular i respectiv spre ochiul examinatorului, n timp ce lumina emis de
fluorocromi trece i poate fi perceput. Filtrele de excitaie i de baraj sunt alese n funcie de fluorocromul
utilizat.
Condensatorul mrete contrastul imaginii mai bine dect un condensator obinuit.
Pentru examinarea n fluorescen mai sunt necesare cteva elemente, respectiv obiectivele acromate (cu
meniunea c obiectivul cu imersie trebuie s aib diafragm iris), utilizarea unui lichid de imersie care nu se
usuc uor i lipsit de proprietatea de fluorescen (ex. glicerin tamponat neutr) i respectiv lame cu
grosimea de 1 milimetru. Este preferabil utilizarea unui dispozitiv monocular.
9. Medii de cultur
Populaia = o multitudine de indivizi ai unei specii care habiteaz ntr-un anumit biotop. Clona reprezint
populaia care rezult dintr-o singur celul prin nmulire vegetativ. Tulpina = populaia microbian alcatuit
din descendenii unei singure izolri n cultur pur.
n funcie de temperatura de dezvoltare, microorganismele pot fi mezofile, psichrofile sau termofile. Bacteriile
studiate de microbiologia medical sunt n imensa lor majoritate mezofile (au temperatura optim de dezvoltare
cuprins ntre 30-37C). Pentru fungi, temperatura optim de dezvoltare este n jur de 28C.
Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecii trebuie ca dintr-un produs recoltat de la pacient s obinem
mai nti respectivul microorganism n cultur pur, pentru ca ulterior s i se poat studia caracterele fenotipice
sau genotipice. Cultivarea este esenial i pentru determinarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice.
Metodele de cultivare a bacteriilor sau fungilor urmresc trei obiective: obinerea unei populaii microbiene
suficiente cantitativ pentru investigaiile propuse, prevenirea contaminrii produsului cercetat cu un
microorganism strin i izolarea fiecrei tulpini microbiene urmrite n cazul unui produs plurimicrobian n
culturi monomicrobiene denumite culturi pure. Nu exist un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricrui
microorganism.
Termenul nsmnare definete operaia de introducere a unei cantitai de germeni ntr-un mediu de cultur
artificial, n timp ce pentru culturile celulare, ou embrionate i mai ales animale de experien folosim
termenul inoculare.
Cultivarea se realizeaz prin nsmnarea microorganismelor pe medii de cultur. Mediile solide sau lichide
care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice necesare creterii i multiplicrii se numesc medii de cultur.
Totalitatea microorganismelor acumulate prin multiplicarea ntr-un mediu de cultur poart numele de cultur
(bacterian, fungic etc).
***
Exist o foarte mare varietate de medii de cultur.
Mediile de cultur se pot clasifica dup mai multe criterii. n primul rnd, n funcie de coninutul n celule vii
avem la dispoziie:
1.
Medii necelulare (artificiale, medii de cultur)
2.
Medii celulare (care includ celule vii) i anume animale de laborator, ou de gin embrionate sau culturi
de celule.
Exist anumite microorganisme (ex. virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu pot fi cultivate dect pe substraturi
care includ celule vii. Majoritatea bacteriilor, fungii i unele protozoare se pot cultiva i pe medii de cultur
(necelulare, artificiale).
linii celulare derivate din rinichi de maimu (Vero, BSC-1, BGMK etc), oarece (McCoy), ovar de
hamster (CHO)
linii celulare derivate din carcinom de col uterin (HeLa), laringe (HEp-2)
Pentru Chlamydia trachomatis se pot utiliza liniile celulare BGMK, HeLa, McCoy, pentru Chlamydia
pneumoniae se pot utilizat liniile celulare HeLa, HEp-2, pentru Chlamydia psittaci se poate utiliza linia celular
McCoy etc. Liniile celulare pot fi utile i n vederea studierii efectului unor exotoxine, spre exemplu n cazul
toxinelor produse de E. coli O157:H7 i respectiv de Shigella shiga se poate utiliza linia celular Vero n timp
ce pentru toxinele produse de Vibrio cholerae i E. coli entero-toxigen se poate utiliza linia celular CHO.
solide (agar / geloz, agar-snge, AABTL, ADCL, Bordet-Gengou, Chapman, Lffler, Lwenstein,
Mueller-Hinton, Sabouraud, TCBS, TSI etc)
lichide (ap peptonat alcalin, bulion Mueller-Hinton, bulion nutritiv, bulion-snge, bulion selenit,
bulion tioglicolat, Middlebrook 7H9, O.C.S.T. etc)
cu umiditate obinuit
medii speciale:
selective (agar-snge azid de sodiu, BSA, Chapman, Mac Conkey, Tinsdale cu telurit de potasiu, medii
cu antibiotice etc)
exemplu, agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) permite diferenierea bacteriilor lactozo-pozitive
(cum este E. coli) de bacteriile lactozo negative (Shigella, Salmonella etc). Alte exemple: ADCL (agar
dezoxicolat citrat lactoz), TSI (3 zaharuri i fier), MIU (mobilitate indol uree).
Iniial, toate mediile de cultur erau preparate n laborator, din ingredientele stabilite conform reetei. Etapele
generale pentru producerea unui mediu sunt asemntoare:
cntrirea ingredientelor
filtrarea
utilizarea examenului microscopic n a doua i respectiv n a patra etap (de identificare) a diagnosticului
direct (capitolele 7 i 8)
substraturile pe care se poate realiza a treia i respectiv a patra etap (cteva dintre caracterele
examinate), n capitolul 9.
n capitolul de fa vom avea n vedere o parte dintre tehnicile indispensabile diagnosticului microbiologic n
general, subliniind utilizarea acestora n a treia i a patra etap de diagnostic
n capitolele urmtoare (11-13) vom prezenta o parte din elementele care definesc complexitatea etapei de
identificare a microorganismelor iar n capitolul 14 vom discuta o parte dintre modalitile de stabilire a
sensibilitii la antibiotice i chimioterapice (antibacteriene sau antifungice) cu ajutorul crora, dup ncheierea
unui diagnostic corect microbiologic, putem stabili n mod tiinific tratamentul antimicrobian ce trebuie
prescris unui anumit pacient care prezint o boal infecioas de etiologie bacterian sau fungic.
Aa cum am menionat i n capitolul 9, tehnicile de cultivare urmresc trei obiective:
izolarea fiecrei tulpini microbiene urmrite n cazul unui produs plurimicrobian n culturi
monomicrobiene denumite culturi pure.
Nu exist un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricrui microorganism.
Este esenial s se neleag necesitatea obinerii coloniilor izolate precum i a culturilor pure n diagnosticul de
laborator bacteriologic i micologic (direct). n cazul n care coloniile izolate reprezint o cultur pur (format
din acelai tip de microorganism), aceasta va fi utilizat n vederea identificrii agentului etiologic (bacteria
izolat de la un pacient cu o presupus boal infecioas) precum i la efectuarea antibiogramei n vederea
stabilirii tratamentului intit (antibioticul la care bacteria izolat este sensibil). n situaia n care nu s-a reuit
obinerea culturii pure, pornind de la coloniile obinute se vor face repicri pe medii de cultur neselective.
Obinerea de colonii bacteriene izolate dintr-un produs patologic se poate realiza prin epuizarea inoculului pe
mediile de cultur folosind:
- ansa bacteriologic
- pipeta Pasteur
- tamponul de vat montat pe o tij
- bagheta de sticl n form de L
- alte tehnici de nsmnare.
Ansa bacteriologic trebuie sterilizat nainte i dup fiecare utilizare a sa prin nclzirea pn la incandescen
(la rou) a buclei i firului urmat de flambarea portansei, pe cnd celelalte ustensile pentru nsmnare vor
fi sterilizate prin alte metode (vezi capitolul 4).
atenie: pe suprafaa mediului de cultur poate exista lichid de condens care ar putea facilita
contaminarea culturii bacteriene; este necesar ca placa Petri cu mediu de cultur pe care dorim s facem
cultivarea s fie meninut n termostat, cu mediul n sus, ntredeschis, pentru evaporarea condensului !
se sterilizeaz ansa bacteriologic la flacra becului de gaz prin aducerea la incandescen a buclei i
firului ansei urmat de flambarea portansei (trecere prin flacr de 2-3 ori)
se noteaz pe placa cu mediu de cultur data inoculrii, numrul de identificare i tipul produsului (tipul
produsului poate fi inclus printr-un simbol n numrul unic de identificare)
se ia eprubeta cu produs patologic n mna stng (n cazul n care fiind dreptaci, ansa bacteriologic este
inut n mna dreapt, ca un creion), se scoate dopul eprubetei utiliznd n acest scop degetele 4-5 de la mna
dreapt
se flambeaz gura eprubetei (trecere prin flacr de 2-3 ori, imprimnd o uoar micare de rotire n
ambele sensuri)
se introduce ansa n eprubet fr s se ating gura sau pereii acesteia n partea superioar, se rcete
bucla pe pereii eprubetei n vecintatea produsului patologic i se ncarc bucla ansei din profunzimea
produsului patologic, recoltnd fragmente care ar putea include cu o mai mare probabilitate bacterii implicate n
procesul infecios (ex. poriuni cu aspect purulent)
se monteaz dopul la eprubet printr-o micare de rsucire ce are ca scop fixarea lui
atenie: n toat aceast perioad se contraindic efectuarea unor micri brute cu ansa ncrcat cu
produs patologic; micrile brute i necontrolate pot determina contaminarea cu produs patologic a mesei de
lucru, a mediului de lucru sau a celui care manipuleaz produsul patologic !
dup ce eprubeta a fost aezat n stativ, mna stng eliberat va lua o plac Petri pe care o va aeza pe
mas cu capacul n jos i mediul n sus
tot cu mna stng se va deschide placa iar cu ansa ncrcat cu produs patologic se vor trasa linii (striuri)
aproximativ paralele ntre ele, ca un zig-zag (fr a se ridica ansa de pe mediul de cultur) reprezentnd o
prim latur a unui pentagon deschis
se rcete ansa (se poate ncerca rcirea ei prin atingere pe suprafaa mediului solid steril, nensmnat,
lng peretele exterior al plcii Petri)
fr s se mai ncarce ansa cu produs patologic se traseaz a doua latur a pentagonului intersectnd-o pe
prima, tot ca linii paralele, dup care ansa se va steriliza din nou
se va proceda la fel ca mai sus i pentru urmtoarele laturi avnd grij s nu se uneasc ultima latur cu
prima latur
se introduce placa Petri pe care a fost realizat cultivarea n termostat, rsturnat (cu mediul n sus i
capacul n jos), la temperatura optim multiplicrii microorganismului suspectat (pentru cele mai multe bacterii
termostatul va fi reglat pentru o temperatur de 35-37C, pentru fungi la 28C)
dup o perioad de incubare de 18-24 ore (pentru cele mai multe dintre microorganismele studiate), pe
prima latur se va obine cea mai important cantitate de cultur (cultur microbian confluent), pe
urmtoarele laturi se va remarca scderea cantitativ a culturii iar cel puin pe ultima latur a pentagonului
deschis se vor obine colonii izolate.
Dac mediul de cultur pe care s-a realizat cultivarea n pentagon deschis este neselectiv, coloniile izolate
obinute pot fi utilizate n etapele ulterioare (identificare prin diferite metode, testarea sensibilitii la antibiotice
i chimioterapice). n cazul n care cultura primar este obinut pe un mediu selectiv, este obligatorie repicarea
coloniilor izolate deoarece coloniile izolate vizibile pot fi asociate cu microorganisme inhibate datorit
selectivitii mediului, care nu se vd cu ochiul liber sau cu lupa i care se vor multiplica pe mediile de
identificare fcnd imposibil interpretarea rezultatelor.
Tehnica descris este o tehnic de baz i cu anumite modificri se poate utiliza i n alte situaii (spre exemplu
atunci cnd produsul patologic este recoltat n alte tipuri de recipiente).
esenial, care poate fi reinut nc din al doilea an de studiu). n continuare vom prezenta alte tehnici de
cultivare, fr a epuiza toate variantele posibile.
nsmnarea cu ansa calibrat
se poate utiliza pentru urocultura i n alte scopuri n care aproximarea numrului de microorganisme
dezvoltate pe mediul de cultur este util
putem utiliza anse de platin sau anse de unic folosin pentru 0,01 sau pentru 0,001 ml / calibrul anselor
de platin trebuie verificat n fiecare lun
urina recoltat corespunztor (vezi capitolele 6 i 29) se omogenizeaz prin rsturnarea de cteva ori a
recipientului de recoltare (nchis etan)
respectnd regulile lucrului aseptic, nclinm recipientul de colectare n aa fel nct s putem s punem
bucla ansei, paralel pe suprafaa urinei i s prelevm p.p.
pe o plac Petri cu mediul de cultur se descarc urina n striu, pe unul dintre diametre; apoi epuizm
inoculul pe toat suprafaa plcii n striuri perpendiculare pe striul de descrcare, cu micri de zig-zag
dup incubare, n ziua urmtoare vom numra coloniile aprute i spre exemplu vom nmuli numrul de
colonii cu 1000 dac am utilizat pentru nsmnare ansa de 0,001 ml
din motive economice putem s realizm nsmnarea n mod asemntor a urinei pe o jumtate sau
chiar pe o ptrime de plac.
nsmnarea cu tamponul sau cu bagheta de sticl n L
aceste tehnici se pot folosi att pornind de la produs patologic (metod preferat n unele laboratoare) ct
i de la colonii care sunt utilizate pentru obinerea de cultur pur
vom prezenta n continuare varianta n care se utilizeaz tamponul pentru cultivarea unui produs
patologic (exsudat faringian etc), presupunnd c suntem dreptaci
notm pe placa cu mediu de cultur data inoculrii, numrul de identificare i tipul produsului (tipul
produsului poate fi inclus printr-un simbol n numrul unic de identificare) nu vom mai nota aceast etap la
prezentarea urmtoarelor tehnici dar menionm acum faptul c este obligatorie, de fiecare dat; alte lucruri cu
importan general, menionate la tehnica obinerii coloniilor izolate prin epuizarea inocului cu ansa
bacteriologic rmn valabile
scoatem tamponul din tubul protector cu primele trei degete de la mna dreapt
cu mna stng lum o plac Petri (care nu mai prezint lichid de condens interior) pe care o aezm pe
mas cu capacul n jos i mediul n sus
tot cu mna stng deschidem placa iar cu dreapta descrcm tamponul ncrcat cu produs patologic
(exist mai multe modaliti de descrcare a tamponului, dintre care vom prezenta dou)
descrcm tamponul prin rulare, pe toate feele pe o raz a plcii, urmnd ca s dispersm produsul cu o
baghet de sticl n L, steril, pe toat suprafaa plcii
descrcm tamponul prin rulare, pe toate feele pe un cadran al plcii, urmnd ca s dispersm produsul cu
ansa bacteriologic n celelalte cadrane, ca n metoda pentagonului deschis (dup nsuirea tehnicii, pentru
economie, se poate realiza cultivarea pe jumtatea unei plci).
Tehnica diluiilor succesive n lichidul de condens al mediilor solide
mediul de cultur este turnat n eprubete sau tuburi; utilizm mai multe eprubete
fr s ncrcm din nou ansa cu p.p. o descrcm n pictura de condens a celui de al doilea tub .a.m.d
dup nsmnare, nclinm eprubetele pentru a sclda suprafaa mediului nclinat, cu pictura
respectiv de lichid de condens, realiznd n acest mod dispersia microorganismelor din pictura de inocul, pe
suprafaa mediului.
Tehnica epuizrii ansei pe medii solide
const n efectuarea unei serii de nsmnri cu ansa bacteriologic ncrcat o singur dat cu amestecul
de microorganisme, ntr-un ir de eprubete cu geloz nclinat, fr a steriliza sau a rencrca ansa
bacteriologic pe parcurs
nsmnm pornind de la baza eprubetei, atingnd mediul i urcnd prin descrierea unor striuri n zigzag, pentru fiecare eprubet n parte
realizm astfel o epuizare a coninutului ansei, n final, ajungnd s nsmnm numai cteva celule
microbiene, din care vor aprea dup incubare colonii izolate.
nsmnarea prin nepare a mediului turnat n tuburi sau eprubete
metoda se poate utiliza pentru conservarea culturilor pure ale unor tulpini considerate reprezentative, a
tulpinilor de colecie, a tulpinilor de referin, pentru nsmnarea unor medii multitest (TSI, MIU etc) etc
se prefer utilizarea unei anse fir, sau a unei anse cu o bucl mic (dup caz)
n funcie de scopul urmrit exist anumite variante ale acestei tehnici, iar tuburile (eprubetele) utilizate
au dimensiuni diferite i o cantitate de mediu care difer (respectnd protocolul de lucru corespunztor)
se utilizeaz tuburi de dimensiuni mici, cantitatea de mediu utilizat pentru un tub fiind de 3 ml
ulterior se nsmneaz partea nclinat prin realizarea unor striuri n zig-zag, atingnd suprafaa
mediului.
nsmnarea cu seringa
produsele lichide (n special snge, pentru hemocultur dar i alte p.p.) se pot nsmna direct cu seringa
cu care s-a fcut recoltarea
nsmnarea cu pipeta (Pasteur sau pipeta gradat, dup caz)
la deschiderea i nchiderea recipientelor flambm gura fiecruia n parte, aa cum am prezentat mai sus
nainte de a folosi pipeta, dei sterilizat n prealabil, o vom flamba prin trecere pe toat lungimea prin
flacr
pentru a preleva p.p. din recipientul de transport precum i pentru nsmnare n mediul lichid sau solid,
folosim un dispozitiv ct de simplu (este contraindicat aspirarea cu gura)
dup ncheierea nsmnrii eliminm lichidul rmas eventual n pipet n flaconul cu amestec sulfocromic, introducem pipeta n amestecul sulfo-cromic i aspirm soluia dezinfectant pn aproape de dopul de
vat al pipetei
se poate folosi pentru depunerea inoculului n vederea realizrii antibiogramei difuzimetrice, pentru
verificarea sensibilitii la bacteriofag (lizotipie) etc
dup ncrcarea pipetei cu cultura pur, inoculul se descarc pe suprafaa mediului solid din placa Petri,
apoi se nclin n mod repetat placa pentru nsmnarea uniform a suprafeei mediului
poate fi folosit pentru diluare unor suspensii antigenice, seruri, fagi etc
n acest scop folosim un ir de eprubete; n toate eprubetele repartizm cu aceeai pipet o cantitate
constant soluie salin fiziologic (0,9 ml n fiecare eprubet)
pipetele gradate sterile i mpachetate n hrtie se desfac n momentul utilizrii n modul urmtor: rupem
hrtia chiar la mijlocul pipetei, printr-o micare de rsucire n sens opus a celor dou mini; tragem partea de
hrtie care se termin cu un capt rsucit liber (corespunde poriunii superioare a pipetei), de care vom ine
pipeta n timpul lucrului; scoatem a doua jumtate a hrtiei fr a atinge partea efilat a pipetei i astfel pipeta
rmne steril pentru lucru
cu o alt pipet prelevm 0,1 ml din cantitatea de suspensie microbian i introducem inoculul n prima
eprubet; aspirm i eliminm lichidul din pipet de cteva ori pentru omogenizarea suspensiei; apoi punem
pipeta se pune n amestec sulfocromic
lum o nou pipet cu care aspirm 0,1 ml lichid din tubul 1 i introducem acest lichid n tubul 2, aa
cum am menionat mai sus; schimbm pipeta i repetm manevra pn la ultimul tub; din ultimul tub scoatem
0,1 ml pe care i eliminm n amestecul dezinfectant
Cteva tehnici de izolare speciale
1.
Metode fizice
nclzirea n baie de ap, timp de 10 minute la 80C a p.p. recoltat n mod corespunztor i suspensionat
n bulion VF (mediu anaerob) din care se dorete izolarea unor germenii sporulai anaerobi
2.
Metode chimice
adugarea la 1 ml de p.p. recoltat n mod corespunztor (i suspensionat n bulion VF) a 1 ml de alcool
etilic de 95 urmat de agitarea tubului timp de o or la temperatura camerei; produsul rezultat se nsmneaz
pe medii anaerobe, pentru izolarea unor germeni sporulai
3.
Metode biologice
se poate izola o cultur pur de pneumococ din snge, cord, splin, ficat etc.
Aplicarea acestor tehnici va fi discutat n capitolelor urmtoare, iar unele dintre tehnici vor putea fi executate
sau prezentate demonstrativ n cadrul lucrrilor practice.
bacterii pretenioase (care necesit medii complexe, mbogite sau / i adugarea n medii a unor factori
de cretere ex. Haemophilus influenzae)
bacterii strict aerobe (Bordetella pertussis), aerobe facultativ anaerobe (E. coli, S. aureus, S. pyogenes
etc), carboxifile (S. pneumoniae etc), microaerofile (Campylobacter spp., etc), strict anaerobe (Clostridium
spp.)
temperatura optim de cultivare (20-30C pentru Listeria monocytogenes, 42C pentru Campylobacter
jejuni, 35-37C pentru majoritatea bacteriilor, 28-30 pentru unele levuri etc)
Examinarea culturilor / coloniilor izolate este un proces foarte important, necesit cunoaterea teoriei, mult
exerciiu, atenie i experien. Pentru a obine cele mai bune rezultate este necesar o bun iluminare
(preferabil lumina natural) iar iluminarea mediului care urmeaz a fi citit se va face cel puin i n inciden
oblic. Examinarea se poate face cu ochiul liber (cel puin iniial) dar ar trebui completat cu examinarea fcut
cu ajutorul unei lupe sau a unui stereomicroscop pentru a putea nregistra toate aspectele importante i pentru a
putea sesiza apariia coloniilor de dimensiuni mici sau foarte mici.
mediul este clar, cu depozit grunjos pe perei i la baza tubului (ex. S. pyogenes)
dezvoltarea culturii se realizeaz ca un inel aderent de pereii tubului, la suprafaa mediului (ex. E. coli)
mediul este clar cu dezvoltarea unei membrane uscate, la suprafa (ex. Bacillus subtilis)
mediul este clar cu apariia unui depozit floconos aderent la baza tubului (B. anthracis)
mediul este clar, iar la suprafa se dezvolt o membran groas, plisat (M. tuberculosis).
dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm aa cum se formeaz n cazul Staphylococcus spp., K.
pneumoniae etc sau n cazul levurilor; medii, de circa 1-2 mm pentru multe dintre bacteriile studiate; mici, sub
1 mm, spre exemplu n cazul Streptococcus viridans, etc i foarte mici, care se pot examina cu ajutorul
stereomicroscopului, aa cum se ntmpl n cazul Mycoplasma spp. sau Ureaplasma spp.)
marginile (regulate, neregulate, ntregi, circulare, erodate, zimate, ondulate, lobate, filamentoase,
acoperite cu miceliu pufos, invadnd mediul n valuri etc)
suprafaa (neted, umed, lucioas, mat, uscat, granular, rugoas, papilat, zbrcit, mucoid,
pufoas etc)
culoarea (pigmentate, pigmentarea este la nivelul coloniei sau al mediului, nepigmentate; acest caracter
depinde de pigmenii produi sau / i de indicatori de culoare din mediu)
Colonia R (rough) este plat, mat, uscat, suprafaa ei prezint rugoziti, marginile sunt crenelate (zimate).
Structura antigenic nu este caracteristic. Nu pstreaz capsula. Virulena nu este conservat (excepii B.
anthracis, M. tuberculosis, C. diphteriae).
Colonia M (mucoid) este mare, strlucitoare, umed, mucoas. Este dat de exemplu de bacteriile care prezint
capsul (exemplu Klebsiella pneumoniae).
Aspecte particulare
fenomenul de invazie, reprezint un caracter de identificare preliminar pentru Proteus spp., o bacterie
foarte mobil; dac nsmnm o tulpin care aparine acestui gen la periferia unei plci Petri cu mediu simplu
(agarizat 2%), de la locul nsmnrii cultura se dezvolt n valuri concentrice (se ntinde din aproape n
aproape) pe toat suprafaa mediului; pe anumite medii selective, invazia este inhibat i se pot obine colonii
izolate (adugm la mediul de cultur acizi sau sruri biliare, tiosulfat de sodiu etc)
fenomenul liniei de demarcaie, reprezint un caracter util n studii epidemiologice, n cazul n care
tulpinile implicate aparin genului Proteus; dac pe o plac cu mediu solid cultivm 2 tulpini diferite, n 2
puncte opuse, tulpinile se vor dezvolta invadnd pn la un punct n apropierea liniei de ntlnire, unde se va
crea o linie de demarcaie ntre cele 2 tulpini (distan de 1-2 milimetri); dac tulpinile nu sunt diferite va
avea loc creterea n valuri fr demarcaie cu dezvoltarea unei pnze continue de cultur
fenomenul de crare, reprezint o variant de izolare n cultur pur a unei tulpini de Proteus;
cultivarea unui produs patologic n lichidul de condens al unui tub cu geloz nclinat incubat n poziie
vertical va conduce (n cazul n care n p. p. exist o tulpin de Proteus spp.) la obinerea n 24 ore a unei
culturi pure de Proteus, care se va dezvolta n valuri suprapuse pn la partea superioar a mediului de
cultur
apariia coloniilor n cap de meduz / coam de leu, aspect care poate fi caracteristic n cazul izolrii
unei tulpini de Bacillus anthracis; coloniile sunt mari, alb-cenuii, de tip R, iar la periferia coloniei, cu
ajutorul unei lupe, se pot observa prelungiri ondulate care au dus la denumirile menionate mai sus
apariia coloniilor pufoase, spre exemplu pe mediul Sabouraud, la 28-30 C, dup circa 7 zile, coloniile
de Coccidioides immitis dezvolt un miceliu aerian, devin pufoase, cresc i acoper n cteva zile suprafaa
mediului; iniial albe, devin n timp galben-maronii; colonii pufoase pot aprea i n cursul dezvoltrii n
anaerobioz a unei tulpini de Clostridium tetani etc.
Caractere metabolice
Exist numeroase teste care permit investigarea acestor caractere ale microorganismelor. n continuare vom
prezenta doar cteva dintre aceste teste (vezi i capitolul 12 precum i diferite capitole din partea special). n
capitolul 11 vom mai discuta i despre cteva dintre testele care evideniaz caractere de patogenitate ale
bacteriilor sau fungilor. Este de remarcat faptul c unele dintre testele care vor fi discutate ar putea fi incluse
att n grupul caracterelor metabolice ct i n grupul caracterelor de patogenitate (ex. hemoliza n cazul
anumitor microorganisme, producerea unor enzime cu caracter de toxine etc).
1. Pigmentogeneza
Pigmentogeneza este caracteristic bacteriilor cromogene i este dependent de condiiile de cultivare. Poate
reprezenta un element util pentru identificare (de exemplu pentru Pseudomonas aeruginosa sau pentru
Staphylococcus spp.).
Dup localizarea pigmentului, bacteriile pot fi cromofore (pigmentul este legat n citoplasm); paracromofore
(pigmentul este prezent n perete sau n stratul mucos, de exemplu pigmentul auriu la S. aureus, pigmentul
galben-citrin la S. saprophyticus); cromopare (pigmentul albastru, sau galben-verzui, sau de alt culoare este
difuzibil n mediu, de exemplu la Pseudomonas aeruginosa).
Fungii pot produce o serie de pigmeni, spre exemplu coloniile de Candida albicans au culoare alb.
Mucegaiurile produc o varietate mult mai mare de pigmeni (ex. Aspergillus deflectus colonii cenuii cu
periferia roz sau cu pete galbene, Aspergillus flavus colonii galben verzui pn la verde nchis iar privite pe
partea cealalt a plcii sunt roii-brune, Aspergillus fumigatus colonii iniial albe care devin albastre-verzui
sau albastre iar privite pe cealalalt parte a plcii sunt colorate brun sau n alte culori, Aspergillus niger
colonii iniial albe care devin brun negre pstrnd o culoare alb pe circumferin iar privite pe cealalalt parte a
plcii sunt colorate n galben etc).
2. Producerea unor hemolizine
Unele microorganisme produc enzime (hemolizine) care lizeaz hematiile din mediile de cultur cu snge.
Hemoliza are diferite aspecte n funcie de mecanismul de aciune i specia de origine a hematiilor (cal, berbec,
iepure etc). Cteva exemple de hemolizine:
1. a-hemolizina produce o liz incomplet a hematiilor, zona avnd o culoare verzuie (ex. Streptococcus
viridans, Streptococcus pneumoniae)
2. a-hemolizina produce liza hematiilor n 2 zone, n apropierea coloniei exist un halou de hemoliz
incomplet nconjurat de o zon de hemoliz complet (ex. unele tulpini de Streptococcus spp.)
3. b-hemolizina produce liza complet a hematiilor, zona de hemoliz este clar (ex. Streptococcus pyogenes,
Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Haemophilus ducreyi)
4. b-hemolizina care produce o hemoliz de tip cald-rece (zone de hemoliz incomplet la 37C care, dup
meninerea culturii la +4C timp de cteva ore, devine complet; ex. anumite tulpini de Staphylococcus aureus)
5. g-hemolizina produs de Staphylococcus spp. lizeaz de iepure, om, oaie, dar nu produce zone de hemoliz
pe agar-snge; n cazul streptococilor, g-hemoliza indic absena hemolizei.
3. Producerea altor enzime
Caractere de patogenitate
Patogenitatea reprezint capacitatea unui germen de a declana n organismul gazd fenomene morbide,
patogene, modificri locale, generale i functio laesa. Patogenitatea este un atribut de specie i este
determinat genetic. Virulena reprezint gradul diferit de patogenitate exprimat n cadrul unei specii. Este un
atribut al tulpinii microbiene implicate.
Caracterele de patogenitate pot fi evideniate in vitro sau in vivo.
Teste efectuate in vitro
examinarea aspectului coloniilor (majoritatea speciilor bacteriene sunt patogene n forma S, cu excepia
bacililor antraxului, difteric i tuberculos); are aspect orientativ
endotoxine (testul Limulus; prezena endotoxinei produce gelificarea unui lizat de Limulus polyphemus)
exotoxine (testul ELEK / vezi capitolul 16, ELISA, efecte citopatice, testul producerii de lecitinaz, testul
plcilor semi-neutralizate etc).
Teste efectuate in vivo
n acest scop se utilizeaz animale de laborator sensibile fa de infecia experimental cu diferite
microorganisme sau fa de anumite toxine microbiene (ex. oareci albi, cobai, iepuri, pisici etc., n funcie de
specia microbian pentru care se efectueaz testul / specia de animal cea mai sensibil i calea de inoculare cea
mai potrivit). Animalele de laborator trebuie s fie sntoase, verificarea se face prin examinarea acestora
nainte de efectuarea testrii, pe parcursul a 10-14 zile. Dup inoculare, animalele sunt marcate i inute sub
observaie (ferite de orice contaminare); observaia este clinic urmrindu-se evoluia curbei febrile i apariia
semnelor de boal. Pentru orice test se recomand utilizarea unui lot de animale pentru acelai tip de inoculare,
ceea ce crete suplimentar costul acestui tip de testare. n continuare vom prezenta cteva exemple:
identificarea Bacillus anthracis: pregtim o suspensie a tulpinii care urmeaz a fi testat n soluie salin
fiziologic i injectm subcutanat, cte 0,2 ml pentru fiecare animal, la un lot de oareci albi; urmrim evoluia
timp de 2-3 zile i efectum frotiuri din sngele recoltat prin puncionarea cordului sau amprente de splin
testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae: obinem o cultur de 24 ore a tulpinii de
identificat; inoculm subcutanat, n regiunea abdominal cte 2-5 ml de cultur pentru fiecare animal, la 2 loturi
de cobai (un lot neprotejat, al doilea lot protejat cu cte 1000 UI de ser antidifteric pentru fiecare animal); n
cazul n care tulpina este toxigen, animalele neprotejate vor muri n 1-4 zile, cu semne de intoxicaie difteric
(congestia capsulelor suprarenale, lichid seros, serofibrinos sau fibrinos n pleur, pericard, peritoneu i edem
gelatinos la locul de inoculare) n timp ce animalele protejate nu prezint nici o reacie
supernatant ca atare
supernatant inactivat
spre exemplu, n cazul n care animalele din loturile 1 i 4 mor, iar animalele din loturile 2 i 3
supravieuiesc, n p.p. exist toxin botulinic de tip A
cercetarea patogenitii unei tulpini de stafilococ se face la iepure, care este animalul de laborator cel mai
sensibil la infecia experimental cu Staphylococcus aureus
testarea patogenitii unor levuri (ex. Candida albicans): pornind de la o cultur de 24 de ore n mediul
Sabouraud lichid separm sedimentul i realizm o suspensie 0,2% a acestuia n soluie salin fiziologic
steril; inoculm n venele cozii la un lot de oareci (cte 0,2-0,8 ml pentru fiecare animal) suspensia obinut i
urmrim evoluia animalelor timp de 4-10 zile; dac este vorba de o tulpin de C. albicans patogen, animalele
vor muri dup circa 1 sptmn (anatomopatologic vom putea evidenia abcese miliare renale, splenice,
hepatice) etc.
12. Teste de identificare avnd la baz diferite caractere biochimice ale bacteriilor i
fungilor
Exist numeroase teste utile n identificarea bacteriilor i fungilor, avnd la baz diferite proprieti biochimice
ale acestora; cteva dintre teste vor fi prezentate n continuare.
Aceste teste de identificare au o importan diferit la diferitele genuri i specii bacteriene i respectiv fungice
i fac parte din etapa a patra a diagnosticului de laborator bacteriologic sau micologic. Schema de prezentare
este ns asemntoare.
Materiale necesare:
soluie de vitamine
soluii 5% ale carbohidrailor (ex. glucoz, maltoz, zaharoz, lactoz, galactoz, trehaloz etc) n ap
distilat, sterilizate prin filtrare
dac dorim s testm pentru 9 carbohidrai diferii avem nevoie de 2 plci Petri.
Incubm la 28-30C pentru 24-48 ore, apoi urmrim apariia culturii n jurul rondelelor.
Exist i alte modaliti tehnice n realizarea auxanogramei.
Interpretare:
trebuie s existe multiplicare levuric (cultur prezent) n jurul rondelei pe care am depus o ans din
soluia 5% de glucoz; toate levurile pot folosi glucoza drept unic surs de C
se noteaz dezvoltarea culturii n jurul rondelelor unde aceasta este evideniat i utiliznd rezultatele
obinute, n contextul celorlalte date de laborator, se stabilete specia levuric
Control de calitate:
soluie de dezoxicolat de sodiu 10%
ap distilat
Tehnica de lucru:
Se prepar n soluie salin fiziologic o suspensie pornind de la coloniile ahemolitice izolate. Turbiditatea
suspensiei trebuie s fie asemntoare cu turbiditatea etalonului McFarland 0,5 sau 1.
Repartizm cte 0,5 ml din suspensie n 2 eprubete de sticl.
n primul tub adugm 0,5 ml dezoxicolat de sodiu iar n al doilea tub adugm 0,5 ml ap distilat. Incubm
timp de 2 ore la 35-37C.
Interpretare:
Testul este pozitiv (bacteriile au fost lizate n prezena dezoxicolatului de sodiu i sunt pneumococi) dac
suspensia s-a clarificat n tubul n care am adugat dezoxicolat i nu s-a clarificat n tubul n care am adugat
ap distilat
colonii de streptococi hemolitici sau nehemolitici (dac un anumit context sau anumite teste sugereaz
prezena unui streptococ de grup B)
tulpina de S. aureus productoare de b-lizin (ATCC 25923) / alternativ am putea utiliza fii din hrtie
de filtru impregnate cu b-lizin stafilococic
tulpini de cercetat
Tehnica de lucru:
Inoculm n striu o tulpin de S. aureus productoare de b-lizin, pe unul din diametrele plcii cu agar-snge.
Perpendicular pe acest striu vom inocula (fr s atingem striul de stafilococ) o tulpin CAMP pozitiv, o
tulpin CAMP negativ i tulpini de cercetat.
Incubm la 35-37C aerob pn a doua zi sau timp de 6 ore n atmosfer de 5-10% CO2.
Interpretare:
apariia unei zone de hemoliz lrgite, n vrf de sgeat (vrful spre tulpina de stafilococ) reprezint
un test pozitiv (confirmat de martorul pozitiv)
peste 20 mm +++
10-20 mm ++
5-10 mm +
Martor mai slab pozitiv (test semicantitativ) M. tuberculosis / n cazul testului pentru
termosensibilitatea catalazei rezultatul va fi negativ dup nclzire 20 minute la 68C
Martor negativ mediu neinoculat peste care se adaug soluie de peroxid de hidrogen
colonii izolate dezvoltate pe medii fr snge / n cazul n care urmeaz s testm o bacterie care s-a
dezvoltat pe geloz-snge, deoarece pot aprea reacii fals pozitive datorit catalazei eritrocitare, urmeaz s
prelevm cultura bacterian fr a atinge mediul de cultur; n acest sens urmeaz s utilizm o ans fir i s
prelevm cultur din poriunea cea mai bombat a coloniei de identificat
ap distilat
Tehnica de lucru:
B1.
Realizm o suspensie bacterian dens n 1-2 ml de ap distilat la care adugm 1-2 picturi de soluie de
peroxid de hidrogen 3%.
Observm imediat i dup trecerea a 5 minute apariia bulelor de oxigen.
B2.
Pe o lam de sticl punem o pictur din soluie de peroxid de hidrogen. Suspensionm cultura n pictura de
H2O2 i urmrim timp de 30 de secunde apariia bulelor de oxigen.
Interpretare:
o suspensie relativ dens obinut din colonia (cultur pur) bacteriei pe care dorim s o identificm
mediul care conine acid citric 0,2% (Simmons), turnat n pant n eprubete mici; n prezena
indicatorului de pH i la pH neutru, mediul nensmnat are o culoare verde
Tehnica de lucru:
cu ajutorul unei anse, prelevm suspensie bacterian pe care o nsmnm ntr-un singur striu pe
suprafaa mediului Simmons
apariia unei culturi bacteriene de-a lungul striului, nsoit de modificare culorii care devine albastr,
semnific un test pozitiv = bacteria utilizeaz citratul ca unic surs de carbon
n prezena unui tub fr dezvoltarea culturii, culoarea mediului fiind verde putem notifica un rezultat
negativ
Control de calitate:
colonii izolate pe mediu neselectiv ale tulpinii care urmeaz s fie testat
plasm de iepure (de preferat) / n cazul n care plasma de iepure nu este disponibil se poate folosi
plasm uman (cu sensibilitate mai mare la coagulaza produs de S. schleiferi i S. lugdunensis)
lame, tuburi
Tehnica de lucru:
a. Testul coagulazei pe lam
Verific prezena coagulazei legate. Pe lam se depune o pictur de ap distilat (nu soluie salin fiziologic).
Suspensionm i omogenizm 1-2 colonii n pictura de ap distilat (suspensia trebuie s fie tulbure omogen).
Ateptm circa 10 secunde i urmrim apariia unei eventuale autoaglutinri (caz n care nu putem interpreta
rezultatul testului; trecem la efectuarea testului coagulrii n tub). Dac pictura rmne tulbure omogen,
adugm 1 pictur de plasm i urmrim apariia coagulilor timp de 10-15 secunde.
Alternativ se pot utiliza truse comerciale.
Interpretare:
absena coagulilor semnific un test negativ / 5% din S. aureus dau reacii fals negative la testul pe
lam, fiind necesar realizarea testului coagulazei n tub
b. Testul coagulazei n tuburi
Verific prezena coagulazei libere. Pipetm aseptic 0,5 ml de plasm ntr-un tub steril. Prelevm o colonie i o
descrcm n plasma din tub (alternativ putem nsmna o colonie de testat n 0,5 ml bulion glucozat, incubm
18-24 ore la 35-37C i vom amesteca plasma cu suspensia microbian rezultat dup cultivare).
Incubm tubul timp de 4 ore la 35-37C (pentru unele tulpini reacia poate fi pozitiv chiar i mai repede de 4
ore). Rezultatul reaciei este examinat prin nclinarea tubului. Dac reacia este negativ la 4 ore, reincubm
pn la 24 ore.
Atenie, cheagul poate fi lizat destul de rapid dup momentul formrii (unele tulpini de S. aureus produc
fibrinolizin). Din acest motiv, unii autori recomand examinare tubului test din 30 n 30 minute, n primele 4
ore.
Interpretare:
ser uman, ser bovin, ser de berbec, ser fetal de viel, serumalbumin bovin etc
aplicatoare de lemn sau sterile pipete Pasteur cu vrful efilat, lame i lamele, tuburi mici
Tehnica de lucru:
ntr-un tub de dimensiuni mici (ex. 12 / 75 mm) introducem aseptic 0,5-1 ml de ser uman sau alt tip de ser. Cu
un aplicator steril (ca un beiga) atingem colonia care trebuie identificat i apoi l introducem n tub. Incubm
timp de 2-4 ore, la 35-37C.
Realizm un preparat ntre lam i lamel i examinm la microscopul optic.
Interpretare:
prezena unor tubi germinativi cu un calibru mai ngust dar cu o lungime de 3-4 ori mai mare dect
diametrul celulei de origine, care continu direct, fr nici o strangulare sau sept blastoconidia, semnific un
test pozitiv
absena aspectului menionat mai sus sau prezena unor pseudotubi germinativi care sunt delimitai printro strangulare i un sept de blastoconidie semnific un test negativ
Control de calitate:
hrtiue indicator cu reactiv Ehrlich (se poate folosi i reactiv Kovacs) sau reactiv Ehrlich / Kovacs
condiionat n sticlue de culoare brun
apariia unui inel de culoare roie la suprafaa mediului nu reprezint un test pozitiv
alternativ, n lipsa hrtiuelor indicator se poate picura reactiv Ehrlich la suprafaa mediului i interpreta
modificarea / lipsa modificrii culorii
Control de calitate:
hrtiue indicator cu reactiv Ehrlich (se poate folosi i reactiv Kovacs) sau reactiv Ehrlich / Kovacs
condiionat n sticlue de culoare brun
apariia unui inel de culoare verde la suprafaa mediului i la nivelul traiectului de nsmnare dup
adugarea unei picturi de clorur feric 10% traduce prezena enzimei
Control de calitate:
coloana prin nepare, apoi retragem ansa i atingnd suprafaa coloanei descriem un striu n zig-zag.
Incubm la 35-37C timp de 24 ore.
Interpretare:
culoarea coloanei rmne roie glucoza nu este fermentat (nu este enterobacterie)
n cazul n care se produce H2S, remarcm apariia unei culori negre la nivelul coloanei
Martor pentru pH acid la nivelul coloanei, pH neutru la nivelul pantei i producere de H2S Salmonella
typhimurium
soluie de bromur de cianogen 10% (ar fi de preferat datorit riscurilor fii de hrtie indicator
impregnate n soluie de bromur de cianogen, produse comercial)
hrtie de filtru
Tehnica de lucru:
Exist mai multe variante tehnice, dar vom discuta doar una dintre acestea. Punem ntr-o cutie Petri un
fragment de hrtie de filtru pe care depunem 1-2 picturi de soluie apoas de tetra-metil p-fenilendiamin 1%.
Dup sterilizarea i rcirea ansei, prelevm dintr-o colonie izolat i descrcm cultura pe hrtia de filtru prin
micri circulare de mic amplitudine.
Urmrim apariia unei reacii de culoare n interval de 10 secunde
Interpretare:
apariia zonei colorate mai tardiv nu permite interpretarea testului, n principiu este vorba despre un
rezultat negativ
Control de calitate:
plci cu agar-snge
tampoane sterile
apariia unei zone de inhibiie cu diametrul mai mare de 14 mm, semnific un test pozitiv
interpretarea este diferit dac se folosesc discuri de optochin cu alte dimensiuni (ex. cu diametrul de 10
mm)
Control de calitate:
lame i lamele
microscop optic
Tehnica de lucru:
A. examinarea preparatului martor
realizm o suspensie omogen opalescent din cultura bacterian n 0,5 ml soluie salin fiziologic i
adaugm 0,5 ml soluie de albastru de metilen
depunem pe o alt lam de microscop o pictur din suspensia bacterian i n stricta vecintate a acesteia
depunem o pictur din serul polivalent anti-capsular
identificarea unor coci colorai n albastru, dispui izolat sau n pereche, nconjurai de un halou clar, mai
bine definit i de dimensiuni mai mari dect haloul vizualizat prin examinarea preparatului martor semnific un
test pozitiv, respectiv prezena pneumococilor
n cazul n care nu este sesizat nici o diferen ntre preparatul test i preparatul martor ne aflm n
situaia unui test negativ
dup identificarea unui test pozitiv fa de serul polivalent, putem utiliza seruri monovalente, specifice de
tip pentru a indentifica tipul capsular
legturi hidrofobe.
Complementaritatea structural sau forele intermoleculare nu sunt, suficiente fiecare n parte, pentru a forma
legturi stabile; este necesar ndeplinirea ambelor condiii. Cu ct energia de legare a reactanilor este mai
mare, cu att complexele Ag-Ac sunt mai stabile.
Interaciunea dintre epitop i paratop este definit de 2 parametri (afinitatea i aviditatea anticorpilor).
Afinitatea msoar fora de legare dintre epitop i paratop. Afinitatea este rezultanta forelor de atracie i
de respingere care mediaz interaciunea celor doi reactani. O interaciune cu afinitate nalt presupune
structuri complementare perfecte, n timp ce complementaritatea imperfect a gruprilor reactante determin o
afinitate sczut, deoarece forele de atracie sunt active numai pe distane foarte mici i sunt diminuate de
forele de respingere. Afinitatea anticorpilor se poate msura prin dializa la echilibru.
Aviditatea este un parametru al interaciunii Ag-Ac care rezult din multivalena Ag. Cele mai multe Ag.
posed mai mult dect un epitop. De exemplu, bacteriile, polizaharidele etc, au pe suprafa un numr mare de
epitopi repetitivi. Ag. proteice au epitopi multipli, dar diferii. Antigenele multivalente leag un numr
echivalent de molecule de anticorpi. Energia total de legare a epitopilor multipli ai unui Ag, cu paratopii
specifici este mult superioar n comparaie cu energia separat a fiecrei interaciuni dintre epitop i paratop.
Aviditatea caracterizeaz energia medie de legare a unui Ag multivalent cu Ac specifici i msoar fora
rezultant a afinitii dintre epitopii multipli ai unui Ag i paratopii complementari. Complexele Ag-Ac formate
de antigenele multivalente sunt stabile, disocierea lor fiind dificil, deoarece este necesar ruperea tuturor
legturilor existente.
Reacii ncruciate
n anumite cazuri pot avea loc reacii ncruciate; un Ag reacioneaz cu un Ac care a fost sintetizat fa de un
alt Ag (aceste reacii pot aprea de ex. datorit faptului c anumite Ag posed anumite grupri determinante
comune). Spre exemplu, serul imun anti-polizaharid capsular de Streptococcus pneumoniae aglutineaz
eritrocitele umane de grup A (cu specificitate antigenic conferit de N-acetil-galactozamin), iar serul imun
anti-Escherichia coli aglutineaz eritrocitele umane de grup B (cu specificitate antigenic conferit de
galactoz). Nu vom detalia aceste aspecte n materialul de fa.
Interaciunile secundare apar la circa 30 de minute dup interaciunile primare. Datorit faptului c Ag
poate avea mai muli epitopi iar Ac are minim 2 paratopi complexele primare mici, solubile, interacioneaz
ntre ele formnd complexe secundare, produsul final fiind un complex Ag-Ac ca o reea tridimensional,
insolubil, mult mai stabil dect complexele primare. Din punct de vedere diagnostic, reaciile Ag-Ac n care
reactanii se afl n interaciune secundar pot fi puse n eviden prin tehnici care vor fi enumerate n finalul
acestui capitol i discutate n capitolele urmtoare. In vivo, manifestrile interaciunilor secundare sunt
dependente de natura reactanilor i de condiiile de reacie.
Interaciunile teriare definesc manifestrile in vivo ale reaciilor Ag-Ac i depind n special de anumite
variabile care sunt caracteristice gazdei. Interaciunile teriare pot conduce la un rezultat pozitiv (protecia
gazdei) sau negativ (degradare tisular).
reacii de precipitare
pot avea loc n gel (imunodifuzia radial simpl Mancini, dubla difuzie Ouchterlony etc) sau
pot avea loc n mediu lichid (reacia Ramon, precipitarea n inel Ascoli etc)
reacii de aglutinare
VDRL (Veneral Disease Research Laboratory), USR (Unheated Serum Reagin), RPR (Rapid Plasma
Reagin) etc, n diagnosticul serologic al sifilisului
Difuzia dubl
metoda Elek
Imunoelectroforeza
Contraimunoelectroforeza
Electroimunodifuzia.
toxinei difterice (Ramon) se pun n contact, n amestec n tuburi, cantiti egale din componenta care trebuie
titrat (toxina difteric, Ag) cu cantiti variabile de Ac la care titrul este cunoscut. Cantitatea maxim de
precipitat se gsete n tubul unde exist raportul de echivalen. Pentru sistemul toxin difteric anticorpi
anti-toxin difteric (ca i n cazul sistemului toxin tetanic anticorpi anti-toxin tetanic), raportul de
echivalen se suprapune peste proporia optim, astfel nct se poate observa relativ uor tubul n care apare
cantitatea cea mai important de precipitat. Cunoscnd titrul anticorpilor, se afl imediat titrul toxinei (1 Lf = 1
limes floculans = cantitatea de toxin care se combin cu o unitate de antitoxin = 1 UA = 1 unitate antitoxic).
Dac spre exemplu precipitarea maxim apare n tubul n care titrul anticorpilor este de 10 UA, titrul toxinei
este de 10 Lf.
n mod asemntor, prin metoda Dean i Web se poate determina titrul anticorpilor anti-toxici, cunoscnd
titrul toxinei.
Reacii de precipitare n inel
Reacia de precipitare n inel, const n punerea n contact a Ag i Ac astfel nct s nu se amestece; reacia care
apare la interfaa dintre Ag i Ac se concretizeaz printr-un inel de precipitare albicios. Se utilizeaz pentru
identificarea originii petelor de snge (reacia Uhlenhut, n medicina legal) i pentru identificarea provenienei
unor preparate pe baz de carne (n industria alimentar).
Demonstrativ, n cursul lucrrilor practice, reacia de precipitare n inel (reacia Ascoli) se poate utiliza pentru
identificarea prezenei antigenului crbunos (Ag obinut de la Bacillus anthracis). Istoric, soluia de antigen se
prepara pornind de la organe (de ex. splin) recoltate de la un animal care a decedat i pentru care se suspecta
c decesul a fost produs de o infecie generalizat cu Bacillus anthracis. Fragmentul de organ se mojara n
soluie de clorur de sodiu steril, adugndu-se ulterior cteva picturi de acid acetic, apoi se meninea la
temperatura de fierbere timp de 5-10 minute. Dup decantarea i alcalinizarea cu NaOH, urma filtrarea i
rezulta soluia antigenic. Din punct de vedere tehnic vom utiliza 3 tuburi, 1 pentru reacie i 2 tuburi martor. n
primul tub martor vom pipeta 0,5 ml ser anticrbunos i 0,5 ml soluie salin fiziologic iar n al doilea tub
martor vom pipeta 0,5 ml ser normal de cal i 0,5 ml soluie de antigen. n ceea ce privete tubul de reacie
trebuie s pipetm nti 0,5 ml din serul anticrbunos, urmnd ca soluia de antigen (n cantitate de 0,5 ml) s
fie pipetat foarte lent, eventual prin scurgere pictur cu pictur pe peretele interior al tubului, n aa fel
nct cele 2 soluii s nu se amestece. n cazul reaciei pozitive (prezena Ag crbunos n soluia antigenic),
dup circa 5 minute, la interfaa dintre cei 2 reactivi apare un inel de precipitare.
afl serul de referin iar rezultatul obinut trebuie s corespund ateptrilor (de ex. 6 mm pentru IgG care a
fost diluat i astfel are concentraia de 25 UI / ml). n cazul c rezultatul este cel ateptat, se poate face direct
citirea diametrelor cercurilor de precipitare pentru serurile de cercetat; n caz contrar este necesar o corecie
(dac spre exemplu diametrul este 6,5 mm n loc de 6 mm, din valoarea obinut pentru serurile de cercetat se
scad 0,5 mm). Dup citirea diametrelor, se compar rezultatele cu cele puse la dispoziie n tabele iar cifra
obinut se nmulete cu diluia probei (spre ex. dac obinem o valoare de 50 UI / ml pentru IgG, vom nmuli
cu 4 pentru a obine rezultatul real).
Imunodifuzia dubl radial (Ouchterlony)
Imunodifuzia dubl se bazeaz pe difuzia Ag i Ac (unul spre cellalt) ntr-un gel. Deoarece mrimea
moleculelor de Ag i Ac este mai mic dect diametrul porilor gelului iar distana parcurs de reactant ntr-un
anumit timp este direct proporional cu gradientul concentraiei sale i invers proporional cu greutatea sa
molecular, migrarea reactanilor unul spre cellalt determin formarea unor linii de precipitare la locul de
ntlnire Ag-Ac. n gelul transparent vor aprea linii opace, numrul lor corespunznd numrului sistemelor
Ag-Ac studiate.
Metoda certific prezena sau absena proteinei cercetate. Se pot evidenia alfa-fetoproteina, proteina C reactiv,
beta-2 microglobulina, proteine Bence-Jones tip kappa i lambda, produi de degragare ai fibrinogenului etc. n
micologie, prin imunodifuzie se poate identifica prezena exoantigenelor fungice (Histoplasma capsulatum,
Blastomyces dermatidis, Coccidioides immitis etc) sau prezena Ac fa de Ag fungice, spre exemplu n
diagnosticul serologic al unei aspergiloze invazive. Aceast metod este nc frecvent utilizat pentru
determinarea specificitii anticorpilor antinucleari sau a altor anticorpi n patologia uman.
Sunt necesare lame de microscop pe care se toarn un gel de agar 1%, lama putnd fi folosit pe parcursul unei
zile (dac acest lucru nu se poate ndeplini, lama trebuie pstrat n camer umed, la temperatura frigiderului,
pentru maxim o sptmn). n gelul de pe lam se perforeaz 3 grupe de godeuri, cte 7 godeuri n fiecare grup
(1 godeu central i 6 godeuri periferice, fiecare cu diametrul de 3 mm). Dac spre exemplu dorim s
determinm prezena proteinei C reactiv (CRP) n seruri de cercetat, avem nevoie de un ser cu Ac anti-CRP,
seruri de cercetat i un ser de referin care conine CRP. Numerotnd godeurile periferice, pipetm Ac antiCRP n godeul central i ser de referin cu CRP n godeurile 1 i 4. n celelalte godeuri pipetm serurile de
cercetat. Incubm la 37 C, timp de 24 de ore, n camer umed (ntr-o cutie Petri putem pune o bucat de vat
mbibat n soluie salin fiziologic, alturi de lama respectiv). Liniile de precipitare pot deveni vizibile dup
2-4 ore dar sunt mult mai clare dup 24 de ore.
Pentru citire poate fi necesar o lup i o surs de lumin. ntre godeul central i godeurile 1 i 4 (martori
pozitivi) vor aprea linii (arcuri) de precipitare. n cazul n care de ex. n godeul 2 exist CRP, va aprea un arc
de precipitare i ntre godeul central i godeul nr. 2. Este certificat prezena CRP n cazul n care cele 2 linii de
precipitare (dintre godeul central i godeurile 1 i 2) sunt una n continuarea celeilalte (imagine de genunchi
ndoit).
Dubla difuzie Elek
Aceast metod permite depistarea capacitii toxigene a unei tulpini de Corynebacterium diphteriae. n cazul
n care tulpina este toxigen, toxina va difuza n mediu iar dup unirea cu Ac anti-toxin, complexele Ag-Ac
vor da natere unor linii de precipitare.
ntr-o cutie Petri turnm mediul Elek i dup ce mediul s-a ntrit, decupm un an pe unul din diametre. n
anul respectiv pipetm 0,5 ml ser antidifteric, ser care conine Ac anti-toxin difteric n concentraie de 1.000
UI / ml. Ac anti-toxin difteric vor difuza n mediu. Dup circa 2 ore nsmnm perpendicular pe anul cu
Ac anti-toxin, de fiecare parte a anului, o tulpin de Corynebacterium diphteriae toxigen (martor pozitiv), o
tulpin de Corynebacterium diphteriae ne-toxigen (martor negativ) i tulpini de cercetat, cte un striu (de
fiecare parte a anului) pentru fiecare tulpin. Incubm la 37 C pentru 48 ore, dar urmrim zilnic apariia
culturii i precipitatului (liniilor de precipitare). De-a lungul liniilor de nsmnare apare cultur bacterian.
Din cultura de Corynebacterium diphteriae toxigen, toxina (Ag) difuzeaz n mediu. Unirea dintre Ag i Ac
duce la formarea unor complexe Ag-Ac care precipit, iar n mediu vor aprea linii de precipitare n unghiurile
dintre cultur i anul cu Ac anti-toxin. n cazul n care apar linii de precipitare n unghiul dintre una dintre
tulpinile de cercetat i anul cu Ac anti-toxin, respectiva tulpin este toxigen. Reacia va fi negativ pentru
martorul negativ i pentru tulpinile de cercetat ne-toxigene.
Electroforeza proteic n gel este folosit n laboratorul de imunochimie pentru decelarea unor proteine
patologice. Deplasarea proteinelor ntr-un strat de gel care este supus aciunii unui cmp electric se va realiza
difereniat, pentru fiecare structur proteic n parte, n funcie de greutatea molecular i ncrctura electric a
proteinelor. Pentru vizualizare este necesar fixarea, uscarea i colorarea liniilor de precipitare care corespund
fraciunilor proteice din serul normal sau unor eventuale proteine patologice (ex. o component monoclonal).
Imunoelectroforeza
Se asociaz electroforeza n gel cu imunodifuzia dubl (realizndu-se separarea prin electroforez a proteinelor
n mediu gelozat, urmat de o imunodifuzie dubl utiliznd un antiser corespunztor). Reacia Ag-Ac se va
vizualiza prin apariia unor arcuri de precipitare. Este o metod foarte util n studierea puritii unui Ag (sau
Ac), ns n mod curent are indicaii didactice. Datorit faptului c n boala pneumococic prin urin se elimin
cantiti destul de importante de Ag K, prezena acestuia poate fi evideniat de ex. prin imunoelectroforez.
Contraimunoelectroforeza
Contraimunoelectroforeza reprezint o dubl difuzie n care deplasarea unul fa de cellalt a Ag i Ac este
accelerat de un cmp electric. Pe o lam de microscop se toarn un gel de agar 1% i se perforeaz 3 grupe de
perechi de godeuri, fa n fa. Metoda poate fi utilizat pentru acele structuri antigenice care n cmp electric
migreaz ctre anod. Lund n discuie spre exemplu doar una dintre cele 3 grupe de perechi de godeuri, n
godeurile care vor fi poziionate spre catod (polul negativ) pipetm Ag iar n godeurile care vor fi poziionate
spre anod (polul pozitiv) pipetm Ac cunoscui, specifici Ag pe care dorim s-l identificm. Reacia este mai
rapid i mai sensibil dect dubla difuzie deoarece migrarea celor doi reactani unul ctre cellalt este
amplificat de cmpul electric. Reacia (apariia unei linii de precipitare ntre godeuri, n cazul n care n godeul
catodic se gsete Ag presupus) poate fi citit dup numai 30-90 minute n loc de 24 de ore aa cum se ntmpl
n dubla difuzie Ouchterlony. Metoda a fost utilizat din punct de vedere istoric pentru identificarea prezenei
Ag HBs. Se poate utiliza pentru identificarea antigenelor capsulare n lichidul cefalorahidian la pacieni cu
meningit acut (Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae).
Electroimunodifuzia
Electroimunodifuzia are la baz electroforeza probelor care conin proteina-antigen, ntr-un strat de gel, care
conine o cantitate constant de anticorpi monospecifici (anti-protein antigen), rezultnd zone de precipitare n
form de rachet sau conuri, a cror arie este direct proporional cu concentraia antigenului. Metoda are o
sensibilitate mai mare dect IDRS.
Inhibarea aglutinrii
Reacia const n inhibarea aglutinrii particulelor ncrcate cu Ag, dup ce n prealabil Ac reacioneaz cu
Ag corespondent. Se utilizeaz de ex. pentru decelarea mioglobinei sau n diagnosticul imunologic al sarcinii.
Aglutinarea n coloan
Metoda permite o mai bun vizualizare a reaciei. Dispozitivul utilizat are 2 compartimente, partea n care se
introduc reactivii (situat superior) i o coloan situat inferior, plin cu microparticule de sticl. Dup
introducerea hematiilor i a serului de cercetat i incubarea acestora, dispozitivul este centrifugat. n cazul
unei reacii pozitive complexul Ag-Ac se va putea vizualiza la nivelul coloanei, n timp ce n cazul unei reacii
negative, hematiile se depun n poriunea inferioar a coloanei.
Aglutinarea mediat de Ac anti-imunoglobuline
Anticorpii anti-Ig se vor cupla cu particule ncrcate cu Ac i vor duce la apariia unor aglutinate (prin
apariia complexului imun). Se utilizeaz spre exemplu n decelarea factorului reumatoid (tehnica WaalerRose).
mpreun cu serurile cu Ac specifici). Lamele pe care se fac reaciile de aglutinare, dup terminarea reaciilor se
introduc n amestecul dezinfectant.
n cadrul lucrrilor practice vor fi discutate aglutinrile pentru identificarea E. coli, Salmonella spp. pn la
nivel de specie (conform clasificrii Kauffmann-White) i respectiv a grupurilor de Shigella spp. Tot prin
aglutinare direct se mai pot identifica tulpini de Vibrio cholerae, Haemophilus influenzae tip b, tulpini de
Brucella spp., tulpini de E. coli entero-patogen, iar n cazul leptospirelor i unor rickettsii apariia aglutinrii
trebuie verificat cu ajutorul microscopului.
Reacii de aglutinare indirect se pot utiliza pentru detectarea n p.p. a streptococilor de grup A sau B,
pneumococilor, meningococilor, E. coli tip capsular K1, H. influenzae tip capsular b, pentru detectarea unor
enterotoxine (stafilococice, clostridiene etc), pentru detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida
albicans, Aspergillus spp.) sau a unor virusuri. Tot prin tehnica de aglutinare indirect se pot identifica
exotoxine n filtratul de cultur, streptococii de grup A-D, E. coli O:157, Legionella pneumophila, Listeria
monocytogenes etc.
2. Aglutinarea n tuburi
Tehnica de aglutinare n tuburi se poate folosi pentru confirmarea unui rezultat pozitiv la aglutinarea pe lam
sau atunci cnd rezultatul unei aglutinri pe lam nu este suficient de clar. Vom avea la dispoziie cultura pur
de identificat care se va prepara difereniat n funcie de tipul de Ag pe care dorim s-l identificm. Spre
exemplu, dac ncercm s identificm Ag de tip O iar bacteria ar putea s prezinte i Ag H sau Ag K (care ar
putea inhiba aglutinarea cu Ag O) cultura se va menine 1-2 ore la 100C pentru inactivarea Ag de nveli, dup
care se va trece la realizarea aglutinrii n tuburi (o procedur asemntoare poate fi necesar i n cazul tehnicii
de aglutinare pe lam). Vom utiliza un ir de eprubete n care vom introduce Ac cunoscui, care se vor dilua
succesiv, binar, cu soluie salin fiziologic. n tuburile respective vom aduga o cantitate echivalent de
suspensie Ag (spre ex., la 0,5 ml Ac vom aduga 0,5 ml suspensie Ag). Incubarea se va face difereniat, n
funcie de tipul de Ag pe care dorim s-l identificm (ex. 20 ore la 52C pentru identificarea Ag O).
Reacia este pozitiv n cazul apariiei aglutinatelor (grunjoase - n cazul prezenei Ag O, floconoase n cazul
prezenei Ag H etc). Reacia de aglutinare n tuburi permite i verificare titrului la care are loc formarea
complexelor Ag-Ac.
Serul de cercetat, pentru fiecare rnd de tuburi, va fi diluat cu tampon fosfat salin, n diluii binare. Dac
amestecul de ser de cercetat i diluant va fi n cantitate de 0,5 ml, vom aduga o cantitate similar de Ag, cte
0,5 ml Ag O n primul rnd de tuburi i respectiv cte 0,5 ml Ag H n al doilea rnd de tuburi. Vom proceda n
aa fel nct s obinem n primul tub o diluie de 1/20, n al doilea tub 1/40 etc. Un tub va conine doar un
amestec de tampon fosfat salin i soluie Ag (tub martor). Dup ce omogenizm coninutul tuburilor, vom
incuba tuburile cu Ag O timp de 20 ore la 52C iar tuburile cu Ag H vor fi incubate timp de 2 ore la 52C urmat
de 10 minute la temperatura camerei.
Citirea se va realiza dup incubare, comparnd rezultatul din fiecare tub cu martorul pentru Ag. Pentru
evidenierea reaciei vom agita uor tuburile. Aglutinarea H difer de aglutinarea O. Aglutinatul O este mai
dens, mai grunjos, n timp ce aglutinatul H este mai floconos i uor de disociat prin agitare. Ultimul tub care
mai prezint aglutinare vizibil permite stabilirea titrului reaciei. n capitolul 31 vom relua acest tip de
diagnostic i vom discuta modalitile de interpretare.
serul de cercetat recoltat de la pacientul suspect sau o pereche de seruri, obinute n dinamic
seruri de referin (martor pozitiv i negativ)
ser hemolitic anti-hematii de berbec (obinut prin injectri repetate de hematii de oaie la iepurele de
laborator, splate cu soluie salin fiziologic) titrat i conservat la 4C
serul de cercetat se va menine 30 minute la 56C, n baia de ap, pentru inactivarea C propriu
n prima etap se pun n reacie C, serul de cercetat i Ag cunoscut; exist 2 posibiliti: a. n serul de
cercetat exist Ac specifici, rezultnd un complex Ag-Ac pe care se va fixa C b.n serul de cercetat nu exist
Ac specifici, nu se formeaz complex Ag-Ac, Crmne liber
n a doua etap se introduce n reacie sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac anti-hematie); exist 2
posibiliti: a. C nu este liber, nu are loc hemoliza, b. C se fixeaz pe sistemul hemolitic, lizeaz hematiile i
observm apariia hemolizei
titrarea C n prezena Ag
se dilueaz conform indicaiilor din protocolul de lucru reactivii utilizai (serul hemolitic, serurile de
cercetat, Ag, serurile de referin, C)
pe o plac separat se prepar martorii (martor pentru sistemul hemolitic, martor pentru C, martor
pentru Ag, 2 martori pentru serul de referin, martor sigur negativ)
exist anumite diferene ntre tehnicile cantitative i cele calitative, dar principiile sunt aceleai
Chlamydia spp., Rickettsia spp., Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella spp., diferite
virusuri etc.
n scopul creterii sensibilitii i specificitii se aleg proprietile Ag cunoscut, o anumit temperatur de
incubare (de ex. 4C n loc de 37C n RFC Kolmer) etc. Ac fixatori de C apar precoce n cursul bolii astfel
nct identificarea prezenei lor poate semnifica o infecie acut sau recent.
identificarea Clostridium perfringens prin metoda plcilor semineutralizate (vezi cap. 44)
testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae (test de seroprotecie, vezi cap. 11)
toxinotipia n cazul suspicionrii unei toxi-infecii alimentare cu Clostridium botulinum (vezi cap. 11 i
45)
diagnosticul serologic
testarea prin IDR (intra-dermo-reacie) a susceptibilitii fa de o anumit boal infecioas care are la
baz drept mecanism patogenic efectul unei exotoxine
tratamentul / profilaxia unor boli infecioase prin utilizarea de imunoglobuline specifice omologe sau utilizarea
unor seruri hiperimune heterologe.
Reacia ASLO
Aceast reacie poate fi utilizat n diagnosticul retrospectiv al unei infecii streptococice sau pentru
confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice (mpreun cu criteriile minore i majore de diagnostic).
Reacia ASLO determin titrul Ac anti streptolizin O (SLO).
Principiu:
Titrarea Ac anti-SLO se bazeaz pe faptul c SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de
berbec. n cazul n care n serul de cercetat exist Ac anti-SLO, aciunea hemolitic a SLO este neutralizat.
Combinnd diluii din serul de cercetat cu o cantitate constant de SLO vom putea determina titrul ASLO.
Materiale i reactivi necesari:
ser de cercetat (sau seruri pereche, recoltate la interval de 2 sptmni)
SLO liofilizat (standardizat de ctre productor)
snge defibrinat de iepure / berbec
soluie salin izoton, soluie de rivanol 0,3%
eprubete, pipete gradate foarte curate
baie de ap, centrifug etc
Tehnica de lucru:
Trebuie urmate toate indicaiile din protocolul de lucru, respectiv
se omogenizeaz suspensia de hematii
se ndeprteaz inhitorii SLO din serul de cercetat (utilizm soluie de rivanol i suspensie de crbune activ,
realizm o diluie de 1/10 a serului care se va menine 30 minute la 56C)
se realizeaz diluiile de ser i se repartizeaz n tuburile de reacie (ser n diluii succesive) mpreun cu SLO
(n cantitate constant, cte 0,5 ml / tub); combinarea serului de cercetat cu SLO reprezint prima etap a
reaciei
se agit tuburile pentru omogenizare i se menin timp de 15 minute la 37C
urmeaz a doua etap a reaciei ASLO, respectiv adugarea suspensie de hematii (5%), cte 0,5 ml n fiecare
tub
se agit pentru omogenizare i se incubeaz timp de 45 minute la 37C
spre ex. n cazul IDR Schick se injecteaz n treimea medie a antebraului, strict intradermic o cantitate
de 0,1 ml toxin difteric diluat corespunztor. n cazul n care n sngele persoanei testate se gsete o
cantitate de Ac anti-toxin mai mare de 0,03 UAI / ml, toxina inoculat va fi neutralizat i nu va aprea nici o
modificare la locul inoculrii (lipsa eritemului semnific faptul c persoana testat nu este susceptibil s fac
difterie, n cazul n care se infecteaz cu un bacil difteric toxigen). n cazul n care persoana respectiv nu
prezint Ac anti-toxin difteric, Ag inoculat va conduce la apariia unui eritem la locul de inoculare
Reamintim c, n funcie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul urmrit exist mai
multe tipuri de reacii Ag-Ac, i anume:
1.
reacii de precipitare
2.
reacii de aglutinare
3.
reacia de fixare a complementului (RFC)
4.
reacii de seroneutralizare.
Dac n cazul primelor 2 tipuri de reacii vizualizarea se poate face direct (cu ochiul liber, cu ajutorul unei lupe
etc) n cazul RFC i RSN este necesar utilizarea unor sisteme indicator. n continuare vom discuta despre
reaciile Ag-Ac n care pentru interpretare este necesar marcarea reactanilor, ceea ce se poate face:
primul reactiv (Ag sau Ac, n funcie de ceea dorim s determinm) este fixat pe un suport solid (foarte
frecvent reprezentat de godeurile unor plci de plastic, dar pot fi i bile, tuburi etc); de regul aceast fixare se
realizeaz de ctre companiile productoare
n cazul n care exist complementaritate structural i electrochimic ntre cei doi reactivi, are loc
cuplarea i formarea complexului Ag-Ac; pentru eliminarea reactivilor care nu au intrat n complex are loc o
prim splare
reactivul adugat n urmtoarea etap variaz n funcie de tipul de tehnic ELISA (n finalul acestui
subcapitol vom prezenta pentru exemplificare una dintre variantele tehnice); de ex. se poate aduga un reactiv
care se poate cupla cu Ac, iar acest reactiv este la rndul lui cuplat cu enzima (conjugat enzimatic); n
continuare are loc o nou splare
pentru vizualizarea reaciei, adugm un substrat cromogen pe care enzima poate aciona i conduce la
apariia unei culori care se poate vedea i cu ochiul liber, dar se citete cu ajutorului unui spectrofotometru
valorile nregistrate pentru prob se compar cu valorile nregistrate pentru martorul pozitiv i martorul
negativ, se aplic formula indicat de ctre productor, iar interpretarea se face aa cum este indicat n
protocolul tehnic care nsoete trusa ELISA.
Enzimele utilizate mai frecvent sunt fosfataza alcalin i peroxidaza. n cazul primei enzime, substratul
cromogen va fi p-nitro-fenil-fosfatul iar n cazul peroxidazei, substratul cromogen va fi o-fenilen-diamina n
soluie de ap oxigenat.
Prin tehnicile de tip ELISA se obine o specificitate bun sau foarte bun iar sensibilitatea este comparabil cu
cea obinut n cazul RIA. Tehnica este obiectiv, a devenit automatizat, iar prin extinderea ofertei i creterea
numrului celor care o utilizeaz preurile sunt competitive.
Exist mai multe modaliti de clasificare pentru aceste tehnici, spre exemplu:
n funcie de scopul urmrit, se poate determina prezena Ag n diferite produse patologice sau prezena
Ac n ser, LCR, alte umori
n funcie de tipul i ordinea reactivilor introdui n reacie tehnicile pot fi necompetitive sau de
competiie (directe sau indirecte)
n funcie de complexitatea tehnicii, putem discuta despre variantele clasice (aa cum a fost descris mai
sus i respectiv aa cum urmeaz s fie prezentat n exemplul concret) i respectiv despre variantele simple /
rapide.
n anumite situaii, rezultatele obinute prin ELISA trebuie confirmate prin metode mai specifice.
n continuare vom prezenta succint etapele ELISA n cazul determinrii prezenei de Ac anti-mycobacterieni n
ser. Nu exist nc o standardizare a diagnosticului serologic n tuberculoz (vezi cap. 42) dar aa cum urmeaz
s discutm, pentru a pune diagnosticul unei infecii cu M. tuberculosis, toate datele care pot fi obinute sunt
importante i trebuie analizate n context.
Principiu:
Anticorpii prezeni n serul de analizat se leag specific de Ag imobilizate pe microplci Koh-I-Nor Hardmuth.
Complexul imun format, reacioneaz prin fragmentul Fc al imunoglobulinelor (n special IgG) cu conjugatul
Protein A stafilococic - peroxidaza din hrean (SpA-HRPO) care este pus n evidena cu orto-fenilen-diamin
HC1 (OPD). Reacia este cuantificat fotometric.
Materiale i reactivi necesari:
Tampon 1 (TFSTCH) este format din tampon fosfat salin pH 7.2, 0.15M, Tween 20 0.05% casein
Hammersten 0.5% i mertiolat de sodiu 0,1%. Se pstreaz la + 4oC. este utilizat pentru rehidratare i diluri.
Tampon 2 (TFST) de 10 ori concentrat are aceeai compoziie ca Tamponul 1 cu excepia caseinei
Hammersten. este utilizat pentru splri.
Ser de cercetat
Placa se golete de coninut (automat sau prin rsturnare i scuturare pe un strat de hrtie de filtru).
Probele de ser de analizat i serurile martor (M+ i M-) se dilueaz 1/25 n Tampon 1 (25 ml ser + 0.6 ml
Tampon 1). Serurile se repartizeaz cte 100 ml n 3 godeuri paralele, notndu-se n caietul de lucru poziia
serurilor.
Placa se spal de 3 ori cu Tampon 2 i de 2 ori cu ap distilat, pentru nlturarea spumei. Pentru aceast
operaie, nti se dilueaz Tamponul 2 concentrat prin amestecarea unui volum Tampon 2 cu 9 volume ap
distilat.
Se nltur din godeuri conjugatul i se spal ca mai sus de 3 ori cu Tampon 2 i de 2 ori cu ap distilat.
Se prepar soluia de OPD prin adugarea a 15 ml Tampon 3 si 8 ml perhidrol, repartizndu-se cte 100
ml /godeu.
Se incubeaz la temperatura camerei, ferit de lumin direct, pna n momentul apariiei n godeul
corespunztor serului M+ a unei culori galbene intense iar corespunztor serului M- lipsa apariiei culorii.
Aceasta se realizeaz n circa 10-30 min.
Valorile de pn la 10 UIE sunt considerate nesemnificative, dei pot indica un nceput de sintez de
anticorpi, repetarea determinrii dup 1-2 luni, putnd indica o cretere a titrului.
declanarea diferitelor investigaii. Spre exemplu, infeciile cu Pneumocystis carinii sau Cryptococcus
neoformans pot trda o afectare a limfocitelor T, infeciile repetate, purulente cu Staphylococcus aureus,
Pseudomonas cepacia, Serratia marcescens, Aspergillus spp. ar putea fi datorate unor suferine ale celulelor
fagocitare etc.
Avnd n vedere cele de mai sus, investigarea pacientului la care se suspicioneaz o imuno-deficien ar trebui
s fie realizat prin urmtoarele activiti:
Aplicarea anamnezei pe parcursul creia ar trebui s aflm date privind medicaia primit de respectivul
pacient, momentul debutului suferinei respective, antecedentele heredo-colaterale, date privind vaccinrile
efectuate (vezi i capitolul 22), date privind agenii etiologici izolai i identificai ulterior etc. Adeseori
anamneza are o importan crucial.
studiul mai aprofundat limfocitelor i subpopulaiilor limfocitare CD3+, CD4+, CD8+ etc (numr,
procent) prin metode clasice i moderne (ex. flow-citometrie)
studiul funciei celulelor fagocitare (aderare, inhibiia aderrii, inhibiia migrrii macrofagelor sau
leucocitelor, deficiene la nivelul granulaiilor, deficiene n mieloperoxidaz, deficiene n NADPH oxidaz,
eliberarea radicalilor de oxigen activi de ctre celulelor fagocitare nestimulate i / sau stimulate cu zimosan,
lectine etc)
studii privind reactivitatea celulelor implicate n rspunsul imun de tip celular apreciat prin incorporarea
de timidin tritiat de ctre limfocitele stimulate cu diveri mitogeni, lectine care se leag de membrana celular
(fitohemaglutinin, concavalin A etc), substane care acioneaz direct fr a necesita existena unor
componente membranare, diferite antigene (PPD, candidin etc), citokine (IL-2), celule allogenice etc
studiul secreiei de citokine, modalitate indirect de apreciere a funciei celulelor implicate n rspunsul
imun de tip celular etc
Teste imunobiologice, prin tehnica intradermoreaciei (IDR), folosind antigene care stimuleaz rspunsul
imun de tip celular (ntrziat); n literatura internaional este recomandat o baterie de antigene, patrucinci dintre antigenele menionate n continuare
Candidin (antigen extras din Candida albicans, un extract apos realizat n diluie 1 / 10; antigenul este
numit i Dermatophyton O)
Coccioidin (antigen extras din Coccidioides immitis) care ns poate interfera cu testele serologice
realizate pentru histoplasmoz
Histoplasmin (antigen extras din Histoplasma capsulatum) care produce i o cretere a titrului
anticorpilor fixatori de complement
Toxoid difteric, cu concentraia de 30 limes floculans / ml (nediluat); pentru ultimele 2 antigene pot
aprea reacii de hipersensibilitate de tip umoral ceea ce poate crea probleme importante n ceea ce privete
evaluarea rspunsului imun de tip celular
Tuberculin (derivat proteic purificat, PPD, extras din cultura de Mycobacterium tuberculosis).
n cele ce urmeaz vom discuta despre IDR cu PPD.
Principiul metodei
Tuberculina reprezint un amestec relativ bine standardizat de antigene proteice mycobacteriene, utilizat n mod
curent pentru decelarea infeciei tuberculoase (TB), individual sau populaional. Acest extract se poate utiliza n
cadrul unei baterii de teste IDR pentru evaluarea reactivitii din punct de vedere al rspunsului imun de tip
celular (RIC). Dup ce o persoan dat se infecteaz cu mycobacterii, urmeaz sensibilizarea i proliferarea
anumitor populaii de limfocite T (LT). Injectarea intradermic a tuberculinei stimuleaz LT i declaneaz o
serie de evenimente ce conduc la un apariia unui RIC i a unor manifestri de hipersensibilitate de tip IV.
Reaciile implic vasodilataie, edem i infiltrat cu limfocite, bazofile, monocite, neutrofile. LT antigenspecifice prolifereaz i elibereaz limfokine care mediaz acumularea local a diferitelor alte celule. Rspunsul
maxim se constituie la circa 48 ore dup injectare. Aria induraiei (infiltratului celular) reflect
hipersensibilitatea de tip ntrziat. Eritemul reprezint o reacie inflamatorie acut, cauzat de vasodilataia
capilar iar apariia eritemului nu va fi interpretat drept o reacie pozitiv. Limfocitele sensibilizate ating un
nivel adecvat pentru a conduce la apariia unui rspuns interpretabil dup 2-4 sptmni de la infecia iniial cu
M. tuberculosis. Sensibilitatea poate persista mai muli ani, dar reactivitatea scade de regul o dat cu vrsta.
Materiale i reactivi necesari
Pornind de la tuberculina preparat de Koch (Old-tuberculin, 1891), n 1901 a fost realizat produsul New
tuberculin, iar ulterior derivatul proteic purificat (PPD-S, preparat de Seibert n anul1941), adoptat ca Standard
Internaional pentru PPD. Metoda de obinere a fost reprezentat de precipitarea proteinelor din filtratul
mediului de cultur concentrat la cald, cu soluie 50% sulfat de amoniu. Unitatea internaional pentru PPD este
definit drept activitatea biologic coninut n 0,000028 mg de PPD-S (0,00002 mg PPD + 0,000008 mg
sruri). PPD-RT 23 reprezint lotul de tuberculin purificat n anul 1958 n Danemarca i asigur
omogenitatea produsului antigenic folosit in studii epidemiologice n lumea ntreag. Din produsul realizat
iniial se prepar diluiile necesare (etalonate) la care se adaug Tween 80 n scopul reducerii absorbiei pe
peretele de sticl al fiolei. n mod uzual se utilizeaz 2 UI/doz, echivalentul a 5 UI PPD-S. n raport cu PPDRT23, n Romnia se utilizeaz PPD IC-65 produs de ctre INCDMI Cantacuzino.
Tehnica de lucru
n ara noastr se utilizeaz tehnica injectrii intradermice (Mantoux).
controlm produsul biologic pe care urmeaz s l utilizm din punct de vedere al perioadei de eficacitate,
conservrii n condiiile prevzute de ctre productor;
utilizm numai seringi cu volumul de maxim 1 ml i cu diviziuni clar marcate, cel puin pentru fiecare
1/10 ml precum i ace pentru injecie intradermic, de unic ntrebuinare;
agitm energic fiola pentru a omogeniza concentraia produsului biologic, tiut fiind c, n timpul unei
conservri mai ndelungate, tuberculina tinde s se absoarb pe pereii de sticl ai fiolei;
aspirm n sering o cantitate suficient de soluie pentru a putea elimina integral orice bul de aer
aprut ntre piston i orificiul acului;
antiseptizm cu alcool (minim 3 minute) o arie situat pe faa anterioar a antebraului stng, la unirea
treimii medii cu cea superioar;
cuprindem zona respectiv a antebraului n palm, ntinznd pielea ct mai uniform ntre extremitatea
inferioar a eminentei tenare i hipotenare pe de o parte i cele patru degete strns lipite, pe de alt parte;
ptrundem cu acul aproape tangent la suprafaa antebraului, cu bizoul n sus, pn acesta este situat n
derm;
eliberm tegumentul i fixm seringa presnd-o pe antebraul subiectului, avnd grij s nu se acopere
diviziunile seringii pentru a putea urmrii cantitatea injectat;
injectm strict 0,10 ml; dac injectarea s-a fcut strict intradermic apare o bul uor denivelat, cu
margini relativ abrupte, cu aspect de coaj de portocal i diametru de 5-8 mm; n lipsa apariiei acestei bule (n
cazul injectrii hipodermice sau cnd se pierde soluie ntre sering i acul incorect montat), este recomandat s
se reia manevra cu mai mult atenie, repetnd injectarea la o distan de 3-5 cm sau la antebraul opus.
La persoanele infectate anterior (sensibilizate), la locul injectrii apare o reacie constnd din eritem-edeminduraie ncepnd dup circa 6 ore i atingnd un nivel maxim dup circa 36-60 ore, care se retrage n
urmtoare cteva zile. Pe locul reaciei poate persista o perioad ndelungat o zon de hiperpigmentaie.
Citirea rezultatului
Citirea rezultatului se face de regul dup 72 ore, asigurnd o bun iluminare a zonei examinate (este de
preferat lumina natural). Recomandm o prim citire la 24 ore (pentru a surprinde o eventual
hipersensibilitate de tip umoral fa de antigenul inoculat care are structur proteic), o a doua citire la 48 ore i
citirea final la 72 de ore.
Identificm existena unei eventuale arii intens eritemato-violacee, care circumscrie zona n care am fcut
inocularea. n cazul existenei unei astfel de reacii, apreciem tactil (prin micri repetate, atingnd zona
respectiv) cu pulpa policelui sau inelarului limitele zonei de infiltraie dermic (perceput ca fiind reliefat)
corespunznd din punct de vedere histopatologic inflamaiei (edem, limfocite, macrofage, PMN) i care
reprezint reacia nespecific i specific fa de antigenul injectat.
Msurm diametrul maxim al zonei de infiltraie. Notm i semicantitativ intensitatea infiltraiei dermice
("tip Palmer"), semnificaia fiind urmtoarea:
persoane nscute n ri n care prevalena TB este crescut (din Asia, Africa, America Latin etc);
persoane care prezint afeciuni care cresc riscul apariiei TB (silicoz, diabet zaharat, boli hematologice
i ale sistemului reticuloendotelial, malnutriie) sau sunt tratate cu medicamente imunosupresive.
3. Reacia este considerat a fi pozitiv dac diametrul induraiei este 15 mm n cazul altor situaii dect cele
menionate mai sus
NB. Persoanele infectate cu alte tipuri de mycobacterii pot prezenta reacii pozitive dup IDR cu PPD, ns de
regul diametrul induraiei <10 mm, excepiile (diametru > 10mm) putnd apare n special la debutul infeciei.
n ara noastr se consider drept pozitive reaciile atunci cnd diametrul este 9 mm. Aceast definiie
convenional se bazeaz pe rezultatele unor testri efectuate pe eantioane semnificative statistic, la care
analiza epidemiologic a distribuiei valorilor a artat c plasarea limitei ntre valorile de 9-10 mm separ cel
mai bine cele 2 categorii (neinfectai i infectai) asigurnd cel mai sczut procent de rezultate fals pozitive i
respectiv fals negative. Clasificarea indivizilor dintr-o populaie n negativi i pozitivi la testul tuberculinic
servete la msurarea extinderii infeciei TB n acea populaie (prevalena infeciei) oferind un plus de
informaie prin analiza separat pe grupe de vrst. Dac se repet determinarea prevalenei infeciei pe vrste
la intervale definite de timp, dinamica prevalenei infeciei n fiecare cohort permite determinarea riscului
anual de infecie, indicator fiabil al evoluiei endemiei tuberculoase.
n ceea ce privete investigarea reactivitii din punctul de vedere al RIC pentru un anumit subiect, la care s-a
utilizat o baterie de antigene, dac spre exemplu rezultatul este negativ pentru fiecare dintre cele 4-5
antigene folosite se poate presupune faptul c subiectul respectiv este anergic n ceea ce privete RIC i se
recomand efectuarea unor investigaii suplimentare.
baz aceste cunotine, n capitolele urmtoare vom discuta pe rnd diagnosticul de laborator al infeciilor
produse de principalele microorganisme studiate.
Pentru fiecare dintre capitolele 24-52 vom utiliza schema de diagnostic prezentat n capitolul 5, schem pe
structura creia am discutat de altfel i diferitele aspecte din partea general. Utilizarea n mod repetat a unei
scheme clare permite o mai bun fixare a cunotinelor precum i atingerea obiectivului stabilit: reinerea unor
principii de ctre studeni indiferent de specialitatea care va fi aleas ulterior sau de ctre medici. Microbiologia
este, dup prerea noastr, o tiin cu foarte mare aplicabilitate practic. Elementele de baz ale microbiologiei
sunt necesare i utile pentru toi cei implicai n sistemul sanitar; cunoaterea acestor elemente de baz ar putea
preveni o serie de anomalii i erori care uneori sunt dezastruoase (aa cum s-a ntmplat de ex. ntr-o
maternitate n care o serie de nou-nscui au decedat datorit unor infecii de spital).
Dac n urm cu circa 30 de ani la nivel internaional a nceput s se considere (n mod eronat) c problemele
legate de bolile infecioase sunt din ce n ce mai puin importante, eroare care a creat i creaz nc mari
probleme n sntatea public la nivel internaional, n ultimii 5-6 ani (n special ncepnd cu anul 1998) s-a
neles c bolilor transmisibile trebuie s li se reacorde importana cuvenit. Astfel, inclusiv la nivel european,
au fost elaborate numeroase acte normative n acest domeniu iar fondurile alocate au sporit substanial,
ncercnd s se amelioreze situaia creat datorit erorilor anterioare.
i n ara noastr, preocuparea fa de sntatea public n general i fa de microbiologia n sntatea public
n mod particular a crescut dup anul 1997. Activitatea desfurat n domeniul reformelor pentru sntatea
public n Romnia este, din acest punct de vedere, destul de aproape de reforma care are loc restul Europei.
Diferitele proiecte i programe iniiate n special n perioada 1997-2000 i gsesc i astzi concretizarea n
aplicarea unor msuri cu mare importan la nivel naional: reabilitarea centrelor de referin pentru
microbiologie, reforma sistemului de supraveghere a tuberculozei, adaptarea la standarde internaionale a
sistemului de diagnostic, prevenire i control pentru bolile cu transmitere sexual, meninerea la un nivel
corespunztor a imunizrilor pentru a preveni bolile prevenibile prin vaccinare, includerea Romniei n sistemul
de pregtire n scopul supravegherii bolilor transmisibile la nivel european etc.
Din anul 1999 Romnia face parte (ca membru fondator) din Reeaua de supraveghere a bolilor transmisibile n
Balcani. n anul 2000, a fost organizat una dintre cele mai importante ntlniri cu scopul armonizrii
supravegherii bolilor infecioase n Europa (Consensus Meeting on Surveillance of Infectious Diseases,
Grottaferrata, Italia, 7 aprile 2000). Prezentarea pe care unul dintre autorii prezentului volum a fcut-o cu acest
prilej, discuiile care au urmat n ateliere de lucru, ntlnirile cu factori de decizie ai Organizaiei Mondiale a
Sntii, iniiativa organizrii unei reele de supraveghere a bolilor transmisibile n rile din Europa Central
i de Est (ntlnire plenar pe care am organizat-o n decembrie 2000, la Bucureti) au dus la construirea unui
proiect de reform n domeniul supravegherii bolilor transmisibile cu sprijin european (PHARE) care a fost
aprobat de asemenea n anul 2000 i este n curs de desfurare.
Chiar dac reprezint o msur pentru prevenirea unor maladii virale (i nu bacteriene sau fungice) vom mai
aminti dintre msuri luate n ultimii ani mbuntirea programului de vaccinare mpotriva infeciilor cu virusul
hepatitei B, n anul 1999. Vaccinarea nou-nscuilor avea deja o vechime de 4 ani, dar n 1999 prin politica
dus n domeniul sntii publice a fost inclus i vaccinarea copiilor din clasa a III-a, vaccinarea tuturor
elevilor din anul I de la colile sanitare postliceale i respectiv a studenilor din anul I din facultile de
medicin i stomatologie. Aceast politic va duce ca n numai civa ani, un mare numr de generaii de copii
s fie vaccinate fa de o infecie care devenise endemic la nivelul anilor 90.
Fiecare din aspectele menionate are o strns legtur att cu microbiologia ct i cu sntatea public i
merit a fi cunoscute de ctre medicii i viitorii medici din sistemul sanitar romnesc.
n bolile infecioase (transmisibile) diagnosticul are o importan considerabil, deoarece de stabilirea corect i
precoce a diagnosticului depind att vindecarea bolnavului, ct i succesul msurilor preventive care trebuie
iniiate ct mai rapid posibil. Spre exemplu, ignorarea primului caz al unei boli infecioase grave (ex. holer)
poate avea consecine epidemiologice foarte importante. Cu toate c n primii de studiu este abordat n mod
special partea microbiologic (bacteriologic, virusologic, parazitologic, micologic) a diagnosticului, este
strict necesar s menionm c examenul clinic i pstreaz i astzi o deosebit valoare. n scopul
diagnosticrii bolilor infecioase au fost puse la punct numeroase tehnici de laborator, metode paraclinice,
precise i obiective, dar utilitatea lor este maxim atunci cnd rezultatele sunt interpretate n contextul clinic i
epidemiologic.
n diagnosticul bolilor transmisibile trebuie respectate o serie de reguli, dup cum urmeaz.
1. Obinerea datelor (clinice, paraclinice i de laborator) este urgent. Anamneza trebuie realizat cu
rigurozitate. Aprecierea statusului imunologic poate fi esenial. Nici un element obinut prin examenul obiectiv
nu trebuie neglijat. 2. Datele obinute trebuie privite ca un tot unitar; nu pot fi absolutizate nici posibilitile
clinice i nici cele ale laboratorului. 3. Este indispensabil s se stabileasc un diagnostic etiologic n toate
maladiile infecioase, avnd n vedere importana tratamentului antimicrobian; 4. Folosirea corect a
laboratorului constituie o alt regul important. Este necesar ca fiecare medic clinician s tie ce analiz s
cear, ce produse se recolteaz de la bolnav, cnd i cum s le recolteze, cum s le expedieze ctre laborator.
Pentru obinerea unor date corecte prin examenele de laborator, clinicianul va respecta cteva reguli: produsele
se recolteaz nainte de administrarea tratamentului antimicrobian; se trimite laboratorului o cantitate suficient
de produs pentru examinat; produsul patologic trimis trebuie s fie reprezentativ pentru boala respectiv (de
exemplu, sput i nu saliv n infeciile respiratorii inferioare); produsul examinat nu trebuie contaminat cu ali
germeni n cursul recoltrii sau al transportului (recoltare aseptic); expedierea ctre laborator se face n
condiiile de conservare cerute pentru fiecare tip de produs patologic n parte; se solicit examinarea imediat a
produselor transmise ctre laborator. 5. Trebuie s existe o colaborare strns i continu ntre clinician i
specialistul de laborator. Este necesar o informare clinic a omului de laborator de ctre clinician pentru
orientarea studiilor n laborator i pentru alegerea celor mai bune metode de identificare a agentului etiologic.
n acelai timp, laboratorul trebuie s informeze clinicianul pe parcurs n legtur cu datele obinute.
n cadrul examenelor de laborator, un loc prioritar este ocupat de diagnosticul microbiologic (bacteriologic,
micologic i / sau imunologic), care va fi prezentat n continuare (vezi i capitolul 5). Foarte pe scurt vom
discuta cteva date referitoare la alte examene paraclinice, utile n diagnosticul bolilor infecioase.
Diagnosticul citologic const n punerea n eviden a unor aspecte celulare caracteristice, utiliznd un produs
prelevat de la bolnav. Spre exemplu, citodiagnosticul revrsatelor pleurale i al LCR poate aduce date preioase
pentru elucidarea etiologiei unei pleurezii i respectiv a unei meningite. Diagnosticul histologic implic biopsii
(recoltate prin tehnic chirurgical) sau puncii-biopsii ale diferitelor organe (ficat, rinichi, plmn, ganglioni
limfatici, fragmente vasculare, mucoas digestiv sau respiratorie) care permit punerea n eviden a unor
modificri structurale caracteristice, determinate de aciunea agentului microbian. Dintre metodele de laborator
nespecifice sunt utile n diagnosticul bolilor infecioase hemograma, leucograma (cu modificri caracteristice n
unele boli), viteza de sedimentare a hematiilor, testele de disproteinemie, diferite teste enzimatice, determinarea
prezenei proteinei C reactiv (beta-globulin care apare n ser n afeciuni inflamatorii, neoplazii i n procese
necrotice), alte teste de inflamaie (reactani de faz acut) etc.
Referitor la alte metode paraclinice vom aminti examenul radiologic care poate furniza date de valoare pentru
bolile infecioase cu participare pulmonar (pneumonii virale, febr Q, tuse convulsiv, pneumonie
pneumococic etc). n diagnosticul bolilor infecioase se mai pot folosi rectosigmoidoscopia,
electroencefalografia, electrocardiografia, diferite determinri biochimice, examene oftalmologice, scintigrafia,
ecografia, tomografia computerizat, tehnica de rezonan magnetic nuclear.
Diagnosticul de laborator microbiologic (ex. bacteriologic)
Diagnosticul de laborator n microbiologie poate fi un diagnostic bacteriologic (direct), un diagnostic
imunologic (indirect) sau o combinaie a celor dou variante menionate. Schema general a diagnosticului de
laborator microbiologic a fost discutat n capitolul 5 i va fi aplicat concret n capitolele care urmeaz. Pentru
fiecare microorganism / diagnostic n parte, din lista p.p. posibil de utilizat, vom alege pentru prezentare cte
unul singur, considerat reprezentativ.
Principalele microorganisme pentru care se va studia diagnosticul microbiologic
Bacteriile studiate pot fi grupate dup mai multe criterii, dar o variant util este cea n care avem n vedere
structura peretelui bacterian i respectiv afinitatea acestuia fa de diferii colorani.
Un prim grup important este cel care include cocii cu importan medical, gram pozitivi (stafilococi,
streptococi, pneumococi etc) i respectiv gram negativi (meningococi i gonococi etc).
Dintre bacteriile gram negative care au dimensiuni pe baza crora nu pot fi ncadrate drept coci sau bacili se
afl parvobacteriile, cocobacilii gram negativi (Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella spp.
etc).
Bacilii gram pozitivi care vor fi discutai se pot grupa n bacili nesporulai (Corynebacterium diphteriae,
Listeria spp. etc) i respectiv bacili gram pozitivi sporulai (Bacillus anthracis, Clostridium spp. etc).
Bacilii gram negativi studiai aparin fie familiei enterobacteriilor (E. coli, Salmonella spp., Shigella spp.,
Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Yersinia spp. etc) fie sunt inclui n genuri separate precum Vibrio
cholerae din genul Vibrio sau Pseudomonas aeruginosa din genul Pseudomonas.
Microorganismele din genul Mycobacterium se pot colora (cu dificultate) prin metoda Gram, dar n mod
caracteristic se coloreaz prin metoda Ziehl-Neelsen. Specia principal studiat este reprezentat de M.
tuberculosis.
O serie de bacterii spiralate (ex. Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp.) nu se coloreaz prin
metoda Gram datorit structurii particulare a peretelui. Pot fi studiate microscopic fie n preparate proaspete
(utiliznd tehnici microscopice speciale) fie utiliznd coloraii particulare (ex. impregnarea argentic).
Pn n urm cu o perioad de timp microorganismele aparinnd genurilor Rickettsia, Chlamydia i
Mycoplasma erau incluse n categoria virusurilor. Totui proprietile lor fundamentale fac s le studiem astzi
ntre bacterii.
n obiectul de studiu sunt ncadrai i fungii (ciupercile) care au o serie de caracteristici aparte. Noiunile legate
de diagnosticul micologic sunt prezentate mai pe larg n tratatele de specialitate.
Staphylococcus
Stafilococii sunt coci gram-pozitivi aerobi, facultativ anaerobi, imobili, nesporulai, catalazo-pozitivi. Genul
Staphylococcus cuprinde mai multe grupe de microorganisme de interes medical (unele dintre aceste grupuri
incluznd mai multe specii). Cele mai cunoscute specii sunt reprezentate de: Staphylococcus aureus; S.
epidermidis; S. saprophyticus. S. aureus reprezint specia cel mai frecvent implicat n clinic, n timp ce alte
specii sunt nepatogene sau condiionat patogene. n funcie de capacitatea de a elabora coagulaz, toi
stafilococii coagulazo-pozitivi sunt grupai ca S. aureus.
Stafilococii pot deveni patogeni i se pot manifesta ca atare fie prin multiplicare i invazivitate, fie prin
multiplicare i toxinogenez (fiind posibil i combinarea acestor mecanisme). Determinanii patogenitii la
stafilococ includ produsele toxice i enzimatice. S. aureus este implicat ca agent etiologic ntr-o mare varietate
de infecii supurative (cu puroi), ncepnd cu infeciile superficiale ale tegumentelor i mucoaselor i
continund cu panariii, furuncule, abcese profunde, infecii ale diferitelor organe interne cu sau fr
generalizarea infeciei. Pe de alt parte, ar fi de menionat toxinozele (datorate n special toxinelor elaborate) i
anume toxiinfeciile alimentare, necroliza toxic a epidermului, sindromul de oc toxic etc. Toxiinfeciile
alimentare sunt provocate de exotoxinele preformate, existente n alimente n care s-au multiplicat stafilococi
enterotoxigeni. Stafilococii coagulazo-negativi (SCN) sunt implicai n infecii aprute dup manevre medicochirurgicale care penetreaz bariera cutaneo-mucoas (cateterisme, implante, protezri intravasculare etc). Ar
mai fi de amintit infeciile tractului urinar i genital cu S. saprophyticus (la femeile tinere). O infecie grav
produs de SCN este enterocolita postantibiotice a nou nscutului (mai ales a prematurului, la care
administrarea necontrolat a antibioticelor poate produce disbacteriemii cu consecine grave). Pentru a discuta
diagnosticul de laborator n infeciile produse de stafilococi vom alege drept reprezentative infeciile purulente
ale tegumentelor i mucoaselor i ne vom referi numai la Staphylococcus aureus.
Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu urmtoarele etape.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai
aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de
vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n funcie de maladia
provocat se pot recolta urmtoarele produse patologice: secreii purulente (din foliculite, abcese, celulite,
fistule, infecii ale plgilor i arsurilor), lichide (de puncie sinusal, otic, mastoidian, articular, peritoneal,
pleural, pericardic), exsudat nazal sau exsudat faringian, snge, LCR, sput, urin, secreie vaginal,
tampoane vaginale, lichid de vom, materii fecale, alimente, prelevate de pe suprafaa cateterelor i a inseriilor
iv. ale acestora. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de puroi (vezi i capitolul 6).
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul
patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv
Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel
tegumentar (eventual modificate fa de normal), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) i
prezena cocilor gram-pozitivi, cu diametrul de 0,5-1,5 m, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai sau n
grmezi neregulate. Cocii se pot situa intra sau extraleucocitar. Se are n vedere locul de unde a fost recoltat
p.p. (puroiul poate fi necontaminat, dac se recolteaz de ex. prin puncie-aspirare dintr-o colecie purulent
profund i este foarte probabil contaminat cu flor de asociaie dac a fost recoltat dintr-o leziune superficial).
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Stafilococii se dezvolt n
general pe medii de cultur obinuite n 18-24 ore, la 35-37C. Coloniile au aspect de tip S, diametrul cuprins
ntre 1-3 mm i sunt pigmentate n funcie de specia izolat (ex. pigment auriu). Pe mediul geloz-snge, n
jurul coloniilor poate aprea o zon de hemoliz clar. Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate,
tolernd o concentraie de 7-10% NaCl (ex. mediul Chapman).
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-pozitivi, cu diametrul de circa 0,5-1,5 m, dispui n lanuri
scurte, perechi, izolai sau n grmezi neregulate
Caractere de cultur: Produc colonii de tip S, pigmentate auriu; pe mediile cu snge pot produce
hemoliz.
Caractere antigenice: Se pot utiliza teste comerciale care includ fibrinogen i IgG care cupleaz
coagulaza legat i proteina A (tehnici de aglutinare indirect).
Caractere de patogenitate: Trebuie efectuat testul coagulazei (vezi capitolul 12, punctul 12.7); pentru
identificarea exotoxinelor se poate utiliza o tehnic de tip ELISA sau aglutinarea pasiv inversat (vezi i
capitolul 11).
Alte caractere / teste utilizate n identificare: Se pot utiliza (n centre de referin) teste care se bazeaz pe
proprieti fenotipice moleculare (studiul acizilor grai celulari, al unor enzime sau al unor polipeptide totale)
sau genotipice (fragmente de restricie ale materialului genetic, hibridarea molecular, ribotipia). S-au dezvoltat
tehnici rapide utiliznd truse de identificare i instrumente automatizate pentru evidenierea unor elemente ale
peretelui celular (proteina A, coagulaza legat), a enzimelor elaborate n aliment sau lichidul de hemocultur
(testul pentru termonucleaz) i a toxinelor (enterotoxine, TSST1, exfoliatine). Exist metode care utilizeaz
markeri moleculari pentru evidenierea prezenei MRSA (stafilococ rezistent la meticilin) i pentru
diferenierea intraspecific la S. aureus i SCN.
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este
obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. n cazul unor infecii grave trebuie s fie
nsoit de alte determinri (vezi capitolul 14).
Streptococcus
Streptococii sunt coci sferici gram-pozitivi care formeaz perechi sau lanuri n cursul diviziunii celulare. Sunt
larg rspndii n natur. Unii fac parte din flora uman normal; alii sunt asociai cu afeciuni umane
importante datorate parial infeciei streptococice i parial rspunsului imun al gazdei. Nu s-a elaborat un
sistem perfect pentru clasificarea tuturor streptococilor. Dintre speciile cu importan medical ar fi de amintit
S. pyogenes (grup A), S. agalactiae (grup B), S. viridans (care aparine florei normale), S. pneumoniae
(pneumococul) etc. Enterococii aparineau grupului D, ns n momentul actual fac parte dintr-un gen separat,
genul Enterococcus. Streptococii sunt imobili, nesporulai i pot avea sau nu capsul. n acest capitol vom
discuta diagnosticul de laborator al infeciilor produse de Streptococcus pyogenes.
Cei mai muli dintre streptococii care conin antigenul de grup A sunt streptococi piogeni. Streptococii piogeni
sunt beta-hemolitici (produc n mod caracteristic zone largi de hemoliz clar n jurul unor colonii de
dimensiuni mici). De regul streptococii piogeni sunt sensibili la bacitracin.
Streptococii sunt potenial implicai ntr-o mare varietate de boli. n principal streptococii piogeni pot deveni
patogeni datorit multiplicrii i capacitii de invazivitate. Proprietile biologice ale microorganismelor
infectante, natura rspunsului gazdei i poarta de intrare a infeciei au o mare influen asupra tabloului clinic.
Infeciile streptococice ar putea fi grupate astfel:
Boli invazive, n care putem include faringita, angina streptococic, erizipelul, diferite infecii n sfera
ORL, pneumonia, impetigo streptococic, celulita, fasceita necrozant, febra puerperal, endocardita infecioas,
sepsisul streptococic etc.
Boli produse de streptococi lizogenizai, n care putem include scarlatina i sindromul de oc toxic
streptococic.
Bolile poststreptococice care includ reumatismul articular acut (RAA) i glomerulonefrita acut
poststreptococic (GNA). Diferii autori iau n considerare i alte entiti clinice.
Pentru a discuta diagnosticul de laborator n infeciile produse de streptococii piogeni vom alege faringita
streptococic. n vederea confirmrii unei boli poststreptococice vom discuta reacia ASLO (vezi i capitolul
19).
Diagnosticul de laborator bacteriologic, direct, n faringita streptococic.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic, secreia purulent de la nivelul faringelui, trebuie s se
realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit
antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de
asepsie i antisepsie, recoltarea se face preferabil dimineaa nainte ca pacientul s mnnce i fr s se fi
splat pe dini, fr s fi utilizat gargarisme cu diferite soluii, iar dac aceste condiii nu au fost respectate,
recoltarea se va face dup minim 4 ore etc (vezi i capitolul 6). Produsul recoltat trebuie prelucrat ct mai
repede posibil, ns n nici un caz nu trebuie s treac mai mult de 2-3 ore de la recoltare pn la cultivare
(preferabil 1-2 ore). n cazul n care se estimeaz depirea acestui interval de timp trebuie folosit un mediu de
transport, ex. mediul Stuart (vezi i capitolul 9). Chiar i n aceast situaie, nu ar trebui s treac mai mult de
24 de ore pn la prelucrarea p.p.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a dou frotiuri din produsul patologic
recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram.
Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel faringian,
prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) i prezena cocilor gram-pozitivi aezai separat, n
perechi sau n lanuri, dar i a altor tipuri de microorganisme. Examenul microscopic al p.p. are doar un rol
orientativ.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Streptococii piogeni sunt
germeni pretenioi care nu se dezvolt pe medii de cultur obinuite. Mediul cel mai frecvent folosit este
agar-snge, pe care cultura apare n n 18-48 ore, la 35-37C. n cazul n care nu remarcm apariia de colonii
caracteristice dup 24 de ore, reincubm placa Petri pentru nc o zi. Coloniile au aspect de tip S cu diametrul
de 0,5-1 mm, nconjurate de o zon de b-hemoliz (zon clar de hemoliz, cu un diametru mult mai mare
dect diametrul coloniei). n cursul nsmnrii, pe cel puin una dintre laturile poligonului descris trebuie s
realizm i o nepare a mediului n aa fel nct inoculul s ajung mai n profunzime. Aceast manevr (exist
i alte variante tehnice) este necesar pentru a permite activitatea hemolizinei O (aceast streptolizin este
inactivat n prezena oxigenului). Speciile care produc material capsular, din acid hialuronic, adeseori dau
natere unor colonii mucoide (de tip M). Se pot folosi pentru cultivare i medii selective (de ex. agar-snge plus
trimetoprim-sulfametoxazol).
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul de circa 1. Se
divid ntr-un plan perpendicular pe axa lor lung i se pot dispune n lanuri. Lungimea lanurilor variaz i este
condiionat de factori de mediu.
Caractere de cultur: Produc colonii de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm, nconjurate de o zon de bhemoliz sau colonii de tip M.
Caractere biochimice:
Prin testul PYR este identificat sinteza pirolidonil-amidazei (actualmente exist i teste comerciale,
rapide, pentru testul PYR).
Caractere antigenice:
Se pot utiliza teste comerciale pentru detectarea rapid a polizaharidului specific de grup A al
streptococilor piogeni n p.p., dup extracie chimic sau enzimatic (ex. cu pronaz). Tehnicile utilizate pot fi
aglutinarea indirect (latexaglutinare), coaglutinarea sau ELISA.
Prin reacii de aglutinare (latexaglutinare, coaglutinare) pe lam, sau precipitare se pot determina
antigenele streptococice de grup (Lancefield) sau de tip.
S. pyogenes este mprit n serotipuri pe baza antigenelor proteice M (peste 80) prin reacia de
precipitare n tuburi capilare i T (28 serotipuri) prin reacia de aglutinare pe lam. Aceste testri se fac n
centre de referin.
Alte teste utilizate n identificare: Se pot utiliza sondele nucleotidice pentru detectarea direct a
streptococilor de grup A n exsudatul faringian.
5. Streptococii piogeni i menin sensibilitatea cunoscut la penicilin (au fost identificate n ultima perioad
tulpini tolerante, care sunt inhibate dar nu distruse de ctre penicilin). Pentru pacienii alergici la betalactamine se poate alege pentru tratament eritromicina, dar au fost identificate tulpini rezistente la acest
medicament antimicrobian i n acest caz antibiograma devine necesar. n general antibiograma se realizeaz
n scop epidemiologic.
Diagnosticul de laborator serologic
Diagnosticul imunologic al infeciilor produse de streptococii b-hemolitici din grupul A ar putea consta din
investigarea fie a rspunsului imun umoral (prezena i titrul anticorpilor, n cadrul diagnosticului serologic),
fie a rspunsului imun de tip celular. n continuare nu vom discuta dect diagnosticul serologic, care are
importan practic.
Diagnosticul serologic este util pentru certificarea etiologiei bolilor poststreptococice (RAA, GNA),
identificarea unei eventuale stri de hipersensibilitate, diagnosticul retrospectiv al unei infecii streptococice,
evaluarea evoluiei clinice i eficacitii tratamentului. Diagnosticul serologic se realizeaz de obicei prin
reacia ASLO, care identific titruri ale anticorpilor anti-streptolizin O (vezi i capitolul 19). Testarea se face
n dinamic, pe seruri recoltate la interval de 7 10 zile. Pentru zona noastr geografic se accept ca normal
un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO. Este strict necesar realizarea controlului intern i extern de calitate.
Exist teste serologice pentru determinarea prezenei i titrului anticorpilor fa de alte structuri antigenice
(streptodornaz, hialuronidaz, streptokinaz). Titrul anticorpilor anti-streptodornaz este crescut la pacienii cu
infecii tegumentare i trebuie investigat dac se suspicioneaz prezena unei glomerulonefrite acute. Se pot
determina i anticorpii anticarbohidrat (hemaglutinare pasiv) sau anti-MAP (prin latex aglutinare).
pneumoniae
Streptococcus pneumoniae se prezint sub form de coci gram-pozitivi, alungii, lanceolai, dispui n general
n diplo pe axul longitudinal, ncapsulai, nesporulai, imobili. Pneumococii sunt aerobi, facultativ anaerobi. Pe
geloz-snge determin a-hemoliz la fel ca Streptococcus viridans. Creterea lor este favorizat n atmosfer
de 5% CO2 la o temperatur de 37C. Streptococcus pneumoniae poate deveni patogen prin multiplicare i
invazivitate, conducnd la apariia unor variate infecii ale tractului respirator superior i inferior, ale urechii
medii, ale sinusurilor, dar i alte infecii produse prin diseminare hematogen (ex. meningit, endocardit, care
pot fi foarte grave). Pneumonia pneumococic se nsoete de prezena edemului alveolar i a unui exsudat
fibrinos, urmat de apariia de hematii i leucocite.
Datorit faptului c poate face parte din flora microbian normal, exist o serie de probleme n ceea ce privete
interpretarea semnificaiei prezenei pneumococilor n produse patologice care pot fi contaminate cu aceast
flor (ex. sputa recoltat prin expectoraie). Una dintre marile probleme terapeutice decurgnd din dezvoltarea
rezistenei la antibiotice o reprezint apariia pneumococilor rezisteni la penicilin i alte medicamente
antibacteriene.
Pentru a discuta diagnosticul de laborator n infeciile produse de pneumococi vom alege drept entitate
patologic reprezentativ pneumonia pneumococic.
Diagnosticul pneumoniei pneumococice
Diagnosticul pneumoniei pneumococice este clinic, radiologic iar din punct de vedere al stabilirii etiologiei este
un diagnostic bacteriologic (direct).
Diagnosticul de laborator microbiologic este numai bacteriologic (direct).
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai
aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de
vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n funcie de maladia
provocat se pot recolta urmtoarele produse patologice: sput, aspirat bronic sau traheal, exsudat faringian,
secreii otice sau conjunctivale, lichid pleural, lichid pericardic, LCR, puroi, snge, material necroptic. n
pneumonia pneumococic agentul etiologic poate fi izolat i prin hemocultur. n continuare vom discuta cazul
n care p.p. este reprezentat de sput (vezi i capitolul 6).
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul
patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv
Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel
alveolar (ex. macrofage alveolare), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena cocilor grampozitivi, alungii, lanceolai, dispui n general n diplo, ncapsulai (cu o capsul comun), nesporulai.
Examinarea microscopic trebuie s demonstreze calitatea produsului patologic i s realizeze o identificare
prezumtiv a microorganismului implicat (vezi i capitolul 52). n coloraia cu albastru de metilen, capsula
poate aprea ca un halou n jurul pneumococilor. Utiliznd anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o
identificare rapid inclusiv direct, pe produsul patologic (de exemplu sput), prin reacia de umflare a
capsulei (vezi capitolul 12, punctul 12. 14).
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Pneumococii sunt germeni
pretenioi, care nu se dezvolt pe medii simple, sunt aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloz-snge formeaz
colonii de tip S sau de tip M, nconjurate de o zon de a-hemoliz (la fel ca Streptococcus viridans).
Multiplicarea este favorizat n atmosfer de 5% CO2 la o temperatur de 35-37C. n mediile de cultur
lichide tulbur omogen mediul.
Produsul patologic se poate inocula i la animale de laborator sensibile, respectiv la oareci albi.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-pozitivi, alungii, lanceolai, dispui n general n diplo,
ncapsulai (cu o capsul comun), nesporulai.
Caractere de cultur: Pe geloz-snge formeaz colonii de tip S sau M, nconjurate de o zon de ahemoliz (la fel ca Streptococcus viridans).
Caractere biochimice:
Glucoza reprezint principala surs de energie pentru pneumococi. Acetia elaboreaz enzime
zaharolitice, proteolitice i lipolitice.
Pneumococii elaboreaz enzime autolitice. Autoliza este indus i accelerat de bil, sruri biliare, acizi
biliari; testul este util n identificarea pneumococilor (testul bilolizei, Neufeld; vezi capitolul 12, punctul 12.3).
Sunt sensibili la optochin (etil-hidrocuprein), sensibilitatea la aceast substan fiind de asemenea util
n identificare i diferenierea de Streptococcus viridans (vezi capitolul 12, punctul 12.13).
Caractere antigenice:
Cel mai important determinant antigenic i patogenic este capsula polizaharidic (antigenul K), ce
protejeaz pneumococul fa de fagocitoz i permite invazivitatea. Structura polizaharidului capsular este
specific fiecrui serotip n parte. Pn n prezent au fost identificate peste 85 de serotipuri capsulare diferite, a
cror structur a fost determinat pentru majoritatea serotipurilor. Au fost produse seruri specifice anticapsulare
polivalente i monovalente, utile n identificarea pneumococilor cu ajutorul reaciei de umflare a capsulei (vezi
capitolul 12, punctul 12. 14). n acelai scop se poate utiliza i reacia de aglutinare.
Datorit faptului c prin urin se elimin cantiti destul de importante de Ag K, prezena acestuia poate
fi evideniat prin reacii de latexaglutinare sau mai bine prin imunoelectroforez.
Caractere de patogenitate: Se poate utiliza inocularea la oarecele alb (vezi capitolul 11).
Alte teste utile n identificare: Se pot utiliza sonde nucleotidice pentru identificarea ARNr.
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este
obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice pe medii suplimentate cu snge defibrinat de
oaie. Pentru verificarea sensibilitii / rezistenei la penicilin se utilizeaz microcomprimate cu oxacilin (1
mg). n cazul unor infecii grave antibiograma trebuie s fie nsoit de alte determinri (vezi capitolul 14).
Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o
structur capsular comun, nesporulai.
Caractere de cultur: Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1-2 mm. Tulpinile
ncapsulate (ex. grupele A, C) pot conduce la apariia unor colonii de tip M.
Caractere biochimice:
Metabolizeaz diferii carbohidrai, activitate care poate fi util n identificare. Spre exemplu
meningococul metabolizeaz att glucoza ct i maltoza.
Exist o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenzimatic a Neisseriilor (ex. Quad Ferm+,
RIM, Minitek etc).
Caractere antigenice: n funcie de structura lipooligozaharidului exist 12 serotipuri. Cel mai important
determinant antigenic este capsula polizaharidic. Structura capsular permite subdivizarea speciei n 13
serogrupuri. Dintre acestea mai importante sunt grupele: A, B, C, Y i W-135.
Prezena meningococului poate fi detectat direct n produsul patologic prin latex aglutinare,
coaglutinare sau contraimunoelectroforez utiliznd seruri polivalente anti -A, C, Y, W-135 i respectiv seruri
monovalente anti-B (se pot detecta 0,02-0,05 mg de Ag / ml). De notat posibilitatea unei reactiviti ncruciate
fa de Ag grupului B, respectiv Ag K1 de la E. coli.
Tehnici similare se pot utiliza pentru identificarea tulpinilor de meningococ izolate n cultur.
Caractere utilizate n tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate: Exist diferite tehnici (imunologice,
electroforetice, de biologie molecular) care sunt practicate numai n centre de referin. Utilizarea PCR are o
sensibilitate i specificitate de circa 91%; foarte util la pacienii pentru care s-a iniiat deja antibioticoterapia.
5. Antibiograma (testarea sensibilitii tulpinilor izolate n vederea stabilirii tratamentului) este recomandat i
se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. n cazul unor infecii grave antibiograma trebuie s fie
nsoit de alte determinri (vezi capitolul 14).
Neisseria gonorrhoeae
Infeciile gonococice continu s reprezinte o problem important de sntate public.
Dup ptrunderea n organismul receptiv, n funcie de calea de transmitere, gonococul se ataeaz de mucoase
(genito-urinar, ocular, rectal, faringian etc) i produce local o supuraie acut. La brbai apare uretrita
gonococic. La femei, gonoreea se localizeaz endocervical, dar se poate extinde la nivelul uretrei, vaginului,
glandelor Bartholin, trompelor uterine. Dac mama are gonoree i nou-nscutul se nate pe cale natural, poate
aprea oftalmia gonococic. Rareori gonococul poate disemina pe cale sanguin (bacteriemie), cu apariia unor
leziuni dermice, artrite, tenosinovite gonococice etc.
Diagnosticul de laborator n gonoree
Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic (direct), cu etapele cunoscute.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (ct mai
aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de
vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). La brbat se preleveaz
secreia uretral (eventual pictura matinal) iar la femeie recoltarea trebuie efectuat pe mas ginecologic
de la nivelul colului uterin i glandelor Bartholin (vezi i capitolul 6). Secreiile au de obicei un aspect
purulent. Este de preferat cultivarea imediat, pe medii de cultur potrivite i n atmosfer de CO2. n cazul n
care p.p. urmeaz a fi transportat ctre laborator, transportul trebuie realizat fr ntrziere (la o temperatur
apropiat de 37C). Chiar i n cazul utilizrii mediilor de transport (ex. mediul Amies plus crbune activat),
acesta nu ar trebui s dureze mai mult de 6 ore. Gonococul ar putea fi izolat i prin hemocultur, cultivarea
secreiilor conjunctivale, faringiene, cultivarea urinei etc. n cazul n care nu exist nici o secreie, se poate
utiliza urina care trebuie centrifugat i nsmnat imediat pe medii de cultur.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul
patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv
Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor, a celulelor
inflamatorii (ex. leucocite) i prezena cocilor gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai
de o structur capsular comun, situai intra sau extraleucocitar.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Gonococii sunt germeni
foarte pretenioi, care nu se dezvolt pe medii simple, sunt aerobi, facultativ anaerobi. Se pot utiliza medii
selective (ex. medii n care se include vancomicin, colistin, trimetoprim i nistatin) sau neselective (ex. mediul
GC, geloz-snge sau geloz-chocolat cu diferite suplimente nutritive; se recomand utilizarea pulberii de
hemoglobin i nu a sngelui proaspt). Este preferat cultivarea n dublu, pe medii selective i neselective;
n cazul n care p.p. este reprezentat de secreie de la nivelul rectului sau de secreie faringian se vor folosi
numai medii selective. Este necesar o atmosfer de 3-10% CO2, la o temperatur de 35-37C. Coloniile apar
n 24-48 de ore. Gonococul produce colonii de tip S, cu dimensiuni de 0,5-1 mm sau colonii de tip M,
nepigmentate, transparente sau opace. Este de remarcat faptul c n aceeai plac pot aprea pn la cinci tipuri
de colonii (T1-T5), ceea ce poate facilita identificarea. Placa este eliminat n cazul n care nu se dezvolt
colonii, dup 72 de ore.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, eventual
nconjurai de o structur capsular comun, nesporulai. Se poate utiliza i coloraia fluorescent.
Caractere de cultur: Coloniile de gonococ sunt de tip S sau M (vezi punctul 3).
Caractere biochimice:
Metabolizeaz diferii carbohidrai, activitate care poate fi util n identificare. Gonococul metabolizeaz
glucoza dar nu i maltoza.
Exist o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenzimatic a Neisseriilor (ex. Quad Ferm+,
RIM, Minitek, Gonochek II etc).
Caractere antigenice:
n funcie de structura lipooligozaharidului exist 6 serotipuri. Gonococii pot exprima simultan mai multe
structuri antigenic diferite, ceea ce creaz probleme tehnice. Aceste testri se realizeaz n centre de referin.
Prezena gonococului poate fi detectat direct n produsul patologic prin coaglutinare (suspensie de S.
aureus tip Cowan I stabilizat i sensibilizat cu Ac monoclonali antiprotein I din membrana extern a
gonococilor) sau printr-o tehnic imunoenzimatic (cu Ac policlonali).
Se pot utiliza Ac monoclonali cunoscui, pentru identificare gonococului prin tehnica imunofluorescenei
directe.
Caractere utilizate n tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate sau direct pentru p.p.:
Exist diferite tehnici (imunologice, biochimice, de biologie molecular) care sunt practicate numai n
centrele de referin.
Metodele biologiei moleculare au att o specificitate ct i o sensibilitate foarte bun; se pot utiliza fie
pornind de la culturi fie de la p.p.
Sondele nucleotidice
PCR
LCR (Ligase Chain Reaction); aceast metod se poate utiliza pornind de la urin sau de la secreii
vaginale i are un singur dezavantaj, costul ridicat.
5. Antibiograma (testarea sensibilitii tulpinilor izolate n vederea stabilirii tratamentului) este recomandat i
se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice (mediul utilizat este GC suplimentat nutritiv dar fr pulbere
de hemoglobin). Au fost identificate tulpini rezistente la penicilin (fie datorit unui plasmid care codific o blactamaz de tipul TEM, fie datorit unor mutaii cromozomiale). Este necesar testarea producerii de blactamaz (de ex. folosind discuri cu nitrocefin). Determinarea CMI se poate realiza prin metode clasice sau cu
ajutorul testului E (vezi capitolul 14).
sunt bacili gram negativi care nu se pot diferenia prin microscopie optic, mobili cu cili peritrichi (ex.
Salmonella spp., Proteus spp.), sau imobili (ex. Shigella, Yersinia, Klebsiella), nesporulai; unele specii
prezint capsul (ex. Klebsiella pneumoniae).
Sunt germeni nepretenioi care se pot multiplica pe medii simple, aerobi facultativ anaerobi, utilizeaz
fermentativ glucoza cu sau fr producere de gaz, sunt oxidazo-negativi, catalazo-pozitivi, reduc nitraii.
Formeaz colonii de tip S, R (n cazul culturilor vechi) sau M (pentru speciile capsulate), pot fermenta
lactoza (ex. Escherichia coli, Klebsiella) sau sunt lactozo negativi (ex. Salmonella, Shigella, Yersinia). Pentru
izolarea speciilor de enterobacterii putem folosi medii selective, difereniale i selectivo-difereniale. Exist
medii cu selectivitate mai redus care inhib majoritatea bacteriilor gram pozitive i permite dezvoltarea tuturor
enterobacteriilor (ex. mediul Mac Conkey cu sruri biliare n concentraie mic; se poate aduga i cristal
violet), medii cu selectivitate medie care inhib multiplicarea enterobacteriilor lactozo-pozitive (ex. mediul
ADCL cu dezoxicolat, citrat i lactoz, mediul Shigella-Salmonella cu sruri biliare i verde briliant sau mediul
XLD cu xiloz, lizin i dezoxicolat, preferat n multe dintre rile Uniunii Europene) i medii cu selectivitate
nalt (ex. mediul Wilson-Blair cu verde briliant n concentraie crescut).
Caracterele biochimice sunt eseniale pentru identificarea enterobacteriilor. Dup examinarea caracterelor de
cultur (pe mediile selectivo-difereniale se poate identifica i comportamentul enterobacterian n ceea ce
privete fermentarea lactozei), prin repicarea coloniilor suspecte pe medii potrivite (TSI, MIU / MILF,
Simmons etc), n ziua urmtoare se pot examina diferite caractere biochimice (fermentarea zaharurilor,
evidenierea unui anumit metabolit, metabolizarea unui anumit substrat, utilizarea citratului ca unic surs de
carbon, identificarea unor enzime etc) sau alte caractere fenotipice (ex. motilitatea). n momentul de fa exist
baterii de teste i sisteme comerciale care permit examinarea unei game extinse de caractere biochimice (ex.
galeriile API). Dorim s menionm c pentru fiecare test fenotipic exist o serie de variaii care sunt prezentate
procentual n tabele special dedicate.
Un alt aspect foarte util pentru identificare este reprezentat de studierea caracterelor antigenice folosind seruri
cunoscute (preparate pe animale de laborator), cu ajutorul diferitelor reacii Ag-Ac (vezi i capitolele 15-20).
Toate enterobacteriile dein Ag O. Enterobacteriile mobile dein Ag H. Enterobacteriile capsulate dein Ag K.
Salmonella typhi prezint i Ag Vi, Yersinia pestis prezint Ag F1 etc.
Infeciile enterobacteriene sunt destul de variate. Pot fi localizate la nivel digestiv (dizenterie i sindroame
asemntoare dizenteriei, sindroame asemntoare holerei, toxi-infecii alimentare etc), la nivelul tractului
urinar, la nivelul aparatului respirator sau la nivelul sistemului nervos. Infeciile enterobacteriene pot avea i
alte localizri sau pot fi generalizate (de ex. n febra tifoid, febrele paratifoide, pest).
n majoritatea infeciilor produse de enterobacterii diagnosticul este bacteriologic, direct. n febra tifoid
diagnosticul poate fi att bacteriologic ct i imunologic (serologic).
Datorit faptului c n multe dintre aceste infecii produsul patologic este reprezentat de ctre materiile fecale,
n continuare vom discuta examenul bacteriologic al materiilor fecale.
Coprocultura
n multe dintre infeciile produse de enterobacterii, care se manifest prin sindrom diareic, utilizm
coprocultura. n cele ce urmeaz vom discuta coprocultura n general, nu numai din punctul de vedere al unei
infecii enterobacteriene.
Ageni etiologici
Boala diareic acut poate fi de etiologie infecioas i neinfecioas. n continuare vom discuta pe scurt
etiologia infecioas n general, nu numai cea bacterian sau fungic. Este de menionat c marea majoritate a
BDA infecioase au etiologie viral.
Etiologia bacterian include:
Salmonella spp.
Shigella spp.
Klebsiella spp.
ali bacili gram negativi (Aeromonas spp., Alcaligenes spp., Pseudomonas spp. etc)
Bacillus cereus
Campylobacter jejuni
Clostridium botulinum
Giardia lamblia
Trichinella spiralis
Cryptosporidium parvum
rotavirusurile
calicivirusurile
astrovirusurile
coronavirusurile
enterovirusurile
adenovirusurile etc.
Gruparea agenilor etiologici n funcie de mecanismul patogenic
Att din punct de vedere diagnostic ct i pentru tratament poate fi important elucidarea tipului de mecanism
implicat. Astfel, BDA ar putea fi produse prin:
mecanism neinflamator, atunci cnd din punct de vedere microscopic n preparatul ntre lam i lamel
nu se evideniaz leucocite (ex. BDA produse de Vibrio cholerae, ETEC, Clostridium perfringens,
Staphylococcus aureus, Giardia lamblia, rotavirusuri, virusuri Norwalk, Cryptosporidium parvum etc)
mecanism inflamator, atunci cnd din punct de vedere microscopic n preparatul ntre lam i lamel se
evideniaz leucocite polimorfonucleare (ex. BDA produse de Shigella spp., EIEC, Salmonella enteritidis,
Vibrio parahaemolyticum, Entamoeba hystolitica etc)
mecanism de penetrare, atunci cnd din punct de vedere microscopic n preparatul ntre lam i lamel
se evideniaz leucocite mononucleare (ex. BDA sau sindrom diareic produs de Salmonella typhi, Yersinia
enterocolitica etc).
Dup cum se poate remarca, simpla recoltare a produsului patologic urmat de realizarea unui preparat nativ
(vezi capitolul 7) i examinarea microscopic a acestuia pot da informaii importante cu privire la etiologia
probabil precum i atitudinea terapeutic de urmat. Este evident c ntr-o BDA pentru care agenii etiologici
sunt virali sau mecanismul patogenic include aciunea unei toxine este contraindicat administrarea de
antibiotice sau chimioterapice antibacteriene.
Indicaiile coproculturii n bacteriologie
atunci cnd este suspicionat o infecie cu Shigella spp., Vibrio cholerae, E. coli (tipurile patogene),
Campylobacter spp., Yersinia enterocolitica sau Salmonella spp. n special la pacieni cu vrste extreme sau
imunodepresie
atunci cnd BDA prezint riscul extinderii la nivelul unei colectiviti (cree, grdinie, tabere, uniti de
alimentaie public, staii de distribuie a apei potabile etc)
atunci cnd BDA apare la pacieni care au fost tratai cu antibiotice iar sindromul diareic persist i dup
ntreruperea antibioticoterapiei
atunci cnd sindromul diareic persist mai mult de o sptmn sau are loc o recdere
n scopul verificrii strii de sntate a persoanelor care lucreaz n uniti de alimentaie public
(conform normativelor stabilite de ctre ministerul sntii)
scaunul emis spontan reprezint produsul patologic utilizat cel mai frecvent. Defecaia are loc ntr-un
recipient de carton sau ntr-un container din material plastic de unic ntrebuinare (care poate fi apoi
decontaminat i eliminat fr probleme). n acelai timp efectum i examinarea macroscopic a p.p. din
punctul de vedere al mirosului, culorii sau aspectului. Utilizm pentru prelevare linguria recoltorului alegnd
poriuni care permit cu o mai mare ans izolarea agentului patogen (fragmente mucopurulente, poriuni cu
snge, flocoane riziforme etc) sau poriuni diferite dintr-un scaun n care nu se remarc aspectele menionate
anterior. Prelevm o cantitate de aproximativ 1 gram pe care o suspensionm n mediul de transport (minim 2
ml n cazul scaunelor apoase).
tamponul rectal este recomandat n cazul unei infecii cronice cu Shigella spp., atunci cnd suspicionm
portajul de Shigella spp. sau Salmonella spp. Tamponul steril se introduce cu blndee i se preleveaz secreiile
de la nivelul mucoasei rectale, prin rotire, pentru a recolta material din criptele rectale. Apoi introducem.
tamponul n mediul de transport. Pentru a putea nchide recoltorul, tiem n mod corespunztor tija tamponului.
sonda Nelaton se poate utiliza atunci cnd urmrim recoltarea p.p. de la nivelul colonului sigmoid.
Introducem cu blndee sonda pn la nivelul dorit (circa 10-12 cm la copil i respectiv circa 15-20 cm la
adult), adaptm la cellalt capt al sondei o sering i aspirm p.p.de la nivel sigmoidian. Introducem p.p. n
mediul de transport.
n cazul n care p.p. nu poate fi prelucrat imediat sau n maxim 1 or, utilizm un mediu de transport,
transportul la rece (+4 C) sau transportul n mediu de transport meninut la 4 C. Cel mai frecvent utilizm
mediul Cary-Blair (vezi capitolul 9). Acest mediu asigur supravieuirea enterobacteriilor patogene timp de 2448 de ore, inhibnd n acelai timp multiplicarea florei de asociaie. Atunci cnd este suspicionat infecia cu V.
cholerae, apa peptonat alcalin servete n acelai timp drept mediu de transport i mediu de mbogire.
Examinarea materiilor fecale
Materiile fecale sunt examinate macroscopic i microscopic. Din punct de vedere microscopic, de fiecare dat
se vor realiza preparate native (ntre lam i lamel). Materiile fecale sunt suspensionate ntr-o pictur de lugol
sau de albastru de metilen 1% iar preparatul se va examina iniial cu obiectivul 10, apoi cu obiectivul 40. Spre
exemplu, evidenierea a peste 40 PMN / cmp, nsoite de macrofage i hematii, conduce la suspicionarea unei
dizenterii bacteriene. Frotiurile colorate pot fi utile n suspicionarea diagnosticului de enterocolit cu
Campylobacter spp. sau al colitei pseudomembranoase, post antibioticoterapie.
Cultivarea materiilor fecale
n mod obinuit, pentru cultivare vom utiliza 3 medii diferite, respectiv o eprubet cu bulion selenit acid de
sodiu i 2 plci Petri, una cu mediu cu selectivitate sczut (ex. Mac Conkey) i alta cu mediu cu selectivitate
medie (ex. ADCL sau XLD). Aceste medii selective sunt n acelai timp i medii difereniale.
Alegem fragmente caracteristice din p.p. (mucus, puroi etc) i nsmnm 2-3 anse n mediul cu bulion selenit
(mediu de mbogire n special pentru Salmonella spp.). Realizm o suspensie omogen n mediul lichid.
Prelevm o ans (sau o pictur) din suspensie i o depunem pe mediul MacConkey. Modul de nsmnare
difer de cel prezentat n capitolul 10. ntindem p.p. n striuri paralele pe o jumtate de plac, pn aproape de
marginile plcii fr s le atingem. Fr s sterilizm ansa, atingem ultimile 3-4 striuri i dispersm p.p. n alte
striuri paralele, perpendiculare pe primele, pe jumtate din mediul disponibil, pn aproape de marginile plcii
fr s le atingem. Atingnd din nou ultimele 3-4 striuri, dispersm p.p. n mod similar pe mediul nc
nensmnat. Incubm timp de 18-24 de ore la 35-37 C.
n ziua urmtoare, pornind de la tubul cu bulion selenit nsmnm aa cum am menionat mai sus o plac cu
MacConkey i o plac cu ADCL (sau XLD); incubm aceste plci timp de 18-24 de ore la 35-37 C. Examinm
plcile nsmnate precedent n vederea selectrii coloniilor suspecte.
Pe mediul MacConkey coloniile lactozo-pozitive au dimensiuni de 1-3 mm, sunt roii, pot prezenta un halou
opalescent, de regul sunt de tip S dar pot fi i de tip M. Coloniile lactozo-negative au dimensiuni de 1-2 mm,
nu sunt colorate, sunt transparente, de regul sunt de tip S.
Pe mediul ADCL majoritatea bacteriilor lactozo-pozitive sunt inhibate; pot aprea tardiv colonii de dimensiuni
mai mici, roii, de tip S. Coloniile lactozo-negative au dimensiuni de 1-2 mm, nu sunt colorate, sunt
semitransparente, de tip S; dac produc H2S centrul coloniei este de culoare neagr.
De regul urmrim apariia coloniilor lactozo-negative, iar pentru etapele de identificare vom repica (fr a
atinge mediul de cultur) 3 colonii n cazul n care pacientul este copil i 3-5 colonii n cazul n care pacientul
este adult. n cazul n care nu exist colonii lactozo-negative, pentru identificare vom repica (fr s atingem
mediul de cultur) 10 colonii la copil i respectiv 10 colonii la adult (dac se consider c identificarea este
necesar, de ex. n izbucniri epidemice de BDA).
Aadar, dup apariia coloniilor izolate pe mediile selectivo-difereniale trecem la identificarea speciilor
implicate patogenic pe baza caracterelor morfo-tinctoriale, de cultur (vezi capitolul 11), biochimice (vezi
capitolele 11 i 12), antigenice (vezi capitolele 11-20, n special capitolul 17), de patogenitate, pe baza
sensibilitii la bacteriofagi i eventual pe baza unor caractere moleculare. Pentru interpretare vom utiliza
diferitele tabele disponibile n tratatele de specialitate sau recomandrile productorilor n cazul utilizrii unor
sisteme comerciale de diagnostic. Pentru tulpinile considerate a fi implicate patogenic vom realiza studiul
sensibilitii la antibiotice i chimioterapice, de regul prin metode difuzimetrice (antibiograma difuzimetric
standardizat, comparativ, E test).
Alte aspecte particulare urmeaz a fi prezentate n capitolele urmtoare.
coli. Urocultura.
Dup ce o serie de date sugerau asemnarea din punct de vedere molecular ntre speciile genurilor Escherichia
i Salmonella, cunotinele actuale pledeaz pentru o grupare a speciilor din genurile Escherichia i Shigella.
Cu toate acestea, vom prezenta n continuare separat diagnosticul de laborator n infeciile produse de
microorganismele aparinnd genurilor clasice. Genul Escherichia cuprinde germeni comensali care se gsesc
ubicvitar (n ap, pe sol, etc) iar la nivelul intestinului uman au rol n sinteza unor vitamine (simbioz). Sunt
bacili gram negativi mobili sau imobili, aerobi facultativ anaerobi, lactozo pozitivi. Specia tip este reprezentat
de Escherichia coli.
Cu toate c majoritatea tulpinilor de E. coli sunt saprofite sau condiionat patogene (fiind implicate n infecii
oportuniste cu localizri n afara tractului digestiv, spre ex. peritonite, colecistite, infecii ale plgilor,
endometrite, pneumonii etc) exist i anumite tulpini dotate cu caractere patogenice particulare. Dintre aceste
tipuri de E. coli (patotipuri) se disting trei grupri mai importante:
E. coli enteroagregativ (EAggEC) implicat n apariia unei BDA apoase, persistent, cu mucus, n special
la sugari
E. coli enterohemoragic (EHEC), spre exemplu serotipul O157:H7, care elaboreaz dou citotoxine i
este implicat n apariia unei BDA apoas, care poate deveni sever i se poate nsoi de o complicaie grav,
sindromul hemolitic uremic
E. coli enteroinvaziv (EIEC) care elaboreaz una sau mai multe enteroxine producnd un sindrom
dizenteriform
E. coli enteropatogen (EPEC) care determin diaree la copilul mic, uneori de gravitate maxim (ex.
diaree malign la nou nscut)
E. coli enterotoxigen (ETEC) care elaboreaz dou enterotoxine (termolabil i termostabil) i produce
un sindrom holeriform
E. coli aderent difuz (DAEC) care produce diaree apoas, persistent, la copii n vrst de 1-5 ani
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute. Produsul
patologic este reprezentat de obicei de scaunul diareic dar am putea recolta i lichid de vrstur sau un anumit
aliment incriminat. Materiile fecale se examineaz macroscopic i se trimit ctre laborator aa cum am
menionat n capitolul precedent. n continuare vom discuta diagnosticul unei infecii produs de EHEC (ex.
O157:H7) dar, subliniem faptul c n practica medical, pornind de la p.p. reprezentat de materiile fecale,
putem izola orice microorganism implicat etiologic n BDA, dup caz. Materiile fecale pot avea aspect
hemoragic iar la examinarea macroscopic a p.p. putem observa prezena unor lambouri de mucoas epitelial.
Transportul se va realiza aa cum am menionat n capitolul nr. 28.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea preparatului nativ, ntre lam i lamel;
remarcm prezena hematiilor i leucocitelor PMN.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi capitolul nr. 28). n vederea izolrii EHEC, pe
lng mediile menionate n capitolul precedent se recomand utilizarea mediului MacConkey cu D-sorbitol,
deoarece spre deosebire de majoritatea tulpinilor de E. coli EHEC nu fermenteaz sorbitolul (sau l fermenteaz
tardiv). n acest sens, coloniile suspecte, repicate (fr a atinge mediul) n vederea identificrii vor fi necolorate,
cu dimensiuni de 1-3 mm, de regul de tip S (coloniile sorbitol-pozitive vor avea o culoare roz).
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere de cultur:
Caractere biochimice (pentru EHEC se vor examina la nivelul centrului de referin; procesarea unor
culturi n care este prezent EHEC necesit msuri suplimentare de siguran):
Fermenteaz glucoza (cu producere de gaz), sunt lactozo-pozitivi, nu fermenteaz (sau fermenteaz
tardiv) sorbitolul, nu produc H2S
Pot produce indol, sunt ureaz-pozitivi, mobili (dar exist i tulpini imobile) etc.
Se pot folosi mediile multi-test convenionale (TSI, MIU, MILF) sau galeriile multi-test API 10 S, API
20 E, API Rapid 20 E sau alte variante
Testarea caracterelor antigenice: Ag somatice pot fi identificate prin reacii de aglutinare sau latex
aglutinare (se pot utiliza i seruri monovalente anti O157 i respectiv anti H7); toxinele pot fi identificate prin
tehnici de tip ELISA, latex aglutinare, latex aglutinare pasiv inversat (VET-RPLA), sau prin seroneutralizarea
efectului citotoxic pe celule Vero
Testarea caracterelor de patogenitate: EHEC produce enterocolit hemoragic letal la purcel; se poate
studia efectul citopatic pe celule Vero
Teste de biologie molecular (PCR, detectarea genelor de patogenitate pornind de la p.p. sau de la
coloniile izolate pe MacConkey cu D-sorbitol).
5. Antibiograma este recomandat de regul numai pentru supravegherea apariiei fenomenului de rezisten la
antibiotice i chimioterapice; se realizeaz prin metode difuzimetrice.
Urocultura
Tractul urinar este n mod normal necontaminat, n schimb uretra distal poate prezenta o flor microbian
foarte variat, fiind contaminat cu microorganisme provenind din zona genital sau de la nivelul colonului.
Dintre aceste microorganisme putem izola de la nivelul uretrei distale stafilococi coagulazo-negativi, E. coli,
Klebsiella spp., Proteus spp., bacili difteromorfi, enterococi, streptococi, neisserii saprofite, Mycoplasma spp.,
Ureplasma spp. sau Fusobacterium spp. La acelai nivel ar putea fi identificate i tulpini de Candida spp.,
Clostridium spp., diferii coci gram pozitivi sau gram negativi anaerobi, lactobabili, mycobacterii
netuberculoase, stafilococi aurii etc. Colonizarea microbian a uretrei distale explic motivul pentru care n
marea majoritate a cazurilor vom realiza urocultura cantitativ.
Cu toate c indiferent de grija cu care vom recolta p.p. (urina) acesta va fi contaminat, prin aprecierea
cantitativ a numrului de uniti formatoare de colonii n urina proaspt recoltat, din mijlocul jetului, putem
s precizm dac pacientul are sau nu infecie urinar. Mai multe studii au artat c atunci cnd se
demonstreaz prezena a 105 bacterii / ml, aceasta indic o infecie a tractului urinar (ITU) n aproximativ 80%
dintre cazuri n timp ce o valoare de 104 bacterii / ml indic ITU n mai puin de 30% dintre cazuri.
Datorit acestor rezultate, n practica medical se consider c ne aflm n situaia unei ITU atunci cnd
numrul de bacterii / ml urin este 105 / ml.
Cu toate acestea, dorim s subliniem c interpretarea rezultatului nu trebuie realizat mecanic i decizia final
n ceea ce privete identificarea bacteriei, efectuarea testrii sensibilitii la antibiotice i respectiv redactarea
buletinului de analiz ar trebui s fie luat avnd n vedere aspectul macroscopic al urinii (ex. purulent),
rezultatul examenului microscopic al sedimentului urinar (ex. prezena de PMN), numrul de uniti formatoare
de colonii / ml urin i elemente clinice (ex. disurie, miciuni mai frecvente, febr), cu alte cuvinte colaborarea
ntre clinic i laborator este esenial. Spre exemplu, n cazul unor elemente sugestive, chiar dac numrul de
bacterii este de 104 / ml, putem lua decizia s repetm urocultura iar izolarea aceleiai bacterii poate indica
prezena ITU. Pe de alt parte, izolarea a peste 104 uniti formatoare / ml n cazul stafilococilor sau levurilor
este luat n considerare iar prezena n urin a Listeria monocytogenes la femeile nsrcinate sau prezena n
urin a Salmonella typhi sunt semnificative indiferent de numrul UFC / ml.
Pentru a sublinia nc o dat importana etapei de recoltare i transport a urinei amintim faptul c urina
reprezint un foarte bun mediu de cultur pentru majoritatea bacteriilor care pot contamina p.p. iar o prob de
urin care are iniial (n momentul recoltrii) 103 bacterii / ml, dup 2 ore la temperatura camerei va conine 105
bacterii / ml.
Clasificarea ITU se poate face dup mai multe criterii. ITU joase includ cistita dar dup unii autori i uretrita,
prostatita i epididimita. ITU nalte includ pielonefrita acut, necroza papilar (complicaie a pielonefritei acute
sau care poate aprea n absena infeciei), abcesul renal sau pielonefrita cronic (dup unii autori). Invazia
tractului urinar poate avea loc pe cale ascendent, limfatic sau hematogen.
Exist o serie de factori care favorizeaz apariia ITU, dintre care amintim: obstruciile care duc la staz urinar
(adenom sau carcinom de prostat, tumori de vecintate, stricturi uretrale sau ale colului vezical, compresiune
uretral n timpul sarcinii, corpi strini, calculi urinari, cateterizare urinar etc), refluxul vezico-ureteral, ali
factori funcionali.
Microorganismele mai frecvent implicate n producerea unei infecii a tractului urinar sunt n ordine
descresctoare E. coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Enterobacter
aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii, Citrobacter
diversus, Enterococcus faecalis, stafilococii coagulaz-negativi. Adenovirusurile pot determina cistite
hemoragice la copii. Mai rar, n ordine descresctoare etiologia ITU poate fi reprezentat de Staphylococcus
aureus, Acinetobacter calcoaceticus, streptococi b-hemolitici din grupele A, B, C sau G, Morganella morgani,
Providencia rettgeri, P. stuartii, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Candida albicans, Salmonella
spp., Corynebacterium urealyticum. Cu privire la E. coli, cel mai frecvent microorganism implicat n ITU,
exist anumite grupuri uropatogene, spre ex. O1, O2, O7 etc. n mod cert, exist diferene n ceea ce privete
etiologia ITU pe grupe de vrst, n funcie de sex sau la pacienii spitalizai n comparaie cu pacienii pentru
care se solicit urocultura n ambulatoriu.
Recoltarea i transportul produsului patologic
n ITU se pot recolta urin, snge (ex. n pielonefrita acut) sau chiar i LCR. n continuare vom discuta despre
recoltarea i transportul urinei.
n afar de recomandrile generale menionate anterio, trebuie s subliniem unele aspecte particulare
n cazul n care nu se poate recolta prima urin de diminea, trebuie ateptat pentru recoltare 3-4 ore
dup miciune
Este preferabil ca recoltarea s aib loc ntr-un spaiu corespunztor n apropiere de laborator iar
personalul medical trebuie s explice i eventual s asiste recoltarea
Este contraindicat recoltarea urinei la domiciliu (pot exista erori de recoltare iar prelungirea timpului de
transport va conduce la multiplicarea bacteriilor, aa cum am menionat mai sus); dup recoltare, n cazul n
care urina nu este prelucrat imediat (sau n cel mult 30 de minute dup recoltare), p.p. trebuie meninut la
temperatura frigiderului iar transportul trebuie realizat la +4 C
De regul se recolteaz urina din mijlocul jetului; dup splarea organelor genitale i a perineului, prin
miciune se elimin circa 100 ml urin (ndeprtnd astfel o parte a germenilor de la nivelul uretrei distale) i
abia apoi se recolteaz 20-50 ml (preferabil 50 ml) urin n recipientul steril, dup care miciunea continu
Exist i alte tehnici de recoltare, neinvazive sau invazive (puncie i aspiraie suprapubian, cateterizare
uretral, cu riscurile respective).
Examinarea macroscopic i microscopic a urinei
Realizm iniial examenul macroscopic; p.p. poate fi tulbure, opalescent, poate prezenta un anumit miros etc. n
vederea examenului microscopic al urinei omogenizm urina prin rsturnare, de 2-3 ori. Punem o pictur de
urin pe lam, acoperim cu o lamel i examinm cu microscopul cu imersie (sau microscopul cu contrast de
faz). n cazul n care identificm prezena a cel puin unei bacterii pe fiecare cmp, n fiecare dintre 5 cmpuri
succesive, putem cu o bun aproximaie s considerm c avem o bacteriurie de 105 bacterii / ml. Alternativ se
poate utiliza preparatul colorat Gram. Este necesar s apreciem concomitent i prezena piuriei (peste 10
leucocite / mm3 de urin). Au fost imaginate o serie de alte teste pentru aprecierea piuriei i bacteriuriei, spre
exemplu testul Griess (detectarea nitriilor n urin), detectarea esterazei leucocitare, teste bioluminiscente etc.
Piuria i bacteriuria trebuie interpretate n contextul clinic.
Examenul sedimentului urinar permite vizualizarea de celule epiteliale (malpighiene, vezicale, uretrale etc),
celule sanguine (leucocite, hematii), cilindrii urinari (hialini, leucocitari, eritrocitari, epiteliali, granulari etc),
cristale urinare, levuri (eventual nmugurite, cu blastoconidii), Trichomonas vaginalis etc; examenul
sedimentului urinar este foarte util i trebuie realizat de fiecare dat.
Cultivarea urinei
n mod obinuit, pentru cultivare putem utiliza 3-4 medii diferite. Din motive de economie am putea nsmna
o jumtate de plac cu mediu MacConkey (fr cristal violet), o jumtate de plac cu geloz-snge i cte un
sector de plac cu mediu agar telurit i respectiv agar cu eozin i albastru de metilen (EMB) n cazul n care
examenul microscopic al urinei este pozitiv. Dac examenul microscopic este negativ, nsmnm doar o
jumtate de plac Petri cu mediu MacConkey.
O variant de nsmnare pentru mediile MacConkey i geloz-snge este utilizarea unei anse calibrate de 1 l
cu ajutorul creia prelevm urin prin atingerea suprafeei p.p. dup omogenizare. nsmnm iniial un striu
pe centrul jumtii de plac dup care ntindem p.p. n striuri paralele, perpendiculare pe primul striu. n final
fr sterilizm ansa ntindem p.p n striuri paralele n unghi de 45 fa de striurile precedente. Dup o incubare
de 18-24 ore la 35-37 C, nmulind cu 1000 numrul de UFC dezvoltate, putem aprecia care este numrul de
bacterii / ml de urin.
Frecvent este utilizat nsmnarea urinei dup diluare (ex. 1/100) cu ajutorul pipetei gradate. nsmnm de
ex. pe o plac cu mediu MacConkey 0,1 ml de urin diluat 1/100, incubm n condiiile cunoscute i dup
apariia coloniilor calculm numrul de bacterii / ml prin nmulirea numrului de UFC inversul diluie
inversul volumului nsmnat.
Interpretarea rezultatelor uroculturii cantitative
Izolarea unei bacterii cu o concentraie de peste 105 / ml de urin confirm ITU la brbat sau la femeie
(cu simptome caracteristice); n cazul c pacienta este asimtomatic, certificarea ITU este dat de izolarea
aceleai bacterii n a doua prob de urin
Izolarea a dou bacterii diferite, fiecare cu o concentraie de peste 105 / ml de urin, impune repetarea
recoltrii i nsmnrii; n cazul n care rezultatul este similar i pentru a doua prob de urin este posibil
ITU mixt (n caz contrar este o foarte probabil contaminare)
Izolarea a trei bacterii diferite, chiar i n cazul n care concentraiile pentru fiecare n parte depesc 105 /
ml de urin, impune repetarea analizei; extrem de probabil este vorba de o contaminare sau de un p.p. recoltat
cu mai mult timp n urm i meninut la temperatura camerei i nu la frigider
Izolarea unei bacterii cu o concentraie de 104 / ml de urin conduce la recomandarea repetrii analizei
(exist i unele excepii, n care rezultatul este considerat pozitiv, spre ex. pentru levuri n concentraie de peste
104 / ml de urin, stafilococii coagulazo-negativi n concentraie de peste 5104 / ml de urin etc)
Lipsa multiplicrii bacteriene sau dezvoltarea de UFC n concentraie de 103 / ml de urin reprezint o
urocultur negativ
Dorim s subliniem din nou c rezultatul microbiologic trebuie s fie analizat n contextul clinic i corelat
cu rezultatul microscopiei iar n cazul anumitor bacterii (ex. Salmonella typhi) rezultatul este pozitiv indiferent
de concentraia UFC / ml de urin.
n cazul unei uroculturi pozitive, bacteria izolat se identific (pe baza caracterelor morfotinctoriale, de cultur,
biochimice, alte caractere) i se testeaz sensibilitatea la antibiotice i chimioterapice, de regul prin metoda
difuzimetric (vezi capitolul 14).
Exist o serie de ncercri pentru optimizarea diagnosticului ITU, inclusiv abordarea unor tehnici miniaturizate.
Dintre acestea vom aminti metoda imaginat n Institutul de boli infecioase Matei Bal (prof. Florin
Cruntu), metoda Uriline etc. Spre exemplu ultima dintre metode utilizeaz o lam de plastic acoperit pe
ambele pri cu mediu de cultur, protejat ntr-un tub de plastic.
Principiu:
Mediul CLED de pe prima parte a lamei (Cysteine - Lactose - Electrolyte Deficient agar) are culoare verde i
permite numrarea coloniilor bacteriene (indirect a numrului de UFC / ml urin) i identificarea prezumtiv.
Concentraia sczut de electrolii inhib invazia Proteus spp. Mediul MacConkey fr cristal violet de pe a
doua parte a lamei are culoare roz; inhib majoritatea bacteriilor gram pozitive.
Tehnica de lucru:
Deurubm capacul i extragem lama fr s atingem suprafaa agarului. Imersm lama n proba de urin
recoltat (dac urina nu este suficient cantitativ, repartizm p.p. pe cele 2 pri ale lamei cu ajutorul unei pipete
Pasteur). ndeprtm excesul de urin pe o hrtie de filtru curat i punem la loc n dispozitiv lama nsmnat.
Incubm n poziie dreapt, timp de 18-24 ore la 35-37C. A doua zi citim rezultatele, comparnd numrul de
colonii aprute pe mediul CLED cu modelul productorului.
Interpretare:
n cazul n care numrul de UFC / ml este mai mare de 105 realizm teste suplimentare pentru identificare i
respectiv antibiograma. Alte elemente privind interpretarea au fost prezentate anterior.
Control de calitate:
Pregtim o suspensie bacterian n soluie salin fiziologic steril cu 105-106 bacterii pe ml din fiecare
dintre tulpinile de referin
Inoculm suspensiile astfel pregtite pe suprafaa mediilor de cultur Uriline, iar dup 18-24 ore incubare
citim i interpretm rezultatele
Staphylococcus aureus: apar colonii doar pe mediul CLED. Fermentarea lactozei este indicat de
prezena culorii galbene n jurul coloniilor dezvoltate.
Proteus mirabilis: apar colonii translucide iar culoarea CLED este albastr; pe Mac Conkey apar colonii
incolore.
Shigella
Genul Shigella ar trebui s fac parte conform studiilor de biologie molecular dintr-un gen care include i
Escherichia spp., genul Escherichia-Shigella. Cu toate acestea, n momentul actual este acceptat tratarea
separat a celor dou genuri nrudite. Pe baza structurii antigenice au fost difereniate patru subgrupe (A-D)
respectiv Shigella dysenteriae (13 serotipuri), S. flexneri (6 serotipuri care se pot subdiviza n sub-serotipuri), S.
boydii (18 serotipuri) i S. sonnei (1 serotip cu 2 faze sau variante, respectiv R i S).
Genul Shigella include bacili gram negativi, imobili, cu dimensiuni de 0,5-0,8 / 2-3, nesporulai, necapsulai,
aerobi facultativ anaerobi, glucozo pozitivi fr producere de gaz oxidazo negativi, lactozo negativi. Subgrupele
se pot diferenia de ex. pe baza fermentrii manitei (subgrupul A este manito negativ). Cresc pe medii simple i
produc colonii de tip S n 24 de ore.
Microorganismele din genul Shigella sunt patogene prin multiplicare i invazivitate. n cazul serotipului 1 din
subgrupul A (Sh. shiga) este implicat i toxigeneza. Exotoxina shiga afecteaz att intestinul ct i sistemul
nervos central (putnd conduce la apariia unor fenomene de meningism sau chiar pierderea strii de contien,
pn la com). Fa de animalele de experien are efect letal.
Infeciile cu Shigella spp. sunt de regul limitate la nivelul tractului intestinal. Dizenteria poate aprea dup
ingestia a numai 10-100 de bacterii, care se localizeaz, se multiplic i invadeaz epiteliul intestinal (pot
aprea abcese la nivelul peretelui intestinului gros, la nivelul ileonului terminal, abcese care evolueaz spre
ulceraie, necroz, hemoragie). Dup o perioad de incubaie de circa 2-5 zile, n cazul unei dizenterii tipice
apar brusc febr, diaree apoas, dureri abdominale intense. Ulterior se elimin scaune foarte numeroase (20-40 /
zi), nefecaloide, cu mucus, puroi i snge, nsoite de colici intestinale i tenesme rectale. Starea general se
nrutete (mai grav n cazul unei infecii produse de Sh. shiga). n lipsa tratamentului corespunztor (n
special n lipsa reechilibrrii hidro-electrolitice) evoluia poate fi fatal. n afar de dizenterie, Shigella spp.
poate produce i toxiinfecii alimentare de tip infecios.
Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic (direct) i trebuie fcut de urgen datorit
implicaiilor posibile ale unei dizenterii.
1.
Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi
capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul
patologic este reprezentat de materii fecale, dar s-ar putea recolta i lichid de vrstur. La nceputul bolii este
mai uor s izolm bacteria patogen, deoarece iniial se elimin circa 103-109 bacterii / gram de materii fecale.
Din punct de vedere macroscopic materiile fecale pot fi n cantitate mic, coninnd mucus, puroi i snge
(uneori sngele nu este vizibil macroscopic). Recomandm recoltarea i cultivarea n special a fragmentelor
care conin mucus, puroi i snge. Transportul trebuie s fie realizat rapid, dar este preferabil nsmnarea la
patul bolnavului. Dac aceast recomandare nu poate fi urmat, recomandm folosirea unui mediu de transport,
mediul bacteriostatic Cary-Blair. O alt variant de recoltare posibil (de ex. n cazuri atipice sau pentru
controlul strii de purttor) este reprezentat de utilizarea sondei Nelaton introdus n colonul sigmoid (10-15
cm la copil sau 15-20 cm la adult) aspirnd p.p. cu ajutorul unei seringi. Materiile fecale se vor suspensiona n
soluie cloruro-sodic sau n mediul Cary-Blair. Exist i posibilitatea de a recolta p.p. atunci cnd se presupune
diagnosticul dizenteriei bacteriene prin rectosigmoidoscopie.
2.
Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspt ntre lam i
lamel (nu efectum frotiuri din acest tip de produsul patologic, n cazul n care suspectm o infecie cu
Shigella spp.). Preparatul se examineaz la microscopul optic cu obiectivul 40. Evidenierea a numeroase PMN
vine n sprijinul stabilirii mecanismului bolii diareice, iar un procent de peste 75% PMN nsoit de prezena
hematiilor este sugestiv pentru dizenteria bacterian. Anumii autori recomand utilizarea imunofluorescenei
directe; examenul este costisitor n special datorit existenei numeroaselor serotipuri.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Se vor utiliza mediile de
cultur recomandate, prezentate n capitolul 28. Shigella se dezvolt pe mediile slab i moderat selective i nu
se multiplic pe mediile nalt selective. n cazul apariiei unor colonii lactozo negative, repicm 3-5 colonii
izolate pe mediile multitest (TSI, MIU, MILF) sau procedm conform protocolului de lucru pentru galeriile tip
API.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere de cultur:
produc colonii de tip S, lactozo negative, semitransparente, cu diametrul de 1-2 mm pe MacConkey sau
ADCL (S. sonnei poate produce colonii care devin roz deoarece poate fermenta tardiv, lactoza) i roii pe XLD
Caractere biochimice:
se pot investiga analiznd rezultatele obinute pe mediile multitest sau pe galeriile API; caracterele
biochimice sunt utile i n diferenierea subgrupelor genului
microorganismele din genul Shigella sunt glucozo pozitive, fr producere de gaz, lactozo negative, nu
produc H2S, imobile, ureaz negative, indol negative
Caractere antigenice:
se utilizeaz seruri imune polivalente pentru subgrup sau seruri imune specifice de tip, prin reacii de
aglutinare pe lam, conform unor scheme stabilite
n cazul n care o tulpin izolat are un comportament biochimic sugestiv dar reacia de aglutinare este
negativ, trebuie s realizm o suspensie (destul de dens) din respectiva tulpin, pe care o meninem timp de
30-60 minute la o temperatur de 100C i ulterior repetm reacia de aglutinare
Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza n studii epidemiologice sau n scop de
cercetare, fiind rezervat laboratoarelor de referin; schemele de lizotipie au fost utilizate n special pentru S.
flexneri 2a i S. sonnei
testul Sereny (producerea cheratoconjunctivitei la cobai); repicm colonia suspect pe geloz nclinat iar
dup 8 ore, introducem o ans de cultur sub pleoapa unui cobai; dup 12-24 ore n cazul unei reacii pozitive
apare congestie conjunctival, secreie purulent i opacifiere a corneei cu accentuarea acestor fenomene i
evoluie spre cheratoconjunctivit (testul poate fi pozitiv i n cazul unor tulpini de Escherichia coli)
tehnici ale biologiei moleculare (stabilirea profilului plasmidic, ribotipia, sondele ADN etc).
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice) se realizeaz prin metoda
difuzimetric standardizat, n special n scopul supravegherii apariiei unor tulpini rezistente la medicamentele
antimicrobiene dar i pentru stabilirea tratamentului antimicrobian corespunztor.
Salmonella. Hemocultura.
Exist mai multe clasificri pentru microorganismele care aparin genului Salmonella. Una dintre clasificrile
acceptate (Ewing) grupeaz genul n 3 specii i anume S. typhi (patogen doar pentru om), S. cholerae suis
(patogen la porc, ocazional i la om) i S. enterica (produce boli diareice la om i la animal, cu aproximativ
2000 de serotipuri). Este nc bine cunoscut schema de identificare serologic (Kaufmann-White) care
submparte genul Salmonella n grupe care includ foarte multe specii, spre ex. grupul A (S. paratyphi A),
grupul B (S. paratyphi B, S. typhimurium), grupul C (S. paratyphi C), grupul D (S. typhi, S. enteritidis) etc.
Genul Salmonella include bacili gram negativi, cu dimensiuni de 2-4 mm / 0,4-0,6 mm, mobili cu cili peritrichi
(cu excepia S. galinarum pullorum), necapsulai, nesporulai, glucozo-fermentativi (cu producere de gaz cu
excepia S. typhi), nu fermenteaz lactoza, produc H2S (exist i excepii) i utilizeaz citratul ca unic surs de
carbon.
Infeciile produse de microorganismele care aparin genului Salmonella se pot mpri n salmoneloze minore
(enterocolite, toxiinfecii alimentare) i salmoneloze majore (febra tifoid, febre enterale).
Enterocolita (gastroenterita, toxiinfecia alimentar de tip infecios) apare dup ingestia a 105-108 salmonele.
Febra tifoid (febra enteral) poate aprea dup ingerarea a circa 103 salmonele. Febra tifoid este o boal grav
care n lipsa tratamentului poate conduce la deces. S. typhi trece prin i printre celulele epiteliale de la nivelul
ansei ileocecale, se multiplic activ n submucoas i este fagocitat de macrofage unde supravieuiete i
continu s se multiplice. Microorganismele trec apoi n ganglionii mezenterici, n canalul toracic i conduc la
apariia unei prime bacteriemii urmat de invadarea altor organe i formaiuni limfatice. Multiplicarea
important, n special la nivelul organelor cu sistem reticulo-endotelial bine reprezentat (ficat, splin), este
urmat de o a doua bacteriemie masiv i de eliminarea prin bil i / sau urin. La sfritul primei sptmni de
boal, S. typhi se elimin din foliculii intestinali i prin bil n materiile fecale, excreia prelungindu-se mult
timp n convalescen. Pot aprea angiocolit, colecistit; bolnavul poate deveni purttor (ex. la nivelul
veziculei biliare) dup vindecare.
n cazul afeciunilor strict digestive, diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct. n cazul
afeciunilor sistemice, diagnosticul poate fi bacteriologic i / sau serologic.
Diagnosticul de laborator microbiologic n infeciile cu localizare digestiv
Diagnosticul bacteriologic (direct) cuprinde etapele cunoscute.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute. Produsul
patologic este reprezentat de obicei de materiile fecale dar am putea recolta i lichid de vrstur, un anumit
aliment incriminat etc. Materiile fecale se examineaz macroscopic i se trimit ctre laborator aa cum am
menionat n capitolul 28.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea preparatului nativ, ntre lam i lamel;
putem remarca prezena granulocitelor mononucleare.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care urmeaz a fi identificat (vezi capitolele 9-10 i 28). Pentru izolarea i
identificarea agentului patogen p.p. este nsmnat pe un mediu lichid de mbogire (bulion selenit) i pe dou
medii gelozate selectivo-difereniale (MacConkey i ADCL / XLD). Dup o incubare de 18-24 ore la 35-37 C,
pe mediile solide pot aprea colonii bacteriene suspecte (lactozo-negative) din care obinem cultura pur n
scopul identificrii i stabilirii sensibilitii la antibiotice. Pentru a crete ansa depistrii agentului cauzal,
cultura de 18-24 ore n bulion selenit va fi trecut pe mediile solide (pe MacConkey i ADCL / XLD).
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic izolat n cultur pur se va realiza pe baza mai multor
caractere:
Caractere de cultur:
cazul n care a fost folosit i mediul Wilson Blair (foarte selectiv, care nu include lactoz) coloniile sunt negre,
cu margini neregulate i halou metalic.
Fermenteaz glucoza (cu producere de gaz), sunt lactozo-negativi, produc H2S, (exis i excepii) i
utilizeaz citratul ca unic surs de carbon.
Pentru punerea n eviden a caracterelor biochimice se pot folosi mediile multi-test convenionale (TSI,
MIU, MILF) sau galeriile multi-test (API 10 S, API 20 E, API Rapid 20 E sau alte variante).
Caractere antigenice:
se utilizeaz seruri imune specifice, n scheme care folosesc iniial Ac anti-O i ulterior, n funcie de
rezultatul obinut, Ac anti-H, prin reacii de aglutinare pe lam conform schemei Kauffmann-White (exist
tabele i scheme care trebuie respectate);
n cazul n care o tulpin izolat are un comportament biochimic sugestiv dar reacia de aglutinare este
negativ, trebuie s realizm o suspensie (destul de dens) din respectiva tulpin, pe care o meninem timp de
30-60 minute la o temperatur de 100C i ulterior repetm reacia de aglutinare.
Alte teste ce pot fi realizate n scopul identificrii germenilor, de regul la nivelul centrului de referin
teste de biologie molecular (determinarea profilului plasmidic, ribotipia, studiul unor secvene specifice
la nivel cromozomial etc).
5. Antibiograma este recomandat de regul numai n cazul pacienilor cu vrste extreme sau pentru
supravegherea apariiei fenomenului de rezisten la antibiotice i chimioterapice; se realizeaz prin metode
difuzimetrice.
Diagnosticul de laborator microbiologic n febrele enterale este bacteriologic i / sau serologic.
Diagnosticul definitiv (cert) este reprezentat de izolarea i identificarea S. typhi n p.p.
Diagnosticul bacteriologic, direct respect etapele cunoscute ale acestui tip de diagnostic, cu anumite
particulariti. Multe din aspecte au fost prezentate anterior.
Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi
capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul
patologic este reprezentat n prima sptmn de snge, ulterior putem recolta materii fecale, urin, lichid
biliar, mduv hematogen etc. Hemocultura va fi discutat n cele ce urmeaz. n cazul n care p.p. este
reprezentat de materii fecale, respectm ceea ce am prezentat mai sus, cu o serie de sublinieri:
- Sunt n studiu metode de identificare a prezenei S. typhi, direct n p.p. (ex. materii fecale) prin latexaglutinare
i PCR
- Coloniile de S. typhi pot s nu prezinte centrul de culoare neagr pe ADCL sau XLD.
- S. typhi n general nu produce gaz din glucoz iar H2S poate fi produs n cantiti mici i tardiv; nu folosete
citratul ca unic surs de carbon i este ornitindecarboxilaz negativ.
- Pentru identificarea Ag O poate fi necesar o inactivare prealabil (termic, folosind o substan acid sau
aceton). Pentru identificarea Ag H poate fi necesar inactivarea cu formaldehid. Prezena Ag Vi poate crea
probleme n ceea ce privete identificarea Ag O.
- Dei lizotipia este o metod laborioas, de multe ori se dovedete superioar din punctul de vedere al
rezultatelor obinute n comparaie inclusiv cu metode ale biologiei moleculare.
- Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice este recomandat pentru fiecare tulpin de S. typhi
izolat.
Diagnosticul serologic
Unii autori consider c nici unul dintre testele utilizabile n diagnosticul serologic nu este suficient de specific,
sensibil i rapid. Diagnosticul serologic se realizeaz respectnd principiile generale ale acestui tip de
diagnostic. Reacia Widal a fost imaginat n finalul secolului al IX-lea i standardizat la mijlocul secolului
XX. Serodiagnosticul Widal, folosind culturi vii de S. typhi nu se mai practic astzi. Cea mai cunoscut
metod utilizabil actual este analiza seric cantitativ, realizat tot prin tehnica aglutinrii n tuburi. Utilizm
serii separate de tuburi, cte o serie pentru fiecare Ag cunoscut folosit, serul de cercetat fiind diluat
corespunztor protocolului de lucru. Atunci cnd presupunem o febr tifoid sau paratifoid utilizm spre ex. 6
serii de tuburi, cu Ag cunoscute i inactivate, pentru a evidenia Ac anti-O (TO S. typhi, AO S. paratyphi A,
BO S. paratyphi B), i anti-H (d S. typhi, a S. paratyphi A, b S. paratyphi B). Dup realizarea diluiilor,
incubm tuburile pentru Ac anti-O timp de 18-20 ore la 52 C urmat de 10 minute la temperatura camerei iar
tuburile pentru Ac anti-H timp de 2 ore la 52 C urmat de 10 minute la temperatura camerei i citim reacia. Un
titru de 1/250 n cazul Ac anti-O i respectiv 1/2500 n cazul Ac anti-H ar putea fi sugestiv. Creterea de 4 ori a
titrului, la 2 determinri succesive (interval de 7-10 zile) poate confirma suspiciunea de diagnostic. La
persoanele vaccinate n antecedente diagnosticul serologic nu poate fi utilizat (rezultatele nu sunt interpretabile)
i este strict necesar izolarea n culturi a S. typhi.
Att n cazul bolnavilor, dar mai ales n cazul convalescenilor i purttorilor a fost recomandat reacia de
aglutinare n tuburi pentru identificarea prezenei i titrului Ac anti-Vi. Se consider c un titru de peste 1/40
poate fi considerat sugestiv.
Hemocultura
Arborele circulator este n mod normal steril.
Bacteriemia / fungemia reprezint prezena tranzitorie i de regul intermitent a bacteriilor / fungilor n
torentul circulator. O bacteriemie / fungemie se poate nsoi de creterea temperaturii i / sau frison precum i
de alte semne sau simptoame. Dintre situaiile care pot conduce la apariia unei bacteriemii putem aminti:
realizarea unei extracii dentare, periajul mai energic al dinilor folosind o periu neadecvat (prea dur)
precum i multe acte medicale sau medico-chirurgicale invazive realizate la diferite niveluri anatomice
(cateterisme etc).
Bacteriemia / fungemia nsoesc infeciile generalizate cu bacterii / fungi. Exist o mare varietate de
microorganisme capabile s produc infecii generalizate (bacterii aerobe i anaerobe, fungi, virusuri, parazii).
Trebuie ns menionat c, destul de frecvent, o hemocultur pozitiv nu indic de fapt agentul etiologic al
infeciei ci o contaminare survenit pe parcursul diagnosticului microbiologic. Dintre agenii contaminani
ntlnii mai frecvent putem aminti: Staphylococcus epidermidis, S. hominis, Micrococcus luteus,
Corynebacterium spp., Brevibacterium epidermidis, Propionebacterium acnes, Acinetobacter calcoaceticus,
streptococii non-hemolitici etc. Este important utilizarea noiunilor de microbiologie clinic care trebuie
foarte bine cunoscute de ctre medicul microbiolog n colaborare cu restul membrilor echipei complexe, pentru
stabilirea n mod corespunztor a etiologiei infecioase i atitudinii de urmat.
Avnd n vedere cele menionate mai sus, dorim s subliniem i alte dou dintre aspectele importante de care
trebuie s se in seama n realizarea unei hemoculturi:
endocardit acut recoltm 3 hemoculturi din 3 sedii diferite, pe parcursul a 1-2 ore
endocardit subacut recoltm minim 2 hemoculturi din 2 sedii diferite (vezi i mai sus) la un interval
mai mare de 15 minute
sepsis recoltm 3 hemoculturi din sedii diferite, pe parcursul a 10 minute (ideal ar fi, pentru toate
cazurile menionate, s recoltm sngele cu circa 30 minute nainte de vrful febril, acest moment ar coincide
cu cea mai mare concentraie de microorganisme n torentul circulator, dar acest moment este dificil de
precizat)
febr de origine necunoscut recoltm 2-3 hemoculturi, din sedii diferite, la un interval de timp de 4560 minute etc.
n ceea ce privete al doilea aspect, avnd n vedere faptul c de regul n cursul bacteriemiilor / fungemiilor
numrul de uniti formatoare de colonii / ml de snge este destul de redus, trebuie s recoltm un volum de
snge adecvat (pentru fiecare hemocultur n parte). Astfel, vom recolta circa 20 ml de snge n cazul adulilor
i 1-5 ml de snge n cazul nou-nscuilor, sugarilor i copiilor mici (deoarece numrul de UFC / ml poate fi de
circa 3 ori mai mare la aceste grupe de vrst).
Atunci cnd este necesar realizarea unei hemoculturi (de fapt a unui set de hemoculturi) este necesar s ne
gndim i la urmtoarele aspecte:
sngele, fiind un produs biologic n mod normal steril, vom izola cel mai adesea un singur agent infecios
(dar exist i posibilitatea unor asocieri)
dintre agenii etiologici cu semnificaie clinic izolai mai frecvent prin hemocultur, n ordine
descrescnd a frecvenei putem aminti: Staphylococcus aureus, diferite enterobacterii, Pseudomonas
aeruginosa, streptococi hemolitici (inclusiv pneumococul), enterococi, Haemophilus influenzae (tip b),
Neisseria meningitidis, germeni anaerobi (Bacteroides fragilis, Fusobacterium spp., Peptostreptococcus spp.,
Clostridium perfringens etc), stafilococi coagulazo-negativi, Listeria monocytogenes, Leptospira spp., Brucella
spp., Candida spp., Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Aspergillus spp. etc
exist anumite particulariti n ceea ce privete etiologia infeciilor generalizate n funcie de vrsta
pacienilor, poarta de intrare posibil, focarul infecios principal, starea din punctul de vedere al aprrii
(specifice i nespecifice) a gazdei respective etc
n snge exist o serie de factori antimicrobieni a cror aciune trebuie pe ct posibil diminuat (aceasta
se realizeaz pe de o parte prin diluarea 1 / 10 a sngelui cultivat n raport cu volumul mediului de cultur dar
exist i o serie de substane chimice care pot fi utilizate n acelai scop, spre ex. polianetol sulfonatul de sodiu
are att efect anticoagulant ct i de neutralizare a unor factori antimicrobieni)
mediile de cultur i condiiile de incubare trebuie ales n aa fel nct s permit dezvoltarea agenilor
etiologici probabili
asigurarea calitii mediilor de cultur va include att controlul sterilitii fiecrui lot ct i controlul
eficienei acestora (prin inocularea mediilor cu tulpini de referin, de colecie).
Pentru recoltarea sngelui trebuie respectate condiiile impuse recoltrii oricrui tip de p.p. Subliniem ns
importana respectrii cu strictee a regulilor de prelevare aseptic i respectiv a recoltrii sngelui nainte de
administrarea oricrui tratament antimicrobian. Orict de urgent ar fi considerat c trebuie nceput terapia se
poate temporiza pn se realizeaz recoltarea sngelui pentru hemocultur, ceea ce n astfel de situaii ar
necesita un interval de timp de numai 10-15 minute.
Este recomandat ca recoltarea s fie urmat de nsmnarea direct pe mediul de cultur, la patul bolnavului,
spre exemplu ntr-un sistem nchis de recoltarea i nsmnare aa cum a fost realizat de Prof. Dr. Matei Bal.
Utilizarea sistemelor cu vacuum este relativ recent n ara noastr; n SUA a fost utilizat nc nainte de 1974.
Altfel spus, recoltarea ar trebui s fie urmat imediat de nsmnare, fr a mai exista o etap de transport.
Dac aceast recomandare nu poate fi urmat am putea folosi un tub care conine 1 ml dintr-o soluie 0,250,50% de polianetol sulfonat de sodiu n care realizm recoltarea sngelui i pe care l transmitem imediat ctre
laborator pentru nsmnarea pe medii de cultur.
Mediile de cultur sunt medii lichide, mbogite (ex. bulion infuzie de cord-creier pentru aerobi i respectiv
bulion Columbia cu cistein pentru anaerobi) condiionate n flacoane corespunztoare cantitii de snge pe
care trebuie s o recoltm. Pentru bacteriile cu multiplicare lent este recomandat utilizarea mediului bifazic
(mediu solidificat n pant, de ex. geloz-chocolat plus mediul lichid bulion tripticaz din soia). n finalul
prezentrii vom discuta i despre sistemele automate pentru hemocultur.
n cazul n care recoltarea a fost realizat simultan n dou flacoane pentru hemocultur, unul va fi incubat n
aerobioz iar cellalt n anaerobioz. Pentru unele microorganisme (ex. Brucella spp.) este necesar incubarea
n atmosfer de 5-10% CO2. Temperatura de incubare este cel mai frecvent 35-37 C.
Examinarea flacoanelor de hemocultur se realizeaz de 2 ori / zi n primele 3 zile, apoi zilnic pentru minim 7
zile (n anumite situaii flacoanele pot fi incubate timp de mai multe sptmni). Examinarea o facem
macroscopic urmrind o serie de aspecte care ar putea s semnifice dezvoltarea microbian (tulburarea mediului
mai mult sau mai puin uniform, apariia unei pelicule la suprafaa mediului lichid, apariia unui depozit pe
stratul de hematii din zona decliv a flaconului, apariia unor bule de gaz, apariia unor colonii pe mediul solid
n cazul n care am utilizat mediul bifazic etc). Din punct de vedere microscopic, manipulnd aseptic flacoanele
de hemocultur putem realiza frotiuri pe care le colorm Gram.
n cazul apariiei unor modificri precum cele descrise mai sus dar i atunci cnd acestea nu apar (treceri
oarbe) vom realiza subcultivri pe medii de cultur solide (de ex. geloz chocolat). Prin utilizarea mediului
bifazic subcultivarea se realizeaz uor i fr riscul contaminrii, prin simpla nclinarea a flaconului i
scldarea pantei cu mediul de cultur solid).
Dup obinerea culturii pure trecem la identificarea agentului etiologic i stabilirea sensibilitii la antibiotice i
chimioterapice a acestuia. n vederea testrii sensibilitii la antibiotice putem utiliza ca inocul bulionul de
hemocultur, dar rezultatele obinute vor fi confirmate prin antibiograma difuzimetric standardizat pornind de
la coloniile izolate (cultura pur).
n momentul de fa exist numeroase sisteme automate utilizate pentru hemocultur (BacT / Alert, Isolator,
BACTEC, Septi-Chek, Vital etc).
Spre exemplu, sistemul BacT / ALERT reprezint un instrument automat pentru detectarea multiplicrii
microbiene, capabil s incubeze, s agite i s monitorizeze continuu (pe baz de reflectometrie) aerob i
anaerob prelevate de la pacieni suspeci de bacteriemie / fungemie.
Instrumentul prezint:
- un modul de control care include un ecran ce permite operatorului s intervin (prin atingerea cu degetul) n
alegerea opiunilor de ncrcare i descrcare a flacoanelor introduse,
- un modul de incubare ce poate prelucra 120 pn la 240 flacoane nsmnate,
- posibilitatea realizrii automate a controlului de calitate al celulelor n care sunt introduse flacoanele
(nefiind necesar intervenia operatorului).
Intervalul optim de funcionare al instrumentului este situat ntre +5o i 45oC. Flacoanele introduse n
instrument sunt recunoscute de acesta cu ajutorul unui cititor de cod de bare (codul se afl pe partea lateral a
flaconului). Flacoanele i instrumentul sunt produse n conformitate cu standardele internaionale de calitate n
vigoare (ISO 9001, FDA i Quality System Regulations). Flacoanele de cultur conin mediu de cultur lichid
(bulion), care permit multiplicarea majoritii speciilor bacteriene precum i a fungilor. Fiecare flacon conine
un senzor LES (senzor emulsie lichid), ce detecteaz producerea de CO2, ca indicator al multiplicrii
microbiene.
Exist mai multe tipuri de flacoane, pentru incubare n aerobioz, anaerobioz, pentru aduli sau copii, pentru
pacieni la care nu s-au administrat medicamente antimicrobiene anterior recoltrii (varianta strict recomandat)
sau chiar i pentru pacieni aflai sub tratament antibiotic.
Citirea se efectueaz automat la fiecare 10 minute, rezultnd o medie de 144 citiri / zi, prin reflectometrie cu
afiaj pe monitor, semnal luminos sau sonor. n cazul unui rezultat pozitiv, flaconul respectiv este analizat prin
metode ale microbiologiei clasice sau moderne n vederea identificrii speciei microbiene i stabilirii
sensibilitii la antibiotice i chimioterapice.
Interpretarea rezultatelor hemoculturii
Avnd n vedere pe de o parte posibilitatea contaminrii unei hemoculturi iar pe de alt parte creterea
incidenei hemoculturilor pozitive cu semnificaie clinic n care sunt implicate microorganisme condiionat
patogene, care fac parte din flora microbian normal, rezultatele trebuie interpretate cu responsabilitate i n
echip.
Exist argumente bacteriologice (de ex. izolarea aceluiai microorganism din mai multe flacoane de
hemocultur) i clinice care permit medicilor infecioniti n colaborare cu medicii microbiologi s stabileasc
etiologia microbian (uneori polimicrobian) a unei infecii generalizate.
Fiind vorba de infecii cu pronostic adesea rezervat, laboratorul are datoria s comunice rezultatele pe msur
ce acestea sunt obinute (de ex. aspectul microscopic pe frotiul colorat Gram dup tulburarea bulionului de
cultur, aspecte microscopice i culturale observate dup dezvoltarea unor colonii, rezultatele antibiogramei
nestandardizate etc, sau faptul c dup o sptmn de observaie nu se poate evidenia multiplicarea
microbian) pentru ca s poat fi luate cele mai adecvate msuri, n favoarea vindecrii pacientului respectiv.
Klebsiella
Microorganismele din genul Klebsiella sunt enterobacterii imobile, nesporulate, caracterizate printr-o intens
activitate metabolic asupra hidrailor de carbon pe care i hidrolizeaz cu producere de acizi i uneori de gaz.
Glucoza este degradat cu producere de gaz. Exist mai multe specii de exemplu Klebsiella pneumoniae, K.
ozaenae, K. rhinoscleromatis i K. oxytoca. Klebsiella pneumoniae este specia principal a genului i include
bacili gram negativi, capsulai (capsula poate avea dimensiuni de 2-3 ori mai mari dect diametrul bacteriei).
Considerat iniial ca agent etiologic al pneumoniilor, s-a dovedit c numai 1-3 % din pneumonii (grave,
necrotice i hemoragice, n special la pacieni cu un sistem de aprare deficitar) sunt produse de Klebsiella
pneumoniae. Microorganismul, condiionat patogen, poate fi implicat ntr-o mare varietate de boli precum
toxiinfecii alimentare de tip infecios, infecii ale tractului respirator superior, infecii urinare etc. Din ce n ce
mai frecvent Klebsiella pneumoniae este izolat n infecii nosocomiale (de spital), vezi i capitolul 23.
Cu toate c nu este cea mai reprezentativ entitate clinic, vom discuta n continuare diagnosticul pneumoniei
produse de Klebsiella pneumoniae. Diagnosticul complet include elemente clinice, paraclinice i de laborator;
diagnosticul bacteriologic fiind util n stabilirea etiologiei i tratamentului antibiotic corespunztor.
Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct, incluznd urmtoarele etape.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai
aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de
vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n infeciile produse de
Klebsiella pneumoniae se pot recolta materii fecale, urin, snge, puroi etc. n continuare vom discuta cazul n
care p.p. este reprezentat de sput (vezi i capitolul 6). Din punct de vedere macroscopic, sputa poate avea un
aspect mucoid, de culoare rou nchis, n jeleu de coacze.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul
patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv
Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel
alveolar (ex. macrofage alveolare), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena bacililor gram
negativi, de dimensiuni relativ mari, ncapsulai (nconjurai de o capsul voluminoas). Examinarea
microscopic trebuie s demonstreze calitatea produsului patologic i s realizeze o identificare prezumtiv a
microorganismului implicat (vezi i capitolul 52). n coloraia cu albastru de metilen, capsula apare ca un halou
n jurul klebsielelor. Utiliznd anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o identificare rapid inclusiv direct, pe
produsul patologic, prin reacia de umflare a capsulei (vezi capitolul 12, punctul 12. 14).
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Klebsiella pneumoniae se
poate dezvolta pe medii de cultur obinuite n 18-24 ore, la 35-37C. Se prefer utilizarea unor medii de
cultur slab selective (ex. MacConkey). Klebsiella pneumoniae nu se dezvolt pe medii nalt selective i este
parial inhibat pe cele moderat selective. Pe mediile solide Klebsiella pneumoniae formeaz colonii lactozo
pozitive, mari, de tip M bombate, cremoase, n pictur de miere, care dau aspectul de curgere pe suprafaa
mediului de cultur, cu tendin de confluare. Se poate realiza i inocularea la animale de laborator sensibile
(oarecele alb), vezi i capitolul 11.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativi, cu dimensiuni mari, capsulai, capsula fiind
voluminoas, dispui n lanuri scurte, perechi sau izolai. n mediul de cultur pot pierde capsula.
Caractere de cultur: Produc colonii lactozo pozitive, de tip M, mari (2-3 mm la 24 de ore, peste 4 mm
la 48 ore), bombate, vscoase, cremoase, n pictur de miere, care dau aspectul de curgere pe suprafaa
mediului de cultur, cu tendin la confluare.
Caractere biochimice:
Klebsiella este un microorganism lactozo pozitiv, ceea ce se poate evidenia nc din etapa de izolare pe
mediul MacConkey.
Alte caractere biochimice se studiaz dup repicarea unor colonii pe medii multi test (TSI, MIU), pe
mediul Simmons sau n sisteme multi test comerciale de tip API.
Klebsiella pneumoniae este glucozo pozitiv (cu producere de gaz), lactozo pozitiv, nu produce H2S,
imobil, ureaz pozitiv, indol negativ, care se dezvolt folosind citratul ca unic surs de carbon.
Caractere antigenice:
Se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui pentru identificarea tulpinilor de Klebsiella, prin tehnici de
aglutinare, coaglutinare sau latex aglutinare. Exist peste 80 de tipuri de antigen K la Klebsiella pneumoniae.
Aceste reacii se pot practica n laboratoare de referin.
Caractere de patogenitate: Se poate utiliza inocularea la oarecele alb (vezi capitolul 11).
Alte caractere / teste utilizate n identificare care se pot utiliza (n centre de referin):
Testarea sensibilitii la bacteriofagi (unele dintre scheme au fost stabilite n Institutul Cantacuzino)
Caractere testate prin metode ale biologiei moleculare (stabilirea spectrului plasmidic, cu identificarea
plasmidelor implicate n virulen etc).
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este
obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Determinarea CMI i CMB poate fi necesar
(vezi capitolul 14).
Proteus
Genul Proteus este format din germeni pleomorfi (de unde i numele genului), foarte mobili, gram negativi,
aerobi facultativ anaerobi, care nu fermenteaz lactoza, produc ureaz, produc fenil-alanin-dezaminaz, sunt
nesporulai, necapsulai. Exist 2 specii principale, Proteus mirabilis i Proteus vulgaris.
De regul microorganismele din genul Proteus sunt implicate patogenic n afeciuni ce apar n afara tractului
digestiv (fac parte din flora microbian intestinal). Exist totui i toxiinfecii alimentare de tip infecios cu
Proteus spp. n mod frecvent se discut despre infeciile tractului urinar (ITU), dar sunt posibile i alte infecii
(tegumentare, genitale, cu alte localizri n cursul unei bacteriemii la pacieni cu status imun deficitar sau n
spital / infecii nosocomiale). Vom discuta n continuare diagnosticul de laborator al ITU.
Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct, incluznd urmtoarele etape.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai
aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de
vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n infeciile produse de
Proteus spp. se pot recolta urin, puroi, diferite exsudate purulente, materii fecale, lichid de vrstur, alimente,
snge etc. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de urin (vezi i capitolul 29). Din
punct de vedere macroscopic, urina ar putea fi tulbure, purulent. Transportul urinei trebuie realizat rapid, n
maxim 30 minute, iar dac aceast recomandare nu poate fi ndeplinit, p.p. trebuie transportat la rece (+
4C).
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspt ntre lam i
lamel, din sedimentul rezultat dup centrifugarea urinei. Examenul microscopic al urinei este foarte important
pentru c este uor de realizat, este ieftin i permite observarea unor elemente care orienteaz diagnosticul.
Examinarea microscopic a urinei ar putea conduce la economii importante (de timp, reactivi i materiale,
medii de cultur); vezi i capitolul 29. Proteus spp. prezint un mare numr de cili peritrichi care confer
mobilitatea caracteristic (exist i tulpini aciliate). Se poate realiza i un frotiu colorat Gram din urina
omogenizat. Germenii au un accentuat polimorfism pe frotiu putndu-se observa bacili, cocobacili, forme
filamentoase de pn la 30 m. Sunt necapsulai i nesporulai. Prezena a cel puin 1 leucocit / cmp
microscopic la examinarea cu obiectivul de imersie sugereaz piuria, care ntr-un context clinic sugestiv ajut la
definirea ITU. n cazul n care din urina omogenizat prelevm cu ansa calibrat de 0,01 ml urin iar n frotiul
rezultat identificm cel puin 1-2 bacterii / cmp (n microscopia optic cu imersie) acest rezultat sugereaz
prezena a 105 bacterii (uniti formatoare de colonii) / ml i respectiv infecia tractului urinar.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic trebuie realizat n aa fel nct s se poat obine
colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Cresc pe medii simple
inclusiv pe medii peptonate lichide cu degajarea unui miros caracteristic de putrefacie. Suport mari variaii de
temperatur i de pH. Este necesar realizarea uroculturii cantitative i demonstrarea prezenei a peste 105
bacterii / ml de urin. Pe mediile simple uzuale, pe agar-snge, pe AABTL etc, nu se pot obine colonii izolate,
fiind cunoscut fenomenul de invazie (vezi i capitolul 11). Acest aspect sugereaz prezena Proteus spp. n
produsul patologic. Fenomenul poate fi inhibat dac se realizeaz nsmnarea p.p. pe medii selectivodifereniale (ex. Mac Conkey sau ADCL). Pe aceste medii Proteus spp. produce colonii lactozo negative, de tip
S.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere de cultur:
Fenomenul de invazie: reprezint un caracter de identificare preliminar pentru Proteus spp., o bacterie
foarte mobil; dac nsmnm o tulpin care aparine acestui gen la periferia unei plci Petri cu mediu simplu
(agarizat 2%), de la locul nsmnrii cultura se dezvolt n valuri concentrice (se ntinde in aproape n
aproape) pe toat suprafaa mediului
Pe anumite medii selective, invazia este inhibat i se pot obine colonii izolate (adugm la mediul de
cultur acizi sau sruri biliare, tiosulfat de sodiu etc); aceste colonii sunt lactozo negative i de tip S
Fenomenul liniei de demarcaie, reprezint un caracter util n studii epidemiologice, n cazul n care
tulpinile implicate aparin genului Proteus; dac pe o plac cu mediu solid cultivm 2 tulpini diferite, n 2
puncte opuse, tulpinile se vor dezvolta invadnd pn la un punct n apropierea liniei de ntlnire, unde se va
crea o linie de demarcaie ntre cele 2 tulpini (distan de 1-2 milimetri); dac tulpinile nu sunt diferite va
avea loc creterea n valuri fr demarcaie cu dezvoltarea unei pnze de cultur continue
Fenomenul de crare, reprezint o variant de izolare n cultur pur a unei tulpini de Proteus;
cultivarea unui produs patologic n lichidul de condens al unui tub cu geloz nclinat incubat n poziie
vertical va conduce (n cazul n care n p. p. exist o tulpin de Proteus spp.) la obinerea n 24 ore a unei
culturi pure de Proteus, care se va dezvolta n valuri suprapuse pn la partea superioar a mediului de
cultur.
Caractere biochimice:
Alte caractere biochimice se studiaz dup repicarea unor colonii pe medii multi test (TSI, MIU), pe
mediul Simmons sau n sisteme multi test comerciale; Proteus spp. este glucozo pozitiv (uneori cu producere de
gaz), lactozo negativ, produce H2S, mobil, ureaz pozitiv, se poate dezvolta folosind citratul ca unic surs de
carbon.
Proteus mirabilis este indol negativ i ornitin decarboxilaz pozitiv n timp ce Proteus vulgaris este indol
pozitiv i ornitin decarboxilaz negativ.
Caractere antigenice:
Se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui (anti-O i anti-H) pentru identificarea tulpinilor de Proteus,
prin tehnici de aglutinare (la nivelul laboratoarelor de referin).
Yersinia
Genul Yersinia include 11 specii dintre care Yersinia pestis (cauza ciumei), Y. pseudotuberculosis i Y.
enterocolitica produc infecii umane. Sunt enterobacterii de dimensiuni mici, cu aspect de bacili sau cocobacili
gram negativi, care prezint coloraie bipolar. n produsul patologic prezint un pleomorfism accentuat. Nu
formeaz spori, pot prezenta structuri de tip capsular. Sunt aerobi facultativ anaerobi, catalazo-pozitivi,
oxidazo-negativi. Cresc pe medii simple i produc colonii de tip S n 24-48 de ore; ultimele 2 specii sunt mobile
la 22-30 C.
n continuare vom discuta despre yersiniozele cu poart de intrare digestiv, care pot avea drept ageni
etiologici Y. enterocolitica sau Y. pseudotuberculosis. Y. enterocolitica reprezint o cauz destul de frecvent a
BDA, cel puin din datele prezentate n literatura de specialitate internaional. Poate determina infecii cu
caracter invaziv localizate pe ileonul terminal, cu prinderea ganglionilor mezenterici i apariia unor dureri n
fosa iliac dreapt ceea ce poate conduce la punerea eronat a diagnosticului de apendicit acut, mai ales la
copii. n cazul adulilor s-a dovedit implicarea Y. enterocolitica n declanarea unor artrite reactive sau a
eritemului nodos cu dificulti n ceea ce privete diagnosticul diferenial. La pacienii cu variate grade de
imunodepresie boala enteric poate fi urmat de manifestri extra-intestinale, uneori n cadrul unei infecii
generalizate. Bolile produse de Y. pseudotuberculosis au o inciden mai redus; pot aprea enterite subacute,
adenopatie mezenteric etc.
Diagnosticul de laborator n yersiniozele cu poart de intrare digestiv este bacteriologic, direct. n cazul
manifestrilor extra-intestinale este indicat diagnosticul serologic.
1.
Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi
capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul
patologic poate fi reprezentat de materii fecale, ganglioni recoltai intraoperator, snge etc. n continuare vom
discuta diagnosticul unei BDA. Se poate folosi mediul de transport Cary-Blair.
2.
Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspt ntre lam i
lamel (nu se efectueaz frotiuri din materiile fecale). Preparatul se examineaz la microscopul optic cu
obiectivul 40. Vom evidenia prezena celulelor inflamatorii.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). n vederea izolrii Y.
pseudotuberculosis sau Y. enterocolitica se pot utiliza diferite medii selective clasice (MacConkey, ADCL) sau
mediul CIN (cefsulodin, irgasan, novobiocin), eventual cu incubare la temperatura camerei (20-30 C). Exist
diferite metode de mbogire, de ex. inocularea p.p. n tampon fosfat salin cu incubare la 4 C timp de 1-3
sptmni urmat de treceri pe mediile menionate mai sus. Coloniile suspecte se repic pe mediile multitest
clasice sau pe galerii API.
4. Identificarea se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: Sunt cocobacili sau bacili gram-negativicu cu dimensiuni de 0,5-3m / 1-2m,
posibil pleomorfi
Caractere de cultur:
Caractere biochimice:
Caractere antigenice:
Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza n studii epidemiologice sau n scop de
cercetare, fiind rezervat laboratoarelor de referin
reacii de aglutinare cu alte seruri imune, pentru tipuri mai puin frecvent ntlnite
bacteriocinotipia
Pseudomonas
Genul Pseudomonas face parte din familia Pseudomonodaceae i include mai multe specii. Pseudomonas
aeruginosa (bacilul piocianic, bacilul puroiului albastru) reprezint specia cea mai important a genului,
relativ frecvent implicat n infecii la persoane cu reactivitate sczut, precum i n infecii nosocomiale
(infecii de spital). Aceti germeni sunt bacili gram-negativi aerobi,oxidazo pozitivi, nesporulai, cu
dimensiuni de 1-5m / 0,5-1m, mobili datorit prezenei unuia sau mai multor flageli (polari).
Datorit capacitii de adaptare i supravieuire n diferite medii, precum i datorit factorilor de virulen pe
care i deine, Pseudomonas aeruginosa poate produce infecii foarte variate, de la infecii tegumentare
superficiale pn la stri de sepsis cu evoluie fulminant. Prezena piocianicului ar putea fi semnalat de
culoarea albastr verzuie a pansamentelor. La persoanele cu reactivitate normal, infeciile sunt de obicei
localizate (foliculite, otite, infecii oculare etc). La nivel dermic, procesul infecios poate avea i o evoluie
grav, cu apariia de vezicule care se sparg i se refac pe o baz necrotic; procesul poate progresa n
profunzime (ecthyma gangrenosum).
La persoanele spitalizate, cu reactivitate diminuat i supuse unor manevre medico-chirurgicale invazive
(intubaii, cateterizri etc) precum i la persoanele cu arsuri, Pseudomonas aeruginosa poate produce infecii
localizate, dar potenialul diseminrii i apariiei unor complicaii grave (bacteriemie, osteomielit, meningit,
endocardit, sepsis) este foarte important. n lipsa tratamentului adecvat (dificil datorit rezistenei la
antibiotice), evoluia procesului infecios poate fi grav sau deosebit de grav. Un fenotip particularal speciei
Pseudomonas aeruginosa produce o infecie pulmonar cronic la pacienii cu fibroz chistic
(mucoviscidoz). Dintre entitile clinice menionate mai sus, din punct de vedere al diagnosticului de laborator
vom discuta infeciile supurative ale tegumentelor i mucoaselor.
Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu urmtoarele etape.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai
aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de
vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n continuare vom discuta
cazul n care p.p. este reprezentat de puroi (vezi i capitolul 6). Puroiul trebuie examinat macroscopic,
deoarece poate avea un aspect sugestiv (culoare albastr sau galben-verzui fluorescent).
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul
patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv
Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel
tegumentar (eventual modificate fa de normal), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) i
prezena bacililor gram-negativi cu cu dimensiuni de 1-5m / 0,5-1m, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Pseudomonas aeruginosa se
poate dezvolta pe medii de cultur obinuite n 18-24 ore, la 5-42 C, cu dezvoltare optim la 30-37C. Se
prefer utilizarea unor medii de cultur selective. Uneori cultivarea se realizeaz pe agar-snge. Pe mediile
solide Pseudomonas aeruginosa formeaz colonii de tip S care se pigmenteaz n mod specific, nsoindu-se
de pigmentarea mediului (albastru sau galben-verde fluorescent). De menionat c pot aprea colonii (de tip S)
cu aspecte diferite, dnd impresia prezenei concomitente a unor bacterii diferite. Cultura poate avea un miros
aromat, ca al florilor de tei sau iasomie. Pe agar-snge produce hemoliz. n medii lichide, Pseudomonas
aeruginosa tulbur mediul ns n timp duce la apariia unei membrane aderent, cenuie, la suprafaa
acestuia. Dup 18-24 de ore, sub membran se poate evidenia prezena pigmentului produs.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere de cultur:
Produc colonii de tip S care se pigmenteaz n mod specific, nsoindu-se de pigmentarea mediului
(albastru sau galben-verde fluorescent). Pot aprea colonii (de tip S) cu aspecte diferite, dnd impresia prezenei
concomitente a unor bacterii diferite. Coloniile pot prezenta o suprafa iridescent, cu luciu metalic i plaje de
autoliz, degajnd o arom ptrunztoare particular. Pentru stimularea sintezei pigmenilor se poate folosi
repicare pe medii speciale, King F (stimuleaz producerea de fluorescein) i King P (stimuleaz producerea de
piocianin).
Caractere biochimice:
Produce diferii pigmeni, dintre care mai importani sunt piocianina (albastru) i pioverdina sau
fluoresceina (galben-verzui fluorescent).
Este un germen catalazo pozitiv care degradeaz oxidativ glucoza i nu fermenteaz lactoza (att coloana
ct i panta mediului TSI au culoare roie).
Pentru studii mai aprofundate, n momentul actual anumite laboratoare utilizeaz sisteme comerciale care
verific n acelai timp numeroase caractere biochimice permind nu numai ncadrarea n genul Pseudomonas,
dar i identificarea precis a speciei (de exemplu Rapid NTF, cu identificarea speciei n 4-48 de ore).
Caractere de patogenitate:
Se pot studia n anumite situaii (inoculm 4 oareci cu cantiti fixe de germeni cultivai pe geloz
nclinat 2 % i urmrim supravieuirea acestora timp de patru zile).
Teste de biologie molecular (sonde nucleotidice, analiza ADN dup utilizarea de endonucleaze de
restricie, PCR).
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este
obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Pseudomonas aeruginosa reprezint unul
dintre microorganismele care pot crea dificulti deosebit de mari n alegerea tratamentului etiologic, datorit
rezistenei la foarte multe dintre antibioticele uzuale. Cu toate c anumii autori indic faptul ca bacilul
piocianic ar fi sensibil la mezlocilin, ticarcilin, ticarcilin-acid clavulanic, piperacilin, piperacilintazobactam, imipenem, aztreonam, anumite aminoglicozide, fluorochinolone sau cefalosporine de generaia a
III-a, considerm c principiul care trebuie reinut este c n orice infecie cu Pseudomonas aeruginosa (atunci
cnd s-a dovedit c acest microorganism este agentul etiologic al infeciei) antibiograma este obligatorie. n
cazul unor infecii grave antibiograma difuzimetric trebuie s fie nsoit de alte determinri (vezi capitolul
14).
obiectivul 40. Esenial este faptul c nu se evideniaz prezena leucocitelor. Vibrionii sunt n numr mare i
prezint micri active, de rostogolire sau micri haotice. Suplimentar, p.p. ar putea fi tratat cu Ac specifici;
dac mobilitatea este stopat, se confirm diagnosticul.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Abordarea diagnosticului de
holer se realizeaz n mod difereniat, respectiv prezumtiv (la nivelul unui laborator periferic) i de certitudine
(la nivelul laboratorului de referin). Este recomandat utilizarea att a unui mediu moderat selectiv (ex. Bile
Salts Agar / BSA) ct i a unui mediu nalt selectiv (ex. Thiosulphate-Citrate-Bile salts-Sucrose / TCBS).
Lund n considerare situaia n care se ridic suspiciunea unei infecii cu V. cholerae se recomand
nsmnarea p.p., direct sau dup transportul n mediul Cary Blair, n ap peptonat alcalin (APA). Dup
incubare pentru o durat de 6-8 ore la 35-37, facem trecerea pe mediul selectiv (TCBS i / sau BSA) lund 2
anse de la suprafaa APA (n acest interval, la suprafaa APA poate s apar un vl, respectiv cultura de
vibrioni).
Examenul microscopic al vlului (preparat proaspt, ntre lam i lamel: vibrioni foarte mobili, cu micri
de rostogolire sau haotice) precum i utilizarea unor anticorpi specifici (reacie antigen-anticorp) pot grbi
diagnosticul.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere de cultur:
Pe mediul BSA, V. cholerae produce colonii de tip S rotunde, strlucitoare, transparente ca picturile de
rou (spre deosebire de coloniile de E. coli care sunt mate).
Caractere biochimice:
Testul uviei de ADN se poate utiliza pentru a diferenia tulpini care sunt oxidazo-pozitive i formeaz
colonii cu aspect asemntor (V. cholerae i Aeromonas spp.); n acest scop suspensionm o colonie suspect
ntr-o pictur de soluie 0,5% dezoxicolat de sodiu, pe o lam de microscop. n cazul n care este vorba de o
colonie de vibrioni, acetia sunt lizai i elibereaz ADN-ul care poate fi tras cu ansa ca o uvi
alte teste biochimice, prin metode clasice sau utiliznd galeriile manuale sau automate (ex. API 20E, ID
32E), se efectueaz la nivelul unui laborator de nivel superior sau la nivelul centrului naional de referin;
testele biochimice pot diferenia biotipul clasic de biotipul El Tor (se apreciaz c V. cholerae O:139 este un
mutant al biotipului El Tor)
Caractere antigenice:
Se utilizeaz ser anti-holeric O:1 i se practic reacia de aglutinare pe lam. La nivelul centrului de
referin se confirm reacia pozitiv i se identific serotipul (Ogawa, Inaba sau Hikojima) iar n cazul unei
reacii negative se realizeaz o reacie de aglutinare pe lam folosind ser anti-holeric O:139
Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza n studii epidemiologice sau n scop de
cercetare, fiind rezervat laboratoarelor de referin. Exist sisteme de lizotipare care definesc peste 140 de
lizotipuri diferite.
determinarea toxinogenezei tulpinilor de V. cholerae prin reacia VET-RPLA (latex aglutinare pasiv
inversat)
Haemophilus
Microorganismele din genul Haemophilus sunt cocobacili polimorfi, imobili, nesporulai, gram negativi, aerobi,
facultativ anaerobi. Sunt germeni pretenioi; pentru a se dezvolta au nevoie de prezena factorilor de cretere
prezeni n snge (de unde i numele genului). Exist mai multe specii, dintre care cele mai cunoscute sunt
Haemophilus influenzae i Haemophilus ducreyi; multe dintre tulpinile de H. influenzae sunt capsulate.
Haemophilus influenzae
Haemophilus influenzae este patogen prin multiplicare i invazivitate. Microorganismul ptrunde pe cale
respiratorie. Boala debuteaz ca o rinofaringit acut, probabil n asociere cu o infecie viral la nivelul tractului
respirator. Aceasta poate fi urmat de epiglotit, laringotraheit, otit, sinuzit, mai rar de pneumonie dar i de
celulit sau de meningit acut purulent la copiii mici precolari. Sinusurile sau urechea medie pot fi afectate
prin extensie local (se poate nota faptul c Haemophilus influenzae tip b i pneumococul se numr printre
agenii etiologici foarte comuni ai otitei medii bacteriene i ai sinuzitelor acute). Dac microorganismul
ptrunde n torentul sanguin, pe aceast cale poate infecta meningele. Ocazional infecia cu H. influenzae poate
duce la o laringotraheit obstructiv fulminant care necesit traheotomie sau intubare prompt a copilului
respectiv. n vederea discutrii examenului de laborator vom avea n vedere meningita produs de H.
influenzae.
Diagnosticul de laborator microbiologic n infeciile cu Haemophilus influenzae este bacteriologic, direct,
incluznd etapele care vor fi prezentate n continuare.
n meningita produs de H. influenzae diagnosticul este urgent (risc de evoluie cu sechele i / sau deces), de
importan maxim fiind recoltarea i transportul rapid al LCR ctre laborator. Este de preferat realizarea unei
cultivri la patul bolnavului, chiar dac pentru concentrarea germenilor ar putea fi necesar centrifugarea
LCR. Analiza citologic i biochimic a LCR este util n stabilirea etiologiei.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai
aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de
vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n infeciile produse de
Haemophilus influenzae se pot recolta secreii de la nivelul tractului respirator superior sau inferior, secreii din
sfera ORL, lichide recoltate prin puncie, snge, LCR etc. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este
reprezentat de LCR (vezi i capitolul 6). Aa cum am mai menionat, recoltarea LCR prin puncie (dup
verificarea presiunii din artera central a retinei prin examinarea fundului de ochi) trebuie fcut pe ct posibil
la patul bolnavului, avnd la dispoziie tot ce este necesar pentru pregtirea frotiurilor, cultivarea pe diferite
medii de cultur, repartizarea unei cantiti de LCR pentru examenul citologic i biochimic (vezi i capitolul 6).
n cazul n care p.p. urmeaz a fi transportat ctre laborator, transportul trebuie realizat fr ntrziere (la o
temperatur apropiat de 37C, refrigerarea este contraindicat). H. influenzae ar putea fi izolat i prin
hemocultur, cultivarea secreiilor nazale sau faringiene etc. Din punct de vedere macroscopic, LCR poate
avea aspect purulent.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul
patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv
Gram. Dac LCR este franc purulent frotiurile se pot executa direct din p.p., n caz contrar realizm iniial
centrifugarea LCR. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor
inflamatorii (ex. leucocite) i prezena cocobacililor gram-negativi, fini, capsulai, dispui separat sau n
grmezi aranjate n aceeai direcie, uneori dispui n lanuri scurte, situai intra sau extraleucocitar. Datorit
faptului c aceste microorganisme se coloreaz relativ slab n coloraia Gram ar putea fi necesar colorarea
frotiului de rezerv printr-o alt metod sau, recolorarea prelungit cu fucsin.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Haemophilus influenzae este
un microorganism foarte pretenios care nu se poate dezvolta pe medii de cultur obinuite. Unele tulpini de
Haemophilus influenzae necesit pentru iniierea creterii 5-10% CO2. Este necesar pentru incubare o
atmosfer umed, la 35-37 C, i o durat de minim 24-48 de ore. Pentru cultivare sunt necesari factori de
cretere precum hemina (factor X) i factorul V care poate fi nlocuit prin NAD, NADP sau alte coenzime.
Ambii factori se obin din eritrocite, ns este necesar eliberarea coninutului acestora n mediu (de exemplu
prin cldur, sau prin digestie peptic). Factorul V este sintetizat i de stafilococul auriu, astfel c pe geloz
snge coloniile de Haemophilus influenzae sunt mai numeroase i de dimensiuni mai mari n apropierea unei
linii pe care a fost nsmnat o tulpin hemolitic de Staphylococcus aureus (fenomenul de satelitism).
Coloniile sunt de tip S sau M i ating un diametru de 0.5-0,8 mm dup 24 de ore, respectiv 1-2 mm la 48 de ore,
avnd aspectul unor picturi de rou pe geloz chocolat. Pe geloz-snge cu infuzie de inim-creier apar colonii
mici, rotunde, convexe, de tip S, care n primele 24 ore prezint irizaii puternice, caracteristice. Nu apare
hemoliz.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: Sunt cocobacili gram negativi, mici (1-1,5 / 0,3 mm), dispui separat sau n
grmezi, uneori dispui n lanuri scurte. n medii complexe, la 6-8 ore, predomin formele cocobacilare, care
au i capsul. n culturile vechi se caracterizeaz prin pleomorfism i pierderea capsulei (dificulti de
diagnostic diferenial microbiologic).
Caractere de cultur: Produc coloniile de tip S sau M care ating un diametru de 0.5-0,8 mm dup 24 de
ore, respectiv 1-2 mm la 48 de ore, avnd pe geloz chocolat aspectul unor picturi de rou. Necesit prezena
n mediul de cultur a factorilor de cretere (X i V). Factorul V este sintetizat i de stafilococul auriu, astfel c
pe geloz snge coloniile de Haemophilus influenzae sunt mai numeroase i de dimensiuni mai mari n
apropierea unei linii pe care a fost nsmnat o tulpin hemolitic de Staphylococcus aureus (fenomenul de
satelitism). Pe geloz-snge cu infuzie de inim-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, care n
primele 24 ore prezint irizaii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliz.
Caractere biochimice:
Fermenteaz inconstant diferii carbohidraii. Pe baza unor teste biochimice specia a putut fi mprit n
biotipuri.
Caractere antigenice:
Se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui pentru identificarea tulpinilor de Haemophilus influenzae, prin
tehnici imunologice, n funcie de Ag K. Tipurile (a-f) se pot diferenia prin reacii de umflare a capsulei i de
imunofluorescen.
Tulpinile capsulate (Ag K) se pot identifica n p.p. (LCR sau urin dup centrifugare) prin
contraimunoelectroforez, latex aglutinare sau ELISA.
Tulpinile necapsulate se pot identifica i tipiza prin Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE).
Alte teste: exist sonde nucleotidice produse comercial pentru identificarea H. influenzae.
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este
necesar i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Este recomandat utilizarea unui mediu special,
respectiv Haemophilus test medium (HTM). Se pot utiliza i truse automate pentru testare (ex. ATB HAEMO
cu citire i interpretare dup 18-24 ore sau rapid ATB E 4 cu citire i interpretare dup 4-5 ore incubare).
Determinarea CMI i CMB poate fi necesar i se realizeaz prin metode clasice sau cu ajutorul testului E (vezi
capitolul 14).
Identificarea rspunsului imun fa de Haemophilus influenzae
Identificarea prezenei de anticorpi fa de H. influenzae ar putea fi util pentru verificarea rspunsului imun n
urma vaccinrii. n acest scop au fost utilizate RIA i ELISA.
Haemophilus ducreyi
Haemophilus ducreyi este strict patogen pentru specia uman fiind agentul patogen al unei boli cu transmitere
sexual, ancrul moale. n regiunea genital apare ancrul moale (iniial se formeaz o papul sensibil, cu
eritem n jur, urmat de apariia unei pustule i apoi a unei eroziuni care ulcereaz), dureros, cu eritem i edem.
Pot exista ancre multiple. Ganglionii regionali sunt mrii, dureroi i pot supura. Diagnosticul diferenial se
face cu sifilisul, infecia cu virusul Herpes simplex i limfogranulomatoza venerian.
Diagnosticul de laborator este n special microbiologic (bacteriologic, direct).
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai
aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de
vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n infeciile produse de
Haemophilus ducreyi se pot recolta secreii de la nivel genital (raclarea secreiei de sub marginea ancrului;
puroi din abces).
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul
patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv
Gram. Putem vizualiza intra sau extra celular bacili de dimensiuni mici, pleomorfi, gram negativi, dispui n
perechi sau lanuri paralele (n iruri), frecvent n asociere cu alte microorganisme. Se pot colora bipolar.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Cultivarea H. ducreyi este
dificil. Necesit pentru cultivare factorul X. Se poate dezvolta dac produsul patologic este recoltat de la baza
ancrului i cultivat pe geloz chocolat plus vancomicin 3 mg/ml la 33C n atmosfer de 5-10% CO2.
4. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili de dimensiuni mici, pleomorfi, gram negativi, dispui n perechi
sau lanuri paralele. Se pot colora bipolar.
Caractere de cultur: Produc coloniile de tip S de dimensiuni mici, dup 3-7 zile de la cultivare. Pe
geloz-snge pot produce hemoliz.
Caractere biochimice:
Bordetella
Microorganismele din genul Bordetella sunt cocobacili polimorfi, imobili, nesporulai, capsulai, gram negativi,
asemntori celor din genul Haemophilus, strict aerobi. Specia tip este reprezentat de B. pertussis agentul
etiologic al tusei convulsive; alte exemple sunt reprezentate de Bordetella parapertussis i Bordetella
bronchiseptica. Sunt germeni pretenioi; pentru a se dezvolta au nevoie de medii de cultur mbogite.
Bordetella pertussis
Bordetella pertussis este patogen numai pentru om. Transmiterea se realizeaz n special pe cale aerian
(picturi Pflgge) ntr-un acces de tuse. Contagiozitatea este maxim n primul stadiu de boal i la nceputul
stadiului al doilea (de tuse paroxistic). Microorganismul ader, se multiplic rapid, interfer cu activitatea
mucociliar normal, apar primele manifestri clinice care se agraveaz treptat. Substanele toxice elaborate (i
n special toxina pertussis / TP) au urmtoarele aciuni: TP conduce la hipoglicemie, sensibilizare la histamin,
reducerea activitii macrofagelor, diminuarea rspunsului imun umoral (sinteza de anticorpi); adenilatciclaza
pertussis diminu activitatea fagocitar a macrofagelor i leucocitelor; toxina letal produce necroze locale,
citotoxina traheal are efect citotoxic pe celulele ciliate etc.
Diagnosticul de laborator microbiologic n infeciile cu Bordetella pertussis este bacteriologic, direct;
diagnosticul serologic este tardiv i ar putea fi util pentru un diagnosticul diferenial (post-factum) sau din punct
de vedere epidemiologic.
Diagnosticul etiologic este foarte util n primul stadiu al tusei convulsive (pacientul este foarte contagios iar
evoluia bolii poate fi influenat pozitiv prin administrarea de antibiotice); identificarea B. pertussis la
persoanele asimptomatice i respectiv la contaci ar permite aplicarea unor msuri preventive.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai
aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de
vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n infeciile produse de
Bordetella pertussis se pot recolta secreii de la nivelul tractului respirator superior (nazal, faringian); vom
realiza recoltarea cu ajutorul tamponului din alginat de calciu care se las pe loc 30-60 de secunde pentru a
favoriza adsorbia B. pertussis (bumbacul inhib dezvoltarea microorganismelor) sau prin aspirarea secreiilor
traheobronice. Este descris i metoda plcilor tuite (se expune o plac Petri cu mediul Bordet-Gengou la
care s-a adugat antibiotic, deschis, la aproximativ 20 cm n faa gurii bolnavului n timpul accesului de tuse).
Este recomandat prelucrarea imediat a p.p., dac este posibil la patul bolnavului (microorganismul fiind
foarte puin rezistent n mediul extern). Nu exist o metod perfect pentru recoltarea p.p. atunci cnd se
suspicioneaz o infecie cu B. pertussis (toate metodele au diferite limite att din punctul de vedere al
sensibilitii sau specificitii ct i din punct de vedere practic).
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul
patologic, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Examinm frotiurile la
microscopul optic cu imersie i notm prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena cocobacililor
gram-negativi, dispui separat sau n perechi, rareori n lanuri scurte. Datorit faptului c aceste
microorganisme se coloreaz relativ slab n coloraia Gram ar putea fi necesar colorarea frotiului de rezerv
printr-o alt metod (imunofluorescen direct) sau recolorarea prelungit cu fucsin sau safranin.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Bordetella pertussis este un
microorganism foarte pretenios care nu se poate dezvolta pe medii de cultur obinuite; este inhibat de acizi
grai, peroxizi organici etc. Izolarea B. pertussis n culturi este dificil, dar eforturile sunt necesare pentru a
putea fi evaluat variaia genetic (de faz) i respectiv pentru a putea supraveghea fenomenul apariiei
rezistenei la antibiotice i chimioterapice.
Bordetella pertussis necesit pentru cultivare nicotinamid sau acid nicotinic i o temperatur optim de 3537C, cu incubare timp de 3-7 zile, n aerobioz i atmosfer umed. Cel mai cunoscut mediu de cultur este
mediul Bordet-Gengou care conine agar, macerat de cartof, snge, glicerol i devine selectiv prin adugare de
penicilin / meticilin sau cefalexin. Albuminele plasmatice din acest mediu leag acizii grai i permit
dezvoltarea microorganismelor. Dezavantajul principal al mediului clasic Bordet-Gengou este reprezentat de
timpul scurt n care poate fi utilizat (1-7 zile).
Actualmente se recomand utilizarea unui mediu folosit iniial ca mediu de transport, care include geloz
nutritiv, crbune activat i este suplimentat cu 10% snge de cal. Acest mediu poate fi utilizat pe parcursul a 12 luni, iar coloniile de B. pertussis apar mai rapid.
n vederea izolrii primare este necesar mediul Bordet-Gengou sau mediul cu crbune activat, ns prin treceri
repetate coloniile se pot dezvolta i pe geloz-snge sau chiar i pe geloz simpl. Microorganismul se va
multiplica mai rapid, coloniile vor fi mai opace i vor aprea modificri morfologice (pleomorfism), alterri
structurale, virulena fiind sczut.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: Sunt cocobacili gram negativi, mici, cu dimensiunea de 0,2-0,5 m / 0,5-2
m, imobili, dispui separat sau n perechi, rareori n lanuri scurte, cu tendina de a deveni pleomorfi n urma
subcultivrilor (pot aprea i forme filamentoase). Utiliznd coloraii speciale, n coloniile rezultate din
primoculturi se pot evidenia structurile capsulare. Dac frotiul se coloreaz cu albastru de toluidin, se pun n
eviden granule metacromatice situate bipolar. Imunofluorescena direct este util i pentru identificarea
microorganismului dup cultivare.
Caractere de cultur: Produc colonii de tip S sau M. Dup 3-7 zile de incubare la 37C pe mediul BordetGengou se pot dezvolta colonii de tip S mici, convexe, uor transparente, cu strlucire metalic, foarte aderente,
nconjurate de un halou de hemoliz (faza I). n lumina transmis oblic coloniile seamn cu picturile de
mercur. Pe mediul cu crbune activat coloniile apar mai repede, sunt tot de tip S, mici, convexe, negre, cu
suprafaa perlat.
Caractere biochimice:
Se pot utiliza truse comerciale manuale care identific specii de bacili gram negativi (ex. API 20 E, API
20 NE), fiind de regul necesare i teste adiionale de identificare.
Caractere antigenice:
Se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui pentru identificarea tulpinilor de Bordetella pertussis, prin
reacia de aglutinare pe lam.
Alte teste de identificare utilizate n laboratoare de referin: Se poate utiliza amplificarea genetic
folosind diferite amorse (primeri); tehnica PCR are o bun specificitate i sensibilitate dezavantajul principal
fiind reprezentat de costul ridicat.
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului)
poate fi necesar n scopul supravegherii apariiei fenomenului de rezisten la antibiotice i se realizeaz prin
metode difuzimetrice.
Diagnosticul serologic este tardiv. Din punct de vedere tehnic au fost utilizate RFC, reaciile de aglutinare,
hemaglutinare i hemaglutinoinhibare sau tehnicile de tip ELISA. Anticorpii apar din a 2-a sau a 3-a sptmn
de boal. Diagnosticul serologic ar putea fi util pentru un diagnosticul diferenial (retrospectiv) sau din punct de
vedere epidemiologic.
Brucella
Genul Brucella cuprinde 7 specii, cu numeroase biotipuri, care infecteaz animalele i se pot transmite de cele
mai multe ori accidental omului de ex. Brucella melitensis (capre, oi), Brucella abortus (vaci), Brucella suis
(porci), Brucella canis (cini). Sunt cocobacili gram negativi (de multe ori colorai bipolar), cu dimensiuni de
0,5-0,6 m / 0,6-1,5 m, imobili, prezentnd eventual o structur capsular, nesporulai, localizai n mod
caracteristic intracelular, aerobi facultativ anaerobi, catalazo pozitivi, relativ inactivi metabolic, care se dezvolt
relativ dificil pe mediile de cultur intrnd n categoria bacteriilor pretenioase cu necesiti nutritive complexe,
sunt bacterii fastidioase (mai ales atunci cnd se realizeaz cultivarea iniial, din p.p.).
Brucelele sunt microorganisme parazite pentru o serie de animale sau pentru om, capabile s determine infecii
acute, cronice sau infecii inaparente. Cronicizarea depinde de capacitatea de multiplicare n celule fagocitare.
Formele cele mai grave apar ca urmare a infeciei cu Brucella melitensis, urmat de infecia cu Brucella suis,
Brucella abortus i respectiv Brucella canis.
Transmiterea la om poate fi realizat pe cale digestiv, cutanat i mai rar pe cale respiratorie. De la nivelul
porii de intrare, microorganismele ajung la nivelul ganglionilor limfatici regionali, depesc aceast barier i
pe calea ductului toracic ajung n snge iar pe cale sangvin n organele cu sistem reticulohistiocitar i la nivel
osos. Incubaia este n medie de 2-3 sptmni, ns uneori pot trece cteva luni ntre momentul infectrii i
apariia fenomenelor clinice. Debutul este de obicei insidios, manifestat prin astenie, indispoziie, cefalee,
artralgii, febr moderat, transpiraii abundente.
n perioada de stare simptomele sunt polimorfe, bruceloza fiind una din bolile extrem de greu de recunoscut
clinic. Febra ondulant (care crete n cursul dup amiezii i scade n timpul nopii) nsoit de frisoane are o
valoare istoric. n realitate, curba febril are un aspect variabil. Transpiraiile abundente nocturne, cu un miros
caracteristic, astenia, durerile sub diverse forme reprezint alte elemente care pot fi comune n cursul bolii. S-au
descris circa 200 de semne clinice care pot apare n bruceloz.
Durata bolii poate fi de 3-4 sptmni, dar cel mai frecvent depete 3 luni, ajungnd n formele cronice la ani
de zile. n formele cronice diagnosticul se stabilete foarte dificil.
Diagnosticul brucelozei
n principiu, n realizarea diagnosticului se pornete de la aspecte clinice i epidemiologice, ns diagnosticul de
laborator este esenial, reprezentnd unica metod cert pentru un diagnostic pozitiv.
Diagnosticul de laborator n bruceloz poate fi bacteriologic (direct) sau serologic. Diagnosticul bacteriologic
include urmtoarele etape.
1.
Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi
capitolul 6), n special ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul patologic
este reprezentat cel mai frecvent de snge, dar s-ar putea recolta i prin puncie ganglionar, puncie medular
(rata de izolare crete), puncie hepatic sau splenic, sau ar putea fi reprezentat de LCR, urin, bil, lapte,
materiale necroptice etc n funcie de simptomatologie i stadiul bolii. n continuare vom discuta situaia n care
se realizeaz o hemocultur prin metode clasice sau n sisteme de cultivare rapide, de tipul BactAlert, Bactec
sau Septi-Chek (vezi i capitolul 31).
2.
Examinarea microscopic a produsului patologic nu aduce de regul informaii utile diagnosticului, n
special dac este vorba de snge. Se poate folosi tehnica imunofluorescent care uneori duce la rezultate
pozitive.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Toate speciile au cerine
nutritive complexe necesitnd pentru dezvoltare medii mbogite cu substane nutritive (aminoacizi, proteine
serice, glucoz, sruri, vitamine, ser, snge etc). Se recomand efectuarea hemoculturilor n mediul bifazic
(solid-lichid), ex. tip Castaneda. Cultura se incubeaz n atmosfer de 5-10% CO2, la 37C pentru o perioad de
minim 2-3 zile; culturile negative trebuie urmrite pn la 4 sptmni. n cazul mediului bifazic, vom
nsmna panta de mediu solid la fiecare 2-3 zile, fr a deschide flaconul.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: Sunt cocobacili gram-negativicu cu dimensiuni de 0,5-0,6 m / 0,6-1,5 m,
dispui izolat sau n perechi, lanuri scurte, grupat. Se pot colora bipolar. Poate fi necesar o prelungire a
timpului de recolorare cu fucsin, altfel sunt palid colorai.
Caractere de cultur:
Pe mediile mbogite corespunztoare nutritiv, pot produce dup 2-3 zile colonii de tip S, cu un diametru
de circa 1 mm; dimensiunea coloniilor se mrete astfel nct la 1 sptmn de incubare diametrul poate fi de
6-7 mm; pot fi identificate (n special dup incubare prelungit) colonii de tip R sau M
Examinate folosind o surs de lumin la 45, coloniile apar transparente, galben-deschis, asemntor
picturilor de miere n timp ce n lumina reflectat prezint o transparen cenuiu-albstruie
Caractere biochimice:
Microorganismele sunt catalazo pozitive, n timp ce testarea reaciilor oxidazei, ureazei i producerii de
H2S pot da rezultate variabile; se pot utiliza sisteme clasice de testare, dar este posibil i utilizarea galeriilor
API (ex. API 20E)
Se mai pot verifica metabolizarea glucozei, lactozei precum i sensibilitatea la diferii colorani inclui de
ex. n medii de cultur (ex. tionin sau fucsin bazic)
Caractere antigenice:
Utilizm seruri imune anti-Brucella adsorbite, prin reacii de aglutinare pe lam (exist reacii
ncruciate); n cazul unei reacii pozitive, la nivelul laboratoarelor de referin se pot realiza reacii de
aglutinare pe lam cu seruri imune monospecifice (anti-A, M sau anti-R n cazul coloniilor de tip R)
Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza n studii epidemiologice sau n scop de
cercetare, fiind rezervat laboratoarelor de referin; spre exemplu fagul Tbilisi lizeaz tulpinile de B. abortus,
poate liza la concentraii crescute tulpinile de B. suis, dar nu lizeaz tulpinile de B. melitensis, B. canis sau
tulpinile n form R
tehnici ale biologiei moleculare (exist sonde nucleotidice specifice pentru diferite biotipuri izolate mai
frecvent, de ex. 1 i 3 aparinnd B. melitensis; se ncearc punerea la punct a PCR, pentru diagnosticul
brucelozei).
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice) se realizeaz prin metoda
difuzimetric standardizat, i este util att n scopul supravegherii apariiei unor tulpini rezistente la
medicamentele antimicrobiene ct i pentru stabilirea tratamentului corespunztor n cazul unei maladii
infecioase n general dificil de tratat.
Diagnosticul serologic
Este de multe ori necesar, innd cont de dificultile ntlnite n cursul diagnosticului bacteriologic. Utilizm
antigene cunoscute i ncercm s determinm prezena anticorpilor specifici n sngele pacientului, valoarea
titrului anticorpilor i respectiv evoluia acestui titru n dinamic. Trebuie s menionm c anticorpii de tip
IgM cresc n infecia acut (n cteva sptmni) dar persist i n infecia cronic sau chiar i dup tratamentul
antibiotic realizat corespunztor (timp de 1-2 ani). Anticorpii de tip IgG apar dup circa 3 sptmni de la
debutul brucelozei, ating o valoare maxim la 6-8 sptmni i persist n cazul unei infecii cronice.
n special din punct de vedere istoric discutm i putem practica n cadrul lucrrilor practice, aglutinarea pe
lam (Huddleson, reacie calitativ, de screening). Cea mai cunoscut i utilizat tehnic de diagnostic serologic
este reacia de aglutinare n tuburi (Wright) prin care putem determina att titrul anticorpilor de tip IgM ct i
cel al anticorpilor de tip IgG.
Avnd n vedere faptul c n bruceloz apar i anticorpi blocani (Ac de tip IgA care blocheaz activitatea
aglutinant a Ac IgM sau IgG), care pot persista ani de zile, exist dificulti i n ceea ce privete interpretarea
rezultatelor obinute n diagnosticul serologic.
Pentru a simplifica, considerm c un titru 1/160 este sugestiv, n timp ce o cretere de 4 ori n dinamic a
titrului, poate confirma diagnosticul de bruceloz.
Exist o serie de variante tehnice care permit reducerea erorilor de interpretare:
testul de blocare (adugm tuburilor n care reacia Wright este negativ cte 1 pictur de ser imun antiBrucella; dac reacia rmne negativ i nici n acest caz nu apare aglutinarea, concluzionm c n serul de
cercetat exist anticorpi blocani)
testul Coombs
utilizarea unei tehnici de tip ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM i IgG care apar fa de proteinele
membranei externe etc.
Diagnosticul imunobiologic
Datorit faptului c n infecia cu Brucella spp. este stimulat n special rspunsul imun mediat celular, diferii
autori menioneaz utilizarea intradermoreaciei cu brucelin n investigarea unui caz suspect de bruceloz. IDR
cu brucelin poate identifica existena unei stri de hipersensibilitate de tip IV, fa de antigenul brucelos.
diphtheriae
Genul Corynebacterium include mai multe specii de bacili gram-pozitivi (se pot colora neuniform), uor
incurbai, mciucai, aezai n V, L, n mici grmezi neregulate sau n palisade, nesporulai, necapsulai,
imobili, aerobi i facultativ anaerobi, catalaz pozitivi.
Studii recente au delimitat grupul Corynebacterium diphtheriae n care se regsesc speciile C. diphtheriae, C.
pseudotuberculosis i C. ulcerans (ultimele dou fiind ureaz pozitive). Cultiv mai bine pe medii mbogite
(de ex. cu adaos de ser sau snge). Au capacitatea (n cazul conversiei genetice) de a elabora exotoxin. C.
diphtheriae include patru biotipuri: gravis, mitis, intermedius i belfanti.
Dup ptrunderea care are loc cel mai frecvent la nivelul tractului respirator (faringian, nazal), urmeaz
multiplicarea i inducerea unei inflamaii locale. Tulpinile lizogene (infectate cu bacteriofagi tox+) sintetizeaz
toxina care poate afecta orice tip de celul, dar cele mai importante efecte sunt la nivel cardiac (miocardit),
nervos (demielinizare), renal (necroz tubular), suprarenalian, muscular i hepatic. n cteva zile de la debutul
infeciei, toxina induce apariia unei structuri compuse din fibrin, leucocite, eritrocite, celule epiteliale
respiratorii moarte i bacterii, respectiv falsa membran de culoare gri-maronie (diphthera - membran).
Aceast structur se poate forma local (amigdalian, faringian, nazal etc) sau se poate extinde, acoperind
faringele, obstrucionnd arborele traheobronic (crup laringian, asfixie mecanic). La adpostul falsei
membrane, bacilii i continu multiplicarea i sinteza de toxin care difuzeaz pe cale sanguin i conduce la
apariia unor tulburri la distan (tulburri de ritm cardiac, miocardit, dificulti vizuale, de vorbire, de
nghiire etc).
Cu ct diagnosticul este mai tardiv, cu att rata mortalitii prin difterie crete.
Datorit faptului c n ultimii 15 ani nu au mai fost nregistrate cazuri de boal n ara noastr, exist riscul
nerecunoaterii acestei patologii de ctre medicii care nu au vzut niciodat un caz de difterie. Riscul apariiei
cazurilor exist iar sistemul de sntate trebuie s fie n permanen pregtit pentru a reaciona prompt, din toate
punctele de vedere (clinic, terapeutic, diagnostic, epidemiologic etc).
Diagnosticul de laborator n difterie este bacteriologic, direct i trebuie realizat urgent; exist anumite
particulariti care trebuie menionate.
n cazul suspicionrii unui caz de difterie diagnosticul i instituirea tratamentului se impun cu maxim urgen.
Se pornete de la un diagnostic prezumtiv bazat pe urmtoarele semne: a). amigdalit i / sau faringit cu dureri
de intensitate medie plus asocierea unei false membrane; b). adenopatie i edem cervical, mai ales dac se
asociaz cu faringit membranoas i semne de toxicitate sistemic; c). cornaj i stridor (respiraii zgomotoase
i uiertoare), tiraj (depresiunea prilor moi suprasternale, supraclaviculare, intercostale, epigastrice n
momentul efortului respirator); d). paralizia palatului moale; e). secreie nazal serosanguinolent asociat cu
prezena unor false membrane la nivelul mucoasei.
Se adaug din punct de vedere bacteriologic examinarea frotiurilor realizate din produsul patologic colorate
Gram i cu albastru de metilen. Tratamentul specific (administrare de antitoxin) se instituie fr ntrziere, fr
a atepta finalizarea diagnosticului bacteriologic.
Diagnosticul direct (bacteriologic), cu realizarea etapelor corespunztoare, este util pentru confirmare i n scop
epidemiologic.
1.
Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi
capitolul 6). Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de secreii de la nivelul faringelui i de
secreii nazale. n cazul prezenei falsei membrane se recomand detaarea cu precauie a acesteia i
recoltarea secreiei aflate sub aceast structur. n vederea prelevrii p.p. vom utiliza minim patru tampoane
diferite, trei pentru recoltarea secreiilor faringiene i al patrulea pentru recoltarea secreiilor nazale. Primul
tampon va fi utilizat pentru realizarea frotiurilor, al doilea se va utiliza pentru cultivare pe diferite medii de
cultur solide, selective i neselective (ex. geloz snge, Loeffler i medii cu telurit de potasiu, precum mediul
Tinsdale), n timp ce al treilea i al patrulea tampon vor fi introduse ntr-un mediu de mbogire (OST, ou-sertelurit). Pentru fiecare cultivare n parte exist un anumit algoritm. Spre exemplu, mediul Loeffler va fi incubat
pentru 4-8 ore la 35-37 C dup care se va realiza un prim frotiu, colorat Gram. Dac rezultatul este negativ
tubul se reincubeaz timp de 18 ore iar dac este pozitiv se face o repicare pe mediul Tinsdale i se ncepe
identificarea pe baza caracterelor biochimice.
2.
Examinarea microscopic a produsului patologic poate fi decisiv (n context clinic i / sau
epidemiologic sugestiv) pentru nceperea tratamentului specific. Realizm minim dou frotiuri, unul colorat
Gram iar cellalt colorat cu albastru de metilen. Prezena unor semne clinice sugestive la care se adaug
vizualizarea pe frotiul colorat Gram a leucocitelor i a unor bacili gram-pozitivi (la limit), uor incurbai,
mciucai, aezai n V, L sau sub form de litere chinezeti n timp ce la coloraia cu albastru de metilen
(modificat) am putea remarca prezena granulelor metacromatice putea conduce la administrarea de antitoxin
difteric; diagnosticul de certitudine urmeaz a fi stabilit ulterior.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Aspectul cel mai caracteristic
se nregistreaz pe mediile cu telurit de potasiu (ex. Gundel-Tietz, Hoyle etc), dup 24-48 de ore. Biotipul
gravis formeaz colonii opace de tip R, plate, cu margini crenelate, cu tendina de a se desface n fragmente
atunci cnd sunt prelevate cu ansa, relativ dificil de emulsionat, de culoare cenuie sau neagr, diametrul
coloniei fiind de 1,5-2 mm. Biotipul intermedius formeaz colonii opace de tip S, plate cu centrul mamelonat,
de culoare cenuie sau neagr cu margine transparent, diametrul coloniei fiind de 1,5-2 mm (dar se recunoate
prezena unor colonii de dimensiuni diferite). Biotipul mitis formeaz colonii de tip S care pot trece n forma R
prin mbtrnire, cu suprafa lucioas, culoare cenuie sau neagr, translucide, diametrul coloniei fiind de
0,5-1 mm. Biotipul belfanti formeaz colonii opace de tip S, de culoare cenuie sau neagr, diametrul coloniei
fiind de 1,5-2 mm (dar se recunoate prezena unor colonii de dimensiuni diferite).
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: Se examineaz cel mai bine atunci cnd frotiul este realizat din colonii
aprute pe mediul Loeffler (aspecte tipice apar i n cazul frotiurilor din p.p.). Sunt bacili gram-pozitivi(la
limit), polimorfi, cu dimensiuni de 1-8m / 0,5-0,8m, uor incurbai, mciucai, aezai n V, L sau sub form
de litere chinezeti. Exist recomandarea realizarea unor frotiuri colorate imunofluorescent, ceea ce ar
permite realizarea unui diagnostic mai rapid.
Caractere de cultur:
n funcie de biotip, produc colonii de tip Ssau R, aa cum am menionat mai sus. Pe mediile de tipul
gelozei-snge aspectul morfologic este aproape similar, culoarea fiind alb sau gri perlat. Biotipurile
intermedius, mitis i belfanti produc o zon mic de b-hemoliz.
Pe mediul Tinsdale coloniile sunt negre (datorit producerii de H2S) cu halo gri-maro. Anumii autori
menioneaz c frotiurile realizate pornind de la coloniile dezvoltate pe acest mediu permit evidenierea
granulelor metacromatice.
Pe mediul Loeffler (mediu electiv) coloniile apar n 18 ore fiind albe, lucioase, bombate, semicremoase,
asemntoare picturilor de spermanet.
Caractere biochimice:
n scopul diferenierii C. diphtheriae de alte specii ale genului se practic testul pirazinamidazei (negativ)
i cistinazei (pozitiv). Testul catalazei este pozitiv.
Se pot utiliza sisteme comerciale, precum galeriile API CORYNE care se bazeaz pe combinarea testelor
biochimice cu testele enzimatice (20 teste)
Caractere antigenice:
Se utilizeaz ser antitoxin difteric pentru identificarea producerii toxinei prin testul ELEK (vezi i
capitolul 16). Testul poate fi interpretat la 24-48 ore; este un test simplu i precis.
Caractere de patogenitate:
Testarea toxigenezei in vivo, pe cobai, la nivelul centrului de referin; cultura este inoculat subcutanat
la un lot de cobai neprotejai i un lot de cobai protejai (cu antitoxin difteric). n cazul n care cultura testat
include microorganisme toxigen, cobaii neprotejai mor n 24-48 ore cu evidenierea semnelor de intoxicaie
difteric.
Testarea producerii de toxin pe celule Vero sau prin alte metode (Western-blot, ELISA, PCR pentru
subuniti ale genei tox+ etc)
Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza n studii epidemiologice sau n scop de
cercetare, fiind rezervat laboratoarelor de referin.
tehnici ale biologiei moleculare (ribotipie, profilul de restricie al unei regiuni caracteristice, dup
amplificare genic etc).
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice) se poate realiza prin metoda
difuzimetric standardizat, n special n scopul supravegherii apariiei unor tulpini rezistente la medicamentele
antimicrobiene. De regul, tulpinile de C. diphtheriae sunt sensibile la antibioticele folosite uzual n tratament
(penicilin, eritromicin).
Listeria
Genul cuprinde mai multe specii dintre care cea mai important specie este Listeria monocytogenes, care poate
produce infecii variate, umane i animale. Mai rar au fost izolate tulpini din speciile L. ivanovii i sau L.
seeligeri. Sunt bacili fini gram pozitivi, aerobi facultativ anaerobi, mobili la 25 C, care se dezvolt preferenial
la 30 C dar se poate multiplica i la temperatura frigiderului (mbogire la rece).
Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes este patogen prin multiplicare i invazivitate (prezint o structur asemntoare
proteinei M streptococice, produce diferite substane cu rol n invazivitate, inclusiv lecitinaza, fosfolipaza C i
listeriolizina O, cu efect hemolitic). Infecteaz probabil iniial celulele intestinale, supravieuiete intracelular i
se multiplic intramacrofagic.
Listerioza este o zoonoz. Infecia uman apare accidental i foarte frecvent evolueaz inaparent. Dintre
manifestrile clinice grave amintim listerioza perinatal, probabil o infecie intrauterin (avort spontan, natere
prematur, sepsis cu deces nainte sau relativ repede dup momentul naterii etc). La aduli pot aprea
meningoencefalit, bacteriemie urmat de metastaze septice (mai ales la imunodeprimai) i mai rar, diferite
infecii focalizate.
Dintre toate tipurile antigenice, 90% dintre tulpinile izolate la om aparin tipurilor Ia, Ib i IVb. Putem meniona
c tipul IVb a fost mai frecvent asociat cu consumul de brnz fcut din lapte nepasteurizat. Asocierea unor
epidemii de listerioz cu consumul de alimente contaminate sugereaz calea gastrointestinal drept cea mai
important cale de ptrundere.
Diagnosticul de laborator microbiologic n infeciile cu Listeria monocytogenes este bacteriologic, direct.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (ct mai
aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de
vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). Diagnosticul de laborator se
bazeaz pe izolarea i identificarea microorganismului, n special din snge i / sau din LCR. n infeciile
produse de Listeria monocytogenes se mai pot recolta lichid amniotic, placent, esut fetal, dar i prelevate
patologice contaminate cu ali germeni precum materii fecale, secreii genitale, alimente, probe din mediul
extern etc.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul
patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv
Gram. Listeria monocytogenes se prezint ca bacili sau cocobacili gram pozitivi, cu dimensiuni de 0,5 - 5 mm /
0,5 - 0,8 mm, dispui izolat, n perechi sau n lanuri scurte, intra sau extracelular.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). De menionat c se poate
multiplica la temperaturi ce variaz ntre 2-45C (temperatura optim fiind de 20-30C); n culturile iniiale,
temperatura sczut favorizeaz multiplicarea L. monocytogenes (mbogire la rece); tolereaz o atmosfer
de 5 - 10% CO2 precum i concentraii de peste 5% NaCl.
n cazul p.p. necontaminate (snge, LCR etc) vom utiliza spre ex. agar glucozat sau triptozat, suplimentat cu
5% snge de berbec. Atunci cnd dorim s realizm izolarea pornind de la p.p. contaminate (alimente, materii
fecale etc) este necesar s folosim medii de cultur selective spre exemplu nsmnm iniial o parte p.p. n 9
pri de bulion pepton-tripton cu extract de carne i drojdie, suplimentat cu cu acid nalidixic i acriflavin iar
dup 2-7 (sau chiar 30) zile de incubare la temperatura frigiderului, incubm nc 18-24 de ore la 35-37 C.
Ulterior realizm o repicare pe medii selective (ex. agar, acriflavin, polimixin B, clorur de litiu, ceftazidim
etc). Exist i alte strategii folosite pentru izolarea L. monocytogenes.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili fini sau cocobacili gram pozitivi, cu dimensiuni de 0,5 - 5 mm /
0,5 - 0,8 mm, dispui separat sau grupai n palisade, n perechi sau n form de litere (asemntor
corynebacteriilor). n culturile tinere predomin formele cocobacilare n timp ce n culturile vechi se
caracterizeaz prin pleomorfism i pot aprea forme filamentoase. n preparatul proaspt se poate demonstra
mobilitatea, n special dac s-a meninut cultura la 18-25 C (sau la temperatura camerei).
Caractere de cultur: Cultura degaj un miros de lapte acidulat. L. monocytogenes formeaz colonii de tip
S. Dup 1-2 zile de incubare la 35-37 C pe agar glucozat, coloniile ating un diametru de 1-1,5 mm (mai mici
pe agarul triptozat); pot s aib aspect de picturi de rou. Pe agar-snge, coloniile sunt nconjurate de o zon
discret de b-hemoliz. Dac nsmnm prin nepare o coloan de mediu semisolid, datorit mobilitii va
aprea creterea n umbrel, caracteristic pentru L. monocytogenes. Multiplicarea la temperaturi extreme (245 C) poate fi util pentru identificare.
Caractere biochimice:
Utilizarea unor tulpini standard de Staphylococcus aureus (pentru L. monocytogenes i L. seeligeri) sau
de Rhodococcus equi (pentru L. ivanovii) n cadrul testului CAMP este util pentru identificare.
Se pot utiliza truse comerciale manuale (ex. API Listeria sau API 20 Strep) i respectiv truse automate
(ex. rapid ID 32 Strep) care permit identificarea L. monocytogenes n 4-24 de ore, n funcie de trusa utilizat.
Caractere antigenice:
Se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui pentru identificarea tulpinilor de Listeria monocytogenes, prin
tehnici imunologice, n funcie de Ag somatice sau flagelare. Serotiparea este util n scop epidemiologic.
Exist 13 serotipuri (serovaruri) majoritatea tulpinilor izolate la om aparinnd tipurilor Ia, Ib i IVb.
Sensibilitatea la bacteriofagi: Lizotiparea este foarte util n scop epidemiologic; exist tulpini care nu pot
fi testate prin aceast metod.
Alte teste rezervate centrelor de referin: n scop epidemiologic sau n cadrul unor studii taxonomice se
pot utiliza Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE), analiza macrorestriciei ADN, RFLP sau RAPD-PCR.
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului)
poate fi necesar i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. n cazul infeciilor grave se vor
determina CMI i CMB (vezi capitolul 14).
Mycobacterium
Elementele minime necesare stabilirii apartenenei la genul Mycobacterium sunt reprezentate de: 1. rezistena la
decolorarea cu acid-alcool (bacili acid-alcool rezisteni, BAAR); 2. prezena unor acizi mycolici care conin 6090 atomi de carbon i care pot fi clivai prin piroliz n acizi grai cu 22 i respectiv 26 atomi de carbon; 3. un
coninut procentual de G+C de 61-71%.
n afar de M. tuberculosis i M. leprae, au fost descoperite o serie de alte mycobacterii considerate anterior
saprofite dar care fiind condiionat patogene, sunt relativ frecvent implicate n patologia gazdelor
Se pot utiliza i sisteme de cultivare rapid (ex. MB-Bact, Bactec) cu depistarea creterii mycobacteriene n
4-25 de zile. n Romnia aceste sisteme au nceput s fie utilizate n unele centre ncepnd cu anul 1998. Aceste
sisteme permit testarea sensibilitii la medicamentele anti-mycobacteriene pentru tulpinile izolate, conform
recomandrilor programului naional.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere biochimice: Identificarea speciei se realizeaz pe baza a cteva teste fenotipice clasice i
anume: testul producerii de niacin, testul reducerii nitrailor, testul catalazei la 22 C i la 68 C, hidroliza
tween 80, susceptibilitatea la hidrazida acidului 2-tiofen-carboxilic (TCH) i susceptibilitatea la acidul p-amino
salicilic (PAS). Primele 3 teste dau rezultate pozitive pentru M. tuberculosis (n timp ce pentru M. bovis numai
al 3-lea test este pozitiv). Testul catalazei la 68 C i respectiv hidroliza Tween 80 sunt negative pentru ambele
specii (hidroliza Tween 80 poate fi pozitiv pentru M. tuberculosis). M. tuberculosis se dezvolt pe mediul cu
TCH n timp ce M. bovis (sau M. bovis-BCG este inhibat de ctre aceast substan). Testul este util n special
n cazul tulpinilor de M. bovis care prezint reacii pozitive (sau slab pozitive) la primele 2 teste.
Caractere de patogenitate: M. tuberculosis este patogen pentru cobai. Inocularea p.p. la cobai este uneori
practicat n vederea diagnosticului.
Alte caractere / teste utilizate n identificare: Se pot utiliza (la nivelul unor centre de referin) teste care
se bazeaz pe proprieti fenotipice moleculare (ex. studiul cromatografic al acizilor grai din peretele celular)
sau genotipice (fragmente de restricie ale materialului genetic, sonde nucelotidice, PCR). Exist i posibilitatea
testrii sensibilitii fa de anumii mycobacteriofagi etc.
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului)
poate fi necesar i se realizeaz conform recomandrilor Programului Naional de control al tuberculozei. Se
pot utiliza metoda concentraiilor absolute, metoda proporiilor, metoda rapoartelor de rezisten, metode
radiometrice etc.
Diagnosticul imunobiologic are la baz un mecanism de rspuns imun de tip celular. Se utilizeaz
intradermoreacia cu tuberculin (PPD, derivat proteic purificat), vezi capitolul 21.
Diagnosticul serologic se bazeaz pe rspunsul imun de tip umoral (anticorpii anti-mycobacterieni pot fi
evideniai prin diferite tehnici, de ex. ELISA). Cu toate c metodologia nu este perfect standardizat, subliniem
faptul c n diagnosticul tuberculozei nici un element nu poate fi considerat ca fiind lipsit de importan ntr-un
anumit context clinic, paraclinic i epidemiologic.
***
Dei nu am prezentat elementele necesare identificrii mycobacteriilor netuberculoase dorim s menionm c,
n cazul utilizrii unui numr redus de teste, exist riscul de a pune un diagnostic eronat i respectiv de a
considera o tulpin drept Mycobacterium tuberculosis, cu toate c a fost izolat o mycobacterie atipic.
anthracis
Genul Bacillus aparine familiei Bacillaceae i cuprinde un numr foarte mare de specii, dintre care n patologie
sunt mai frecvent implicate B. anthracis, B. cereus i B. subtilis. Germenii din specia B. anthracis se prezint
sub form de bacili gram pozitivi, de dimensiuni mari, imobili, sporulai, cu sau fr capsul. Sunt aerobi
facultativ anaerobi.
Manifestrile clinice ale infeciilor determinate de bacilul antraxului sunt reprezentate de antraxul cutanat
(forma cel mai frecvent ntlnit la om), antraxul pulmonar i respectiv antraxul gastrointestinal; n toate
formele poate avea loc diseminarea infeciei. De menionat c B. anthracis infecteaz n special animalele i
poate produce ocazional infecii umane. n ultima perioad se discut frecvent despre implicarea acestui
microorganism n bioterorism.
Diagnosticul de laborator n antrax este bacteriologic, direct i trebuie realizat ct mai rapid; sunt urmate
etapele cunoscute dar exist anumite particulariti.
Diagnosticul unui caz de antrax pornete de la datele clinice i epidemiologice. Examenul bacteriologic va
confirma diagnosticul.
1.
Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi
capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul
patologic este reprezentat cel mai frecvent de secreii de la nivelul leziunilor cutanate dar se pot recolta i
aspirat din edemul local i / sau din ganglionii regionali, sput, materii fecale, alimente incriminate, lichid
cefalorahidian, probe necroptice, snge (pentru hemoculturi) etc, n funcie de forma clinic. n cazul n care
este de presupus c p.p. este contaminat se pot folosi o serie de metode, spre ex. utilizarea mediilor selective,
tratarea termic sau tratarea cu alcool a p.p. n cazul mediilor selective, agentul selectiv mai frecvent utilizat
este polimixina B. n cazul celei de a treia variante, utilizm etanol steril de 95. Vom suspensiona p.p. n
proporie egal n etanol pentru o durat de 30-60 minute, la temperatura camerei, dup care vom preleva circa
0.25 ml din suspensie pe care o cultivm pe mediul de cultur ales. n cazul n care estimm c transportul ctre
laborator va dura mai mult de 60 minute, asigurm o temperatur de transport de 2-8 C. Trebuie s menionm
faptul c atunci cnd presupunem diagnosticul de antrax, trebuie luate msuri de biosecuritate speciale.
2.
Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unor frotiuri care se coloreaz cu
albastru de metilen i Gram; cel puin un frotiu se va pstra de rezerv. Se mai pot utiliza albastru de metilen
policrom (McFadyean) sau coloraia imunofluorescent, pentru evidenierea capsulei bacteriene. n p.p. se pot
remarca structuri tisulare, leucocite i bacili gram pozitivi, cu capetele tiate drept, de dimensiuni mari (11,5mm / 3-10mm), capsulai, dispui izolat, n perechi sau lanuri scurte, inclui ntr-o capsul comun. n
coloraia cu albastru de metilen policrom bacilii apar albatri iar capsula apare ca un halo de culoare roz.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Putem utiliza geloz nutritiv
sau geloz snge, n condiii de aerobioz, la o temperatur de 37 C (dei se poate multiplica ntre 15 i 42 C).
n cazul n care este de presupus c p.p. este contaminat se pot folosi metodele menionate mai sus. Pentru
izolarea B. anthracis se poate folosi un mediu cu polimixin B, lizozim, EDTA i acetat de thaliu, mediul
PLET.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-pozitivicu dimensiuni de 1-1,5m / 3-8m, formnd lanuri
lungi; ncepe procesul de sporogenez (sporul este oval, situat central, mai mic dect grosimea bacilului
respectiv).
Caractere de cultur:
Pe medii simple produc colonii de tip R, mari, cu diametrul de 2-5 mm; marginile sunt neregulate, cu
prelungiri laterale filamentoase care au permis asemnarea acestora cu capul de meduz sau coama de leu;
pe mediile cu snge, poate aprea o zon discret de b-hemoliz dei n mod caracteristic B. anthracis este nonhemolitic.
Pe medii speciale se poate stimula dezvoltarea capsulei polipeptidice (vezi mai jos).
Caractere biochimice:
Bacillus anthracis este catalazo pozitiv, produce lecitinaz i este sensibil la penicilin (fa de
majoritatea speciilor din genul Bacillus, rezistente la penicilin); exist i alte teste biochimice care sunt
efectuate la nivelul centrului de referin
Un alt caracter care trebuie investigat se refer la motilitate, absent n cazul B. anthracis i prezent la
majoritatea speciilor din genul Bacillus. n acest scop putem nsmna o coloan de geloz moale, cu incubare
la 37 C pentru 1-4 zile i urmrim dezvoltarea culturii fa de traseul pe care am nsmnat asemntor cu
interpretarea mediului MIU n cazul enterobacteriilor
Caractere de patogenitate:
Testarea producerii capsulei in vitro, caracteristic tulpinilor virulente de B. anthracis se poate realiza
prin cultivare (repicare) pe un mediu care conine bicarbonat de sodiu (0,7%), la 37 C i n prezena unui
procent crescut de CO2; dup 24 de ore, tulpinile capsulate vor produce colonii mucoide iar prezena capsulei se
va demonstra microscopic (ex. coloraia McFadyean sau Giemsa).
examene microscopice (frotiuri colorate cu negru Sudan pentru identificarea prezenei globulelor lipidice
de b-hidroxibutirat)
alte teste pentru demonstrarea sensibilitii la penicilin (ex. testul colierului de perle)
Clostridium
Genul Clostridium include peste 100 de specii care se gsesc n intestinul animalelor i se pot elimina n mediul
exterior prin materiile fecale, sporulnd. Sunt bacili gram pozitivi (uneori la limit), de dimensiuni mari,
aezai n perechi sau lanuri, mobili cu cili peritrichi (cu excepia C. perfringens). Multe dintre specii
sintetizeaz exotoxine. n cele ce urmeaz vom discuta despre speciile care produc tetanos, botulism i
gangrena gazoas.
Tetanosul este produs de Clostridium tetani patogen prin multiplicare la poarta de intrare i toxinogenez
(produce o exotoxin neurotrop). Neuronii motori spinali sunt de obicei inhibai de ctre glicin i acidul g
aminobutiric. Toxina blocheaz eliberarea acestor mediatori ceea ce determin excitarea neuronilor motori
spinali, cu apariia de spasme severe i dureroase ale musculaturii striate (paralizie spastic). Contiena este
pstrat. Toxina poate ajunge la nivelul SNC i retrograd prin propagare pe cale axonal de la poarta de intrare
sau pe cale sangvin. Clinic, la 4-5 zile de la contaminare apar spasme ale musculaturii din zona contaminat,
apoi ale muchilor masticatori, manifestate prin trismus (gura nu se mai poate deschide) i facies de tip risus
sardonicus (spasme ale musculaturii faciale). Orice stimul extern precipit un atac de tetanos. Moartea se poate
produce prin asfixie; mortalitatea este de circa 50%.
Botulismul apare de obicei prin ingestia de alimente care conin toxina produs de Clostridium botulinum, fiind
o toxiinfecie alimentar de tip toxic (toxin preformat n aliment). Toxina botulinic este cea mai puternic
otrav cunoscut; doza letal pentru om este de circa 1-2 mg. Dup ingerare, toxina se resoarbe la nivel
intestinal, ajunge n circulaie, iar pe aceast cale la nivelul plcilor neuromotorii unde mpiedic eliberarea de
acetilcolin (determin paralizie flasc). Paralizia ncepe la extremitatea cefalic (ex. paralizia muchilor
globilor oculari care apare la 18-24 ore de la ingestie i se manifest prin diplopie) i evolueaz descendent.
Decesul poate surveni prin asfixie (datorit paraliziei muchilor respiratori). Botulismul infantil (posibil i la
aduli) este urmare a formrii toxinei botulinice prin germinarea la nivel intestinal a sporilor ingerai.
Mortalitatea n botulismul neo-natal este foarte mare. Botulismul plgilor poate aprea la persoane care folosesc
droguri injectate intravenos sau prezint leziuni contaminate cu pmnt.
Gangrena gazoas este produs de dou sau mai multe dintre urmtoarele specii: C. perfringens, C. novyi (C.
oedematiens), C. septicum, C. histolyticum i C. sporogenes. Sporii clostridieni ajung la nivel tisular prin
contaminarea unor leziuni (traume). n condiii de anaerobioz sporii germineaz, formele vegetative se
multiplic, fermenteaz zaharuri i apare gaz. Distensia tisular, obstrucia mecanic a structurilor vasculare n
conjuncie cu sinteza de toxine favorizeaz diseminarea infeciei. Enzimele (toxinele) produse contribuie i la
alterarea grav a strii generale. Gangrena gazoas este caracterizat prin edeme dure, crepitante (datorit
prezenei de gaz) i necroz. Necroza tisular se extinde, multiplicarea bacterian se amplific, apare anemie
hemolitic, toxemie i evoluie (n 20-80% din cazuri) ctre deces.
nainte de a discuta cteva aspecte legate de diagnosticul infeciilor produse de clostridii dorim s menionm
faptul c exist i alte microorganisme anaerobe de interes medical (bacili gram pozitivi nesporulai, bacili
gram negativi, coci gram pozitivi i gram negativi, spirochete). Diagnosticul de laborator al infeciilor
produse de germenii anaerobi este laborios, costisitor i de regul poate fi definitivat numai n laboratoare
specializate; sunt necesare dotri speciale i un personal medical cu experien.
n continuare vom prezenta cteva aspecte privind diagnosticul de laborator n infeciile produse de
microorganismele din genul Clostridium.
1. Etapa de recoltare i transport a p.p. este esenial; trebuie meninute condiiile de anaerobioz.
2. Din punct de vedere macroscopic am putea meniona mirosul putrid al p.p., prezena unor fragmente de esut
necrotic, a unor secreii de culoare nchis, existena de snge i puroi n plag etc.
Examenul microscopic are rol orientativ (pentru majoritatea laboratoarelor este i ultima activitate care poate fi
realizat atunci cnd agentul etiologic este un microorganism anaerob). C. tetani are dimensiuni de 0,5-2 mm /
2-18 mm i poate prezenta un spor rotund localizat terminal, C. botulinum are dimensiuni de 0,5-1,5 mm / 3-20
mm i poate prezenta un spor oval localizat central sau subterminal iar C. perfringens are dimensiuni de 0,5-1,5
mm / 1,5-19 mm i poate prezenta un spor oval localizat subterminal. Examenul microscopic poate permite n
acelai timp un control al calitii p.p. (evideniind prezena celulelor inflamatorii i a celulelor lezate) i ar
putea servi la alegerea terapiei antimicrobiene.
3. Pentru cultivarea p.p. vom pregti cel puin 3 medii de cultur: bulion VF (viande-foi) cu acid tioglicolic i
albastru de metilen (care testeaz digestia crnii de ctre clostridii), mediul geloz - snge suplimentat cu
neomicin 100 mg / ml incubat n anaerobioz i mediul geloz - snge incubat n condiii aerobe. Pentru p.p.
provenite din abcese sau din plgi care sugereaz gangrena gazoas am putea folosi i mediul Nagler (cu
glbenu de ou) care permite evaluarea producerii de lecitinaz i lipaz.
Pentru a distruge formele vegetative i a reine sporii putem proceda aa cum am artat n capitolul 10 (tehnici
de izolare speciale).
Incubarea n condiii de anaerobioz dureaz 24-48 de ore la 35-37 C.
nainte de a trece la etapa de identificare trebuie s ncercm s dovedim c am izolat germeni anaerobi i s
verificm puritatea culturii care urmeaz a fi identificat. n condiiile n care p.p. a fost nsmnat pe 2 plci
cu geloz - snge incubate aerob i anaerob, este util s realizm examenul microscopic al coloniilor. Dac apar
colonii asemntoare n ambele plci iar din punct de vedere microscopic prezint caractere similare, este vorba
de microorganisme facultativ anaerobe. Dac pe frotiurile din coloniile izolate pe mediul incubat n anaerobioz
apar i alte tipuri morfologice, nseamn c exist microorganisme strict anaerobe. Pentru a verifica puritatea
culturii obinute, nainte de a trece la etapa de identificare, repicm coloniile suspecte n bulion VF regenerat
(prelevm colonia prin decupare cu geloza subiacent). Incubm timp de 24 ore la 35-37 C. n cazul n care
exist multiplicare bacterian procedm la a. realizarea unui frotiu colorat Gram (i comparm rezultatele cu
cele obinute anterior); b. repicarea pe o pant de geloz nutritiv cu incubare n aerobioz (nu trebuie s apar
cultur bacterian n cazul n care bacteriile izolate anterior sunt anaerobe). Dac rezultatele sunt corecte,
trecem la identificarea microorganismelor.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere, aa cum am
discutat i n capitolele precedente.
Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-pozitivicu dimensiunile menionate mai sus. n culturi
nvechite bacteriile pot fi gram negative i se pot detecta endosporii (deformeaz bacilii). n cazul n care la
examenul microscopic nu evideniem spori vom repica pe mediul Nagler, cu incubare 48 de ore la 35-36 C i
apoi la temperatura camerei. Urmrim sporularea pe un nou frotiu colorat Gram. Putem evalua fenomenul de
sporogenez i prin metode de cultur (vezi mai jos).
Caractere de cultur: Speciile mobile (marea majoritate) formeaz la suprafaa mediului colonii de tip S,
cu margini ondulate, neregulate, cu tendin de invadare a mediului (datorit mobilitii). n jurul coloniilor
remarcm prezena b-hemolizei. Dac a avut loc inocularea i n profunzimea mediului, coloniile au aspect
pufos. Clostridium perfringens (specia imobil) formeaz colonii de dimensiuni mari, de tip S, rotunde, cu
margini regulate, convexe dar care pot avea i aspect rugos. Majoritatea tulpinilor produc hemoliz dubl (zona
intern, de b-hemoliz, este mai ngust n timp ce zona extern, de a-hemoliz este mai larg); exist i tulpini
care produc zone foarte largi de hemoliz precum i tulpini slab hemolitice. Aa cum am menionat, prin
cultivare putem s evalum fenomenul de sporogenez (cunoscut fiind c sporii rezist timp de 10 minute la
temperatura de 80 C). Dac pe frotiul din cultur colorat Gram nu evideniem spori, pregtim 2 tuburi cu
bulion pepton, glucoz, amidon i extract de levur. Repicm coloniile suspecte n cele 2 tuburi iar unul dintre
tuburi n supunem unei temperaturi de 80 C, 10 minute. Incubm cele 2 tuburi la 35-37 C pn apare
multiplicarea bacterian. Dac bacteriile se dezvolt n ambele tuburi, am dovedit existena sporilor. Dac dup
o incubare de cel mult 10 zile nu apare multiplicare bacterian n tubul supus la temperatur, nu exist spori.
Caractere biochimice: Exist numeroase caractere biochimice care pot fi utile n diferenierea speciilor de
clostridii.
n identificarea microorganismelor din acest gen utilizm iniial testarea producerii de lecitinaz i lipaz.
Pe mediul Nagler inoculm tulpina n striu (se pot testa concomitent mai multe tulpini). Pentru aprecierea
producerii de lecitinaz incubarea dureaz 48 de ore. n cazul n care testul este pozitiv (precipitat opac n
mediul din jurul striului de cultur) poate fi vorba de o tulpin de C. perfringens. Testul este negativ pentru C.
tetani sau pentru C. botulinum. Pentru tulpinile lecitinaz pozitive, la nivelul centrului de referin se mai pot
testa mobilitatea, fermentarea lactozei, producerea de lipaz, ureaz, hidroliza gelatinei, digestia crnii etc.
Pentru aprecierea producerii de lipaz incubarea dureaz 1 sptmn. n cazul n care testul este pozitiv (film
perlat, iridescent la nivelul striului de cultur i n mediul adiacent) poate fi vorba de o tulpin de C. botulinum.
Testul este negativ pentru C. tetani i C. perfringens.
Testul plcilor semineutralizate poate fi practicat la nivelul centrului de referin. Folosim o plac cu
mediul Nagler. Pe jumtate din plac etalm anti-toxin (lecitinaz). Dup uscarea plcii inoculm n striuri o
tulpin martor pozitiv, o tulpin martor negativ i cteva tulpini de testat. Incubm timp de 18-24 de ore la 3537 C n anaerobioz. C. perfringens (ca i tulpina M+) d un rezultat pozitiv doar pe jumtatea de plac fr
anti-toxin.
Creterea n lapte turnesolat sau cu bromcrezol purpur (C. perfringens produce cheag alveolar n laptele
turnesolat).
Clostridiile sunt sensibilie la vancomicin i rezistente la colistin. Ali autori propun testarea sensibilitii
la metronidazol.
Demonstrarea prezenei tetanospasminei prin seroneutralizare la oareci (un animal este protejat cu 1-2
ore nainte de test prin injectare subcutanat a 1000 de UAI de anti-toxin tetanic; injectm la ambele animale
0,5 ml din cultura pe mediu lichid; animalul protejat supravieuiete, iar cellalt va prezenta semne tipice de
tetanos)
Testarea (la om) a prezenei anti-toxinei tetanice n titruri protective prin ELISA sau hemaglutinare (T
0,01 UAI / ml).
Demonstrarea prezenei toxinei botulinice n alimente, materii fecale, ser sau n medii de cultur. Spre ex.
prelevm din bulionul VF pe care am identificat multiplicarea bacterian, centrifugm iar supernatantul l
mprim n 2 tuburi. Unul dintre tuburi l supunem temperaturii de 100 C (toxina botulinic este
termosensibil). Inoculm intraperitoneal p.p. la dou loturi de oareci. Dac oarecii injectai cu p.p. inactivat
termic mor, nu este vorba de toxina botulinic. Urmrim oarecii timp de 2-4 zile pentru a remarca apariia
semnelor de botulism (reducerea mobilitii, respiraii ample, contracii ale muchilor abdominali urmate de
convulsii i deces). Prezena toxinei botulinice poate fi confirmat prin seroneutralizare (protejm spre ex. un
animal de laborator cu anti-toxin de tip A i un alt animal de laborator cu anti-toxin de tip B dup care i
injectm cu p.p. respectiv; dac animalul seroprotejat cu anti-toxina de tip A supravieuiete iar cellalt animal
moare cu semne caracteristice pentru botulism, n mediul de cultur a existat C. botulinum de tip A)
Titrarea toxinei botulinice, prin metoda DL50 (folosind injectarea p.p. n vena cozii i curbe standard
pentru interpretare, pentru fiecare serotip)
Titrarea toxinei botulinice printr-o tehnic de tip ELISA (poate detecta 10 pg)
Treponema
Ordinul Spirochaetales cuprinde dou familii importante n patologia uman, familia Spirochaetaceae (n care
se descriu genurile Treponema i Borrelia) i familia Leptospiraceae cu un singur gen, Leptospira. Genul
Treponema include specia Treponema pallidum cu patru subspecii care produc infecii la om. Treponema
pallidum subspecia pallidum este agentul etiologic al sifilisului.
Sifilisul poate fi congenital sau dobndit. n cazul sifilisului dobndit exist mai multe stadii, respectiv stadiul
primar, stadiul secundar, stadiul latent (recent, tardiv sau de durat nelimitat) i stadiul teriar. n stadiul teriar,
n funcie de organele sau sistemele afectate putem discuta despre afectarea nervoas (neurosifilis), cardiovascular etc. n mod particular se discut sifilisul congenital, sifilisul la gravide i sifilisul aprut la pacienii
infectai cu HIV.
Infecia natural cu T. pallidum este limitat la gazda uman. Infecia se transmite de obicei prin contact sexual,
iar leziunile de primoinfecie sunt cantonate la nivelul tegumentelor i mucoaselor din zona genital. Totui n
10-20% din cazuri, leziunile primare sunt localizate la nivel rectal, perianal sau oral. Spirochetele se multiplic
local la poarta de intrare, iar unele trec de bariera ganglionilor limfatici i ajung n circulaie. n 2-10 sptmni
de la infecie, la locul inoculrii se dezvolt o papul care se deprim pentru a forma o ulceraie cu baza curat,
indurat (ancru dur) la nivelul creia se gsete un lichid clar, ns foarte bogat n treponeme. Aceast leziune
primar se vindec ntotdeauna spontan, dar dup circa 2-10 sptmni apar leziunile secundare, care
constau n leziuni eritematoase maculopapulare localizate oriunde pe corp i papule umede, palide (condiloame)
n regiunile anogenital, axilar i n cavitatea bucal. Pot aprea de asemenea meningita, corioretinita, hepatita,
nefrita sau periostita sifilitic. Leziunile secundare se remit i ele spontan. Att leziunile primare, ct i cele
secundare sunt bogate n spirochete i foarte contagioase.
n cele ce urmeaz vom aborda diagnosticul de laborator n cazul sifilisului primar sau secundar. Diagnosticul
pornete de la elemente clinice i epidemiologice, dar trebuie confirmat prin metode de laborator.
Diagnosticul de laborator n sifilis poate fi bacteriologic (direct) sau serologic.
Diagnosticul bacteriologic
Treponema pallidum nu poate fi cultivat pe medii artificiale, n laborator. Din acest motiv, diagnosticul
bacteriologic cuprinde numai primele etape din structura clasic a schemei diagnosticului direct. Diagnosticul
bacteriologic poate fi realizat att n sifilisul primar ct i n sifilisul secundar.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi
capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei, avnd o
serie de particulariti. Produsul patologic poate fi reprezentat de lichidul clar (serozitatea) de la nivelul
leziunilor primare n funcie de localizare (penian, cervical, vaginal, perianal etc), de la nivelul leziunilor
secundare (condiloma lata, rozeole sifilitice etc), de la nivelul unor leziuni umede bogate n treponeme n
cazul sifilisului congenital timpuriu sau poate fi prelevat din ganglionii limfatici regionali. n cazul ancrului,
vom recolta p.p. dup ndeprtarea cu grij (fr a produce sngerare) a crustelor care acoper leziunea. Ar
putea fi necesar s comprimm baza leziunii pentru a stimula acumularea de lichid (clar) din care vom efectua
2-3 preparate microscopice. Prelevm lichidul fie cu ajutorul ansei bacteriologice, fie cu ajutorul unei pipete
Pasteur, fie aplicnd pur i simplu lama de sticl pe leziunea umed. Acoperim cu o lamel i eliminm prin
uoar apsare eventualele bule de aer. Transportul trebuie s fie realizat foarte rapid, de preferat n maxim 20
de minute astfel nct se recomand ca recoltarea s fie realizat ntr-un spaiu corespunztor, n imediata
vecintate a laboratorului. Este o etap esenial.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic se poate realiza fie cu ajutorul microscopului cu fond
ntunecat, fie prin imunofluorescen direct (exist i alte tehnici, care nu vor fi discutate n acest manual).
Pentru examenul microscopic pe fond ntunecat, pregtim 2 lame (preferabil 3) pentru fiecare leziune
pe care dorim s o examinm. Preparatele nu trebuie s conin hematii, leucocite, fragmente de esut sau bule
de aer. n timp ce examinm primul preparat microscopic vom introduce celelalte 2 preparate ntr-o cutie Petri
n care exist puin vat sau hrtie de filtru umezit, pentru a pstra atmosfera umed i a preveni uscarea.
Preparatul microscopic trebuie examinat sistematic (minim 10 minute n cazul unui rezultat aparent negativ),
iniial cu obiectivul uscat, ulterior, dup vizualizarea unor microorganisme care par s aparin genului
Treponema, cu obiectivul de imersie. Este necesar ca examinatorul s aib experien n acest tip de examinare.
Microorganismele caracteristice sunt foarte subiri i lungi (0.25-0.3mm / 6-14 mm), spiralate, prezentnd 8-14
spire (regulate, strnse, adnci i rigide), mobile (spirele nu se deformeaz), deplasarea n cmpul microscopic
nu este foarte rapid dar seamn cu o micare de nurubare (exist i microorganisme care sunt imobile dar
pstreaz micrile de translaie, rotaie lent, flexie uoar de la un cap la cellalt sau flexie median cu
revenire ca un resort), luminoase pe fondul negru al cmpului microscopic. n cazul unui rezultat negativ putem
repeta recoltarea i examinarea, n anumite situaii se poate recomanda nceperea tratamentului, iar evoluia va
fi monitorizat clinic i serologic (rezultatul negativ nu elimin diagnosticul de sifilis). Rezultatul pozitiv,
atunci cnd poate fi exclus prezena unor treponeme saprofite, pune diagnosticul de sifilis primar nainte ca
anticorpii s poat fi detectai serologic.
Imunofluorescena direct permite diferenierea T. pallidum de alte treponeme cu ajutorul anticorpilor
marcai fluorescent (reacie Ag-Ac); un alt avantaj este reprezentat de faptul c nu este necesar ca treponemele
s fie mobile. n plus, pentru c reacia este specific, se poate utiliza cu succes i n cazul unor leziuni foarte
probabil contaminate cu treponeme saprofite (ex. orale, rectale). n cazul n care examinarea nu poate fi
realizat imediat secreia poate fi recoltat ntr-un tub capilar care se nchide la flacr i poate fi transportat la
+4 C; alternativ putem realiza frotiul, ateptm s se usuce n vecintatea becului de gaz i putem s l trimitem
ctre laborator. Frotiul poate fi colorat:
cu Ac anti-T. pallidum obinui de la pacieni cu sifilis sau de la iepuri infectai cu T. pallidum; serul este
tratat pentru creterea specificitii cu tulpina Reiter (o tulpin nepatogen de T. phagadenis) iar Ac sunt apoi
marcai cu izotiocianat de fluorescein sau
Inocularea p.p. la animale de laborator reprezint cea mai sensibil metod pentru detectarea T. pallidum.
Pentru meninerea n laborator a unor treponeme viabile sau pentru determinarea infectivitii au fost utilizate
diferite animale (hamsteri, cimpanzei etc) ns cel mai util este iepurele. Iepurele poate fi inoculat
(intratesticular sau cutanat) cu orice tip de p.p. cu condiia ca ntre momentul recoltrii i inoculare s nu treac
mai mult de 60 minute. n caz contrar, p.p. trebuie adus rapid la o temperatur de cel puin -78 C (ex. n azot
lichid) i meninut astfel pn n momentul inoculrii. Testul infectivitii la iepure (RIT) rmne metoda
standard; cu ajutorul RIT se apreciaz sensibilitatea i specificitatea oricrei alte metode care este propus
pentru diagnosticul sifilisului.
n centrele de referin au mai fost utilizate i tehnici ale biologiei moleculare (sondele nucleotidice,
PCR). Tehnica PCR ar putea avea utilitatea diagnostic atunci cnd p.p. este reprezentat de lichidul amniotic.
Treponema pallidum i pstreaz sensibilitatea la penicilin, medicament care rmne de elecie pentru
tratamentul sifilisului. Exist i o serie de alternative, dar dorim s subliniem c n vederea tratamentului acestei
maladii trebuie respectate recomandrile fcute de ctre comisia de specialitate a ministerului sntii, pentru
fiecare form de sifilis n parte.
Diagnosticul serologic
Diagnosticul serologic se realizeaz folosind antigene nontreponemice i antigene treponemice. Testele
nontreponemice (nespecifice) i treponemice (specifice) sunt complementare; nu se exclud. Testele
nontreponemice sunt utilizate n screening, diagnostic i monitorizarea pacienilor n cursul tratamentului. n
vederea stabilirii diagnosticului vom utiliza i testele treponemice n corelaie cu cele nontreponemice (nici unul
dintre cele dou tipuri nu pot acoperi din punct de vedere diagnostic toate stadiile sifilisului). Cel mai
frecvent utilizm VDRL sau RPR (din prima categorie) cuplat cu TPHA sau FTA-Abs (din a doua categorie).
De obicei utilizm serul provenit de la pacientul suspect, dar n anumite situaii testul este realizat folosind
plasm sau LCR.
A. Reacii serologice care utilizeaz antigene nontreponemice
Antigenele nontreponemice sunt lipide care pot fi extrase din diferite esuturi. Cardiolipina este un
difosfatidil-glicerol. Pentru creterea sensibilitii, cardiolipina este cuplat cu colesterol i lecitin. Anticorpii
anti - cardiolipin au fost numii reagine. Sunt depistai n serul pacienilor la 2-3 sptmni i n LCR la 4-8
sptmni de la debutul infeciei, n cazurile netratate.
Reacia de fixarea a complementului Bordet-Wasserman (RBW) a fost utilizat o lung perioad de timp,
ncepnd cu 1906. Datorit faptului c RFC este o metod laborioas i n special datorit apariiei unor alte
tehnici, RBW este discutat n prezent din punct de vedere istoric.
Tehnica actual standard este VDRL (Veneral Disease Research Laboratories), un test de floculare.
Testele de floculare se bazeaz pe faptul c particulele antigenice rmn dispersate n serul normal, dar
formeaz grunji vizibili atunci cnd se combin cu reaginele. Testele se preteaz la automatizare i la folosirea
pentru screening datorit costului redus. O variant economic i elegant este microreacia VDRL care se
practic n plci cu godeuri.
Pregtirea serului de cercetat include controlul aspectului serului (se clarific prin centrifugare),
inactivarea timp de 30 minute la 56 C i o nou centrifugare (n cazul apariiei unor particule n suspensie). Nu
vor fi testate serurile infectate sau hemolizate. n cazul n care trec mai mult de 4 ore din momentul inactivrii,
serul va fi inactivat din nou timp de 10 minute la 56 C.
Temperatura din camera de lucru trebuie s fie ntre 23-29 C. Testul se efectueaz pe ser nediluat (pentru
monitorizarea evoluiei sub tratament se pot face diluii binare). Se pot testa mai multe seruri concomitent i
este necesar o notare clar a godeurilor, pentru fiecare godeu n parte. Fiecare test va include martori (seruri cu
reactivitate cunoscut, martor pentru Ag). n fiecare godeu punem cte 0,05 ml ser (n godeul pentru martor Ag
punem soluie salin fiziologic). Dup agitarea flaconului cu suspensia antigenic, utiliznd o sering cu ac
calibrat depunem cte o pictur (1/60 ml) n fiecare godeu. Acoperim placa i o aezm pe un agitator care
poate fi reglat la 180 turaii pe minut, pe o durat de 4 minute.
Citim imediat rezultatul, prin transiluminare pe fond negru, cu ajutorul unei lupe, ncepnd cu martorii
(negativ, slab pozitiv, pozitiv, martorul pentru Ag) i continund cu serurile de testat.
Rezultatul este negativ dac lichidul nu prezint flocoane i este asemntor martorului negativ i
martorului Ag. Rezultatul este slab pozitiv atunci cnd vizualizm flocoane de dimensiuni mici ntr-un lichid
uor turbid n timp ce rezultatul este intens pozitiv atunci cnd vizualizm flocoane de dimensiuni mari iar
lichidul este clar. Repetm rezultatele slab pozitive sau dificil de interpretat. n cazul n care suspicionm
existena fenomenului de prozon (inhibiia total sau parial a floculrii prin exces de Ac), vom repeta
testarea se va repeta pe diluii de ser.
Rezultatul negativ nu elimin diagnosticul de sifilis; pacientul se poate afla n perioada de incubaie sau
poate fi cazul unui sifilis latent (evideniabil prin TPHA). n cazul unui pacient suspect pentru sifilis primar,
repetm testul dup 1 sptmn, 1 lun i la 3 luni.
Vom lua n considerare un rezultat pozitiv n corelaie cu rezultatul obinut la testul treponemic,
rezultatul diagnosticului bacteriologic, elementele clinice i epidemiologice. Un rezultat pozitiv n condiiile n
care toate celelalte date sunt negative este de obicei un rezultat fals pozitiv. Pot aprea rezultate fals pozitive la
persoane cu hepatit viral acut, pneumonii virale, rujeol, malarie, mononucleoz infecioas, alte infecii
virale, la persoane care au fost recent vaccinate, precum i la persoane cu boli ale esutului colagen, persoane
care se drogheaz, la persoanele n vrst etc. Reaciile fals pozitive pot aprea i pe parcursul sarcinii.
Testul VDRL semi-cantitativ, efectuat pe 2 probe consecutive de ser este util n urmtoarele situaii:
scderea de 4 ori a titrului n sifilisul recent, tratat, semnific de regul eficacitatea tratamentului; creterea de 4
ori a titrului sugereaz o infecie activ n evoluie, o reinfecie sau ineficacitatea tratamentului.
Testul RPR (Rapid Plasma Reagin) este executat pe carduri din material plastic pe care apar mai multe
cercuri de 18 mm. Antigenul este preparat dintr-o suspensie antigenic tip VDRL modificat (pentru a elimina
etapa de inactivare prin cldur). Reactivul conine i particule de crbune. Antigenul RPR este amestecat cu
serul de cercetat n cercul de pe card. Daca Ac anti-T. pallidum sunt prezeni, se combin cu particulele lipidice
din Ag i produc aglutinarea lor. Particulele de crbune coaglutineaz cu Ac i duc la apariia unor granule
negre pe fondul alb al cardului. n absena Ac rezult un aspect gri uniform. Testul se poate realiza calitativ i
cantitativ (diluii de ser).
Au fost realizate i tehnici serologice care utilizeaz antigene treponemice extrase din T. Reiter (specifice
de grup) de tipul RFC i CIE.
De utilitate practic sunt reaciile serologice care utilizeaz antigene treponemice extrase din tulpina
Nichols de T. pallidum, cu o mare specificitate.
Pentru o lung perioad de timp, tehnica standard a fost testul imobilizrii treponemelor (TPI). Tehnica a
fost pus la punct n anul 1949. Serul de cercetat era diluat i amestecat cu complement i treponeme vii,
mobile, obinute din ancrul testicular de la iepure. n prezena Ac specifici, treponemele erau imobilizate, n
timp ce n lipsa acestora, mobilitatea era pstrat (examinarea se fcea cu microscopul pe fond ntunecat).
ndeprta Ac care nu sunt specifici pentru T. pallidum. Probele de ser i/sau LCR de la pacieni sunt diluate 1/5
cu un extract care conine Ag treponemice de grup (Reiter), comune treponemelor patogene i comensale.
Astfel sunt nlturai Ac nespecifici. Exist lame pe care a fost fixat tulpina Nichols de T. pallidum. Probele de
ser i/sau LCR absorbite i martorii corespunztori se depun pe spoturile de pe lam. Dac n ser/LCR exist Ac
specifici, acetia se vor lega de treponemele fixate pe lam formnd complexe antigen-anticorp. Dup
ndeprtarea materialului nelegat prin splri repetate, Ac legai se detecteaz prin incubare cu un conjugat
fluorescent anti Ig umane. Dup ndeprtarea prin splare a conjugatului nelegat de complexele antigenanticorp, lamele se examineaz la microscopul cu fluorescen (UV). n cazul n care serul de cercetat este
pozitiv, treponemele de pe lam apar fluorescente (galben verzui).
Testul de hemaglutinare (Treponema pallidum Hemagglutination Test, TPHA) a fost pus la punct n
urm cu 30 de ani. n prezena unor Ac fa de Ag adsorbite pe membrana lor, hematiile aglutineaz n reele
caracteristice formate din complexe imune. Ag treponemic este extras din tulpina Nichols i adsorbit pe
suprafaa hematiilor de oaie sau pasre fixate (hematii sensibilizate). Drept martor sunt folosite hematii fr Ag
treponemice (nesensibilizate). n cazul n care n serul de cercetat sunt prezeni Ac anti-T. pallidum, hematiile
sensibilizate aglutineaz; hematiile nesensibilizate nu aglutineaz i se depun sub forma unui buton pe fundul
godeului. Pentru creterea specificitii, majoritatea truselor comerciale includ n diluent un extract de
treponeme nepatogene. Testul poate fi realizat calitativ sau semi-cantitativ (diluii ale serului de cercetat).
Exist metode automate, utilizate pentru testarea sngelui donat.
Tehnica ELISA
Tehnica ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM anti-T. pallidum; este util pentru documentarea infecie
intra-uterine.
Tehnica Western blot poate detecta att Ac de tip IgM ct i de tip IgG.
Aa cum am mai menionat, interpretarea rezultatelor obinute se face innd cont de contextul clinic,
epidemiologic i de laborator. Lund n considerare numai rezultatele de laborator pentru testele menionate n
acest capitol, ar putea rezulta mai multe variante. Spre exemplu, dac testul VDRL este negativ i testul TPHA
este tot negativ, de regul infecia este exclus. Dac ne gndim c pacientul este la debutul bolii iar anticorpii
sunt nc nedectabili, repetm testele dup 3 sptmni. n cazul n care testul VDRL este pozitiv iar testul
TPHA este negativ, este posibil s ne aflm n situaia de mai sus, la debutul bolii i repetm testele dup 3
sptmni. Dac rezultatele rmn nemodificate, este vorba de o reacie fals pozitiv. Pot fi luate n discuie i
alte posibiliti.
Leptospira
Genul Leptospira include mai multe specii, dintre care mai cunoscute sunt L. interrogans i L. biflexa.
Leptospirele sunt spirochete foarte mobile, descriind micri de burghiu imprimate de dispoziia particular a
flagelilor, cu dimensiuni de 0,1 mm / 6-15 mm, prezentnd un crlig la unul sau la ambele capete. n cadrul
speciei Leptospira interrogans exist peste 218 serotipuri (serovaruri n terminologia anglo-saxon, de ex. L.
icterohaemorrhagiae; un serovar include mai multe grupe) care pot determina boala la animale i accidental la
om. Specia Leptospira biflexa reunete peste 63 de serotipuri saprofite.
L. interrogans este patogen prin multiplicare i invazivitate. Leptospiroza se caracterizeaz prin polimorfism,
pe parcursul evoluiei aspectul clinic putndu-se modifica. Dup o perioad de incubaie de 1-2 sptmni,
debutul bolii poate fi marcat de febr, perioad n care leptospira este prezent n snge. Microorganismul se
cantoneaz apoi n organele parenchimatoase (ficat i rinichi), n forma cea mai grav (sindromul Weil) putnd
determina apariia de icter, hemoragii, necroz tisular i disfuncii de organ. Boala este frecvent bifazic (dup
o ameliorare iniial urmeaz faza a doua a bolii remarcndu-se creterea titrului de anticorpi de tip IgM).
Infecia leptospirotic poate conduce relativ frecvent la meningit aseptic (cu lichid clar).
Diagnosticul de laborator n leptospiroz poate fi bacteriologic i / sau serologic.
Diagnosticul bacteriologic este relativ dificil, laborios, respectnd etapele cunoscute i este cel mai frecvent
realizat la nivelul centrului de referin.
Diagnosticul pornete de la elemente clinice i epidemiologice. Diagnosticul bacteriologic al leptospirozei este
laborios i costisitor.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi
capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul
patologic poate fi reprezentat de snge sau LCR (n primele 7-10 zile), urin (dup 9 zile de la debut pn la 2-8
sptmni de boal), dar s-ar putea recolta i lichid peritoneal, pleural etc. Datorit fragilitii leptospirelor i
fenomenului de autoliz, transportul trebuie s fie realizat rapid, n maxim 1-3 ore, la temperatura camerei.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspt (fr a folosi ns
lamela). Preparatul se examineaz la microscopul cu fond ntunecat. Exist o serie de proceduri utilizate pentru
pregtirea preparatului. n cazul lichidului peritoneal, LCR etc, produsul de centrifugheaz la 1.500g pentru o
durat de 30 minute, utilizndu-se sedimentul obinut. n cazul sngelui, recoltarea se face pe anticoagulant (dar
nu cu citrat), urmnd o prim centrifugare la 500g pentru o durat de 5 minute. Prelum supernatantul pe care
l centrifugm la 1.500g pentru o durat de 30 minute i utilizm sedimentul obinut. n aceste condiii, un
medic microbiolog cu experien ar putea stabili diagnosticul prezumtiv. Leptospirele apar ca filamente
luminoase, spiralate, foarte mobile, cu micri de nurubare i flexiune, dar i cu o uoar deplasare n spaiu,
pe fondul negru al preparatului.
Unii autori recomand realizarea de frotiuri colorate Giemsa prelungit sau prin impregnare argentic (FontanaTribondeau), mai ales pentru preparatele histo-patologice; leptospirele apar ca filamente regulat spiralate cu
extremitile fin ngroate sub form de buton, de culoare maro. A fost recomandat i colorarea
imunofluorescent (IF direct) n cazul suspicionrii diagnosticului de leptospiroz. n ultima perioad, pornind
de la p.p. (ser, urin, LCR etc) au fost puse la punct tehnici PCR.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz dificil, cu costuri ridicate, datorit
sensibilitii n mediul extern i particularitilor de multiplicare a leptospirelor. De regul cultivarea se face la
nivelul centrului de referin; utiliznd medii de cultur lichide nu obinem colonii izolate.
Exist i posibilitatea inoculrii p.p. la cobai sau alt animal de laborator, intraperitoneal. Starea clinic trebuie
monitorizat zilnic. Identificarea infeciei se poate face prin diagnostic serologic, prin izolarea leptospirelor
(hemocultur) sau anatomopatologic i bacteriologic dup decesul sau sacrificarea animalului respectiv.
n cazul utilizrii mediilor de cultur este recomandat ca toate p.p. s fie nsmnate att pe medii de cultur
selective ct i neselective. Mediul de cultur cel mai cunoscut este mediul Korthof (cu acizi i alcooli grai,
care conine i ser de iepure), pregtind n acest scop mai multe tuburi n care nsmnm cantiti progresive
de p.p. (ex. pornim de la o pictur, continum cu 2 picturi etc). Mediile selective includ neomicin i / sau 5fluorouracil.
Realizm incubarea la 28 C. Multiplicarea bacterian nu determin o tulburare a mediului (apariia turbiditii
reprezint cel mai frecvent o contaminare cu o alt bacterie). Dup 3 zile, respectnd cu strictee normele de
asepsie, realizm preparate native pe care le examinm la microscopul cu fondul ntunecat. n cazul n care
rezultatul este negativ, repetm aceast examinare la interval de circa 3 zile pentru o durat total de minim 4
sptmni, sau pn la obinerea unui rezultat pozitiv. n general creterea bacterian are loc n 3-14 zile de la
momentul nsmnrii.
Costul i durata diagnosticului cresc i datorit faptului c, pentru identificare sunt necesare cel puin 1-2
repicri pe un alt mediu lichid, dup detectarea microscopic a unor microorganisme care ar putea fi implicate
patogenic. O alternativ (i mai costisitoare, utilizat mai ales dac presupunem contaminarea culturii cu o alt
bacterie) este reprezentat de inocularea intraperitoneal a culturii respective la cobai. Dup 30-60 minute,
avnd n vedere faptul c leptospirele invadeaz sistemul circulator mai rapid n comparaie cu alte bacterii,
dup anestezierea animalului se recolteaz snge (prin puncie cardiac) i realizm o hemocultur.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: Realizm un preparat proaspt (fr a folosi lamela) din mediul de cultur i
l examinm la microscopul cu fond ntunecat. Leptospirele cu dimensiuni de 0,1 mm / 6-15 mm, apar ca
filamente luminoase, spiralate, foarte mobile, cu micri de nurubare i flexiune, dar i cu o uoar deplasare
n spaiu, pe fondul negru al preparatului. Se pot realiza frotiuri colorate Giemsa prelungit sau prin impregnare
argentic (Fontana-Tribondeau) precum i prin IF direct.
Caractere de cultur:
Caractere biochimice:
Caractere antigenice:
centrului de referin care a elaborat protocolul standard de operare; n mod similar se poate identifica i
serovarul implicat
tehnici ale biologiei moleculare (amplificarea prin PCR a fragmentelor obinute prin restricie
endonucleazic etc).
5. Antibiograma nu se realizeaz (nu a fost pus la punct o tehnic n acest scop). Este cunoscut faptul c
leptospirele sunt sensibile la penicilin, amoxicilin, tetraciclin, doxiciclin etc dar tratamentul se stabilete n
funcie de forma i gravitatea bolii.
Diagnosticul serologic
Anticorpii specifici se pot evidenia n serul pacienilor ncepnd cu a 4-6 - a zi de la debutul bolii, atingnd un
nivel maxim ntre sptmna a 3-6 - a de boal, dup care scad progresiv. Tehnica de referin este reprezentat
de reacia de aglutinare microscopic, realizat pe seruri pereche (primul recoltat la 1-2 sptmni de la debut,
al doilea recoltat la 3-4 sptmni de la debut). O cretere de 4 ori a titrului la a doua determinare semnific un
diagnostic pozitiv. Un titru 1/800 n prezena unor semne clinice este foarte sugestiv. Trebuie s menionm c
pentru unii pacieni seroconversia are loc mai tardiv. O alt problem este reprezentat de faptul c se utilizeaz
leptospire vii n calitate de Ag cunoscut, motiv pentru care aceast reacie nu se poate practica dect n centrul
de referin.
La nivelul altor uniti sanitare se pot practica reacii de tip ELISA, reacia de hemaglutinare indirect sau
reacia de aglutinare pe lam utiliznd Ag preparate din tulpini saprofite (sensibilitatea i specificitatea acestor
reacii este mai sczut). Tehnica ELISA de identificare a anticorpilor de tip IgM pune diagnosticul infeciei
acute dar nu poate permite determinarea serogrupului implicat aa cum se ntmpl n cazul tehnicii de
referin.
Borrelia
Genul Borrelia include spirochete de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 mm / 8-30 mm), cu spire largi i inegale,
mobile (cu micri de rotaie i rsucire), care infecteaz n special animalele i se transmit la om prin
intermediul unor vectori. Produc spre exemplu febra recurent, boal transmis de artropodele hematofage,
borrelioza Lyme etc. Borreliozele transmise prin cpue sau pduche poart de obicei numele regiunii
geografice n care se gsesc preponderent. Vom discuta n cele ce urmeaz aspecte legate de febra recurent cu
agent etiologic Borrelia recurrentis, care produce infecii i n Europa.
B. recurrentis supravieuiete mai multe luni n sngele contaminat sau n culturi la 4C. n anumite cpue,
bacteriile sunt transferate din generaie n generaie. Tulpinile de B. recurrentis izolate n diverse pri ale lumii,
de la diferite gazde i de la vectori diferii (cpue sau purici) au primit denumiri variate sau au fost catalogate
drept subtipuri ale speciei principale. n urma infeciei apare un rspuns imun umoral, putnd fi detectai
anticorpi aglutinani i anticorpi fixatori de complement. De remarcat faptul c, inclusiv n decursul unei
singure infecii apar modificri antigenice, care explic recderile. Ultima vindecare (dup 3-10 recderi) este
asociat cu prezena anticorpilor mpotriva mai multor variante antigenice. Imunitatea consecutiv infeciei este
de obicei de scurt durat.
Dup o perioad de incubaie (3-10 zile), debutul este brusc, cu frisoane i creterea rapid a temperaturii. Se
asociaz cefalee sever, mialgii, artralgii, letargie, fotofobie i tuse cu sau fr expectoraie. n acest timp,
spirochetele se afl n numr mare n snge. Pot aprea hemoragii (peteii, epistaxis etc) dar de regul fr
evoluie fatal. Febra persist 3-6 zile, apoi scade. Perioada afebril dureaz 4-10 zile i este urmat de un al
doilea atac de frisoane, febr, cefalee intens i stare de ru. Pot aprea succesiv pn la 10 asemenea recderi,
a cror severitate scade n general progresiv. Puseele febrile se asociaz cu bacteriemie.
Diagnosticul de laborator n borrelioza recurent este bacteriologic, direct urmnd etapele cunoscute.
Diagnosticul serologic poate oferi unele date.
Diagnosticul borreliozelor pornete de la elemente clinice, epidemiologice, anumite date de laborator i este
confirmat prin diagnostic bacteriologic.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi
capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul
patologic este reprezentat cel mai frecvent de snge dar s-ar putea recolta i vectori (pduchi, cpue) sau LCR,
lichid sinovial etc, n funcie de manifestarea clinic. Sngele trebuie recoltat n perioadele febrile. n cazul n
care produsele nu se pot examina imediat, recomandm transportul acestora la temperatura frigiderului (+4 C)
sau inocularea unor animale receptive (ex. oareci) i transportul acestora ctre laborator.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspt ntre lam i
lamel utiliznd sngele ca p.p., cu examinare la microscopul cu fond ntunecat. Borreliile se vd ca spirochete
luminoase de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 mm / 8-30 mm), cu spire largi i inegale, foarte mobile (cu micri
de rotaie i rsucire), pe fondul negru al preparatului. Se pot realiza frotiuri subiri sau examenul picturii
groase, colorate Giemsa prelungit, May-Grnwald-Giemsa sau Wright precum i cu acridin-orange sau cu Ac
monoclonali marcai fluorescent i cu examinare la microscopul cu fluorescen. Pe frotiul colorat Giemsa
prelungit spirochetele apar albastre, lungi, cu capetele efilate, situate printre hematii. Examenul microscopic
realizat de ctre un medic experimentat permite identificarea borreliilor n circa 70% dintre cazuri, n condiiile
respectrii normelor diagnosticului bacteriologic.
Preparatele microscopice ar mai putea fi realizate pornind de la hemolimfa vectorilor infectai (pduche,
cpu). De menionat faptul c n cazul acestui p.p. borreliile i menin pentru o lung durat de timp forma i
mobilitatea caracteristice n timp ce n sngele recoltat de la gazda uman sufer modificri datorit prezenei
anticorpilor specifici, iar n timp i pierd mobilitatea).
n ultima perioad s-a introdus tehnica PCR pentru identificarea ADN-ului borrelian, pornind de la produsul
patologic.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz de regul la nivelul centrului de referin,
existnd mai multe tehnici care ar putea fi utilizate.
Se pot inocula animale de experien sensibile (ex. oareci sau obolani), cu inoculare intraperitoneal.
Animalele vor fi monitorizate zilnic clinic i prin examinarea microscopic a sngelui (p.p. se poate recolta de
la nivelul venei cozii). Se mai pot inocula vectori (pduchi sau cpue) sau oul de gin embrionat (la nivel
intra alantoidian sau n membrana chorioalantoidian).
Se pot utiliza i medii de cultur artificiale speciale (cu ageni reductori, N-acetilglucozamin, acizi grai
nesaturai cu caten lung, ser de iepure), n condiii de microaerofilie, cu incubare la 32-37 C. Se recomand
i utilizarea mediilor selective care includ o combinaie de ageni antimicrobieni precum rifampicin,
amfotericin B i fosfomicin. Datorit faptului c mediile de cultur sunt lichide, nu se obin colonii izolate.
Creterea microbian trebuie verificat prin realizare de preparate proaspete examinate la microscopul cu fond
ntunecat la fiecare 3 zile, pentru o durat de 2-6 sptmni.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se poate realiza pe baza:
Caracterelor morfotinctoriale: Sunt spirochete luminoase de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 mm / 8-30
mm), cu spire largi i inegale, foarte mobile (cu micri de rotaie i rsucire), pe fondul negru al preparatului.
Pe frotiul colorat Giemsa prelungit spirochetele apar albastre, lungi, cu capetele efilate.
Caracterelor de cultur:
Dac are loc multiplicarea borreliilor pe mediul de cultur acesta rmne limpede, fr sediment, dar i
modific culoarea (ex. vireaz de la rou-portocaliu spre roz-glbui)
Caracterelor biochimice:
Borreliile sunt microaerofile, fermenteaz glucoza producnd bioxid de carbon i acid lactic (dar aceste
teste nu sunt utilizate de regul n diagnostic).
Rickettsiaceae
Rickettsiile sunt microorganisme care iniial au fost ncadrate printre virusuri deoarece au dimensiuni mai mici
dect bacteriile (600/300 nm) i n majoritate nu se pot cultiva dect pe gazde vii. Familia Rickettsiaceae
include trei genuri, genul Rickettsia, genul Coxiella i genul Ehrlichia. Microorganismele sunt transmise de
obicei de ctre artropode (pduche, purice, cpu) multiplicndu-se n corpul acestora. Cel puin patru rickettsii
(Rickettsia rickettsii, Rickettsia conorii, Rickettsia tsutsugamushi, Rickettsia akarii) i probabil i altele sunt
transmise transovarian n artropode care servesc deopotriv ca vector i rezervor. Rickettsia prowazeckii,
agentul etiologic al tifosului exantematic este considerat ca specia tip a genului Rickettsia. n cele mai multe
cazuri, rickettsiozele se caracterizeaz prin asocierea unui sindrom infecios sever cu un exantem. Clasificarea
lor se poate face dup mai multe criterii. Dup principalele caractere clinice i epidemiologice rickettsiozele se
pot mpri n urmtoarele grupe: a). tifosul de pduche sau purice; b). grupul febrelor butonoase (febrele
peteiale) reunete rickettsiozele transmise prin cpue care paraziteaz animalele domestice i slbatice; c).
grupul tifos tropical reunete rickettsiozele transmise de larvele unor mici acarieni. Tifosul pulmonar sau
febra Q are ca agent etiologic Coxiella burnetii poate fi transmis i de cpue, contaminarea este ns posibil
i pe cale respiratorie sau digestiv.
Microorganismele se multiplic n celulele endoteliului vaselor sanguine mici i produc vasculite. Celulele se
umfl i se necrozeaz, apar tromboze ale vaselor care duc la ruptur i necroz. Leziunile vasculare par a fi
baza alterrilor hemostazei. Pot aprea coagulare intravascular diseminat i ocluzii vasculare. La nivel
cerebral apar agregri limfocitare, leucocitare i ale macrofagelor ceea ce conduce la apariia nodulilor tifici.
Se observ leziuni similare n vasele mici la nivel cardiac sau la nivelul altor organe. Infeciile rickettsiene se
caracterizeaz prin febr, cefalee, indispoziie, prostraie (stare general foarte alterat), rash (erupie) cutanat i
mrirea splinei i ficatului. n febra Q nu exist leziuni cutanate.
Vom discuta n continuare despre diagnosticul febrei Q dei Coxiella burnetii poate produce i un sindrom
febril auto-limitat (2-14 zile), endocardit, hepatit, osteomielit etc. Febra Q se poate manifesta prin
pneumonie atipic, pneumonie rapid progresiv sau pneumonie n care semnul principal este reprezentat de
febr (simptomatologia pulmonar fiind absent iar implicarea pulmonar putnd fi demonstrat paraclinic).
Pornim de la elemente clinice (nespecifice), paraclinice i de laborator i ncercm stabilirea etiologiei prin
diagnostic microbiologic (bacteriologic i serologic). Obinerea de hemoculturi i sputoculturi negative pentru
alte microorganisme este un element care n contextul clinic i paraclinic reprezint un element sugestiv.
Diagnosticul bacteriologic
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi
capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul
patologic este reprezentat cel mai frecvent de sput; putem recolta i snge (ar fi de preferat cheagul sanguin),
lichid pleural, lichid pericardic, fragmente de placent (n cazul unui avort) etc. Transportul trebuie realizat
rapid i n condiii de maxim siguran (ceea ce trebuie respectat n toate etapele diagnosticului
bacteriologic; microorganismele din familia Rickettsiaceae prezint un grad nsemnat de infeciozitate prin
aerosoli). n cazul n care p.p. nu poate fi procesat i inoculat imediat este recomandat meninerea la -20 C
(inclusiv pe parcursul transportului).
2. Examinarea microscopic a produsului patologic este rareori util pentru diagnostic. n sput, mai ales dac
este recoltat prin biopsie transbronic, putem remarca prezena macrofagelor alveolare iar printre acestea
prezena unor cocobacili de dimensiuni mici. Pornind de la gena pentru superoxid-dismutaz au fost obinui
primeri (amorse) utilizai n amplificarea genetic, pornind de la produsul patologic.
3. Cultivarea pe produsului patologic se poate realiza numai pe gazde vii, la nivelul unui laborator de referin.
Trebuie luate toate msurile de prevenire a unei infecii n laborator. Coxiella burnetii poate cultiva pe animal
de laborator (cobai), culturi de celule sau ou de gin embrionat (la nivelul sacului vitelin). n afar de p.p.
menionate mai sus am putea folosi pentru inoculare i artropode. La nivelul sacului vitelin C. burnetii sufer o
variaie de faz, ntructva similar variaiei de la forma S la forma R ntlnit la alte bacterii. Tulpinile recent
izolate sunt n faza I n timp ce dup subcultivare se obin tulpini cu virulen sczut, n faza II.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza astfel:
Caractere morfotinctoriale:
realizarea de frotiuri colorate prin metoda Gimenez (microorganismele apar de culoare roie pe fondul
verde al frotiului) sau Machiavello (microorganismele apar de culoare roie pe fondul albastru al frotiului); se
poate utiliza i metoda Giemsa
Chlamydia
Chlamydiile sunt bacterii de dimensiuni mici (0,25-1 mm), gram negative, strict parazite, imobile, care se
multiplic n citoplasma celulelor gazd printr-un ciclu de dezvoltare caracteristic. Datorit importanei pentru
diagnostic, vom prezenta ciclul de dezvoltare al chlamydiilor. Dup ce ptrunde n interiorul celulei gazd,
particula infecioas (corpusculul elementar, form cocoid, cu diametrul de 0,25-0,3 mm) se transform ntr-o
particul mai mare (corpuscul reticulat, cu diametrul de 0,5-1 mm). Corpusculii reticulai se reunesc i se
multiplic prin diviziune binar, formnd colonii (incluzii) intracitoplasmatice. Dup o perioad variabil n
funcie de specia de chlamydii i de celula parazitat, de la nivelul incluziilor apar noi corpusculi elementari,
care sunt expulzai, urmnd s paraziteze alte celule. ntregul ciclu dureaz 24-48 ore.
Genul conine trei specii care pot fi implicate n patologia uman. De regul infecia este subclinic, boala
reprezentnd o excepie la gazdele naturale ale acestor germeni. Transmiterea de la psri la om favorizeaz
apariia bolii. C. trachomatis produce incluzii compacte intracitoplasmatice, cu glicogen. Include tulpini care
determin pneumonie la oarece i cteva afeciuni umane: trahom (serovarurile A, B, Ba i C), conjunctivite,
uretrite nongonococice, salpingite, cervicite, pneumonii la nou-nscui (serovarurile D-K) i
limfogranulomatoza venerian (serovarurile L1-L3). C. psittaci produce incluzii intracitoplasmatice difuze,
srace n glicogen. Include tulpini care determin psitacoza uman, ornitoze la psri, meningit, pneumonie la
feline i multe alte afeciuni ale animalelor. (provoac infecii la animale dar poate fi transmis omului). C.
pneumoniae poate provoca la gazda uman pneumonii atipice la fel ca i C. psittaci, Coxiella burnetii sau
Mycoplasma pneumoniae. Unii autori clasific C. psittaci i C. pneumoniae n genul Chlamydophila.
Diagnosticul de laborator n infeciile chlamydiene poate fi bacteriologic i imunologic. Infeciozitatea (prin
aerosoli) este important astfel c trebuie luate toate msurile necesare pentru prevenirea apariiei unor infecii
la personalul de laborator.
Diagnosticul bacteriologic
Diagnosticul bacteriologic complet poate fi realizat la nivelul unor centre de referin.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi
capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei i
respectnd msurile de precauie. Produsul patologic poate fi reprezentat deraclat conjunctival sau de la nivelul
altor mucoase (ex. cervival), urin, sperm, secreie purulent uretral, secreii nazale, secreii faringiene,
sput, aspirat ganglionar, puroi din fistul etc. Ne vom referi n continuare la diagnosticul infeciei produse de
C. trachomatis. n cazul n care spre ex. secreia uretral nu este evident, putem utiliza un tampon subire pe
care l introducem cu blndee 3-5 cm n uretr, rotindu-l uor. Indiferent de p.p. recoltat, tampoanele nu trebuie
s fie din vat sau alginat de calciu ci din Dacron. Produsul trebuie s fie prelucrat imediat. Dac acest lucru nu
este posibil, transportul se va face n medii speciale de transport sau la cel puin -20 C (preferabil -70 C).
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unor frotiuri pe care le colorm dup cum
urmeaz. Cea mai sensibil i specific metod pentru punerea n eviden a incluziilor intracitoplasmatice sau
corpusculilor elementari este imunofluorescena. Frotiul este uscat, fixat chimic (cu aceton, la -20 C) i
colorat imunofluorescent (metoda direct sau indirect). Urmrim prezena celulelor inflamatorii (PMN) i a
celulelor caracteristice esutului de la nivelul cruia am realizat recoltarea. Incluziile apar ca o mas bine
definit, cu fluorescen de ex. galben-verzui, n interiorul celulelor epiteliale. Frotiul va fi examinat cel puin 3
minute n cazul n care pare s fie negativ. n afar de Celelalte frotiuri le putem colora prin metoda Gimenez
(corpusculii elementari apar aglomerai i de culoare roie pe fondul verde al frotiului), cu lugol (incluziile de
C. trachomatis conin glicogen; apar ca o mas de culoare brun) sau Machiavello (corpusculii elementari apar
aglomerai i de culoare roie pe fondul albastru al frotiului). Unii autori menioneaz c examenul citologic, cu
punerea n eviden a unor limfocite transparente i a unui numr crescut de histiocite este sugestiv pentru
infecia cu C. trachomatis. Prin tehnici de tip ELISA se pot pune n eviden antigene n p.p. Exist i tehnici
ale biologiei moleculare care pot fi aplicate direct pe p.p. (sonde nucleotidice, PCR etc).
3. Pentru cultivarea produsului patologic am putea utiliza oul de gin embrionat (la nivelul sacului vitelin) dar
de regul se folosesc culturile de celule. Pentru Chlamydia trachomatis se pot utiliza liniile celulare BGMK,
HeLa 229 (tratate cu dextran i cicloheximid), McCoy (tratate cu cicloheximid 1 mg/ml), pentru Chlamydia
pneumoniae se pot utiliza liniile celulare HeLa, HEp-2, pentru Chlamydia psittaci se poate utiliza linia celular
McCoy etc. nainte de inocularea pe culturile de celule, p.p. este centrifugat (3000g, timp de 60 minute). Se pot
utiliza culturile de celule n sistemul clasic sau micrometoda de cultivare pe culturi de celule n godeuri.
Incubarea dureaz 48-72 de ore. Tehnica incubrii este destul de complex (incubri repetate, n condiii
diferite) i trebuie s respecte strict protocolul de lucru.
4. Identificarea se va realiza difereniat. n cazul n care s-a utilizat micrometoda, godeurile se examineaz
microscopic dup colorare cu lugol sau prin imunofluorescen. n cazul cultivrii prin metoda clasic, realizm
frotiuri pe care le fixm chimic (de ex. cu metanol). Un frotiu va fi colorat cu lugol (incluziile de C. trachomatis
conin glicogen) iar altul cu Ac monoclonali marcai fluorescent. Se pot aplica i tehnici de biologie molecular.
5. Nu exist tehnici standardizate de stabilire a sensibilitii la antibiotice i chimioterapice a tulpinilor de
Chlamydia spp. n tratament se pot folosi eritromicina (sau alte macrolide), tetraciclinele sau fluorochinolonele.
Diagnosticul serologic
Diagnosticul serologic implic utilizarea reaciei de fixare a complementului, reaciei de
microimunofluorescen i a tehnicilor de tip ELISA. Se consider c un titru 1/64 este sugestiv n timp ce o
cretere de 4 ori a titrului n dinamic permite diagnosticul pozitiv. Identificarea prezenei Ac de tip IgM la nou
nscui permite diagnosticul de pneumonie cu C. trachomatis. Tehnicile imunologice sunt frecvent utilizate n
scop epidemiologic (studii de seroprevalen).
Diagnosticul imunobiologic
Utilizarea intradermoreaciei (IDR Frei) a intrat n istoria medicinii.
Mycoplasma
Clasa Mollicutes include patru ordine. Ordinul Mycoplasmataceae include genurile Mycoplasma (circa 100
specii) i Ureaplasma (6 specii). Cteva dintre speciile acestor genuri prezint interes medical. Mycoplasmele
sunt cele mai mici microorganisme care pot tri liber n natur (125-250 nm) i se pot multiplica pe medii de
laborator. M. pneumoniae este implicat n infecii respiratorii, M. hominis poate produce infecii cu localizare
genital inclusiv infecii post-abortum i post-partum n timp ce U. urealyticum a fost izolat din uretrite nongonococice i din alte infecii uro-genitale.
Diagnosticul de laborator poate fi bacteriologic i / sau serologic, n funcie de localizarea infeciei i specia
implicat.
Diagnosticul infeciilor respiratorii pornete de la elemente clinice i paraclinice i poate fi confirmat etiologic
prin diagnosticul microbiologic.
Diagnosticul bacteriologic
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi
capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul
patologic poate fi reprezentat de exsudat faringian, secreii nazale, sput, secreii genitale, urin etc dar n
continuare vom discuta numai diagnosticul de laborator n infeciile respiratorii. Transportul trebuie realizat la
rece (la +4 C) ct mai rapid posibil, fr a depi un maxim de 3-4 ore de la recoltare. O alternativ este
reprezentat de utilizare mediilor speciale de transport care pot asigura conservarea p.p. pentru cel mult 24 de
ore. Utilizarea azotului lichid (-70 C) permite conservarea probelor timp de mai multe zile dar nu este nc
accesibil (cu foarte puine excepii) sistemului sanitar romnesc.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic nu permite obinerea unor rezultate utile, M. pneumoniae ca
i celelalte specii ale ordinului are dimensiuni foarte reduse. Unii autori recomand realizarea de frotiuri
colorate imunofluorescent. Pornind de la p.p. s-ar putea realiza amplificarea genetic (PCR) cu o sensibilitate
foarte bun. Prin tehnici de tip ELISA pot fi puse n eviden Ag de M. pneumoniae n sput.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se poate realiza utiliznd tehnici i medii speciale. Unul
dintre mediile de cultur cunoscut este mediul mbogit, pe baz de infuzie de cord bovin numit generic PPLO.
Acest mediu include att substane nutritive, surse de energie, indicator de pH (rou fenol) ct i substane care
i asigur selectivitatea (penicilin i/sau acetat de taliu). Cei mai muli autori recomand nsmnarea p.p. att
pe un mediu de cultur solid ct i pe un mediu de cultur lichid (ex. bulion PPLO). Vom realiza o incubare la
37 C n atmosfer de 5% CO2 i urmrim culturile pe mediul lichid pentru a sesiza ct mai rapid (dar nu mai
devreme de 48-72 ore de incubare) modificrile de culoare care trdeaz virajul pH-ului. Mediul devine acid
prin fermentarea glucozei n cel mult 3-4 sptmni. Este recomandat s realizm repicri pe medii solide i
lichide ct mai curnd dup ce am observat virajul pH-ului.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere de cultur:
Se pot examina la stereomicroscop (cu mrire de minim 25). n scopul identificrii trebuie s citim
placa cu mediu agarizat de cel puin 2 ori pe sptmn. Pot aprea colonii de dimensiuni foarte mici (cu
diametru de la 10 mm pn la 200 mm), cu aspect muriform. Sunt descrise i colonii cu aspect de ou-ochi, cu
centrul dens, opac, nconjurat de o zon periferic mai clar pe care unii autori le consider drept tipice pentru
Mycoplasma (astfel de colonii ar mai putea fi produse de bacterii n form L i necesit realizarea
diagnosticului diferenial).
Se poate realiza i cultivarea pe oul de gin embrionat (inoculare intravitelin) sau n culturi de celule.
Caractere biochimice:
cteva minute i urmrim apariia aglutinrii. Dac apare aglutinarea repetm testul realiznd diluii de ser
pentru a determina titrul. Un titru 1/32 este sugestiv pentru infecia cu M. pneumoniae.
Se poate utiliza i RFC, dar pentru c Ac fixatori de complement apar tardiv este util n studii epidemiologice.
Tehnica de tip ELISA poate determina Ac de tip IgM i este util n infecia acut.
Candida
Diagnosticul infeciilor fungice nu este un diagnostic facil, dar este foarte important pentru c trebuie s avem
n vedere c aceste afeciuni sunt mult mai frecvente dect sunt raportate n ara noastr. Oricare laborator clinic
ar trebui s poat realiza cel puin examinarea microscopic n vederea evidenierii levurilor sau structurilor
miceliene sau pseudo-miceliene precum i testul filamentrii. Dintre infeciile fungice vom discuta doar despre
infeciile produse de levuri i dintre acestea numai despre infeciile produse de levurile din genul Candida, mai
precis de specia Candida albicans.
n ceea ce privete diagnosticul unei infecii cu Candida spp. (respectiv C. albicans) exist anumite
particulariti de care trebuie inut cont atunci cnd se diagnosticheaz o candidoz localizat la nivel mucocutanat n comparaie cu o candidoz localizat profund. Diagnosticul poate fi micologic (direct) sau
imunologic (indirect).
Diagnosticul micologic
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai
aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice antifungice, ct mai rapid i corect din
punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n cazul
candidozelor superficiale, dup antiseptizarea suprafeei leziunii raclm spre ex. tegumentul i colectm
scuamele rezultate ntr-un recipient. Mai putem recolta fire de pr, fragmente de unghie etc. n principiu putem
introduce p.p. recoltat n pachet de hrtie, introdus la rndul lui ntr-o cutie Petri. Transportul trebuie s dureze
maxim 48 de ore. n cazul candidozelor profunde ca i n cazul candidozelor localizate la nivelul mucoaselor
trebuie s evitm uscarea p.p. pe parcursul transportului. Vom utiliza recipiente care se pot nchide ermetic i
dac estimm c transportul va dura mai mult de 1-2 ore introducem n recipient un tampon de vat sau tifon
umezit cu soluie salin fiziologic. Pentru a preveni multiplicarea bacterian putem aduga p.p. antibiotice (ex.
penicilin, streptomicin, cloramfenicol). Este bine ca volumul de p.p. recoltat s fie ct mai mare. n cazul
candidozelor profunde preferm ca recoltarea s fie urmat imediat de realizarea preparatelor microscopice i
nsmnare pe medii de cultur (la patul bolnavului).
2. Examinarea microscopic a produsului patologic se realizeaz diferit, n funcie de p.p. prelucrat, dar face
parte din orice examen micologic.
n cazul n care examinm o secreie sau un produs obinut prin raclare de la nivel tegumentar sau
fragmente de unghie vom realiza un preparat proaspt (umed), montat n soluie de 10-30% KOH-glicerol.
Putem utiliza pentru colorare calcofluor alb, un fluorocrom care permite evidenierea levurilor datorit faptului
c au n compoziie chitin (la nivelul peretelui celular). Elementele fungice (levuri ovoide, cu dimensiunea de
4/6 mm, pseudomicelii i micelii) apar galben-verzui sau alb-albstrui n funcie de lungimea de und a
radiaiei de excitaie. Punerea n eviden a formaiunilor menionate mai sus permite suspicionarea prezenei
Candida spp., dar pentru confirmarea prezenei C. albicans este necesar obinerea culturilor pure i
identificarea acestora.
n cazul n care examinm secreii de la nivelul mucoaselor vom pregti att preparate umede ct i
frotiuri pe care le vom colora (Gram, AM sau Giemsa). Pentru creterea sensibilitii examinrii preparatelor
umede, acestea vor fi colorate cu calcofluor alb sau cu lactofenol albastru cotton. Indiferent de metoda utilizat,
punerea n eviden a levurilor i pseudomiceliilor ridic o suspiciune, ns datorit prezenei Candida spp., n
flora microbian normal (ex. bucal, vaginal etc) doar punerea n eviden a miceliilor alturi de prezena
formelor levurice (gram pozitive la coloraia Gram) poate permite confirmarea infeciei. Este necesar
obinerea culturilor pure i identificarea acestora. Pe de alt parte, dorim s menionm c o cultur pozitiv n
absena unui examen microscopic pozitiv ridic semne de ntrebare privind diagnosticul infecie cu C. albicans.
n cazul candidozelor profunde, interpretarea se va face difereniat. Atunci cnd p.p. este normal steril
(recoltat prin puncie lombar, lavaj bronho-alveolar, puncie bioptic etc), identificarea structurilor fungice
(levuri, micelii) este foarte important pentru diagnostic. Dac p.p. este reprezentat de urin, materii fecale,
sput sau alt produs potenial contaminat de flora microbian normal, interpretarea este mai dificil n ceea ce
privete semnificaia structurilor fungice observate. Pentru examinarea p.p. recoltate de la pacieni care prezint
candidoze profunde vom realiza att preparate umede ct i frotiuri fixate, colorate prin metodele amintite. Este
posibil ca elementele fungice s apar deformate datorit fixrii precipitatelor de colorant, pe frotiul colorat
Gram. n cazul biopsiilor tisulare am putea utiliza coloraiile histochimice.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii
izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Exist mai multe medii de
cultur care pot fi utilizate. Cel mai cunoscut este mediul Sabouraud (agar, glucoz sau maltoz, polipepton)
produs i de INCDMI Cantacuzino. n cazul p.p. contaminate vom folosi i medii selective, de ex. mediul
Sabouraud cu antibiotice (cloramfenicol, gentamicin i/sau tetraciclin) i/sau mediul Sabouraud cu
cicloheximid. Dorim s menionm c n cazul p.p. necontaminate realizm cultivarea numai pe mediul
Sabouraud neselectiv n timp ce n cazul p.p. contaminate vom realiza cultivarea att pe mediul neselectiv ct i
pe mediile selective. Putem incuba plcile la 22-30 C, dar mai frecvent incubarea se realizeaz la 28 C (sau la
temperatura camerei) i la 35-37 C, timp de 24-96 ore n cazul candidozelor superficiale i pn la maxim 3
sptmni n cazul candidozelor profunde.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Vom realiza att preparate proaspete, colorate de ex. cu lactofenol ct i frotiuri fixate i colorate. Vom
putea remarca prezena levurilor (blastoconidii), rotunde, ovoide sau puin mai alungite, gram pozitive, putnd
prezenta muguri i pseudomicelii. Prin examenul microscopic dovedim i puritatea coloniei.
Dup repicarea pe agar cu fin de porumb sau agar cu extract de cartof (medii srace din punct de
vedere nutritiv), examinarea microscopic a preparatului proaspt va demonstra producerea de chlamidoconidii
(chlamidospori) care apar la extremitatea pseudomiceliilor. Testul este negativ n numai 3-4% dintre cazuri.
Caractere de cultur:
Produc colonii de tip S, rotunde, bombate, netede, asemntoare cu unele colonii bacteriene dar cu
dimensiuni mai mari. Coloniile apar n 1-4 zile, au o culoare alb sau alb-glbuie i consisten cremoas. n
timp suprafaa coloniilor capt un aspect zbrcit.
Caractere biochimice:
Auxanograma: Levurile prezint un anumit echipament enzimatic cu ajutorul cruia pot s utilizeze un
anumit carbohidrat ca unic surs de carbon. Dezvoltarea pe un mediu n care este inclus un singur carbohidrat
demonstreaz utilizarea acestuia ca unic surs de carbon. n mod asemntor se poate testa capacitatea
asimilrii unor substane azotate. C. albicans asimileaz glucoz, maltoz, trehaloz, galactoz etc (vezi i
capitolul 12).
Utilizarea unor teste produse comercial precum API 20C, API 32C, Vitek etc
Relativ recent au fost puse la punct medii cromogene (ex. CHROMagar) care testeaz producerea
anumitor enzime i sunt utile n identificarea C. albicans, C. krusei i C. tropicalis.
Caractere antigenice:
Se pot utiliza reacia de aglutinare pe lam, reacia de latex-aglutinare sau ELISA folosind antiseruri
cunoscute. Ultimele dou tehnici sunt folosite i n scopul identificrii prezenei Ag de Candida spp. n diferite
p.p.
Caractere de patogenitate: