3.

3 PROTEINE
3.3.1 Structura. Conformaia. Configuraia
a) Formula general
O

H2N
C

R
H
aminoacid
N-terminal

R
N
H

C
O

H
N

COOH

R
n aminoacid
C-terminal

unde n > 50.

Proteinele sunt formate din lanuri polipeptidice a cror structur poate fi
determinat prin metoda Edman cu fenilizotiocianat.
b) Structura primar
Se refer la natura i succesiunea aminoacizilor n catena proteinei.
c) Structura secundar
Se refer la forma adoptat de catena polipeptidic n urma formrii de
legturi de hidrogen intra- i intercatenare ntre atomul de hidrogen dintr-o
grupare amidic i o grupare carbonil din alt legtur amidic.
Legtura amidic sau peptidic din proteine este polar, structura real
fiind un hibrid de rezonan n care sunt sarcini pariale la atomii de oxigen i
azot:
H
H
H
C
C
N
C
N
N
..
C + C
C
C
C + C
_
_
:O :
: O:
..
:O
:
..
Legtura peptidic are caracter parial de dubl legtur, fapt ce mpiedic
rotaia liber n jurul legturii C N la temperatura fiziologic i determin
coplanaritatea celor ase atomi implicai n legtura peptidic:
C1,C,O,N,H,C2.
63

Exist posibilitate de rotaie numai n jurul legturilor C1 C i N - C2:

O
C

R H
C

C
O

H
C

H
N

C
H

C
R

O caten polipeptidic poate adopta mai multe conformaii datorate

rotaiilor libere n jurul legturilor simple, dar poate avea dou configuraii limit,
trans i cis, datorate mpiedicrii rotaiei n jurul legturii peptidice CO N:

C 2

H
C
C

_
:O
.. :

N
+

C
_
:O
.. :

C 2

trans

N
+

cis

n configuraia trans cei doi atomi de carbon se afl n colurile opuse

ale planului rectangular care conine toi atomii legturii peptidice. Este o
configuraie mai stabil, iar majoritatea proteinelor naturale adopt aceast
configuraie.
n configuraia cis catenele laterale de aminoacizi legate n poziia sunt
aezate spaial prea aproape, fapt ce determin apariia unor repulsii sterice.
n lanurile polipeptidice care conin restul de prolin cele dou configuraii
sunt la fel de probabile pentru c atomul de azot din prolin face parte dintr-un
ciclu, lanul polipeptidic suferind o uoar curbare.
n legturile de hidrogen care se formeaz, atomul de azot este donorul,
iar atomul de oxigen este acceptorul de hidrogen.
Structura secundar definete o conformaie a scheletului polipeptidic
care se repet regulat.
Prin analize de raze X s-a stabilit c n general exist dou tipuri de
structuri secundare:
* elice - exemplu tipic fiind -keratina din firul de pr sau ln;
64

*conformaie sau de foi pliate - exemplu tipic fiind -keratina din

mtasea natural sau din firele pnzei de pianjen.
A) Elicea
Structura secundar n elice poate fi cu pas de dreapta sau de stnga. Se
constat c stabilitatea elicei de dreapta este mai bun dect a celei de stnga.
Intr-un schelet polipeptidic natural nfurarea (spiralarea) se face spre
dreapta, de-a lungul unei axe longitudinale, fiecare atom de oxigen al grupei
carboxil formeaz o legtur de hidrogen cu atomul de hidrogen care aparine
celui de-al patrulea rest de aminoacid, aflat n aval de partea aminoacidului Cterminal. Legturile de hidrogen sunt aproape paralele cu axa longitudinal a
elicei. Unitatea care se repet, o spir complet a elicei, este format din ~ 3.6
aminoacizi, pasul elicei este de 0.54 nm, iar catenele laterale R sunt orientate
spre exterior (vezi Figura 3.5):

Figura 3.5 Structura secundar de elice a unei proteine

In proteinele cu structur de elice predomin aminoacizii cu catene
laterale mici, fr sarcini electrice, alanina, leucina, fenilalanina fiind destul de
frecvente.
Catenele ncrcate electric sau polare, care au tendina de a se respinge,
destabilizeaz elicea din care fac parte. Astfel de aminoacizi sunt serina,
glutamatul, arginina,etc.
65

Prolina este rar ntlnit n structura de elice .

-Keratinele sunt proteine fibroase a cror structur secundar este de
elice . La vertebrate aceste proteine reprezint componenta principal din pr,
unghii, ciocuri i ghiare.
-Keratinele sunt bogate n cistin ( ~ 22% n coarne, unghii; 10-14% n
pr, piele, ln ; cu ct este mai mare procentul de cistin, cu att este prul
mai cre).
Spectrul de raze X al acestei proteine este diferit dup tratare cu abur i
alungire 100%. In cursul alungirii la temperatur ridicat se rup punile de sulf,
aspectul firului de pr devenind neted, fr ncreituri.
n -keratin unitatea structural care se repet de-a lungul catenei are
0.5 0.55 nm, n timp ce n -keratina are 0.7 nm.
Se constat c spectrul de difracie al firului de pr dup ntindere n
prezena aburului este asemntor cu al -keratinei din mtasea natural, care
nu conine cistein, fiind format din glicocol, alanin i serin.
Firul de pr este format din mai multe microfibrile reticulate prin puni de
sulf. O microfibril este format din opt protofibrile solidarizate prin legturi de
hidrogen sau covalente.
Fiecare protofibril este compus din dou perechi de lanuri nfurate
ntre ele sub form de elice cu pas de stnga, iar fiecare pereche este format
din dou lanuri -elicoidale care conin regiuni nespiralate,nfurate ntre ele
cu pas de stnga.
Deci, protofibrila este o supraelice, aceasta reprezentnd structura
teriar a proteinei.
Adoptarea conformaiei de elice depinde de pH, mrimea catenelor
laterale sau de polaritatea catenelor laterale.
Astfel, polialanina formeaz elice la pH = 7, polilizina la pH = 12, iar
acidul poliglutamic la pH = 2.
Poliizoleucina nu formeaz elice datorit grupelor laterale voluminoase
n vecintatea carbonului .
Poliglicina nu formeaz elice , ci adopt o conformaie de foi pliate.
B) Conformaie
n structura secundar de conformaie lanurile polipeptidice sunt
aproape complet ntinse. Atomii de oxigen i de hidrogen ai legturilor amidice
sunt aezai aproape perpendicular pe axa lanului polipeptidic ntins.
66

Conformaia denumit foi pliate rezult n urma formrii legturilor de

hidrogen ntre lanuri polipeptidice vecine.
Aceast structur nu este riguros plan, ci este pliat datorit unghiurilor
dintre legturile lanului polipeptidic.
Exist dou feluri de conformaii : paralel i antiparalel.
Catenele laterale ale aminoacizilor componeni sunt dirijate alternativ de-o
parte i de alta a planului foii.
Conformaia cu lanuri paralele

N
H

H R
C

C
O

H
N
H

H
N

R
C

C
H

N
H

H
N

N
H

C
H

O
H R
C

H
N

N
H

R
C

H
N

R
C
C

N
H

Conformaia cu lanuri antiparalele

R

H
N
H

C
O

O
C

C
H

H
N
O

N
H

R
H
C

C
R

H
N

R
N
H

O
C

H
N

C
R
R

C
C

C
H

H
N

N
H

H
C
N
H

C
H

unde N = aminoacid N-terminal i C = aminoacid C-terminal

67

Fibroina din mtasea natural cu unitatea structural de baz

(Ser-Gly-Ala-Gly)n are o structur cu lanuri antiparalele, iar catenele laterale
ale serinei i alaninei se gsesc aezate alternativ de o parte i de alta a
lanurilor polipeptidice.
Fibroina este flexibil pentru c unirea foilor pliate este asigurat numai
prin legturi van der Waals ntre catenele laterale ale aminoacizilor din foile
vecine. Fibra este stabilizat prin legturi de hidrogen ntre lanuri vecine.
Ins fibroina din mtasea natural este aproape inextensibil pentru c
lanurile polipeptidice sunt deja aproape complet ntinse.
In structurile cu conformaie nu se gsesc anumii aminoacizi: metionina
sau cisteina, etc. Prolina este ns deseori prezent dei are tendina de a
dizloca foile introducnd torsiuni ale lanurilor polipeptidice.
Conformaiile lanurilor polipeptidice
Poziiile prezentate mai sus pentru structurile cu conformaie cu lanuri
paralele i antiparalele sunt poziiile extreme cele mai stabile.
Caracterul parial de dubl legtur a legturii peptidice exclude rotaia
liber n jurul acestei legturi,libertatea de rotaie fiind limitat numai n jurul
legturilor simple C - C1 i N - C2 vecine legturii peptidice, precum i n
majoritatea legturilor simple din catenele laterale.
Poziia acestor grupe mobile la nivelul unui rest de aminoacid dat
definete conformaia lanului polipeptidic. Exist un numr mare de interaciuni
i aezarea final a unei catene laterale este dat de minimalizarea repulsiilor
sterice din caten.
Conformaiile pot fi :
- eclipsate n care repulsiile sunt maxime, iar lanul polipeptidic are
energie maxim, iar atomii de hidrogen sunt aezai n poziii foarte apropiate.
- intercalate este conformaia predominant, n care atomii de hidrogen
sunt aezai ct mai departe posibil unul de cellalt; este o conformaie cu
energie joas, deci mai stabil.
Ramachandran a propus o diagram bidimensional (Figura 3.6) care
poate oferi informaii n legtur cu conformaiile stabile ale unui lan polipeptidic
n funcie de unghiurile de rotaie i :

68

C1
O1

H1
N1

O2

C2

C
N2
H2

Aceast diagram prezint conformaiile observate ntr-o caten

polipeptidic, regiunile interzise din motive sterice, precum i regiunile permise
pentru aezarea diferitelor catene laterale.

Figura 3.6

Diagrama Ramachandran

3.3.2 Structuri suprasecundare

Structurile supramoleculare se refer la configuraii stabile ale unor lanuri
polipeptidice :
- lanuri --

- cheie greceasc:

69

- meandre :

d) Structura teriar
Structura teriar este dat de poziia relativ n spaiu a lanurilor
polipeptidice care formeaz o protein (vezi i pag.66).
Ea este determinat de formarea altor tipuri de legturi ntre catenele
laterale R ale aminoacizilor:
- interaciuni van der Waals ntre resturi alchilice :
CH
CH
H3C
H3C

CH3
CH3
CH
CH

-legturi de hidrogen:
CH

C=O

-legturi covalente i electrovalente:

CH
CH2

S
S

NH3

CH2
CH

70

Structura teriar este foarte important pentru enzime.

Ea reprezint conformaia nativ care este caracterizat prin existena
activitii biologice.
e) Structura cuaternar
Unele proteine sunt formate prin asocierea unor lanuri polipeptidice cu
structur identic sau diferit.
Aranjarea spaial a acestor subuniti polipeptidice definete structura
cuaternar a proteinei.
Exemple:
- hemoglobina : este format din patru lanuri polipeptidice 22 fiind un
dimer care conine dou tipuri de lanuri polipeptidice () numite protomeri.
Asamblarea celor patru protomeri n deoxihemoglobin se face astfel:

In timpul oxigenrii fiecrei subuniti, structura cuaternar se modific: se

micoreaz distana ntre 2 - 1 i 2 - 1, dar se menin nemodificate distanele
1 - 1 i 2 - 2:

71

In literatur structura cuaternar a deoxihemoglobinei se noteaz cu T, iar

cea a oxihemoglobinei cu R.
- aspartat transcarbamoilaza (ATCaza) din Escherichia Coli
Este format din dou feluri de subuniti: cu rol catalitic (C) i cu rol de
reglare (R).
La determinarea masei moleculare s-a stabilit compoziia C 6R6 ( masa
molecular a ATCazei = 300kD, a subunitii catalitice C = 33 kD, iar a
subunitii de reglare R = 17 kD).
Studiile de raze X au permis stabilirea aezrii spaiale a celor 12
protomeri:

- lactatdehidrogenaza (LDH) bovin

Este format din patru protomeri identici (M 4 i H4) sau diferii (MH3, MH2,
M3H). Cele cinci izozime au mobiliti electroforetice diferite, fapt ce a permis
izolarea lor n stare pur:

72

3.3.3 Clasificarea proteinelor

* Dup forma catenei:
- fibroase sau scleroproteine: -keratina, -keratina,colagenul,elastina
- globulare sau sferoproteine: albumine, globuline
* Dup solubilitatea n ap:
- insolubile: proteinele fibroase
- solubile: proteinele globulare
* Dup compoziie:
- holoproteine dau la hidroliz numai aminoacizi
- heteroproteine dau la hidroliz aminoacizi i grupe prostetice
Exemple de heteroproteine:
- metaloproteine
- cromoproteine
- fosfoproteine
- glicoproteine
- lipoproteine
- nucleoproteine
- glicofosfoproteine

grupa prostetic
metal
hem, clorofil,etc.
acid fosforic
glucide
lipide
acizi nucleici
glucid + acid fosforic

3.3.3.1 Proteine fibroase

a) -Keratina
Acest tip de protein se gsete n pr, ln, unghii, piele, ciocuri i
ghiare. Este format din lanuri polipeptidice cu conformaie de elice ,
aminoacizii componeni avnd catenele laterale mici i hidrofobe. Moleculele keratinei sunt lungi, iar elicea pe care o formeaz are axa parelel cu axa fibrei
din care face parte i care are structura asemntoare cu cea a unui cablu
torsadat:
73

- unitatea de baz este protofibrila format din trei lanuri elicoidale de

dreapta spiralate ntre ele cu pas de stnga sau din dou perechi de lanuri n
elice , nfurate una n jurul celeilalte sub form de elice de stnga formnd o
supraelice stabilizat prin legturi de hidrogen i covalente, precum i prin
interaciuni van der Waals (vezi pag.66).
- opt pn la 11 protofibrile se asociaz ntre ele cu formarea unei
microfibrile. Datorit structurii elicoidale a lanurilor polipeptidice, firele de pr
sunt extensibile.
b) -Keratina
Se gsete n fibroina din mtasea natural, n pnza de pianjen, penele
psrilor,etc. Structura sa este conformaia cu lanuri antiparalele fiind
caracterizat de rezisten la ntindere (fibroina, pag. 67).
c) Colagenul
Colagenul se gsete n tendoane, piele i matricea oaselor, reprezentnd
o treime din masa proteic a unui organism viu.
Unitatea de baz a colagenului este tropocolagenul, format din trei
lanuri polipeptidice, spiralate cu pas de stnga, nfurate unul n jurul celuilalt
n elice cu pas de dreapta. Fiecare lan este format din circa 1000 de
aminoacizi, cu o spir de aproximativ 3,3 resturi de aminoacizi.
Stabilitatea supraelicei este asigurat de legturi de hidrogen i covalente.
Legturile de hidrogen intercatenare se formeaz cu ajutorul grupelor
hidroxil din 4-hidroxiprolin i 5-hidroxilizin.
Hidroxilarea prolinei se face n prezena prolinhidroxilazei, oxigenului, cetoglutaratului i vitaminei C:

74

CH

CH2

H2C
H

CO

_ prolinhidroxilaza
+ O2 + COO
vitamina C
CH2
CH2
CO

C
H

COO
CH

CH2

H2C
C
H

CO

_
COO
+
+ CO2
CH2
CH2

OH

COO

n mod asemntor se hidroxileaz lizina n prezena lizinhidroxilazei cu

formarea 5-hidroxilizinei.
Lipsa din organism a vitaminei C mpiedic aceste hidroxilri, fapt ce
determin scderea rezistenei pielii i a vaselor sanguine.
Dermatoza i sngerarea gingiilor sunt simptomele avitaminozei C (boala
numit scorbut).
Colagenul conine mult glicin (~ 30%) i prolin (~ 25%), astfel c
secvena de aminoacizi care se repet este (Gly-Pro-X) sau (Gly-X-Hypro),
unde X este un alt aminoacid, iar Hypro este 4-hidroxiprolina.
Rezistena sa este foarte mare datorit prezenei unor legturi covalente
ntre supraelicele tropocolagenului. Aceste legturi se realizeaz n urma unor
reacii enzimatice n care lizina sufer o oxidare la grupa amino din catena
lateral:

CO

lizinoxidaza
+
CH (CH2)3CH2NH3
NH

O2

CO
CH

(CH2)3 CHO

NH
+
NH4+H2O
allizina

Allizina se condenseaz fie cu un alt rest de lizin, fie cu un rest de allizin

astfel:
75

CO
CO
CH (CH2)3 CHO + H2N (CH2)4CH
NH
NH

CO
CH (CH2)3 CH=N

_ HO
2

NH
(CH2)4 CH
CO

NH
reductaza

NH

CO
CH

(CH2)3 CH2NH (CH2)4 CH

NH

CO

CO
CO
CH (CH2)3 CHO + H2C (CH2)2 CH
NH
NH
CHO

CO
CH (CH2)3 CH=C
NH

NH
(CH2)2 CH

CHO

CO

reductaza
NH

CO
CH (CH2)3 CH2CH
NH

(CH2)2 CH

CHO

76

CO

_ HO
2

Colagenul fixeaz cu ajutorul resturilor hidroxil din 5-hidroxilizin oligozaharide, el fiind o glicoprotein. O dizaharid des ntlnit n colagen este cea format
dintr-un rest de -D-glucoz i unul de -D-galactoz prin aciunea unor enzime
specifice: galactoziltransferaza i glucoziltransferaza:
+ NH3
CH2
CH2OH
O
O CH
HO H
NH
OH H
H (CH2)2 CH
HOH2C H
H
CO
O
H
HH
OH H
O
HO
H

OH

d) Elastina
Se gsete n esutul conjunctiv. Este o protein fibroas, flexibil i
extensibil n toate direciile datorit prezenei n compoziia sa a dezmozinei, care se
formeaz din allizin prin condensare cu lizin:
NH CH CO
(CH2)3
CO

CO

CHO

CH (CH2)2

CH2

NH

CHO

H2C
NH2

CHO

(CH2)4
NH

CH
77

(CH2)2 CH

CO

NH

NH

CH CO
(CH2)3

CO

CO
(CH2)2 CH

CH (CH2)2
+
N

NH

NH

(CH2)4
CH

NH

CO

Elastina are o conformaie neregulat, n lanuri dezordonate n raport cu

structura regulat a colagenului i a keratinelor. In elastin se gsesc n proporie mare glicina, prolina i lizina. 4-Hidroxiprolina se afl n cantitate foarte
mic, iar 5-hidroxilizina este absent. Structura elastinei se aseamn cu o
estur flexibil, format din lanuri reticulate, extensibil n toate direciile:

Structura elastinei: 1- n stare relaxat; 2- n extensie

3.3.3.2 Proteine globulare

78

Proteinele globulare au forma sferic sau oval. Ele sunt foarte importante
n viaa celulei avnd activitate biologic specific, spre deosebire de proteinele
fibroase care au funcie structural i mecanic.
Majoritatea proteinelor globulare sunt enzime (catalizatori biologici)
absolut indispensabili celulei vii.
Imunoglobulinele au rol de aprare a organismului viu mpotriva bolilor.
Mioglobina i hemoglobina sunt proteine responsabile pentru transportul
oxigenului.
De asemenea, proteinele globulare transport lipide, hormoni sau
mediatori hormonali.
Conformaia acestor proteine este foarte complex.
Astfel, mioglobina este format din opt segmente de elice , racordate
ntre ele, formnd o structur globular. Unitatea fixatoare de oxigen este hemul
cu structur porfirinic i cu un atom de fier bivalent, care reprezint 0.335% din
masa mioglobinei:
CH=CH2
H3C

CH3
CH=CH2

+2 N
Fe
N
N

CH3

H3C
_

OOCCH2CH2

CH2CH2COO

Structura hemului

79

Curba de saturare cu oxigen a mioglobinei este de tip hiperbolic:

Figura 3.7: Variaia saturrii mioglobinei cu oxigen n funcie de

presiunea parial a oxigenului
Albuminele i globulinele sunt proteine globulare care nu conin glicocol,
un aminoacid care mpiedic formarea elicei .
Dup sursa din care se separ se cunosc:
- albumine serice , globuline serice izolate din plasma sanguin
- lactalbumine, lactoglobuline din lapte
- ovalbumine, ovoglobuline din ou
- mioalbumine, miozina din muchi.
3.3.3.3 Proprietile fizice ale proteinelor
Pentru a putea caracteriza proteinele este necesar izolarea lor n stare
pur prin metode de separare specifice:
a) Determinarea masei moleculare
Determinarea masei moleculare a unei proteine se poate face prin
ultracentrifugare sau gel-filtrare.
Masa molecular se msoar n daltoni [ 1 dalton (D) = 1.67 x 10 -24 g], iar
masele moleculare ale proteinelor variaz ntre cteva mii i sute de mii de
daltoni.
80

* Metoda ultracentrifugrii
Acest procedeu se bazeaz pe proprietatea proteinelor de a se sedimenta
n funcie de mrimea, forma i densitatea lor. Un rol important n procesul de
sedimentare l joac densitatea solventului.
Masa molecular se calculeaz cu ecuaia Svedberg:
sRT
M = --------------------D (1 v )
unde : s = coeficientul de sedimentare
= densitatea solventului
R = constanta gazelor (8.31.107 erg/mol. oK)
D = coeficientul de difuzie
v = volumul specific parial
T = temperatura absolut (oK)
Obs.: v = creterea volumului cnd se adaug 1 g de substan uscat la un
volum de solvent infinit de mare. Pentru majoritatea proteinelor volumul parial
specific este de ~ 0.74 cm3/g.
Coeficientul de sedimentare de 1.10-13 se numete unitate Svedberg.
n Tabelul 3.3 sunt date constante fizice pentru cteva proteine.

Tabelul 3.3: Exemple de constante fizice ale unor proteine

Proteina
mioglobin
chimotripsinogen
-lactoglobulin
albumin seric
uman
hemoglobin
uman
fibrinogen uman

Masa
molecular
(daltoni, D)
16.700
23.240
37.100
68.500

Coeficientul
de difuzie
(D20.107 cm2/ s)
11,3
9,5
7,48
6,1

Coef.de
sedimentare
(s20.1013, s)
2,04
2,54
2,85
4,6

64.500

6,9

4,46

339.700

1,98

7,63

81

* Gel-filtrarea
Este separarea moleculelor de proteine prin trecerea pe o coloan
umplut cu gel de poliacrilamid (Biogel) sau dextran (Sephadex). Moleculele
cu dimensiuni mai mari dect porii gelului sunt antrenate spre ieirea din
coloan, iar moleculele mai mici dect porii gelului trec prin aceti pori, astfel
nct avansarea lor este ntrziat. Aceste geluri se comport ca nite site
moleculare, care cern moleculele dup mrimea lor.
Se calibreaz coloanele cu proteine cu mase moleculare cunoscute i
apoi se separ amestecuri necunoscute.
* Determinarea masei moleculare minime
pe baza compoziiei chimice
O metod mai simpl pentru determinarea masei moleculare minime se
aplic pentru cromoproteinele care au un atom de metal drept grup
prostetic.
Exemplu: pentru masa mioglobinei se folosete relaia:
masa atomic a fierului
M = -------------------------------- . 100 =
% fier

55.8
------ x 100 = 16.700 daltoni
0.335

Masa molecular real este un numr ntreg al valorii masei minime.

Astfel, pentru hemoglobin, care conine patru lanuri polipeptidice
asemntoare mioglobinei, masa molecular este: 4x 16.700= 66.800 daltoni.
b) Proprieti amfotere
Proteinele globulare au n molecul grupe acide i bazice, care pot avea
sarcin electric n funcie de pH, astfel nct proteinele pot fi anioni, amfioni
sau cationi.
La punctul izoelectric concentraia anionilor este egal cu cea a cationilor,
forma majoritar fiind cea amfionic. Solubilitatea proteinei este minim i astfel
proteina se poate separa din soluie.
c) Proprieti electroforetice
82

Proteinele au capacitatea de a migra n cmp electric spre anod sau spre

catod n funcie de sarcina electric global, putndu-se separa astfel.
Deplasarea unei proteine aflat n soluie sub aciunea cmpului electric
poart numele de mobilitate electroforetic i se noteaz cu :
= v / E [ cm2 s-1 V-1]
unde v = viteza de migrare [ cm / s]
E = valoarea cmpului electric [Volt /cm]
Mobilitatea electroforetic este dependent de pH-ul soluiei tampon n care se
efectueaz electroforeza.
d) Proprieti coloidale
In soluii diluate proteinele exist sub forma unor coloizi hidrofili: sisteme
heterogene formate dintr-o faz dispersat i una dispersant.Faza dispersat
(proteina) prezint afinitate pentru ap i se poate mbiba cu ap.
Proteinele nu dializeaz prin membrane semipermeabile datorit
caracterului coloidal.
In soluii concentrate, proteinele formeaz agregate macromoleculare
numite micele.
e) Denaturarea proteinelor
Dezorganizarea structurii native (teriare) a proteinelor sub aciunea unor
ageni agresivi se numete denaturare.
Ageni fizici: cldur, agitare, radiaii UV i X, ultrasunete;
Ageni chimici: -acizi minerali: HCl, HClO4, H3PO4, H2SO4;
-acizi organici: trifluoroacetic, picric;
-baze: NaOH, KOH;
-detergeni, uree
-metale grele: mercur, plumb
-solveni: etanol absolut, aceton.
Denaturarea proteinelor poate fi reversibil sau ireversibil.
Ea modific conformaia nativ ordonat a proteinei ntr-o stare dezordonat,
mrind n acelai timp entropia.

83

Consecinele denaturrii sunt: pierderea activitii biologice, micorarea

solubilitii, mrirea vscozitii, mrirea activitii optice, creterea valorii
punctului izoelectric.
Denaturarea reversibil se produce atunci cnd la nlturarea agentului
agresiv, lanul polipeptidic al proteinei i reface spontan structura teriar i i
recapt activitatea biologic.
Exemplu: Ribonucleaza (enzima care catalizeaz hidroliza legturilor
3,5-fosfodiesterice din ARN) n prezena ureei i a -mercaptoetanolului sufer
denaturare n cursul creia se rup cele patru puni de sulf din interiorul moleculei
i i pierde funcia biologic:

La nlturarea ureei i a mercaptoetanolului, cele patru legturi de sulf se

reformeaz i ribonucleaza devine din nou activ biologic.
f) Solubilitatea proteinelor
Solubilitatea proteinelor n soluii apoase depinde de tria (fora) ionic
(prezena electroliilor, concentraia i sarcina ionilor pe care-i formeaz).
Fora ionic se calculeaz cu urmtoarea formul:
fi = 1/2 [ (c z2)i ]
unde: fi = fora ionic; c = concentraia molar a fiecrui ion;
z = valena fiecrui ion.
Srurile neutre, caracterizate prin trie ionic, influeneaz semnificativ
procesul de solubilizare a proteinelor(exemplu: sulfatul de amoniu).
84

Descrierea proteinelor dup solubilitate

1. Albumine
Sunt solubile n ap distilat, soluii saline, acizi i baze diluate.
Sunt solide, precipit n soluii saturate de sulfat de amoniu sau de sodiu.
Se coaguleaz la 60o - 70o C, au mobilitate electroforetic mare.
Rolul albuminelor:
- tampon al pH-ului sanguin;
- regleaz presiunea osmotic a sngelui;
- transport acizi grai, anioni, medicamente;
- rezerv de proteine.
2. Globuline
Sunt greu solubile n ap sau insolubile; sunt solubile n soluii saline i
baze diluate.
Separarea globulinelor de albumine se face prin precipitare n soluii
saline. Au mase moleculare mai mari n raport cu albuminele, fiind mai greu
cristalizabile.
La electroforeza globulinelor serice se obin cinci fracii: 1, 2, 1, 2, .
Nivelul lor variaz n funcie de specia animal sau de starea patologic a
organismului respectiv.

3. Histone
Sunt proteine solubile avnd mase moleculare mici. Conin lizin i arginin n proporie de 30-90%, avnd un caracter bazic; punctul izoelectric este
aproximativ 11.
Histonele sunt coagulabile la nclzire.
In celula vie se gsesc libere n leucocite i n asociaie cu acizi nucleici n
nucleoproteine.
Rolul histonelor este acela de reglare a activitii genelor.
4. Protamine
85

Sunt solubile n ap, au caracter mai bazic dect histonele, fiind formate n
proporie de 80 90% din aminoacizi bazici. Nu conin triptofan, cistein,
fenilalanin, tirozin i nu se coaguleaz la nclzire.
5. Prolamine
Sunt insolubile n ap, solubile n soluii diluate de acizi, baze, n metanol,
glicerin , etanol 70% i greu solubile n etanol absolut.
Diferena de solubilitate n etanol de diverse concentraii este utilizat pentru
operaiile de separare.
Au coninut mic n lizin i triptofan, iar valoarea nutritiv este mic.
Nu se coaguleaz la nclzire.
6. Gluteine
Sunt insolubile n ap, dar solubile n soluii alcaline diluate.
Sunt insolubile n etanol. Au valoare nutritiv mai mare n raport cu
prolaminele.
Gluteina se gsete n boabele de gru sub form de gluten ( 25 40%)
mpreun cu gliadina (40 50%). Glutenul faciliteaz formarea aluatului capabil
s rein dioxid de carbon.
7. Proteine fibrilare (fibroase, scleroproteine)
Sunt insolubile n ap, acizi i baze diluate. (vezi keratinele, colagenul,
elastina, pag.73).

8. Miozina
Este proteina contractil din muchi. Are structura parial globular, parial
fibrilar:

86

Miozina conine aminoacizi acizi i bazici.

Cu partea globular se leag de o protein (actina) i formeaz
actinomiozina activ n procesul contractil.
Energia necesar procesului de contracie se obine din hidroliza ATP-ului
n ADP i fosfat.
3.3.3.4 Descrierea proteinelor dup compoziie
1. Metaloproteine
Sunt heteroproteine n care grupa prostetic este un metal legat
coordinativ sau covalent: fier, cupru, magneziu, zinc, cobalt.
Exemple:
-feritina - conine 23% fier i constituie forma de rezerv de fier gsinduse n mduv i ficat.
-siderofilina conine 0.12% fier , transport fierul i se gsete n splin.
-transferina conine 0.13% fier, este solubil n ap i are doi atomi
de fier n molecul.
-seruloplasmina (n plasma sanguin) i hemocupreina (n hematii) sunt
proteine transportoare de cupru.

2. Cromoproteine
Sunt heteroproteine care au drept grup prostetic un compus colorat.
Exemple:
87

A) Mioglobina, conine 153 resturi de aminoacizi, grupate n opt

segmente de elice unite prin poriuni neelicoidale, alctuite din prolin, serin,
izoleucin i o molecul de hem (vezi pag.79), capabil s fixeze reversibil o
molecul de oxigen la ionul de fier bivalent central.
Molecula de mioglobin este compact, catenele laterale ale aminoacizilor
sunt orientate spre interior, iar hemul este plasat ntr-un buzunar cptuit cu
resturi de aminoacizi nepolari, grupele metil i vinil fiind dirijate spre centrul
hidrofob, iar grupele carboxilat spre exterior:

Figura 3.8: Structura mioglobinei

B) Hemoglobine
Sunt cromoproteine care transport oxigen, iar structura lor variaz n
funcie de: specia animal, esut, vrst ( hemoglobina adultului este diferit de
cea a foetusului),starea de sntate.
Hemoglobina este format din globin (96%) i hem (4%).
Structura sa a fost elucidat cu ajutorul razelor X: este format din patru
uniti polipeptidice (protomeri), asemntoare mioglobinei: dou uniti care
conin cte 141 resturi de aminoacizi i dou uniti ,formate din cte 146
resturi de aminoacizi. Fiecare lan are ataat cte un hem, structura electronic
a atomului de fier fiind d2sp3, tip piramid dubl, cu baza un ptrat (format din
cei patru atomi de azot din ciclurile porfirinei).
88

Legturile Fe+2 N sunt dou cte dou perpendiculare pe celelalte, iar

legturile Fe+2 O2 i Fe+2 histidin (din globin) sunt perpendiculare pe acest
plan:

O
O
N

2+

Fe
N

N
N
NH

NH

CH2
CH CO

Figura 3.9: Modul de legare a hemului de protomerul

oxihemoglobinei
* Combinaii ale hemoglobinei cu gaze
a) Combinaia cu oxigenul
Rolul esenial al hemoglobinei este de a transporta oxigenul de la plmni
la esuturi, fiind capabil s formeze o combinaie reversibil cu oxigenul numit
oxihemoglobin:
[Hb]4 + 4 O2

[HbO2]4

Cantitatea maxim de oxigen pe care poate s o lege 100 mL de snge

(care conine ~ 15g hemoglobin) este de aproximativ 20 mL.
Presiunea parial a oxigenului influeneaz deplasarea echilibrului de
oxigenare. Capacitatea de saturare a hemoglobinei este de ~ 96% (n plmni
presiunea parial a oxigenului este de ~ 100 mmHg), iar variaia sa cu
presiunea parial a oxigenului este o curb cu aspect de sigmoid (vezi Figura
3.10).
Mioglobina absoarbe oxigen repede i se satureaz la presiune parial
sczut a oxigenului n amestecul de gaze.
89

Hemoglobina este saturat la presiunea arterial a oxigenului.

La presiunea venoas mioglobina din muchi cedeaz aprox. 10% din
oxigen, n timp ce hemoglobina cedeaz aproape 50% din oxigenul fixat, fapt ce
permite ca oxigenul s fie transferat de la snge la muchi.
Curba de oxigenare a mioglobinei este de tip hiperbolic, iar forma de
sigmoid a curbei de oxigenare a hemoglobinei reflect o interaciune ntre cele
patru uniti de hem, astfel c fixarea unei molecule de oxigen uureaz fixarea
celorlalte trei.

Figura 3.10: Comparaie ntre oxigenarea hemoglobinei i mioglobinei

Aceast interaciune se explic prin procesul de cooperare care se
manifest prin apariia unor tranziii alosterice.
Molecula de oxigen se leag coordinativ, fr modificarea strii de oxidare
a fierului.
Fixarea reversibil a oxigenului la ionul de fier bivalent se face prin
eliberarea unei molecule de ap prin care unitatea de hem este legat de
globin ( vezi Figura 3.11).
Echilibrul de oxigenare permite cedarea oxigenului la nivelul esuturilor
unde presiunea parial a oxigenului este sczut ( aprox. 30 mmHg).
pH-ul influeneaz echilibrul de oxigenare al hemoglobinei.
La nivelul esuturilor unde concentraia dioxidului de carbon este mare,
concentraia ionilor de hidrogen crete, fapt ce favorizeaz eliberarea de oxigen:
_
+
CO2 + 2 H2O
H3O + HCO3
90

+
[HbO2] + H3O

[HbH] + O2 + H2O

Deci, la scderea pH-ului, crete concentraia oxigenului, respectiv

presiunea sa parial. Acest efect poart numele de efect Bohr i determin
variaia capacitii de saturare cu oxigen a hemoglobinei ntre 65% (n esuturi)
i 96% (n plmni) (Figura 3.12).

CH CO
CH2

NH

globina + apa

HN
O

H
O
N

2+

O2

Fe

Fe
N

N
N

NH

N
NH

NH
NH

2+

CH2
CH

CO

CH2
CH CO

Figura 3.11: Oxigenarea unui protomer al hemoglobinei

91

Figura 3.12: Influena pH-ului asupra oxigenrii hemoglobinei

Mecanismul oxigenrii hemoglobinei
S-au propus dou tipuri de mecanism:
a) Modelul concertat (Monod-Wyman-Changeux) pentru oxigenarea
hemoglobinei presupune c n absena oxigenului hemoglobina se afl n dou
forme conformaionale, n echilibru: una cu afinitate mare pentru oxigen
(relaxat, R), iar cealalt cu afinitate sczut (tensionat, T):

n absena oxigenului, forma predominant este T.

n prezena oxigenului,forma relaxat R se va oxigena repede i astfel are
loc deplasarea echilibrului ctre forma R pn la oxigenarea complet a ntregii
cantiti de hemoglobin.
b) Modelul secvenial (Koshland-Nemethy-Filmer) presupune c fixarea
unei molecule de oxigen la unul din protomerii hemoglobinei, aflate n
conformaie tensionat T, provoac o transformare conformaional ntr-un
protomer vecin, care conduce la schimbarea conformaiei tensionate n cea
92

relaxat, cu afinitate mare pentru oxigen. Deci, conformaiile intermediare sunt

un amestec de conformaii relaxate i tensionate ale protomerilor:

Acest mecanism se bazeaz pe trei argumente:

- proteina are o singur conformaie n absena oxigenului;
- fixarea oxigenului la un protomer conduce la schimbarea conformaiei sale;
- noua conformaie afecteaz afinitatea protomerilor vecini pentru
oxigen.
b) Combinaia hemoglobinei cu dioxidul de carbon
Hemoglobina reacioneaz cu dioxidul de carbon i se transform n
carbohemoglobin.
Astfel este transportat dioxidul de carbon format la nivel de esut (unde
presiunea sa parial este mare) spre plmni, unde presiunea sa parial
este mic; carbohemoglobina se descompune i dioxidul de carbon este
eliminat prin respiraie.
O grupare amino liber din hemoglobin poate fixa CO 2 i formeaz un
compus disociabil ( forma carbamat):

Hb NH2 +

_
+
Hb NHCOO + H

CO2

c) Combinaia hemoglobinei cu oxid de carbon

Hemoglobina are o afinitate mai mare pentru oxidul de carbon n
comparaie cu oxigenul, astfel nct 50% din hemoglobina din snge se
transform n carboxihemoglobin, ntr-o or, cnd aerul conine numai
0.07% volume de CO:

Hb + CO

HbCO
93

Constanta de echilibru n cazul formrii carboxihemoglobinei este de 300

de ori mai mare dect constanta de echilibru a reaciei de oxigenare.
HbCO este un compus toxic, puin disociabil.
Dac 50% din hemoglobina din snge este blocat sub form de
carboxihemoglobin, organismul respectiv se asfixiaz.
C) Cloroplastina
Este o protein vegetal format dintr-o parte proteic (plastina) i o
parte prostetic (clorofila).
Clorofila este un compus porfirinic asemntor hemului din hemoglobin, dar substituit diferit, iar metalul central este ionul de magneziu.
Clorofila exist n dou forme, a i b, cu structura prezentat n Figura
3.13.
In fotosintez radiaiile luminoase sunt absorbite selectiv numai de
clorofila b, care emite prin fluorescen radiaii care pot fi absorbite de
clorofila a, lrgind astfel regiunea spectral efectiv utilizat n fotosintez.
Raportul molar ntre cele dou forme de clorofil este de 3 : 2.
In pigmenii din frunzele verzi aceste clorofile sunt nsoite de dou
carotenoide: xantofila i carotina.

CH=CH2
H3C

H3C
H

CH3 (CHO in clorofila b )

CH2CH3

N 2+ N
Mg
N

H
ROOCCH2CH2

CH3

CH CO
COOCH3

R = rest fitil (C20H39) : H( CH2CHCH2CH2)3 CH2C=CHCH2

CH3
Figura 3.13: Structura clorofilei a i b
94

CH3

3. Glicoproteine
Glicoproteinele sunt heteroproteine formate dintr-o parte proteic i un
rest glucidic: monozaharide, oligozaharide sau polizaharide. Se gsesc n
plasma sanguin, saliv, secreia mucoaselor, etc.
Glicoproteinele protejeaz mucoasele aparatului digestiv, respirator i
uro-genital mpotriva enzimelor proteolitice, a agenilor chimici i mecanici.
Sunt componente specifice de grup sanguin i mpiedic aglutinarea
hematiilor.
Exemple:
Colagenul conine o dizaharid format dintr-un rest de -D-glucoz
legat (1- 2) de un rest de -D- galactoz, iar galactoza se leag de protein
prin intermediul grupei OH din poziia 5 a unui rest de lizin (vezi structura la
pag. 76).
Ovomucoidul restul glucidic este 2-N-acetil--D-galactozamin
legat cu grupa OH glicozidic de un rest asparagil.
Mucopoliglucidele sunt glicoproteine n care predomin componenta
glucidic format din: galactoz, glucoz, manoz, xiloz, glucozamin, Nacetilgalactozamin, acid glucuronic i galacturonic.
4. Lipoproteine
Lipoproteinele sunt formate dintr-o parte proteic i una lipidic.
In funcie de locul unde se gsesc n organism, lipoproteinele sunt:
- celulare (n membrane, mitocondrii, cloroplaste) i
- circulante (n snge).
Din serul sanguin s-au separat prin centrifugare un numr mare de
lipoproteine circulante.
Lipoproteinele au densitatea cu att mai mic cu ct coninutul lor n
lipide este mai mare. La centrifugare ele se ridic la suprafa, prezentnd
fenomenul de flotaie. Unele lipoproteine conin ~ 80% lipide: triacilgliceroli,
colesterol, steride.
Cea mai studiat lipoprotein este -lipoproteina.
S-au mai izolat lipoproteine din mitocondriile hepatice i lipoviteline din
glbenuul de ou.
95

Rolul lipoproteinelor
- ajut la transportul unor compui dintr-o parte n alta a membranei
celulare datorit caracterului hidrofil al prii prostetice;
- furnizeaz energie celulei.
Lipoproteinele celulare se gsesc n membrane, mitocondrii i cloroplaste.
5. Fosfoproteine
Gruparea prostetic din fosfoproteine este acidul fosforic legat printr-o
legtur esteric de o grupare OH din serin, treonin sau tirozin.
In fosforilserin gruparea fosforic este legat de un rest de serin:

NHCHCONHCHCONHCHCO
CH2
R
_ R
2
OPO3
Fosfoproteinele au un caracter acid i pot forma sruri de calciu sau
potasiu.
Se gsesc n lapte, ou, etc.
Exemple:
* cazeinele din lapte
* ovovitelinele din glbenuul de ou
Cazeinele sunt insolubile n mediu acid. Ele sunt principalele proteine
din lapte. Prin electroforez s-au izolat trei tipuri de cazein cu mobilitate
electroforetic diferit: , , - cazeina.
La fierberea laptelui cazeinele nu precipit, ele protejeaz albuminele
i globulinele contra coagulrii. Ionii de Ca 2+ precipit cazeinatul de calciu,
insolubil n ap, care este digerat n stomac prin aciunea enzimelor
proteolitice.
Cazeinele conin toi aminoacizii eseniali i de aceea prin coninutul n
cazein, laptele este un aliment cu valoare nutritiv foarte mare.
Fosfoproteinele din glbenuul oului sunt asociate cu lecitinele, fiind o
surs de aminoacizi i de fosfat pentru dezvoltarea embrionului.

96

6. Nucleoproteinele
Grupa prostetic a acestor heteroproteine sunt acizi nucleici.
In funcie de acidul nucleic, nucleoproteinele pot fi :
- ribonucleoproteine cu ARN ( exemplu: ribozomii)
- deoxiribonucleoproteine cu ADN prezente n nucleul celular.
Rolul nucleoproteinelor este de a stabiliza configuraia acizilor nucleici.
3.3.3.5 Procedee de separare i purificare a proteinelor
a. Dializa
Proteinele globulare aflate n soluie pot fi uor separate de substane cu
molecule mici prin dializ. Se utilizeaz o membran semipermeabil, care las
s treac numai moleculele de ap i moleculele mici dizolvate.
Moleculele proteinelor au mase moleculare mai mari dect porii
membranei i vor rmne n sacul de dializ.
Deplasarea moleculelor mici are loc prin difuzie pe baza gradienilor de
concentraie care se stabilesc de o parte i de alta a membranei de dializ.
Pentru mrirea vitezei de separare se lucreaz cu agitare sau se schimb
solventul fa de care se face dializa.
Desalinizarea unei soluii saline de albu de ou fa de ap distilat se
face utiliznd o membran de celofan (acetat de celuloz).
Se verific trecerea ionilor de clor din sacul de dializ n ap cu soluie de
azotat de argint. La sfritul dializei se observ c n sacul de dializ au
precipitat ovoglobulinele, insolubile n soluii saline diluate i ap distilat.
b. Ultrafiltrarea
Este o filtrare a unei soluii proteice saline printr-o membran
semipermeabil, sub aciunea unei fore centrifuge sau a presiunii externe a
unui gaz (azot).
Ca membran se poate utiliza celofanul sau alte materiale sintetice
poroase.
c. Centrifugarea n gradient de densitate (centrifugare zonal)
Aceast metod se utilizeaz pentru separarea proteinelor, ct i pentru
separarea organitelor celulare.
97

Se folosete o eprubet umplut cu o soluie concentrat de zaharoz, cu

gradient continuu de densitate (la fundul eprubetei este concentraie mai mare).
Amestecul de proteine se introduce la partea superioar a eprubetei, care
apoi se centrifugheaz n poziie orizontal, cnd are loc sedimentarea fiecrui
tip de protein n funcie de greutatea, densitatea i forma moleculelor.
Fiecare tip de protein apare ca o band sau zon distinct care poate fi
determinat optic.
Separarea zonelor se poate face astfel:
- nghearea eprubetei i tierea ulterioar a coninutului dup
zonele respective
- scurgerea printr-un orificiu aflat pe fundul eprubetei.
d. Precipitarea n apropierea punctului izoelectric
La punctul izoelectric moleculele proteinelor dintr-o soluie apoas, aflat
ntr-un cmp electric, nu se pot deplasa spre anod sau catod, majoritatea fiind
sub form de amfioni. De aceea solubilitatea este minim i proteina se poate
separa pstrndu-i conformaia nativ.
Pentru c proteinele au valori diferite pentru pH-ul izoelectric, s-au putut
separa prin precipitare.
e. Salifierea
Solubilitatea proteinelor n ap este influenat de prezena srurilor
neutre n anumite concentraii:
- creterea solubilitii proteinelor la concentraii mici de sruri neutre este
cunoscut sub numele de salting-in. Srurile cele mai folosite sunt: sulfatul de
amoniu, clorura de magneziu i mai puin clorurile de sodiu, potasiu sau amoniu.
- scderea solubilitii proteinelor n prezena srurilor este cunoscut sub
numele de salting-out. Ea depinde de tria ionic: cu ct crete tria ionic, cu
att scade solubilitatea proteinei.
Proteinele astfel izolate pot fi redizolvate n ap fr modificarea
conformaiei native.
In laborator se folosete curent sulfatul de amoniu pentru astfel de
precipitri, deoarece are solubilitate mare n ap putndu-se obine o trie ionic
mare.
f. Fracionarea cu solveni
La adugarea unor solveni (etanol, metanol, aceton) miscibili cu apa
ntr-o soluie apoas de proteine apare fenomenul de precipitare a proteinelor.
98

Se pot precipita selectiv proteinele, utilizndu-se solveni organici adecvai,

temperatura de lucru fiind mic pentru a evita denaturarea.
g. Electroforeza
Aceast metod este cea mai eficient i mai folosit n prezent. Ea se
bazeaz pe proprietile electroforetice ale proteinelor.
Dintre tipurile de electroforeze utilizate menionm:
- electroforeza zonal
- disc-electroforeza
- electrofocusarea
De exemplu, electrofocusarea a permis separarea a 40 de proteine din
plasma sanguin cu ajutorul unui suport de gel, n care s-a generat un gradient
de pH fiind apoi introdus ntr-un cmp electric. Fiecare protein a migrat n
funcie de sarcina sa global i s-a oprit n zona n care pH-ul a fost egal cu
punctul su izoelectric.
h. Cromatografia de schimb ionic
Pentru separarea proteinelor se utilizeaz faze staionare capabile s
schimbe fie anionii, fie cationii.
- Dietilaminoetilceluloza (DEAEC) este anionit:
CH3CH2
_
_
+ N CH2CH2O celuloza A + proteina COO
CH3CH2
CH3CH2
_
_
proteina COO + N CH2CH2O celuloz a + A
CH3CH2
- Carboximetilceluloza (CM-celuloza) este cationit:

99

+
OOC CH2O celuloza + proteina NH3

_
+
proteina NH3 OOC CH2O celuloza
Se poate folosi i o metod de separare mixt, care mbin cromatografia
de schimb ionic cu gel filtrarea (excluderea molecular) utilizndu-se ca faz
staionar DEAEC-Sephadex sau DEAC-Sephacel.
i. Adsorbie selectiv
Este o metod cromatografic n care faza staionar este crbune,
silicagel sau gel de aluminiu, care adsorb selectiv proteinele. Prin eluarea
ulterioar selectiv se pot izola proteinele adsorbite.
O faz staionar des utilizat este hidroxiapatita (fosfat de calciu
cristalizat), care reine proteina cu ajutorul ionilor de calciu din reeaua sa. Prin
eluare cu tampoane de fosfat adecvate se pot desorbi selectiv proteinele astfel
reinute.
j. Cromatografia de afinitate
Aceast metod se bazeaz pe proprietile biologice ale proteinelor.
Metoda presupune imobilizarea (n mod obinuit printr-o legtur
covalent) a unui ligand specific capabil s lege o anumit protein dintr-un
amestec de proteine. Dup trecerea amestecului de proteine prin coloana astfel
pregtit are loc eluarea proteinei legate prin anihilarea interaciei protein
ligand, sau prin introducerea n eluent a unui
partener competitiv, care se va lega de ligandul imobilizat, punnd astfel n
libertate proteina fixat anterior.
Aceast tehnic cromatografic servete i la purificarea enzimelor care
se pot lega necovalent de coenzimele specifice.
Pentru a separa o anumit enzim dintr-un amestec de proteine, se
folosete o faz staionar inert (agaroz reticulat) pe care se imobilizeaz
cofactorul sau coenzima capabil s lege enzima respectiv.
La trecerea amestecului de proteine, enzima rmne fixat pe faza
staionar, iar restul proteinelor ies din coloan.
Ulterior se elueaz enzima de pe faza staionar.
100

In acest mod s-a izolat proteina receptoare a insulinei, utilizndu-se o

coloan cu o faz staionar de agaroz pe care era imobilizat insulina.

101