Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
CAPITOLUL I
COMPONENTELE STRUCTURALE ALE ACIZILOR NUCLEICI ................................ 11
1. INTRODUCERE ...................................................................................................................... 11
2. BAZELE AZOTATE ................................................................................................................ 12
2.1. Tipuri de baze azotate ................................................................................................. 12
2.1.1. Baze majore ........................................................................................................................ 12
2.1.2. Baze modificate .................................................................................................................. 13
3. NUCLEOZIDE ........................................................................................................................ 22
3.1. Pentoza nucleozidelor ................................................................................................. 22
3.1.1. Natur i configuraie ......................................................................................................... 22
3.1.2. Legtura cu baza azotat ..................................................................................................... 22
4. NUCLEOTIDE ........................................................................................................................ 30
4.1. Tipuri de nucleotide .................................................................................................... 30
4.1.1. Mono- i difosfat nucleozide .............................................................................................. 30
4.1.1.1. Monofosfat nucleozide ............................................................................................... 30
4.1.1.2. Difosfat nucleozide..................................................................................................... 31
4.1.2. Polifosfat nucleozide .......................................................................................................... 31
4.1.3. Nucleotide ciclice ............................................................................................................... 34
Cuvnt nainte
Cunotinele n acest domeniu al biochimiei, acizii nucleici, structur i
organizare, s-au dezvoltat n ultimii ani ntr-o manier exploziv. Dup geniala
descoperirea a lui Watson i Crick care au deschis calea dezvoltrii fr precedent a
biologiei, foarte muli cercettori au urmat aceast direcie. n fiecare an un numr din
ce n ce mai mare de articole este publicat. Premiile Nobel obinute pentru cercetri n
acest domeniu se succedDirecii noi apar iar cele deja consacrate se dezvolt.
Acest volum prezint cunotinele de baz indispensabile unui student din
primul ciclu
universitar de
la
specializrile
10
CAPITOLUL I
COMPONENTELE STRUCTURALE ALE ACIZILOR
NUCLEICI
1. Introducere
Acizii nucleici sunt substane, care aa cum o indic numele lor, au fost pentru
prima dat izolate din nucleii celulelor. De fapt, mai trziu s-a evideniat, existena
acizilor nucleici att n nucleu ct i n citoplasma celulelor. Dei denumirea general
nu este cea mai adecvat a fost totui pstrat din considerente istorice.
Exist dou tipuri de acizi nucleici:
a) ADN (acid deoxiribonucleic) localizat n principal n nucleul celulelor dac
acesta este individualizat, cum este cazul eucariotelor;
b) ARN (acid ribonucleic), prezent n principal n citoplasma celulelor dar i n
nucleu.
Interesul studierii acizilor nucleici: acizii nucleici ADN i ARN au rol esenial
n sinteza proteinelor, compui fundamentali ai celulei, suportul marii majoriti a
activitilor biologice.
ADN conine informaia genetic necesar funcionrii celulare i deci i
programul sintezei proteinelor. El este responsabil de dictarea ordinii n care
aminoacizii se leag ntre ei pentru a da natere unei proteine adecvate. ADN este un
element permanent al celulei, informaiile coninute n structura sa fiind transmise
descendenilor. Din acest motiv se afirm c ADN este suportul ereditii. Majoritatea
tipurilor de acizii ribonucleici, ARNr, ARNt i ARNm, sunt moleculele implicate n
realizarea sintezei proteice.
Molecula de ADN este cea mai mare din organism, masa sa molecular variind
3
de la 10 -105 pb, la virusuri, la 108-109 pb, la mamifere. Din punct de vedere structural,
acizii nucleici sunt molecule polinucleotidice foarte mari formate din repetiia unor
subuniti numite nucleotide (Figura 1.1).
Unitile nucleotidice sunt formate din acid fosforic, un monozaharid cu cinci
atomi de carbon i o baz purinic sau pirimidinic.
11
2. Bazele azotate
n structura nucleotidelor i a polimerilor lor intr cinci baze azotate majore
care le confer proprieti eseniale pe care le vom trece n revist n continuare.
Acestui grup i se adaug bazele modificate enzimatic n structura acizilor nucleici,
dup sinteza acestora, i care reprezint adesea, semnale chimice de protecie i
control.
Diferitele baze din structur au origini diverse: intermediari metabolici,
produi de transformare chimic n condiii celulare, analogi de sintez, etc.
12
Nucleotidele din structura ADN i ARN nu conin dect patru baze azotate: trei
dintre acestea sunt comune celor dou tipuri de acizi nucleici - cele dou purine i
citozina i cte una este specific pentru fiecare tip: baza pirimidinic timina este
specific pentru ADN i derivatul su metilat, uracilul pentru ARN.
2.1.2. Baze modificate
n structura acizilor nucleici sunt prezente o serie de forme modificate sau
substituite ale bazelor azotate. Situsurile de modificare sunt prezente la nivelul ciclului
sau sunt exociclice. Pentru nomenclatur, n primul caz, este suficient indicarea
numrului atomului, n timp ce n al doilea caz sunt necesare indicaii privind natura
gruprii modificatoare i poziia n ciclu a atomului pe care aceasta se grefeaz (Figura
1.3).
Figura 1.3. Baze modificate: N6-metil adenina (bacterii) 5-metil- citozina (plante,
animale); hipoxantina.
Moleculele de citozin metilate din structura ADN bacterian au cel puin dou
roluri:
i) constituie un sistem de distincie i de protecie a ADN bacterian fa de
ADN strin. Celula activeaz de fapt enzime de restricie (endonucleaze) pentru a
distruge ADN viral nemetilat, cel puin n cazul primei infectri. Acest sistem de
aprare este cunoscut sub numele de restricie-modificare;
ii) sunt elemente ale sistemului de corectare a eventualelor greeli de replicare.
Moleculele de ARN, i mai ales ARNt conin un numr variat de baze
modificate derivate de la purin (hipoxantina derivat de la guanin) sau de la
pirimidin.
Degradarea bazelor purinice implic reacii de deaminare: dac nu sunt
reciclate, bazele purinice sunt degradate la acid uric trecnd prin formele deaminate
hipoxantin i xantin. Acidul uric, foarte puin solubil, este produsul de excreie al
acestor baze la primate (Figura 1.4).
n aceeai categorie cu produii amintii mai sus putem introduce alcaloizii
vegetali, cu structur de metil-xantine, care au i utilizri farmacologice: cafeina
(stimulant), teobromina i teofilina (stimulatori cardiaci, relaxani ai musculaturii
netede i vasodilatatorii)
Analogii sintetici sunt molecule utile, care intr n structura acizilor nucleici i
pot avea utilizri diferite:
- a) n biologia molecular: 5-bromo-uracilul este mutagen; de asemenea exist
derivai fluoresceni care servesc drept reactivi de marcare pentru polinucleotide;
- b) n medicin ca ageni terapeutici: intr n competiie cu bazele naturale; se
comport ca antimetabolii ai sintezei acizilor nucleici i pot avea astfel rol
bacteriostatic; ageni antivirali; antimitotici. n figura 1.5 sunt prezentate cteva
exemple: i) derivaii fluorurai, tiol i aza care sunt substane cu aciune antitumoral;
14
ii) derivat ester al N9-metilguanin care este un agent antiviral eficace fa de herpesul
genital (comercial aciclovir).
Figura 1.5. Civa analogi sintetici ai bazelor din structura acizilor nucleici:
5-bromouracil, aciclovir (2-hidroxi-etoxometil guanin), 5-fluorouracilul; 6tiopurina; 8-azaguanina;
16
Figura 1.6. Echilibre tautomere posibile la pH 7,0 ntre formele lactam (la
stnga) i lactim (la dreapta) ale bazelor pirimidinice i purinice
(prezente sunt form nucleozidic sau nucleotidic).
17
ii) un efect de respingere al apei de ctre bazele ale cror planuri tind s se
suprapun. Aceast tendin reprezint fenomenul de stivuire sau stacking care este
foarte mult studiat. n figura 1.7 este prezentat modelul de stivuire a inelelor din
cristalul de 9-metil-adenin. Suprapunerea parial a inelelor reprezint o asociere
tipic
bazelor
structuri
agitaiei
moleculare
este
un
factor
de
dezorganizare,
nltur
uracil;
5-metilcitozin
adenin
hipoxantin;
guanin
timin;
xantin.
20
Figura 1.10. Reacii de dezaminare ale bazelor: a) citozin la uracil; b) 5-metil-citozin la timin
21
3. Nucleozide
3.1. Pentoza nucleozidelor
3.1.1. Natur i configuraie
n structura acizilor nucleici glucidele implicate sunt riboza (Rib) n acizi
ribonucleici i derivatul su 2-deoxiriboza (dRib) - n acizii deoxiribonucleici. Acestea
au urmtoarele caracteristici de configuraie (Figura 1.12):
Serie steric
Ciclizare hemiacetalic
furanoz
Anomerie
(beta)
Tabel 1.1 Denumire i simbol cu trei litere i cu o liter pentru baze i nucleozidele lor
Baze azotate
Nume
Ribonucleozide
S
Nume
3L
Baze
Deoxiribonucleozide
Simbol
3L
Nume
1L
nucleozide
Simbol
3L
1L
2deoxiribonucleozide
pirimidinice
Pyr
pirimidinice
Pyd
pirimidinice
dPyd
dY/Yd
Citozin
Cyt
citidin
cyd
2-deoxicitidin
dCyd
dC/Cd
Uracil
Ura
Uridin
Urd
2-deoxiuridin
dUrd
dU/Ud
Timin
Thy
Ribozil-timin
Thd
(2-deoxi) timidin
dThd
dT/Td
Baze
nucleozide
2deoxiribonucleozide
purinice
Pur
purinice
Puo
purinice
dPuo
dR/Rd
Adenina
Ade
Adenozin
Ado
2-deoxiadenozin
dAdo
dA/Ad
Guanina
Gua
Guanozin
Guo
2-deoxiguanozin
dGuo
dG/Gd
Xantina
Xan
Xantozin
Xao
2-deoxixantozin
dXao
dX/Xd
Hipoxantina
Hyp
Inozin
Ino
(twist), prezint numai trei atomi coplanari: atomul de oxigen i cei doi atomi de
carbon adiaceni. Ceilali doi atomi de carbon se deprteaz lejer de o parte i de alta.
n cazul conformaiei E (anvelope), sunt patru atomi adiaceni-oxigenul i
trei atomi de carbon-care pot fi considerai mpreun ca formnd un plan. Deviaiile
dintre acetia sunt foarte mici, de ordinul picometrilor. n urma studiilor realizate
pentru structura cristalin a peste 50 de nucleozide i nucleotide, s-a demonstrat c cel
de al cincilea atom se deprteaz la cteva zecimi de nanometri (mai puin de 0,05 nm;
distana ntre cele dou nuclee ale atomilor implicai ntr-o legtur covalent C-C fiind
de ordinul 0,15 nm) (Figura 1.14).
Aceste conformaii sunt desemnate ca endo dac C care deviaz din plan este
de aceeai parte a planului cu carbonul C5, i exo dac acesta se afl orientat n
direcie opus. Nomenclatura adoptat este cea de E i T cu referire la atomii de carbon
exoplanari.
La marea majoritate a nucleozidelor, atomii de C exteriori sunt C2 i C3. Dou
dintre cele mai probabile conformaii pentru D-riboz i pentru derivatul su 2-deoxiriboz din structura nucleotidelor, sunt prezentate n figura 1.15. Conformaia ribozelor
impune polinucleotidelor structuri spaiale diferite.
3.2.2. Izomerii de rotaie n jurul legturii glicozidice
n cazul legturii peptidice rigide i n cazul legturilor C-C din structura
acizilor grai, este asigurat o anumit libertate de rotaie substituenilor caracteristici
care stau la originea conformaiilor structurale multiple. n cazul nucleozidelor,
nucleotidelor i acizilor nucleici legtura glicozidic C1-N permite rotaia bazei
azotate n jurul legturii i situarea sa n dou poziii diametral opuse n raport cu
pentoza (Figura 1.16).
Pentru conformaia syn (mpreun), planul bazelor este orientat de aceeai
parte cu riboza, n timp ce pentru conformaia anti (contrar), orientarea este contrar. n
cazul nucleozidelor pirimidinice singur conformaie natural admis este anti
deoarece carbonul din poziia 2 purttor de grupare carbonilic determin apariia unor
fore de respingere cu oxigenul ciclului ribozic.
n figura 1.16 este prezentat modul convenional de definire a regiunilor syn i
anti n funcie de unghiul de torsiune : i) considerm rotaia dreapt a lui N1 ctre C1
n jurul legturii considerate; ii) axa de referin (00) este reprezentat de legtura C1O4 din pentoz; iii) legturile bazelor considerate pentru calcularea unghiului sunt
N1-C2 pentru pirimidine i N9-C4 pentru purine.
24
Figura 1.16. Izomerii de rotaie n jurul legturii glicozidice i definirea unghiului de torsiune (n raport
cu legtura N9-C1 i N1-C1).
probabilitatea existenei unuia sau a altuia dintre rotameri (izomeri de rotaie sau
conformeri de rotaie) depinde i de conformaia adoptat de pentoz.
Mai trziu se va discuta incidena acestei rotaii asupra conformaiei finale a
polinucleotidelor.
funcia
Coenzima A (CoA)
acilare
Oxido-red
Nicotinamid adenin
dinucleotid (NAD i NADP)
Coenzima B12 (Co B12)
Oxido-red
Fosfoadenozin fosfosulfat
(Ado3P5PS, PAPS)
S-adenozilmetionin
(AdoMet)
depl. grup.
trans.sulfat
transf. metil
nucleotidul sau
nucleozidul din structur
adenozin 3-fosfat
5-difosfat (Ado3P,5PP)
adenozin 5-difosfat
(Ado 5 PP, ADP)
adenozin 5-difosfat
(Ado 5 PP, ADP)
5-deoxiadenozin
(5 dAdo)
adenozin 3,5-bisfosfat
(Ado3,5diP)
Adenozin (Ado)
26
legtura cu restul
moleculei
ester: 5 diP-alcool
ester: 5 diP-alcool
ester: diP-oz
C5-Co din nucleu
andidrid:5P-sulfat
sulfhidril: C5S(Met)
Figura 1.17. Exemple de nucleozide care intr n structura unor metabolii sau/i cofactori: a) Sadenozilmetionina (SAM); b) inozina (hipoxantin riboz); c) fosfoadenozilosfosulfat
(PAPS)
27
28
29
4. Nucleotide
4.1. Tipuri de nucleotide
Sunt esteri fosfat ai nucleozidelor. Primele lor denumiri bazate pe numrul de
grupri fosfat prezente n molecul (mono-, di-, trifosfai) au fost nlocuite printr-o
nomenclatur care nltur ambiguitile. De fapt, n nucleotidele naturale:
a) fosforilarea privete gruparea hidroxil legat la unul sau mai muli atomi de
carbon din ciclul pentozei: nucleotidul este un nucleozid mono-, di- sau trifosfat;
b) gruparea fosfat poate ea nsi s fie angajat: i) cu alte molecule de acid
fosforic n condensri anhidridice; ii) cu un nucleotid cu structur de nucleozid di- sau
trifosfat, deoarece aceast combinaie i cea de mai nainte nu se exclud;
c) o alt grupare hidroxil, printr-o a doua legtur ester poate nchide molecula
i determina formarea de nucleotide ciclice.
Acizii nucleici sunt polimeri de nucleozide monofosfat. Celelalte nucleotide
intervin n biosinteza acestora i n alte tipuri de interaciuni de tipul acelora evocate
mai sus. Nomenclatura i tipurile de nucleotide este prezentat n tabelul 1.3.
4.1.1. Mono- i difosfat nucleozide
30
31
32
33
34
Figura 1.25. Exemple de intermediari metabolici activai: CDP-diacil glicerol, CDP-etanolamin, UDP-glucoz
35
de 260 nm. Spectrul UV pentru fiecare dintre aceste nucleozide sau derivai
nucleotidici poate fi diferit n funcie de pH. Absorbiile UV puternice i diferenele
datorate structurii specifice a bazelor, din structur, furnizeaz metode sensibile de
dozare a acestor compui att din punct de vedere calitativ ct i cantitativ. De
exemplu, deaminarea citozinei din structura nucleozidului sau nucleotidului la derivaii
uracil corespunztori determin a deplasare a max. de la 271 nm la 262 nm, care este
uor de determinat. Datorit coeficienilor molari de extincie mari ai bazelor purinice
i pirimidinice n acizii nucleici, o soluie de ARN sau ADN de concentraie 1 mg/ml
va avea o absorban la 260 nm de aproximativ 20 uniti, n timp ce o soluie proteic
obinuit cu concentraia de 1 mg/ml va avea la 280 nm o absorban de aproximativ o
unitatea. n consecin, acizii nucleici pot fi uor detectai i n concentraii foarte mici.
Legtura N-glicozidic, din structura nucleozidelor purinice i pirimidinice,
este stabil n prezen de baze. Totui, stabilitatea acestei legturi la hidroliz acid
difer marcant. Legtura N-glicozidic din structura nucleozidelor i nucleotidelor
purinice se hidrolizeaz uor n prezen de acizi diluai i prin creterea temperaturii
(600C) conducnd la purine libere i glucide sau glucide-fosforilate. Pe de alt parte,
legtura N-glicozidic din nucleozidele derivate de la uracil, citozin i timin i din
nucleotidele derivate de la acestea este foarte stabil la tratament acid. Pentru
eliberarea pirimidinelor libere i completa distrugere a restului glucidic sunt necesare
condiii drastice de hidroliz, cum ar fi acid percloric (60%) i temperatur de 1000C.
Legtura N-glicozidic din structura nucleozidului derivat de la dihidrouracil este
sensibil la tratament acid moderat.
Datorit gruprilor fosfat foarte polare, nucleotidele purinice i pirimidinice
sunt mult mai stabile n soluii apoase dect nucleozidele i bazele libere din care
deriv. In general, nucleozidele sunt mult mai solubile dect bazele purinice i
pirimidinice libere.
Bazele purinice i pirimidinice, nucleozidele i nucleotidele derivate din
acestea pot fi uor separate printr-o serie de tehnici. Aceste metode sunt: cromatografie
pe hrtie, cromatografie n strat subire (Thin Layer Chromatography TLC),
cromatografie de schimb ionic, electroforez. Cele mai bune separri ale compuilor
purinici i pirimidinici s-au realizat prin cromatografie lichid de nalt presiune n faz
invers (High Presure Liquid Chromatography HPLC). Prin aceast tehnic pot fi
separate cantiti de ordinul nano-molilor din aceste componente ntr-o scurt perioad
de timp. n figura 1.29 este prezentat profilul de separare prin HPLC al unui amestec
format din baze, nucleozide i nucleotide. Dezvoltarea acestei tehnici prin introducerea
37
implicate ntr-un numr foarte mare de procese metabolice care asigur creterea i
funcionarea normal.
Rol n metabolismul energetic: dup cum am prezentat mai sus ATP reprezint
principala form sub care energia este disponibil n celul. Cantitativ, ATP este
generat n celule prin fosforilare oxidativ i fosforilare la nivel de substrat. ATP este
folosit pentru a coordona reaciile metabolice, ca agent de fosforilare, fiind implicat i
n procesele de contracie muscular, transport activ i meninerea integritii
membranare. Ca agent de fosforilare, ATP servete drept donor de fosfat pentru
generarea altor nucleozide 5-trifosfat (GTP, UTP i CTP).
Uniti monomere ale acizilor nucleici: acizii nucleici, ADN i ARN, sunt
compui din uniti monomere, nucleotide. n reaciile de sintez ale acizilor nucleici,
nucleozidele 5-trifosfat sunt substrate care particip la formarea legturilor 3, 5fosfodiester cu eliberarea unei molecule de pirofosfat la fiecare condensare.
Mediatori fiziologici: una dintre cele mai recent recunoscute funcii ale
nucleotidelor i ale derivailor acestora este implicarea n procesul de mediere a unor
procese metabolice cheie. n primul rnd, trebuie luat n considerare rolul AMPc ca
mesager secundar n controlul glicogenolizei i glicogenezei mediat de epinefrin i
glucagon i n semnalizarea transmembranar prin intermediul proteinelor G. De
asemenea a fost recunoscut i importana GMPc ca mediator celular. O serie de studii
confirm rolul critic al concentraiei ADP n agregarea plachetelor n timpul coagulrii
sngelui. Adenozina provoac dilatarea vaselor de snge coronariene i poate avea un
rol important n reglarea fluxului de snge la nivelul coronarelor. GTP este necesar
unor reacii cum este prelucrarea post-transcripional a ARNm (adugarea capului),
transmiterea semnalului ctre proteinele G (GTP binding protein), i formarea
microtubulilor.
Componente ale coenzimelor: intr n structura NAD+, NADP+, FAD i CoA
care sunt constitueni celulari foarte importani cu rol critic n multe reacii metabolice.
Intermediari activai: nucleotidele au i rolul de transportori (carriers) ai
intermediarilor activai ntr-o serie de reacii metabolice. Compusul UDP-glucoz
este un intermediar cheie n sinteza glicogenului i glicoproteinelor. Compuii GDPmanoz, GDP-fucoz, UDP-galactoz, i CMP-acid sialic sunt cu toii intermediari
cheie n reaciile n care monomerii glucidici sunt transferai pentru sinteza
glicoproteinelor. CTP este folosit pentru generarea CDP-colinei, CDP-etanolaminei i
CDP-diacilglicerolilor, care sunt implicai n metabolismul fosfolipidelor. De
asemenea, ali intermediari activai sunt S-adenozilmetionina (SAM) i 339
40
CAPITOLUL II
STRUCTURA PRIMAR A ACIZILOR NUCLEICI
Asemenea poliglucidelor i proteinelor, aceti polimeri se caracterizeaz
printr-o structur covalent primar i prin aranjarea spaial a acesteia ntr-o ierarhie
pe care o vom discuta n capitolele urmtoare.
Structura primar a acizilor nucleici (AN) se refer la secvena nlnuirii
monomerilor nucleozid 5-fosfat (NMP), legturile dintre acetia i mrimea
polimerilor obinui.
Acidul
nucleic
Pentoza
ARN
D-riboza
ADN
2-deoxi-D-riboza
NMP majore
Pyr
U
C
dT
dC
Pur
A
G
dA
dG
NMP minore
42
care
este
necesar
separarea
moleculelor
polinucleotidice
mici
sau
Tabel 2.2. Mrimea unor molecule de ADN din diferite surse, comparat cu cea a unei proteine fibroase,
colagenul, i celulele procariote i eucariote.
ADN/ particule/
organisme
Virusuri ADN
SV40
fag X174
fag
Procariote
E. coli
Eucariote
Drosofila
Om
Colagen
n de baze
(kb)
Mas
(MDa)
Lungime
(nm)
(nm)
numr de
cromozomi
5,2
5,4
48
3,2
3,6
32
2
2
2
4000
2600
1,7x10-3 (1,7m)
1,8x10-3 (1,8 m)
17x10-3 (17 m)
1,36
62 000
125 000
3x1000
aminoacizi
41000
80 000
0,33
21
41
0,3x10-3 (0,3 m)
2
2
1,5
2x4
2x23
Celule
Bacteria E. coli
2x10-3 (0,5x2 m)
Mamifere
aprox 10x10-3 (10 m)
SV40: virus simian; mrimea exact a ADN este de 5243 pb. Bacteriofagii folosii ca exemplu au drept
gazd Escherichia coli. ADN al fagului X174 este monocatenar, dar n celulele infectate se
mperecheaz sub form de dubl caten. n tabel sunt date dimensiunile celei de a doua forme. La
drosofila este dat mrimea celui mai mare ADN, este vorba de cromozomul gigant. La om este dat
mrimea ADN/cromozom.
metoda
clasic
de
Figura 2.3. Separarea acizilor nucleici prin ultracentrifugare: a) Separare ADN prin
ultracentrifugare n gradient de CsCl; b) separare ARN prin
ultracentrifugare n gradient de zaharoz
45
Figura 2. 5. Sinteza unei monocatene de ADN: a) formarea legturii fosfodiester ntre un dinucleotid i
deoxiadenozin citidin trifosfat; b) reprezentarea schematic a reaciei de sintez cu marcarea
orientrii 5-3 a catenei n formare
47
Figura 2.6. Structura unei molecule ARN: a) evidenierea nlnuirii nucleotidelor i vectorizarea catenei;
b) reprezentrile prescurtat i simbolic.
Condiii
Acide
pH 1,0 + nclzire
pH 4,0
Alcaline
Produi de hidroliz
ARN
ADN
pentoze + fosfai + baze
baze purinice + AN apurinici
NMP (2 sau 3)
-
Figura 2.7. Schema mecanismului de hidroliza ARN prin cataliza bazic: 1. Hidroxilul din 2
este deprotonat de ctre ionul hidroxid; 2. Alcoxidul, nucleofil, atac gruparea
fosfodiester cu formarea unui diester ciclic 2: 3; 3. Un al doilea hidroxid provoac
hidroliza uneia sau alteia dintre legturile ester: se obin izomeri 2 i 3 fosfat.
51
Tietur
tip2; specificitate
Produi
Exonucleaze
fosfodiesteraza (venin de arpe)
ARN, ADN s
5-NMP
fosfodiesteraza (splin)
ARN, ADN s
AND
AND
p
extremitatea 3
d
extremitatea 5
p
extremitatea 3
p
extremitatea 3
Nucleaze
Endonucleaze
endonucleaza S1 (Aspergillus oryzae)
3-NMP
5-NMP
5NMP+ADNs
ARN,ADN s,d
p
5-NMP +ON n 5 P
aleatoare
ribonucleaz T1 (Aspergillus oryzae)
ARN s
p
5-NMP +ON n 3 P
G/N
ribonucleaza A (pancreas)
ARN s
d-Pyr/N
3-NMP +ON n 3 P
Deoxiribonucleaza II (timus)
ADN s
d sPyr/dPur
ON n 3 P
1
s: monocatenar (single strand); ON: oligonucleotide. 2 tip de tietur p sau d: vezi figura 2.8.
52
din
care
fost
extras
53
Enzimele de restricie sunt clasificate n trei categorii, dar numai cele de tip II
sunt utile n cercetrile de biologie molecular deoarece scindeaz catenele de ADN
chiar la nivelul situsurilor specifice pe care le recunosc. Dou enzime de restricie care
recunosc aceeai secven sunt numite izoschizomere.
Numrul de situsuri recunoscute i tiate de anumite enzime este evident
corelat cu structura ADN. n tabelul 2.5 este prezentat un exemplu de aciune
difereniat a enzimelor de restricie asupra ADN viral din diferite surse. Scindarea
difereniat reprezint o modalitate important de a obine marcheri de mas
molecular utilizai n tehnicile de biologie molecular.
Tabel 2.5. Numrul situsurilor de tiere prezente la nivelul ADN din trei virusuri pentru trei endonucleaze comune.
Endonucleaza (sursa)
EcoRI (E. coli RY13)
BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H)
HaeIII (Haemophilus aegypticus)
fag
5
5
>50
calcularea raportului densitilor optice la 260 nm/280 nm care, n mod normal, trebuie
s fie apropiat de valoarea 1,8-2,0. n cazul ADN, un raport mai ridicat indic o
contaminare cu ARN. Dac exist o contaminare cu proteine (280 nm) sau fenol (270
nm), raportul va fi net inferior valorii de 1,8. Dac ADN i ARN sunt puri, cantitatea
poate fi apreciat astfel:
unitatea DO (260 nm) = 50 ng/l pentru ADN dublu-catenar
unitatea DO (260 nm) = 33 ng/l pentru ADN monocatenar
unitatea DO (260 nm) = 40 ng/l pentru ARN
1.5.2. Utilizarea de mini-gelulri
Dac nu dispunem de ADN n cantitate suficient sau de sisteme miniaturizate
care s permit msurarea densitii optice la 260 nm, se poate realiza o estimare semicantitativ utiliznd mini-geluri de agaroz. Dup realizarea separrii electroforetice,
se realizeaz colorarea cu bromur de etidium urmat de evaluarea intensitii benzilor
obinute dup expunerea la UV. Estimarea semi-cantitativ se realizeaz prin
compararea rezultatelor obinute cu migrarea unor cantiti cunoscute de ADN standard
folosite pentru etalonare.
55
Figura 2. 12. Principiul i prezentarea schematic secvenializrii prin metoda Maxam i Gilbert.
Figura 2.13. Metoda Sanger: a) Principiul de sinteza a catenei complementare i modul de intervenie al
ddNTP; b) Prezentare schematizat a realizrii practice a secvenializrii. n urma
electroforezei celor patru loturi se obine secvena catenei complementare.
60
fosforoamidiilor
monomerii
activai
sunt
deoxiribonucleozide
61
62
c) Hidroxilul din 5 este eliberat prin acidifiere: catena este gata pentru
urmtorul ciclu. n aceast etap gruparea protectoare DMT este eliberat n mediu de
acid dicloracetic care elibereaz 5OH i las celelalte grupri protectoare intacte. n
acest moment catena are o unitate monomer n plus i este gata pentru o nou reacie
(Figura 2. 16).
Procedeul este automatizat i poate produce lanuri de 150 baze necesitnd 10
minute pentru fiecare ciclu. Sinteza ribopolinucleotidelor este mult mai delicat
datorit reactivitii hidroxilului din poziia 2: este dificil protecia eficient fr a
altera posibilitile de reacii ale gruprii 3.
La sfritul sintezei se realizeaz un tratament cu amoniac pentru a elimina
toate gruprile protectoare i detaaz nucleotidele curate de pe suport. Sinteza n
faz solid reprezint abordarea ideal att pentru sinteza polipeptidelor ct i pentru a
polinucleotidelor. Toate reaciile au loc n acelai recipient i reacia poate fi
coordonat n funcie de cantitile de reactivi introdui. Produii de reacie pot fi
purificai prin electroforez n gel de poliacrilamid sau prin cromatografie lichid de
nalt rezoluie (HPLC High Performance Liquid Chromatography).
Figura 2.16. Sinteza n faz solid a catenelor unui polinucleotid prin metoda fosforamidiilor.
63
64
Capitolul III
STRUCTURA SECUNDAR I TERIAR A ADN
Legturile prezente n structura secundar i teriar a acizilor nucleici sunt
comune cu cele din alte tipuri de polimeri biologici. Acestea sunt legturi cu energie
sczut, a cror multiplicitate determin apariia unor fore destul de puternice pentru a
stabili i menine coeziunea de ansamblu, n spaiu, i pentru a autoriza modificrile
plastice.
Cu toate acestea secvena covalent a lanurilor polinucleotidice demonstreaz
diferene fundamentale fa de proteine. Acestea se traduc prin interacii particulare
ntre compui i cu mediul i stau la originea conformaiilor permise. Aceste diferene
vin: i) din structura scheletului polimer; ii) prin prezena substituenilor laterali, bazele
azotate, care aduc n structur proprietile lor originale: planuri apolare susceptibile de
stivuire (de suprapunere) i capabile s realizeze mperecheri specifice prin intermediul
gruprilor lor polare.
66
2+
2. Legtura de hidrogen
Pentru acizi nucleici, modul de formare a structurilor sub form de elice (helix)
este diferit de cel cunoscut pentru proteine datorit forelor de repulsie i afinitii
electrostatice crescute precum i a interaciilor dintre baze (pe care le vom discuta n
continuare). De fapt, n cazul acizilor nucleici, legturile de hidrogen nu se stabilesc
ntre polii scheletului, ci ntre echivalenii lanurilor laterale, bazele.
Figura 3.2. mperecheri pirimidin-purin conform Watson i Crick (formarea legturilor de hidrogen).
68
Figura 3.3. mperecheri diferite de tipul Watson-Crick: a) mperecherea de tip Hoogsten a derivailor
cuplurilor T-A (gruparea metil nlocuiete pentoza); b) mperechere ipotetic ntre C i T; c)
mperechere de adenine n structura cristalului de 9-metil-adenin
70
pentoz-fosfat ii) dimensiunile elicei (helixului) sunt indicate n tabelul 2.7. Elicea conine, n
medie, 10 perechi de baze pe tur, care au un pas de 3,4 nm i un diametru de 2 nm. Distana
dintre planurile bazelor este corespunztoare grosimii nucleelor n contact; iii) datorit
poziiei axei n centrul fiecrei perechi de baze i de ataarea lor covalent di-simetric pe
schelet, se formeaz dou fose (mare i mic) care au deschidere i profunzime diferit i care
alterneaz la nivelul flancurilor elicei, pe toat lungimea acesteia (Figura 3.5). Morfologia
acestor fose sufer variaii locale, n funcie de secvena de baze. De exemplu, ntr-o regiune
bogat n A-T, fosa mic este mult mai ngust dect n cazul unei regiuni bogate n G-C.
d) conformaiile pentozei i legturii glicozidice n structura unitilor nucleotidice
sunt caracteristice acestui tip de structur (Tabel 3.1).
Conformaia B, cea descris de Watson i Crick, este cea mai stabil n condiii
fiziologice i deci considerat drept forma nativ de referin pentru ADN. Totui,
flexibilitatea relativ a structurii i permite acesteia s adopte i alte conformaii duplex, dintre
care dou sunt bine caracterizate prin cristalografie. n tabelul 3.1 sunt grupate caracteristicile
diferitelor conformaii iar n figura 3.5. este prezentat modelul conformaiei B.
3.1.2. Conformaia A
Dac se concentraz o soluie de ADN n ap, moleculele ncep s treac
reversibil ntr-o conformaie diferit, care a fost numit A. ADN-A este tot o dubl
elice dreapt dar cu o geometrie particular:
i) aceasta este mult mai compact; pentru acelai numr de perechi de baze
lungimea sa total este mai redus iar diametrul este mai mare dect n cazul ADNB. Ca urmare acestei structuri bazele sunt mai puin accesibile;
ii) planurile bazelor sunt rsucite cu 1800 n raport poziia celor din forma B
i sunt mult nclinate fa de ax, ceea ce strivete i adncete fosa mare i
aplatizeaz pe cea mic. n acest caz, calificativele de fos mare i mic i pierd
sensul;
iii) conformaia furanozei trece n 3E (C3 endo) (Figura 1.15).
In vivo, conformaia A este adoptat de: i) ADN din anumii spori bacterieni
formai ca rspuns la uscarea mediului. Aceast trecere poate explica rezistena la
condiii extreme i efectul de dimerizare al radiaiilor UV; ii) mperecherile locale
sub form de dubl elice ale ARN, care prezint o preferin net pentru conformaia
C3 endo a pentozei (3E); iii) hibrizi ARN-ADN care se formeaz tranzitoriu n
timpul procesului de amorsare a replicrii i n timpul transcripiei.
72
Figura 3. 4. Legturi de hidrogen ntre bazele complementare din structura catenelor elicei ADN: a) reprezentare n
plan a legturilor de hidrogen; b) prezentare schematic plan a vectorizrii catenelor.
Figura 3.5. Structura ADN B: a) imagine schematic a dublei elice cu evidenierea dimensiunilor, b)
vedere schematic de sus; c) imagini ADN B cu evidenierea scheletului riboz-fosfat i a
planului bazelor; d) vederi de sus cu evidenierea cilindrului central (adaptat dup
Biochemistry, Voet&Voet, 1995)
73
conformaie B
sens de rsucire
Drept
numr de pb/tur
10,4 (10,0-10,7)
nlimea pe ax
pe tur (pas)
3,4 nm
pe plan de baze
0,34 nm
nclinarea bazelor fa de
10
ax
360
rotaia planului bazelor
Diametru
2 nm
Conformaii
2
dPyd: pentoz
E
legtur glicozidic
Anti
2
dPuo: pentoz
E
legtur glicozidic
Anti
fos: mare
mare i profund
Mic
ngust i profund
n text este explicat aceast aparent contradicie
conformaie A
conformaie Z
drept
11
Stng
12 (6 di-nucleotide)
2,8 nm
0,26 nm
200
330
4,5 nm
0,37 nm
90
-600/dinucleotid
2,3 nm
1,8 nm
3
E
anti
3
E
anti
ngust i profund*
mare i profund*
2
E
Anti
3
E
Syn
ngust i profund
3.1.3. Conformaia Z
Este o structur radical diferit de precedentele deoarece se formeaz prin
rsucirea elicei spre stnga. Pentru prima dat, a fost evideniat, in vitro, prin
cristalografie cu raze X, la 25 de ani de la descoperirea conformaiei B de ctre Watson
i Crick. Aceast conformaie este prezent n segmentele de secven alternante PurPyr (-G-C-G-C-). Unitatea de structural de baz este dinucleotidic. Componenta
purinic prezint o conformaie care prezint modificri la nivelul formei anvelope a
pentozei i a poziiei bazei.
Aceast conformaie Z a fost detectat la procariote i la eucariote, la nivelul
secvenelor bogate n metil-citozine, ale cror grupri hidrofobe favorizeaz formarea
structurii. Analiza structurii primare evideniaz c anumite regiuni scurte de ADN
prezint alternana necesar pentru adopta conformaii Z. Acestea ar putea avea rol de
comutator al expresiei genelor ca urmare a trecerii reversibile din conformaie B n Z.
Cu siguran c acest proces este foarte costisitor care din punct de vedere energetic.
Este general admis c, n condiii fiziologice (trie ionic i pH celular), apare
necesitatea unei etape indispensabile de pregtire prealabil a dublei catene, de
exemplu printr-o supra-rsucire. Cu ajutorul spectroscopiei prin dicroism circular a fost
identificat net existena conformaiilor B i Z i posibilitile de tranziie ale acestora
(Figura 3.7).
74
Figura 3.6. Alte conformaii ADN: a) conformaia ADN A - vedere normal i de sus; b) conformaia Z
vedere normal i de sus (adaptat dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995)
75
ADN nu este considerat o molecul static. Aceasta trebuie privit mai mult
ca o structur dinamic, flexibil, la nivelul creia unele conformaii sunt n echilibru
cu altele.
78
Hoogsteen), ale crei planuri sunt triade de tip T-A x T i C-G x C (unde x marcheaz
mperecherea Hoogsteen) (Figura 3.9.).
n mod analog, o tripl elice eterogen se poate forma ntre un ADN bicatenar
i o caten de la o alt specie (ADN sau ARN). Astfel de structuri ar putea responsabile
de iniierea schimburilor de secvene implicate n recombinarea genoamelor.
79
80
provoca mperecheri ale regiunilor de pe aceeai caten. Cum cele dou catene sunt complementare o
mperechere poate determina o mperechere simetric pe cea de a doua caten. Rezultatul l reprezint
formarea unei structuri cruciforme.
4. Topoizomeri i topoizomeraze
Majoritatea cromozomilor bacterieni sunt suprarsucii n celule. De asemenea,
chiar moleculele de ADN lineare lungi conin regiuni suprarsucite local. n mod
normal, cromozomii bacterieni posed aproximativ cinci suprarsuciri pentru fiecare
1000 perechi de baze ADN. De asemenea, ADN din nucleii celulelor eucariote este
suprarsucit. Toate organismele posed enzime care pot scinda ADN pentru a de-rsuci
sau suprarsuci moleculele de ADN n scopul modificrii topologiei acestuia n funcie
de necesitile fiziologice ale celulei.
a fost explicat ca fiind rezultatul unei posibile denaturri pe care o vom analiza mai
trziu. Autorul a interpretat apariia celor trei benzi prin existena a trei forme mai mult
sau mai puin compacte ale aceleiai molecule: i) 14S, molecule lineare; ii) 16S,
molecule circulare relaxate care reprezentau eventuale forme modificate; iii) 20S,
singura form nativ care conine ADN circular compactat printr-o suprarsucire a
dublului helix.
Demonstrat c fiind starea fiziologic a moleculelor de ADN, aceast
suprarsucire este indus printr-o rsucire a moleculei prealabil nchiderii sale. Pentru
facilitarea explicaiei considerm o molecul ipotetic de 374 pb care va fi utilizat
drept exemplu (lungimea
L = 500 (5 300/10,6)
forma nativ:
L = 475
= - 0,05 (-25/500)
85
86
Figura 3.12. Modelul unei brri elastice: cele dou laturi pot reprezenta cele dou catene ale dublului
helix.
Supra-rsucirea
exercit
constrngere
asupra
moleculei.
Aceast
87
Figura 3.13. Micrografii electronice ale topoizomerilor unei molecule de ADN dublu-catenar circular nchis:
1) forma relaxat; 2, 3, 4, 5 forme supra-rsucite. (dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995)
3.14
este
prezentat
separarea
88
4.2.2. Topoizomerazele
Sunt enzime care modific numrul de rsuciri . Deci, ele sunt capabile s
induc sau s elimine super-turele ntr-un dublu helix ADN. Pentru a modifica numrul
de nlnuiri este necesar tierea uneia dintre cele dou catene sau a ambelor.
Pn n prezent se cunosc dou tipuri de topoizomeraze: topoizomeraza de tip I
i topoizomeraza de tip II.
89
Figura 3.17. Modul de aciune al girazelor bacteriene: a) introducerea de super-ture negative; b) replicarea
ADN dublu catenar circular nchis cu formarea de regiuni supra-rsucite (catenate); c)
intervenia girazelor n procesul de catenare decatenare;
90
91
92
Figura 3.18. Model molecular al activitii catalitice a topoizomerazei II de la E. Coli (dup Molecular
Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)
93
Eucariote
nelegem foarte bine necesitatea topoizomerazelor de tip I pentru relaxarea
super-turelor negative i pozitive. n ceea ce privete topoizomerazele de tip II, acestea
se pare c au mai ales capacitatea de a desface nodurile (constrngerile) care apar n
structura ADN. Asemeni situaiei de la procariote, acestea taie dubla elice ADN, las
s treac un alt segment dublu catenar prin aceast bre i apoi o nchid. Se cunosc
izoformele alfa i beta, forma beta avnd o extremitate COOH terminal mai lung
dect forma alfa.
In concluzie, topoiomerazele sunt foarte utile, fie pentru a schimba suprarsucirea unei molecule de ADN, fie pentru a desface nodurile care apar n structura
ADN n urma diferitelor procese de transcripie i replicare. Aceste enzime sunt
extraordinari prestidigitatori, capabili s realizeze traversarea unei molecule de ADN
de ctre o alt molecul monocatenar sau dublu-catenar fr a las semne.
Deci, fr topoizomeraze nu ar putea fi rezolvate suprarsucirile inevitabile
care se produc n structura ADN n urma naintrii ARN i ADN polimerazelor.
mai mare. Dintre medicamentele din aceast categorie amintim: etopozidul (VP16),
inhibitor al topoizomerazei II i taxolul (extras din Taxus baccata), inhibitor al
topoizomerazei I.
Din
pcate,
exist
numeroase
cazuri
de
rezisten
la
inhibitorii
96
Figura 3.20. Aciunea bromurii de etidium asupra structurii ADN: a) structura bromurii de etidium; b)
intercalarea bromurii de etidium ntre planurile bazelor (adaptat dup Biochemistry,
Voet&Voet, 1995)
Figura 3.21. Efectul temperaturi asupra ADN dublu catenar: a) creterea valorilor DO260 nm n urma
procesului de denaturare termic; b) efectul hipercrom al procesului de denaturare i
modalitatea de estimare a temperaturii de melting
Tm (0C)
0
40
50
70
100
65
87
92
>98
105
100
pH, trie ionic; ii) starea mai mult sau mai puin avansat a denaturrii; iii) protocolul
adoptat pentru revenirea la temperatura ne-denaturant (Figura 3.24).
Procesul de renaturare face obiectul a numeroase studii n intenia nelegerii
cineticii i a modelrii etapelor. Procesul de denaturare/renaturare parcurge diferite
etape n funcie de protocolul utilizat:
a) dac soluia este rcit prea repede, timpul de cutare al catenelor
complementare este prea scurt: moleculele sunt ngheate n starea imperfect de
cupluri inter- i intramoleculare;
b) dac soluia este meninut timp ndelungat la o temperatur inferioar Tm
(Tm-20 sau la temperatura optim Tm-250C) s-a observat, din contr, o revenire
gradat la proprietile caracteristice structurii bicatenare. Trebuie asigurat durata
necesar pentru explorarea bazelor prezente pe cele dou catene, reconstituirea
mperecherilor complementare i formarea dublei elice. Aceste condiii au fost
denumite de anelare, annealing sau trempe, expresii mprumutate din activitatea
de turnare a sticlei sau a metalelor.
Dac se pornete de la o soluie complet denaturat, re-mperecherea se
realizeaz n dou etape de cinetic diferite:
i)
catenele
separate
se
ntlnesc
la
ntmplare
(hazard).
Catenele
complementare se pot mperechea la nivelul unei scurte regiuni i pot forma nceputul
unei duble elice. Aceast etap este lent i este limitant de vitez pentru procesul
total de renaturare;
ii) mperecherile se vor efectua foarte rapid, plecnd de la punctele de iniiere a
procesului, dup modelul nchiderii unui fermoar, impunnd structura 2-D elicoidal pe
toat lungimea moleculei.
n afar de determinarea vscozitii i absorbiei, starea ADN mai poate fi
controlat prin microscopie electronic i prin tehnici de biologie molecular. Prin
microscopie electronic se vizualizeaz direct moleculele n timp ce biologia
molecular furnizeaz metodele indirecte: i) studiul activitii de transformare a ADN
pentru un anumit tip celular; ii) degradarea preferenial a duplexului de ctre enzime
cum sunt nucleaza S1 i ExoII (Tabel 2.4). Cromatografia de absorbie pe hidroxiapatit
ofer o alt modalitate de separare a duplexului, prin reinerea pe suprafaa suport a
monocatenelor.
Denaturrile i renaturrile sunt etape cheie pentru numeroase tehnici de
biologie molecular. Hibridizarea, etap tehnic foarte important, presupune formarea
de duplexuri artificiale ntre ADN din diferite surse sau ntre ADN i ARN.
101
Figura 3.24. Procesul de denaturare prin nclzire i tratament alcalin (dup Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000)
6. Bilan
Principalii factori care determin structura spaial a acizilor nucleici:
1) conformaia scheletului i sarcina electrostatic;
2) dublele interacii ale bazelor cu solventul: hidrofobe prin intermediul
nucleelor i hidrofile prin intermediul substituenilor polari;
3) stivuirea bazelor prin contacte Van der Waals;
4) mperecherea specific a bazelor prin legturi de hidrogen.
103
De ce T n ADN i U n ARN?
Dezaminrile accidentale (oxidative) fac ca citozina (C) s poat pierde
spontan gruparea sa amino (nlocuit de OH) i s se transforme n uracil, deci s stea
la originea unei mutaii. Din fericire, exist enzime de reparare care recunosc U,
deoarece U nu este prezent n mod normal n structura ADN. Acestea nltur U prin
excizie i o pot nlocui cu C.
n ADN, baza T poate fi deci considerat ca un semnal care indic
normalitatea, i c orice apariie a lui U trebuie considerat o greeal. Dac ADN ar fi
avut U n stare normal, enzimele de reparare nu ar fi putut distinge ntre U normal i
U provenind din dezaminarea citozinei.
n ceea ce privete ARN, acesta posed U fie n stare normal sau dup
dezaminarea accidental a citozinei. Este deci imposibil diferenierea celor dou tipuri
de U. n acelai timp sinteza T (compus metilat) este mai scump din punct de vedere
energetic dect U. Deoarece integritatea ADN este esenial pentru organism, ARN nu
a beneficiat de acest sistem de protecie specifica ADN.
105
CAPITOLUL IV
STRUCTURA SECUNDAR I TERIAR A ARN
Moleculele de ARN, care conin dou catene mperechiate, reprezint o
excepie care este ntlnit la cteva virusuri. Diferitele tipuri de ARN sunt, de fapt,
produi ai reaciilor de transcripie a unei singure catene. n acest caz structura primar,
reprezentat de compoziia i secvena nucleotidic constituie:
a) suportul copiei codificate de gene destinat traducerii n proteine;
b) obiectul unei serii de modificri importante i variate care determin
obinerea unor baze atipice (dihidro-uridina, pseudo-uracilul, etc.);
c) structura care individualizeaz situsuri specifice de legare a proteinelor;
d) structura care determin orientarea spaial a polimerului la nivel secundar
i teriar.
106
Figura 4.1. Tipuri de legturi de hidrogen care sunt specifice structurii secundare a ARN (dup Molecular
Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)
108
n urma interaciunilor descrise mai sus iau natere structurile 3-D. Un numr
restrns de asocieri simple, prezente n motivele arhitecturale 3-D, au fost deja
identificate iar altele sunt n curs.
109
110
Figura 4.3. Structura ARN de transport: a) Motivele elementare de structur 2-D; b) Structura
teriar n form de L (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000).
111
Figura 4.5. Structura secundar a ARNr de 16 S de la E. Coli de 1542 nucleotide bazat pe compararea
secvenelor de la diferite tulpini (dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995)
3. Tipuri de ARN
Studiul aprofundat al structurii diferitelor molecule de ARN nu prezint interes
real dect n corelaie cu funciile acestora n mecanismul transcripiei sau n cadrul
biosintezei proteice. n aceste condiii ne vom limita numai la cteva aspecte ilustrative
privind structurile elementare descrise anterior.
113
114
ARNm este de numai cteva minute. La eucariote aceste molecule sunt mai stabile
durata de via variind de la cteva minute la cteva zile.
ARNm se rennoiete foarte repede, aceste molecule fiind permanent produse
i degradate. Ele au, asemeni trandafirilor, viaa unui mesaj. Cu toate acestea, aceeai
molecul de ARNm poate fi citit de mai multe ori la nivelul ribozomilor.
Din punct de vedere cantitativ ARNm nu reprezint dect cteva procente din
totalul moleculelor de ARN din celul.
n timpul transcripiei unui fragment de ADN, n molecula de ARN
corespunztoare, se formeaz tranzitoriu hibrizi scuri ARN-ADN cu conformaie A, la
nivelul buclei unde catenele de ADN sunt local desfcute.
Figura
4.6.
Sinteza
moleculelor de ARNm: a)
transcripia
ARNm
policistronic la procariote; A,
B; C, D i E sunt genele
operonului triptofan (trp)
b) transcripia i maturarea
ARNm la eucariote (gena
globinei); ARN transcris de
la nivelul unei uniti
complexe (albastru) conine
exoni (c) i introni (d); poate
fi procesat pe mai multe ci
pentru a conduce la unul sau
la mai multe uniti ARNm
monocistronice funcionale;
liniile punctate marcheaz
nlturarea intronilor (dup
Molecular
Cell
Biology
Lodish H., et. al., 2000)
traducerea mesajului dintr-un cod format din nlnuirea repetitiv i aleatoare a patru
nucleotide n altul, reprezentat de alternana a 20 de aminoacizi. Fiecare aminoacid este
codificat de una sau mai multe secvene de trei baze, numite codoni, din structura
ARNm. Codul genetic aste format din 64 de combinaii posibile (codoni) dintre care 61
specific amino acizi i trei (AAA, AAG i AGA) semnalizeaz ncheierea traducerii
(STOP). Codonul de iniiere, AUG codific formil-metionin la procariote i metionin
la eucariote. Codul genetic este degenerat deoarece majoritatea aminoacizilor sunt
codificai de mai muli codoni (Figura 4. 8). Codul genetic standard este comun pentru
procariote i eucariote. Mici diferene au fost evideniate n cazul codului genetic
utilizat de ctre mitocondrii.
116
117
prin
legturi slabe
cu
codonul ntr-o
manier
antiparalel
molecule posed o bucl suplimentar, care reprezint regiunea cea mai variabil a
moleculelor de ARNt. n funcie de structura, la acest nivel distingem: i) moleculele de
ARNt de clas 1, cele mai bine reprezentate i care prezint un bra suplimentar scurt
de 3 la 5 nucleotide; ii) moleculele ARNt de clas 2 care posed un bra suplimentar
lung de 13 la 21 nucleotide dintre care 5 sunt complementare (Figura 4.10).
mperecherea secundar a bazelor determin formarea de elice constante. Dac
parcurgem structura din direcia 5 ctre 3 numrul de perechi de baze din care acestea
sunt formate este 7, 3 (sau 4), 5 i 5. mperecherile bazelor sunt de tip Watson-Crick
ct i de alte tipuri.
Compararea secvenelor moleculelor de ARNt evideniaz conservarea n
poziii invariabile a unor baze pirimidinice sau purinice.
3.2.2. Structura teriar n L a moleculelor ARNt
n figura 4.3b este prezentat structura teriar a unei molecule de ARNt.
Numrul mare de puni de hidrogen, care se formeaz ntre baze situate la distan,
realizeaz replierea moleculei i apariia unei conformaii cu dou regiuni elicoidale ale
cror axe sunt situate n planuri perpendiculare.
Una dintre aceste elice lungi se formeaz ntre braul D i anticodon iar
cealalt ntre braul acceptor i TC. Cu toate c molecula n aceast conformaie 3-D
este compactat, constatm c doi poli sunt particular accesibili: extremitatea 3 i
bucla anticodon.
n ciuda numrului mic de cristalizri reuite pentru moleculele de ARNt,
datele obinute sunt suficiente pentru a admite existena unei structuri identice sau
foarte apropiate pentru toate tipurile de ARNt.
Figura 4.9.
Recunoaterea codon
anticodon (dup
Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000)
120
Figura 4.11. Principalele caracteristici ale ribozomilor de la procariote i eucariote (dup Molecular Cell
Biology Lodish H., et. al., 2000)
122
123
Figura 4.13 Diferite tipuri de antibiotice, majoritatea cu aciune selectiv asupra sintezei proteice la
nivelul ribozomilor celulelor procariote
124
P. Spre deosebire de exemplul studiat de Cech, ARN din ribonucleaza P aciona asupra
unei alte molecule substrat i nu asupra propriei structuri.
Numeroase tipuri de reacii catalitice sunt acum cunoscute ca fiind catalizate
de ARN. Au fost denumite ribozime acele molecule de ARN dotate cu capacitate
enzimatic despre care, pn la un anumit moment, se considera c este rezervat
numai proteinelor. Activiti catalitice ale ARN sunt direcionate ctre: i) substrate
separate; ii) propria molecul i sunt descrise ca auto-maturare sau auto-splicing, n
funcie de tipul de reacie.
Cteva din cele mai cunoscute exemple de activitate catalitic a ARN sunt:
a) Enzima ribonucleaza P, ribonucleoprotein care conine o singur molecul
de ARN legat la o protein. ARN posed capacitatea de a cataliza clivarea substratului
ARNt, n timp ce componenta proteic are un rol indirect, probabil n meninerea
structurii conformaionale a ARN catalitic.
b) Intronii din grupa I posed capacitatea de a-i realiza propria maturare din
pre-ARNm n care sunt coninui. Reacia poate fi realizat in vitro numai de ctre
ARN, dar in vivo ea este asistat de proteine. Aciunea intronilor din grupa I genereaz
molecule ARN care posed multe alte activiti catalitice corelate cu activitatea de
origine.
c) Anumii introni, att din grupul I ct i din II, conin faze de lectur care pot
fi traduse n proteine. Unii introni din grupa I codific pentru maturaze i pentru
endonucleaze.
d) Moleculele mici de ARN din clasa viroizilor i virusoizilor au capacitatea de
a realiza reacii de auto-clivare. Cu toate c aceste reacii sunt intramoleculare,
molecula poate fi mprit ntr-o parte enzimatic i o parte substrat ale cror
funcii sunt independente. S-a demonstrat c majoritatea viroizilor i virusoizilor care
sufer auto-clivare au, n principiu, o structur secundar sub form de cap de ciocan
n figura 4.15 este prezentat aceast structur obinut prin analize cu craze X. La
nivelul structurii secundarea a complexului ARN-ADN sunt reprezentate prin linii
punctate interaciile de tip Watson-Crick iar cele diferite prin linii continue.
126
Figura 4.14. Tipuri de structuri secundare posibile ale ARNr de tip 16S: a) la archeobacterii; b) eucariote,
drojdii; c) mitocondrie de mamifer (bovine). Se observ conservarea filogenetic a domeniilor
i subdomeniilor din structur (dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995)
Figura 4.15. Structura secundar cap de ciocan a unei ribozime (Lewin B., Genes VII,2000)
127
128
CAPITOLUL V
STRUCTURA MOLECULAR A
CROMOZOMILOR I GENELOR
Unul dintre criteriile care stau la baza clasificrii organismelor este absena sau
prezena nucleului individualizat. Celulele procariote lipsite de un veritabil nucleu,
includ eubacteriile i archeobacteriile. De cealalt parte se afl celulele eucariote care
posed o membran nuclear care separ cromozomii de restul celulei. Cromozomul
unic al celulelor procariote este format dintr-o molecul de ADN dublu catenar
circular care conine cteva milioane de perechi de baze (Tabel 5.1). n general,
genoamele eucariotelor au o mrime i o complexitate variabil i conin mai muli
cromozomi.
Att celulele procariote ct i cele eucariote posed mecanisme, pe de o parte
comune i pe de alt parte distincte, pentru reglarea expresiei genelor i a fluxului de
informaie de la ADN la proteine. Transcripia ADN realizat de ARN polimeraze
constituie prima etap, comun la toate organismele. La celulele procariote, ribozomii
se fixeaz pe molecula de ARNm, n curs de sintez, i realizeaz traducerea imediat a
informaiei n proteine, n citoplasm. Din contr, la eucariote membrana celular
separ locul n care se realizeaz transcripia de cel n care are loc traducerea.
Transcriptul primar, ARNm imatur, conine o succesiune de secvene netraduse,
numite introni, care vor fi eliminate prin procedeul de scindare a intronilor i sudare a
exonilor (splicing) n procesul de maturare a ARNm. n urma acestei etape,
localizat n nucleu, ARNm trece n citoplasm unde este tradus. Maturarea ARNm
prin splicing confer celulei eucariote posibilitatea diversificrii informaiei prin
combinarea alternativ a exonilor, o alt etap foarte important n dezvoltarea
organismelor.
Figura 5. 1. Reprezentare clasic a unei celule procariote (dup Campbell, et al., Biology, 2002).
Dei cea mai mare parte a genoamelor procariote sunt mai mici de 5 Mpb
lungime, exist i cteva mai mari (Tabel 5.1). n prezentarea tradiional, genomul tipic
procariotelor conine o singur molecul circular de ADN, localizat la nivelul
nucleoidului.
Aceast abordare este adevrat pentru E. coli i pentru multe alte bacterii
foarte studiate dar, specificm c evoluia cunoaterii, n sfera genomului procariotelor,
pune n discuie anumite concepte dezvoltate n era pre-genomic a microbiologiei.
Aceste aspecte se refer att la structura fizic a genomului procariotelor ct i la
organizarea genetic.
130
molecula de ADN, dar nu se cunoate dac tetramerii sunt distribuii de-a lungul ADN
sau sunt poziionai numai n regiunea central a nucleoidului.
Tabel 5. 1. Mrimea i complexitatea genomului la cteva virusuri i celule
Nume comun
Mrimea genomului
(pb)
Mrimea relativ a
genomului (E. Coli=1)
5,2 x 103
4,8 x 104
1,4 x 105
1,3 x 10-3
1,2 x 10-2
3,5 x 10-2
0,7 x 106
2,9 x 106
4,6 x 106
9,7 x 106
30 x 106
1,7 x 10-1
7,2 x 10-1
1
2,6
6,5
Drojdii
Ciuperci
1,5 x 107
1,5 x 107
3,7
3,7
Porumb
Ceap
7,0 x 107
3,9 x 109
1,8 x 1010
1,7 x 101
9,7 x 102
4,5 x 103
Musc
oarece
Taur
Om
1,8 x 108
2,7 x 109
3,2 x 109
3,4 x 109
4,5 x 101
6,7 x 102
8,0 x 102
8,5 x 102
Virusuri
SV40
Bacteriofagul
Virus herpes bovin
Celule Procariote
Mycoplasma capricolum
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Myxococcus xanthus
Bacillus megaterium
Celule Eucariote
Ciuperci
Saccharomyces cerevisiae
Aspergillius niger
Plante
Arabidopsis thaliana
Zea mays
Alium cepa
Animale
Drosophila melanogaster
Mus musculus
Bos taurus
Homo sapiens
Bacterii
132
de
Funciile genelor
Exemple plasmide
plasmid
Rezisten
Fertilitate
Uciga
(killer)
Degradativ
Virulen
Rezisten antibiotice
Conjugare i transfer ADN ntre
bacterii
Sinteza de toxine care ucid alte
bacterii
Enzime
pentru
metabolismul
moleculelor neobinuite
Patogenitate
135
Figura 5.3. Diferite tipuri de operoni: a) operonul lactoz de la E. coli; b) operonul triptofan de la E. coli;
c) operonul mixt de la Aquifex aeolicus
Numr de gene
H. influentzae
1 727
68
54
53
84
112
30
25
87
6
64
27
141
123
M. genitalium
470
1
5
19
17
31
6
6
32
7
7
12
101
34
Din cele 470 gene ale genomului de la M. genitalium, 350 sunt prezente i la
bacterii mai ndeprtate evolutiv, cum este Bacillus subtilis. Aceasta sugereaz c
trsturile biochimice i structurale care disting Mycoplasma de Bacillus sunt
codificate n aproximativ cele 120 gene care sunt unice la fiecare tip. Din nefericire,
astfel de comparaii privind genele particulare nu dau rspunsuri cheie privind
caracteristicile care individualizeaz fiecare tip de microorganism.
138
140
Figura 5.6. Anvelopa nuclear a ovocitelor de Xenopus vizualizat prin microscopie electronic: a) faa
citoplasmatic a complexului porului nuclear (CPN); b) faa nucleoplasmatic a anvelopei
nucleare dup ndeprtarea membranei nucleare a CPN, evideniind structura sub form de
co; c) faa nucleoplasmatic a anvelopei nucleare dup ndeprtarea membranei nucleare prin
tratament blnd cu detergent. Reeaua laminar, care se insereaz n inelul nuclear al NPC,
este expus dup acest tratament (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)
ii) interacia ntre proteina nuclear i receptorul pentru SLN permite acostarea
Ran-GTP
la
Ran-GDP
avnd
drept
rezultat
transformare
purttor al unui semnal bazic SLN, care iniiaz un alt ciclu de import nuclear. Se
presupune c Ran-GDP este i el translocat prin porii nucleari din citoplasm n
nucleoplasm, unde factorul nucleotidic de schimb, Ran (RCC1), determin eliberarea
GDP i relegarea GTP.
Un por nuclear individual este capabil s importe proteine i s exporte ARN i
ribonucleoproteine. Acest transport bidirecional poate fi vizualizat prin microscopie
electronic. De asemenea, tendina de acumulare n unul dintre cele dou
compartimente celulare a unor proteine purttoare de semnale de localizare n
citoplasm sau n nucleu poate fi vizualizat prin microscopie de fluorescen (Figura
5.8)
sau confocal.
Figura 5.7. Mecanismul propus pentru transportul, din citoplasm n nucleu, a proteinelor
cargocare conin un semnal de localizare nuclear (SLN) (dup Molecular Cell
Biology Lodish H., et. al., 2000).
143
nucleu:
a)
pete observate ntr-un anumit nucleu reprezint situsul sintezei mai multor molecule de
ARNm diferite. Diferitele elemente ale nucleului sunt organizate n acest compartiment
printr-o reea interactiv complex de filamente care compun matricea nuclear.
2.1.3. Matricea nuclear
Cnd nucleele izolate sunt tratate cu detergeni anionici i o concentraie
crescut de sruri (NaCl 2M), pentru a extrage lipidele i aproape toate proteinele
histonice i nehistonice ale cromatinei, ADN apare ca un halou care nconjoar un
centru nuclear rezidual (Figura 5.10a). Dac fibrele de ADN sunt apoi digerate cu
nucleaz, rmne o structur care pstreaz forma nucleului de origine, dar ea este
compus din fibrile proteice subiri care se ncrucieaz pe suprafaa spaiului nuclear
Matricea nuclear nu este numai un schelet care menine forma nucleului sau
un eafodaj pe care se organizeaz buclele de cromatin; ea servete i de fixare pentru
mecanismele care intervin n diferite activiti ale nucleului, cum sunt transcripia,
maturarea ARN i replicarea. De exemplu, dac celulele sunt incubate n prezen de
precursori radioactivi ai ARN sau ADN n timpul unei scurte perioade, gsim c
aproape toi acizii nucleici sintetizai sunt asociai fibrilelor matricei nucleare.
145
Figura 5.10. Matricea nuclear: a) micrografie electronic a unui nucleu izolat n prezen de detergeni i
sruri 2M; b) micrografie electronic a unei regiuni de fibroblast de oarece n urma
tratamentului cu detergent i nlturare a cromatinei i ADN
Proba cea mai clar privind importana matricei nucleare a fost furnizat de o
serie de cercetri efectuate n laboratorul lui Jeanne Lawrence de la Universitatea din
Massachusetts. Utiliznd hibridizarea fluorescent, in situ, pentru a identifica
localizarea secvenelor specifice de ADN sau ARN. Lawrence i colaboratorii si au
constatat c moleculele de ARN transcrise, pornind de la o anumit gen, apar ca o
tren ntr-o serie limitat de nuclee. Trena fluorescent apare datorit prezenei mai
multor sute de molecule de pre-ARNm transcrise pornind de la o singur gen (Figura
5.9a).
2.2. Cromozomii
Cromozomii se individualizeaz structural la nceputul mitozei i par s
dispar din nou la sfritul acesteia. Acetia sunt constituii dintr-un complex de ADN
i proteine numit cromatin. Cromatina exist n diverse stri n diferite faze ale
ciclului celular. Cromozomii sunt mult mai scuri dect lungimea moleculelor de ADN
pe care le conin. n medie, un cromozom uman conine o molecul de ADN de
aproximativ 5 cm. Compactarea acestui material genetic, n structura cromozomului,
presupune existena unui sistem organizat de mpachetare care s permit totui
funcionarea genomului i exprimarea genelor. Observate la microscopul electronic,
cea mai mare parte a organitelor intracelulare prezint o structur care ne ofer
informaii interesante despre funcia lor. Totui, micrografiile electronice ale
preparatelor fine ale nucleului ofer destul de puine informaii privind natura
cromozomilor n interfaz. n aceast etap, cromozomii sunt mult mai puin vizibili
deoarece cromatina se afl ntr-o stare mai relaxat (Figura 5.11a).
bandare G. Prin aceasta se evideniaz prin benzi nchise la culoare regiunile bogate
n AT i prin benzi pale cele bogate n GC.
Figura 5.11. Comparaie ntre starea cromatinei n interfaz i a cromatinei compactate n mitoz: a)
micrografie electronic prezentnd starea dispersat a cromatinei n interfaz; b)
micrografie electronic a unui cromozom mitotic (dup Molecular Cell Biology Lodish
H., et. al., 2000)
anomalii
cromozomale.
Exist
posibilitatea
determinrii
cromozomilor
suplimentari, absena lor sau o serie de alte modificri vizibile la microscopul optic.
O alt modalitate de prelucrare o reprezint colorarea cu quinacrin (bandarea
Q) care evideniaz striuri transversale. Deoarece distribuia benzilor Q este
caracteristic, fiecrui cromozom de la fiecare specie, tehnica permite identificarea
rapid a cromozomilor i realizarea unor comparaii ntre specii. De asemenea, se pot
detecta anomalii minime din structura cromozomului prin identificarea modificrilor
148
149
Bandarea R
Bandare Q
Bandare C
2.2.1.1. Centromeri
Se poate remarca c toi cromozomii reprezentai n figurile 5.11 la
5.13 posed o regiune unde suprafaa lor exterioar este net rscroit. Aceast
scobitur care este vizibil foarte bine n figura 5.11b reprezint centromerul
cromozomului.
Poziia
centromerului
este
variabil,
mprind
cromozomul
150
Figura 5.12. Cariotipul cromozomilor mitotici de la om: a) tehnic folosit pentru obinerea de preparate
de cromozomi mitotici din leucocitele sngelui periferic; b) dup obinerea unei fotografii a
cromozomilor eliberai din nucleu, acetia sunt aranjai perechi i dup mrime.
.
Figura 5. 13. Hibridizarea fluorescent n situ (FISH) i aplicaiile ei: a) utilizarea de sonde fluorescente
pentru marcarea regiunii centromerice a cromozomului 16; b) exemplu de cariotip spectral;
c) evidenierea prezenei telomerilor la cromozomi de oarece (adaptat dup Molecular Cell
Biology Lodish H., et. al., 2000)
151
2.2.1.2. Telomerii
Cele dou extremiti ale moleculei de ADN, de la nivelul fiecrui cromozom,
posed segmente particulare de secvene repetitive numite telomeri, care formeaz un
coif la fiecare capt. La om telomerii posed motivul repetitiv TTAGGG/AATCCC
care se repet de o mie de ori i permite replicarea normal a capetelor cromozomilor
(Figura 5.14).
Contrar celor mai multe tipuri de secvene repetitive, care variaz mult ntre
specii, chiar dac ele sunt nrudite i apropiate evolutiv, n cazul telomerilor de la om i
de la marea majoritatea a vertebratele studiate pn n prezent, gsim aceeai secven
telomeric. La alte organisme, cum sunt protozoarele i drojdiile, telomerii au secvene
diferite. Totui, asemeni situaiei de la vertebrate, una dintre catene este ntotdeauna
bogat n resturi de guanozin iar complementara sa n resturi de citozin. Catena
bogat n G este orientat n sensul 5-3 ctre extremitatea cromozomului i depete
cu 12 la 15 nucleotide extremitatea catenei bogat n C. Datorit existenei acestui
dezechilibru catena bogat n G formeaz o coad scurt, monocatenar, la cele dou
extremiti ale cromozomului. Aceast dispoziie persist de la o generaie celular la
alta datorit unei enzime speciale, telomeraza, care poate aduga noi uniti repetitive
la extremitatea 3 a catenei bogate n G (Figura 5.14b).
Telomeraza, ale crei proprieti au fost bine studiate de ctre Elisabeth
Blackburn i colegii si de la Universitatea din California, San Francisco, este o
transcriptaz invers care asambleaz fragmente de ADN folosind o caten ARN
matri. Este o enzim foarte neobinuit deoarece fragmentul de ARN care servete
drept model (matri) face parte din structur.
Telomerii au roluri importante: i) sunt necesari replicrii complete a
cromozomului; ii) protejeaz cromozomii de nucleaze i de alte influene
destabilizatoare; iii) mpiedic fuziunea dintre extremitile cromozomilor n procesele
de recombinare; iv) faciliteaz interaciile dintre extremitile cromozomilor i
anvelopa nuclear n anumite tipuri celulare. De asemenea, telomerii i activitatea
telomerazei par s fie unii dintre principalii actori implicai n procesul de mbtrnire.
Celulele normale, n cultur, nu sunt capabile s se divid dect de un numr limitat de
ori nainte de a da semne de mbtrnire i de a muri n final. Dintre ipotezele
propuse pentru a explica aceast observaie este i scurtarea progresiv a telomerilor.
152
Figura 5.14. Completarea capetelor ADN de ctre telomeraz: a) procesul de replicare i evidenierea
formrii capetelor incomplete ale cromozomilor pentru catena ntrziat; b) mecanismul de
aciune al telomerazei cu evidenierea motivelor repetitive de la capetele cromozomilor
Telomerii se scurteaz deoarece cea mai mare parte a celulelor umane par s
fie lipsite de telomeraze. Contrar celulelor normale, celulele canceroase nu nceteaz s
creasc n cultur i devin nemuritoare. Unul dintre factorii care ar putea contribui la
imortalizarea celulelor maligne este reactivarea telomerazei, care conserv lungimea
telomerilor de-a lungul generaiilor. De fapt, cercetrile realizate n acest sens au
demonstrat clar c celulele canceroase posed o activitate telomerazic care nu poate fi
evideniat n celulele normale. Aceast descoperire a declanat stimularea cercetrilor
privind inhibitorii specifici ai acestei enzime n sperana c acetia vor avea efect
benefic n tratamentul anumitor tipuri de cancer.
2.2.2. Tipuri neobinuite de cromozomi
Cariogramele de la anumite organisme evideniaz existena unor trsturi
neobinuite care nu sunt ntlnite la om. Acestea includ minicromozomii i cromozomii B.
Minicromozomii sunt structuri relativ mici n lungime dar bogate n gene. De
exemplu, genomul de la pui conine 39 cromozomi: i) 6 macrocromozomi care conin
66% din cantitatea de ADN i numai 25% dintre gene; ii) 33 minicromozomi care
153
conin 33% ADN i restul de 75% gene. Densitatea genic pe minicromozomi este de
ase ori mai mare dect pe macrocromozomi.
Cromozomii B sunt cromozomi adiionali existeni la unii indivizi din
populaii, dar nu la toi. Acetia sunt structuri comune la plante dar exist i la fungi,
insecte i animale. Cromozomii B par s fie versiuni fragmentare ale cromozomilor
normali care sunt rezultatul unor evenimente neobinuite aprute n timpul diviziunii
nucleare. Unii dintre acetia conin gene, care adesea codific pentru ARNr, dar nu se
cunoate starea de activare a acestora. Prezena cromozomilor B poate afecta fenotipul
organismului, mai ales la plante, unde sunt asociai cu viabilitatea redus. O serie de
studii au evideniat pierderea gradual a cromozomilor B n descenden datorit
anormalitilor evideniate n modul de motenire.
din catene de ARNhn in diferite stadii de maturare i din ARNsn care intervine n
procesul de splicing al ARNm.
n celulele eucariote, unitatea de baz a organizrii cromatinei este
nucleozomul. Acesta reprezint o entitate n care 146 pb sunt rsucite n dou ture de
super-elice stng n jurul unui octamer de histone care conine cte dou exemplare
din moleculele H2A, H2B, H3 i H4. Nucleozomii sunt organizai n filamente de 10
nm n diametru prin interaciuni cu histona H1, care se leg la ADN care intr i iese
din nucleozom. Un al treilea nivel de organizare este obinut prin rsucirea unui
filament de 10 nm ntr-o elice care conine 6 nucleotide pe tur, cu formarea unui
solenoid cu un diametru de 30 nm. Structuri mai complexe ale cromatinei sunt realizate
prin condensarea filamentelor de 30 nm, dar detaliile privind aceste structuri sunt mai
puin cunoscute (Figura 5.15).
Microscopia electronic a furnizat dovezi decisive privind organizarea
cromatinei n regiuni, bucle i domenii distincte de 30 la 300 kpb, fixate fiecare pe o
matrice bogat n proteine. Fiecare bucl pare s aib doar o singur origine de
replicare i s se comporte ca o unitate de replicare. Buclele, sunt uniti de suprarsucire independente, structura topologic a fiecreia fiind independent de starea
celorlalte. Se pare c acest lucru este posibil datorit fixrii extremitilor buclelor n
matrice. Cu toate c fiecare bucl conine mai multe uniti de transcripie, activitatea
ntregii regiuni poate fi coordonat pentru a fi reprimat sau potenial activat (Figura
5.15).
de la mazre, care au acelai numr de aminoacizi (102) i ale cror secvene primare
nu difer dect prin doi aminoacizi: o lizin n locul unei arginine i o leucin n locul
unei valine. Aceste diferene minore sunt prezente n condiiile n care divergena
dintre animal i plant s-a produs acum un miliard de ani. Structura histonei H1 este
mult mai variabil de la o specie la alta. Aceast conservare extrem sugereaz c toi
aminoacizii au un rol bine definit n funcionarea proteinei.
Structura teriar a histonelor din primul grup demonstreaz existena a dou
domenii: un domeniu central globular, hidrofob i un domeniu N-terminal, hidrofil,
ncrcat pozitiv i flexibil. Histona H1, mai lung, posed un al treilea domeniu la
nivelul captului C-terminal, hidrofil i flexibil.
La nceputul anilor 1970, s-a putut observa c n urma tratamentului
cromatinei, cu nucleaze nespecifice, cea mai mare parte a ADN era transformat n
fragmente de aproximativ 200 perechi de baze sau n multipli ai acestora.
Din contr, acelai tratament aplicat moleculelor de ADN nud determin
obinerea unei populaii de fragmente de mrimi aleatoare. Aceast descoperire i-a
fcut pe cercettori s considere c fragmentele uniforme de ADN cromozomial erau
protejate de atac enzimatic probabil prin asocierea lor periodic cu o protein.
Tabel 5.5: Caracteristicile histonelor din timus de vac
Histone
Nr. aminoacizi
Masa
% Arg
% Lys
PUE*
kDa
(10-6 ani)
H1
215
23,0
1
29
8
H2A
129
14,0
9
11
60
H2B
125
13,8
6
16
60
H3
135
15,3
13
10
330
H4
102
11,3
14
11
600
* PUE = Perioad unitar de evoluie: durat de timp necesar pentru o schimbare cu 1%
a secvenei de aminoacizi a unei proteine dup separarea a dou specii
156
Figura 5.15. Schema general a organizrii cromatinei cu evidenierea principalelor nivele cunoscute
de organizare (Campbell, et al., Biology 2002).
157
159
160
161
162
Figura 5.18. Modelul solenoid de organizare a fibrelor de cromatin condensat de 30 nm: a) micrografia
i modul de organizare a nucleozomilor din structur; b) micrografie prezentnd fibrele de 30 nm i
modelul de mpachetare solenoid cu caracteristicile sale structurale (adaptat dup Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000)
Figura 5.19. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei: a) micrografie electronic prezentnd
domenii de cromatin, n bucle la cromozomii n perie izolai dintr-un ovocit de amfibian; b) model de
structurare a buclelor fibrelor de cromatin de 30 nm imaginat n urma experienelor de hibridare in situ
cu sonde (A la H) situate la distane variabile pe ADN liniar; c) micrografie electronic a unui cromozom
metafazic din celule HeLa, lipsit de histone ca urmare a unui tratament moderat cu detergeni.
163
numit corpuscul Barr, dup numele cercettorului care l-a descoperit n anul
167
gena ovalbuminei, n oviduct i n ficat, i pentru genele IgL (k) din limfocite, dup
reorganizare ntr-o form transcripional activ.
2.4.3. Hipersensibilitatea la nucleaze
Genele transcrise activ prezint pe lng sensibilitatea normal la nucleaze,
situsuri de hipersensibilitate situate n jurul unitilor de transcripie. O astfel de hipersensibilitate la deoxiribonucleaza I nu apare la nivelul unor fragmente de ADN nud.
n general, situsurile de hipersensibilitate sunt poziionate imediat n amonte de situsul
de iniiere a transcripiei, dar i la extremitatea 3 a unitii de transcripie. Acestea pot
s conin secvene de amplificare sau de terminare. n cea mai mare parte a cazurilor,
hipersensibilitatea este restrns la esuturile sau celulele n care genele sunt exprimate
sau programate s fie exprimate. De exemplu, situsul de hipersensibilitate situat n 5
de gena pre-proinsulinei, este prezent n insulele ale celulelor pancreatice dar nu a
fost identificat n celulele hepatice. La fel, au fost evideniate situsuri de
hipersensibilitate asociate genelor reorganizate ale imunoglobulinelor n celulele B, dar
nu i n esuturile hematopoietice.
Probabil, situsurile de hipersensibilitate la nucleaze apar acolo unde exist o
discontinuitate n aranjarea nucleozomilor. Pentru prima dat, acest fapt a fost
demonstrat de corelaiile evideniate ntre situsurile de hipersensibilitate i zona lipsit
de nucleozomi din genomul SV40 (Figura 5.17). Aceast regiune se ntinde de la situsul
de iniiere a transcripiei genei precoce pn la extremitatea din amonte a elementului
activator. Dac acest segment de 400 pb este transferat ntr-o alt regiune a genomului
SV40 sau este integrat ntr-o plasmid, se formeaz n aceste locuri, o zon liber de
nucleozomi, hipersensibil la deoxiribonucleaza I. Deci, cele dou proprieti sunt
probabil consecina secvenei nucleotidice a acestui segment de ADN. Totui, este
posibil ca sensibilitatea la nucleaz s fie modulat i de proteine nehistonice care
recunosc aceast regiune.
De asemenea, situsuri de hipersensibilitate la nucleaze i lipsite de nucleozomi
au fost identificate n structura elementelor activatoare ale genelor pentru IgH i IgL(k)
i n secvenele activatoare din amonte asociate extremitii 5 a genelor
metalotioneinei. Alte situsuri de hipersensibilitate la deoxiribonucleaza I au fost
asociate cu activarea transcripiei ADNr. Ele au fost identificate n amonte de situsul de
iniiere i n apropierea regiunilor separatorilor intergenici. Astfel, hipersensibilitatea la
nucleaze a devenit un indicator al regiunilor de reglare a transcripiei genelor eucariote.
168
Figura 5.22. Analiza translocrilor cromozomiale prin bandare (a) i prin marcarea fluorescent a
cromozomilor (b). Se observ formarea cromozomului Filadelfia datorit translocrii unei
regiuni din cromozomul 22 pe cromozomul 9.
171
Saccharomyces cerevisiae
Drosophila melanogaster
Om
Porumb
Salamandr
12,1
140
3 000
5 000
90 000
Numr.
cromozomi
16
4
23
10
12
174
Figura 5.23. Mrimea coninutului n ADN a genomului haploid de la diferite organisme. Complexitatea
morfologic a organismelor, estimat n funcie de numrul tipurilor celulare pe care le
prezint, crete de jos n sus (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)
.
Analiza molecular ncearc s explice i paradoxul aparent pe care l
reprezint faptul c genoamele eucariotelor par s conin o cantitate nsemnat de
ADN care nu este necesar celulei. Acum mai bine de 30 de ani se considera c
eucariotele conin aproximativ 50 000 gene. Cum fiecare secven codant era
considerat ca avnd, n medie, 1 200 pb, genomul acestora ar fi trebuit s conin
numai aproximativ 6 x 107 pb. Acum se cunoate c genoamele unor ciuperci sunt mai
mici dect aceast valoare i c cea mai mare parte a genoamelor de mamifere i de
plante conin de 50 la 100 ori mai mult ADN (Tabel 5.1).
Iniial, pentru estimarea numrului de gene, o serie de cercettori au extrapolat
situaia cunoscut de la E. coli unde de 4,7 milioane pb codific pentru 3000 de gene.
Pstrnd proporionalitatea ei considerau c genomul haploid uman de 2,9 miliarde pb
trebuia s aib un numr mult mai mare de gene (de 600 ori mai mare). Odat cu
ncheierea secvenializrii genomului uman a fost posibil identificarea tuturor fazelor
de lectur i realizarea unei estimri ct mai corecte a numrului genelor de la om. n
prezent se discut de 30-40 000 n loc de 60-80 000 gene cum se considera n
momentul nceperii acestui program. De asemenea, evoluia tehnicilor de biologie
175
Mrime genom
1,8 Mb
12 Mb
97 Mb
100 Mb
180 MB
3 200 Mb
Nr. de gene
estimat
1 700
6 000
19 000
25 000
13 000
30 000-40 000
Nr. de
gene/Mb
950
500
200
200
100
10
intronilor nu este obligatorie existnd i gene lipsite de acetia. Genele care codific
pentru moleculele de ARN funcionale cum sunt ARNt i ARNr pot s posede i ele
secvene intercalare, dar ntreruperile la nivelul acestora sunt mai puin frecvente. n
general, cantitatea de ADN prezent n introni depete cu mult pe cea din exoni.
ii) anumite gene apar de mai multe ori ntr-un genom eucariot i contribuie la
creterea taliei. Existena de copii multiple ale unei anumite gene nu este ns o
proprietate exclusiv a eucariotelor. De exemplu, E. coli posed apte gene pentru
ARNr, probabil pentru a satisface necesitile, n ribozomi, ale unei creteri rapide.
Eucariotele posed i ele gene n copiii multiple pentru a rezolva astfel de probleme.
La mamifere exist mai multe sute de gene care codific pentru ARNr. O alt
parte important din excesul de ADN este determinat de prezena copiilor
nefuncionale ale genelor. n general, aceste copii sunt numite pseudogene i sunt
inactive din cauza existenei unor deleii sau altor alterri ale secvenei ADN. Numrul
pseudogenelor pentru un anumit tip de gen variaz foarte mult. Astfel, n genoamele
eucariotelor, o gen poate fi prezent o singur dat, sau foarte bine, poate s fac parte
dintr-o familie de gene funcionale strns nrudite. Acestea pot fi exprimate n
momente diferite sau n esuturi i celule diferite. Astfel de familii pot include i
pseudogene. n figura 5.24 este prezentat clusterul -globinei care conine dou
pseudogene. De asemenea, se remarca cantitatea mare de ADN nefuncional prezent
la om comparativ cu drojdia Saccharomyces cerevisiae.
iii) o alt cauz a mrimii excesive a genoamelor eucariote este prezena unor
familii mari de secvene de ADN repetitiv a cror funcie este, pentru moment,
necunoscut. Astfel de familii reprezint adesea ntre 10% la 50% din genom (Tabel
5.10)
. Aceste secvene au fost pentru prima dat identificate n urma analizei cineticii
secvene foarte scurte care se repet de multe ori n tandem formnd clustere mari.
Datorit unitilor repetitive scurte, aceste secvene de ADN sunt adesea denumite
secvene ADN simple sau secvene satelit.
Tabel 5.9. Variabilitatea numrului de introni i exoni i mrimea acestorala diferite specii
Produsul genei
Organism
Exoni
Introni
Adenozin dezaminaza
om
Pb total
numr
Pb total
1 500
11
30 000
Apolipoproteina B
om
14 000
28
29 000
Beta-globina
oarece
432
762
Citocrom b
drojdii
2 200
5 100
Dihidrofolat reductaza
oarece
568
31 500
Eritropoetina
om
582
1 562
Factorul VIII
om
9 000
25
177 000
oarece
1 307
32 000
Interferon alfa
om
600
Receptor LDL
om
5 100
17
40 000
Fazeolin
Fasole verde
1 263
515
Tiroglobulin
om
8 500
>40
100 000
ARNtTyr
drojdii
76
14
Ureaz (subunitate)
soia
300
4 500
Vitelogenin
broasc
6 300
33
20 000
Zein
porumb
700
Hipoxantin
transferaza
fosforibozil
178
25-40%
100-10 000 pb
1 la 1 milion
Figura 5. 25. Curbele de reasociere (Cot) pentru ADN dublu catenar din sursele indicate pe grafic. Se
observ procesul de renaturare rapid a secvenelor repetitive sau care conin satelii dup
Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)
Acest tip de secvene sunt prezente n aproape toate genoamele eucariote, dar
cantitatea lor total este extrem de variabil. n genoamele mamiferelor acestea
reprezint, n mod normal, < 10% dar la Drosophila virilis, cantitatea este de 50%.
179
180
Tip de organism
Mrime
genom (kb)
Alg verde
Vertebrate (oarece)
Vertebrate (om)
Nevertabrate
Nevertebrate (musc)
Alg roie
Ascomicete, fungi
Protozoar
Drojdie
Bazidiomicete, fungi
Plante cu flori (varz)
Plante cu flori
Plante cu flori (porumb)
Plante cu flori (pepene)
16
16
17
17
19
26
33
69
75
121
160
367
570
2 500
Pante cu flori
Plante
Plante cu flori (orez)
Plante cu flori (tutun)
Alg verde
120
121
136
156
195
plantelor, i pentru subunitatea a ATP-azei F1. ARNr de la plante este mult mai mare
dect cel de la alte eucariote. Secvenializarea recent a uneia dintre cele mai mici
molecule de ADNmt de la plante a evideniat c mrimea este datorat existenei de
regiuni necodante i de secvene duplicate.
Diferenele de mrime i de capacitate codant a ADNmt de la diferite
organisme poate reflecta un anumit schimb de ADN, ntre mitocondrie i nucleu, n
cursul evoluiei. Dovezi directe, n favoarea acestei afirmaii au fost furnizate de
evidenierea unor proteine ale cror gene sunt la unele specii localizate n nucleu i la
altele n mitocondrie. Se pare c este vorba de o deplasare a genelor din mitocondrie n
nucleu i invers, n timpul evoluiei. Cel mai elocvent exemplu este cel al genei cox II,
care codific subunitatea 2 a citocrom c oxidazei. Pentru toate organismele studiate,
aceast gen se gsete n ADNmt, cu excepia unei specii de legume numit Bob
(mung bean) unde gena cox II este nuclear.
Tabel 5.12. Caracteristicile genelor mitocondriale
Caracteristica
Numr total de gene
Tipuri de gene
Gene care codific proteine
complexul respirator
proteine ribozomale
proteine transportoare
ARN polimeraza
Factor de translaie
Gene care codific ARNr
Gene ARNt
Alte gene ARN
Numr de introni
Mrimea genomului (kb)
C.
reinhadtii
12
7
7
0
0
0
0
2
3
0
1
16
Homo
sapiens
37
S.
cerevisiae
35
A.
thaliana
52
R.
americana
92
13
13
0
0
0
0
2
22
0
0
17
8
7
1
0
0
0
2
24
1
8
75
27
17
7
3
0
0
3
22
0
23
367
62
24
27
6
4
1
3
26
1
1
69
care codific pentru proteine din cloroplaste, folosind codul genetic standard. Alte
proteine specifice din cloroplastelor sunt fabricate n citoplasm i sunt transportate,
dup traducere.
ADN din cloroplaste sunt molecule circulare de aproximativ 120 000-160 000
pb, n funcie de specie. Multe dintre moleculele de ADN din cloroplaste au fost
complet secvenializate (Tabel 5.11). Genomul cloroplastelor din planta a crei denumire
popular este plmn prezint dou secvene repetitive inverse fiecare constnd n
10058 pb care conin genele ARNr i alte cteva gene duplicate. n ciuda diferenei de
mrime (plmn 121 024 pb; tutun 155 844), ntreaga organizare i compoziia
genelor de la plmn i de la tutun este foarte similar; Diferena de mrime apare, n
primul rnd, de la repetiiile inversate provenite din duplicarea anumitor gene.
Din aproximativ 120 de gene codificate de ADN din cloroplaste, aproape 60
sunt implicate n transcripia i translaia ARN i includ genele care codific pentru
ARNr, ARNt, subunitile ARN polimerazei i proteinele ribozomale. Aproximativ 20
de gene codific pentru subunitile complexelor transportoare de electroni din
cloroplast i pentru complexul FoF1 ATP-azic. De asemenea, sunt codificate de ctre
genomul cloroplastelor cele dou subuniti mari ale ribulozo 1,5 difosfat carboxilaza,
care este implicat n fixarea dioxidului de carbon n timpul fotosintezei.
Reflectnd originea endosimbiotic a cloroplastelor unele regiuni din genomul
acestora sunt similare cu cele ale ADN de la bacteriile actuale. De exemplu, ADN din
cloroplaste codific patru subuniti ale ARN polimerazei care sunt omologe cu
subunitile ARN polimerazei de la E. coli. Un alt segment al ADN din cloroplaste
codific 8 proteine care sunt omologe cu 8 proteine ribozomale de la E. coli. Ordinea
genelor este similar n cele dou tipuri de ADN. ADN din cloroplastele plmnului
posed cteva gene care nu sunt n ADN din cloroplastele tutunului i invers. Acest
lucru poate indica un posibil schimb ancestral ntre cloroplaste i nucleu.
184
185
BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1.
ALBERTS B., BRAY D., JOHNSON A., LEWIS J., RAFF M., ROBERTS K.,
and WALTER P. (1998) Essential Cell Biology. An introduction to the
Molecular Biology of the Cell, International Student Edition, Garland Publishing,
Inc, New York
2.
ALBERTS B., JOHNSON A., LEWIS J., RAFF M., ROBERTS K., and
WALTER P. (2002) Molecular Biology of The Cell, 4th ed. Ed., Garland Science
Taylor&Francis Group, New York
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
CAMPBELL, and REECE. (2002) Test Bank For Biology, 6th ed., Ed.,
Benjamin Cummings, San Francisco
13.
CAMPBELL, and REECE. (2002) Instructor's Guide to Text and Media for
Biology, 6th ed. Ed., Benjamin Cummings, San Francisco
14.
15.
16.
17.
CAU P., and SETE R. (1999) Cours de Biologie Cellulaire, 2eme ed., Ellipses
Edition Marketing, Paris
18.
19.
20.
21.
22.
23.
DAVIS L.G., DIBNER M.D., and BATTERY J.F. (1999) Basic Methods in
Molecular Biology, Elsevier, New York
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
a Practical
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
LEWIS R. (1997) Human Genetics Concepts and Applications, 2nd ed. Ed.,
WCB McGraw-Hill, Boston
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
MORGAN J., and DARLING D. C. (1993) Animal Cell Culture, BIOS Scientific
Publishers, Liverpool
62.
63.
OULMOUDEN A., DELOURME D., MAFTAH A., PETIT J.M., and JULIEN
R. (1999) Gntique, Dunod, Paris
64.
65.
66.
ROSS M. H., ROMRELL L. J., and KAYE I. G. (1995) Hystology a text and
Atlas, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia
67.
68.
69.
70.
71.
STRYER A. (2003) BIiochemistry 5th ed. Ed., Freeman and Comapany, New
York
72.
73.
74.
75.
UCL Medical School, C. o. t. C. a. G. (ed) (1996) Tutorial Problems & ProblemSolving Exercises,, Department of Biochemistry and Molecular Biology,
University College London, London
76.
VOET D., and VOET J. G. (1995) Biochemistry, 2nd Ed., John Wiley and Sons,
New York
77.
190
191
Lista figurilor
Figura 1.1. Structura polimer a acizilor nucleici ........................................ 12
Figura 1.2. Bazele majore din structura acizilor nucleici ............................ 13
Figura 1.3. Baze modificate: N6-metil adenina (bacterii) 5-metil- citozina
(plante, animale); hipoxantina. ............................................................... 14
Figura 1.4. Produii de degradare i alcaloizii vegetali derivai ai baze-lor
purinice. (Xantina; acidul uric; 1,3-dimetil-xantina = teofilina; 3,7dimetilxantina = teo-bromina; 1,3,7-trimetil ......................................... 15
Figura 1.5. Civa analogi sintetici ai bazelor din structura acizilor
nucleici: 5-bromouracil, aciclovir (2-hidroxi-etoxometil guanin), 5fluoro-uracilul; 6tiopurina; 8-azaguanina;.......................................... 16
Figura 1.6. Echilibre tautomere posibile la pH 7,0 ntre formele lactam (la
stnga) i lactim (la dreapta) ale bazelor pirimidinice i purinice
(prezente sunt form nucleozidic sau nucleotidic). ........................... 17
Figura 1.7. Stivuirea bazelor n cristalul de 9-metil-adenin (dup
Biochemistry, Voet & Voet, 1995) ........................................................... 18
Figura 1.8. Absorbia diferit n UV a moleculelor de ADN mono- i
dublucatenare nsoit de deplasarea spectrului de absorie ............... 19
Figura 1.9. Variaia absorbiei relative la 258 nm cu creterea
temperaturii:a) polimerul poli (A); b) dinucleotidul ApA (dup
Biochemistry,Voet&Voet,1995) .............................................................. 19
Figura 1.10. Reacii de dezaminare ale bazelor: a) citozin la uracil; b) 5metil-citozin la timin ............................................................................ 21
Figura 1.11. Dezaminri provocate de acidul azotos i consecinele acestora
.................................................................................................................... 21
Figura 1.12. Structurile furanozice ciclice cu anomerie ale ribozei i
deoxiribozei ............................................................................................... 22
Figura 1.13. Legtur -N glicozidic ntre o baz purinic i riboz ...... 23
Figura 1.14. Cele dou conformaii pe care le adopt pentoz n structur
acizilor nucleici:a) E (anvelope) i b) T (twist) (dup Biochemistry,
Voet&Voet, 1995) ..................................................................................... 25
Figura 1.15. Cele mai probabile conformaii ale ciclului furanozic (riboz i
deoxiriboz) din structura nucleotidelor. a) perspectiv; b) vedere din
fa (planul atomilor coplanari perpendiculari pe planul paginii)
(dup Biochemistry, Voet&Voet,1995) ................................................... 25
Figura 1.16. Izomerii de rotaie n jurul legturii glicozidice i definirea
unghiului de torsiune (n raport cu legtura N9-C1 i N1-C1). ..... 25
192
pseudo-teriare (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)
.................................................................................................................. 111
Figura 4.5. Structura secundar a ARNr de 16 S de la E. Coli de 1542
nucleotide bazat pe compararea secvenelor de la diferite tulpini
(dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995) ................................................ 113
Figura 4.6. Sinteza moleculelor de ARNm: a) transcripia ARNm
policistronic la procariote; A, B; C, D i E sunt genele operonului
triptofan (trp) ......................................................................................... 115
Figura 4.7. Schema unei molecule de ARNt ncrcat: a) schema general a
structurii secundare a moleculei; b) modul de formare a legturii ntre
ARNt i aminoacil (dup Biochemistry, Voe t& Voet, 1995) .............. 117
Figura 4.8.. Codul genetic standard. Codonul AUG care codific pentru
metionin este cel mai comun codon start. Trei dintre codoni AAA,
AAG i AGA funcioneaz drept codoni STOP. Se poate observa
degenerescena codului genetic deoarece numai metionina i
triptofanul sunt codificai de un singur codon, restul aminoacizilor
fiind codificai de doi la ase codoni. .................................................... 117
Figura 4.9. Recunoaterea codon anticodon (dup Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000) .......................................................................... 120
Figura 4.10. Tipuri de molecule de ARNt difereniate n funcie de
mrimea braului suplimentar: structurile 1, 2 i 3 aparin categoriei
clasei 1 n timp ce 4 aparine clasei 2. Sunt marcate elementele de
identitate majore n cele patru tipuri. Fiecare baz din structura
ARNt este reprezentat de cercuri pline. Cercurile roii indic
poziiile identice pentru recunoaterea ARNt de ctre aminoacil-ARNt
sintetaz. Bazele din structura anticodonului care reprezint elemente
de identificare sunt subliniate.(dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995)
.................................................................................................................. 120
Figura 4.11. Principalele caracteristici ale ribozomilor de la procariote i
eucariote (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000) ....... 122
Figura 4.12. Structura puromicinei analog cu tirozil ARNt .................... 122
Figura 4.13 Diferite tipuri de antibiotice, majoritatea cu aciune selectiv
asupra sintezei proteice la nivelul ribozomilor celulelor procariote . 124
Figura 4.14. Tipuri de structuri secundare posibile ale ARNr de tip 16S: a)
la archeobacterii; b) eucariote, drojdii; c) mitocondrie de mamifer
(bovine). Se observ conservarea filogenetic a domeniilor i
subdomeniilor din structur (dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995)
.................................................................................................................. 127
Figura 4.15. Structura secundar cap de ciocan a unei ribozime (Lewin
B., Genes VII,2000)................................................................................. 127
Figura 4.16. Asamblarea moleculelor de ARN U pentru formarea
spliceozomului implicat n nlturarea intronilor i sudarea exonilor
197
din structura pre-ARNm (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et.
al., 2000) .................................................................................................. 128
Figura 4.17. Molecule ARNsn implicate n recunoaterea pre-ARNm i n
realizarea procesului de splicing (dup Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000) .......................................................................... 128
Figura 5. 1. Reprezentare clasic a unei celule procariote (dup Campbell,
et al., Biology, 2002). .............................................................................. 130
Figura 5.2. Model pentru structura nucleoidului de E. coli ....................... 133
Figura 5.3. Diferite tipuri de operoni: a) operonul lactoz de la E. coli; b)
operonul triptofan de la E. coli; c) operonul mixt de la Aquifex
aeolicus .................................................................................................... 136
Figura 5.4. Nucleul celular i caracteristicile sale (dup Campbell, et al.,
Biology, 2002). ......................................................................................... 140
Figura 5.5. Complexul porului nuclear, model schematic.......................... 141
Figura 5.6. Anvelopa nuclear a ovocitelor de Xenopus vizualizat prin
microscopie electronic: a) faa citoplasmatic a complexului porului
nuclear (CPN); b) faa nucleoplasmatic a anvelopei nucleare dup
ndeprtarea membranei nucleare a CPN, evideniind structura sub
form de co; c) faa nucleoplasmatic a anvelopei nucleare dup
ndeprtarea membranei nucleare prin tratament blnd cu detergent.
Reeaua laminar, care se insereaz n inelul nuclear al NPC, este
expus dup acest tratament (dup Molecular Cell Biology Lodish H.,
et. al., 2000).............................................................................................. 141
Figura 5.7. Mecanismul propus pentru transportul, din citoplasm n nucleu, a
proteinelor cargocare conin un semnal de localizare nuclear (SLN) (dup
Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000). .......................................... 143
Figura 5.8. Semnalul de Localizare Nuclear (SLN) al antigenului T
(SV40) poate direciona o protein citoplas-matic n nucleu: a)
Piruvat kinaza normal, localizat n citoplasm, vizualizat prin
imunofluorescen dup tratarea celulelor n cultur cu un anticorp
specific; b) piruvat kinaza himer, care conine un semnal SNL al
SV40 la captul su N-terminal, este direcionat ctre nucleu.
Proteina himer a fost exprimat n urma transfeciei unei gene
modificate produs prin fuziunea unui fragment al unei gene virale
care codific NLS al SV40 cu gena piruvat kinazei (dup Molecular
Cell Biology Lodish H., et. al., 2000). .................................................... 144
Figura 5.9. Localizarea situsurilor de sintez i de maturare a pre-ARN cu
sonde fluorescente: a) vizualizarea procesului de transcripie prin
colorare cu DAPI pentru evidenierea genei i cu anticorpi fa de
heterogen nuclear ribonucleo proteine, marcai cu fluorescein; b)
evidenierea procesului de poliadenilare prin colorare cu poli-dT
198
201
Lista tabelelor
Tabel 1.1 Denumire i simbol cu trei litere i cu o liter pentru baze i
nucleozidele lor ......................................................................................... 23
Tabel 1.2. Coenzime i molecule intermediari metabolici n structura
crora intr adenozina............................................................................. 26
Tabel 1.3. Nomenclatura i simbolurile diferitelor tipuri de nucleotide
(sunt figurate numai ribonucleotidele, n afar de timin care servete
ca exemplu pentru deoxiribonucleotide). ............................................... 32
Tabel 1.4. Constante spectrofotometrice ale nucleozidelor purinice i
pirimidinice ............................................................................................... 38
Tabel 2.1. Constituenii ARN i ADN..................................................... 41
Tabel 2.2. Mrimea unor molecule de ADN din diferite surse, comparat
cu cea a unei proteine fibroase, colagenul, i celulele procariote i
eucariote. ................................................................................................... 44
Tabel 2.3. Produii de degradare chimic a acizilor nucleici ....................... 49
Tabel 2.4. Exemple de nucleaze reprezentative i diferitele lor
caracteristici. ............................................................................................ 52
Tabel 2.5. Numrul situsurilor de tiere prezente la nivelul ADN din trei
virusuri pentru trei endonucleaze comune. ................................................ 54
Tabel 3.1. Caracteristicile diferitelor conformaii ale elicelor ADN ... 74
Tabel 3.2. Exemple de valori Tm n funcie de coninutul n (G+C) ......... 100
Tabel 5. 1. Mrimea i complexitatea genomului la cteva virusuri i
celule ........................................................................................................ 132
Tabel 5.2. Trsturile ctorva plasmide tipice ............................................ 134
Tabel 5.3. Catalog comparativ de gene pentru E. coli, H. influentze, M.
genitalium ................................................................................................ 137
Tabel 5.4. Tehnici de colorare folosite pentru bandarea cromozomilor ... 149
Tabel 5.5: Caracteristicile histonelor din timus de vac ............................ 156
Tabel 5.6. Numrul de cromozomi la diferite organisme (celula haploid)
.................................................................................................................. 174
Tabel 5.7. Mrimea genoamelor, numrul de gene i distribuia acestora
.................................................................................................................. 176
Tabel 5.8. Clasificarea secvenelor ADN de la eucariote ............................ 176
202
203