Metode generale de izolare a toxicilor

n ziua de astazi, toxicologia analitic esta narmat cu un numr uimitor de unelte pentru
determinarea i cuantificarea compuilor cu potenial toxic la concentraii considerate imposibil de
detectat cu 10 ani n urm. Persoanele implicate n analiza probelor coninnd, de exemplu, ageni
cancerigeni n probe de esut, reziduuri de pesticide din soluri i hidrocarburi aromatice policiclice
(HAP) din aer, trebuie s aib o bun nelegere a tuturor aspectelor procedurale referitoare la probele
pe care le analizeaz pentru a se asigura c datele generate sunt corecte i complete.
Toxicii se pot clasifica n
toxici gazoi
toxici lichizi
toxici solizi
Functie de provenienta (origine, natura):
toxici minerali
toxici organici naturali
vegetali
animali
toxici organici de semisinteza si sinteza
Ogier si Kohn-Abrest au clasificat toxicii functie de criteriul analitic, adica de modul in care
sunt izolati din aer si/sau material biologic in vederea identificarii si dozarii lor :
a)toxici gazosi, care se izoleaza in general prin recoltare din aer, mai rar din material biologic
(ex:CO, H2S, AsH3) ; marea majoritate sun anorganici.
b)toxici volatili
- care se izoleaza prin distilare (au p.f.100C) din mediu acid sau bazic. In aceasta grupa
se incadreaza cea mai mare parte a toxicilor volatili;
- care se izoleaza prin antrenare cu vapori de apa (au p.f. 100C) ex : fenol, nitrobenzen,
anilina.
Marea majoritate a toxiclor volatili sunt organici.
c)toxici minerali ficsi
- care se izoleaza prin mineralizarea (distrugerea) materiei organice
- care se izoleaza prin extractie apoasa, hidroalcoolica sau dializa (metode blande pentru
a nu-i denatura); exemple : nitriti, nitrati, cloruri, acizi corozivi, baze caustice ; ei se izoleaza in
portiunea C de organe (10% din proba pentru expertiza)
d)toxici organici ficsi (nevolatili)
- care se izolaza din mediu acid (cei cu caracter slab acid sau neutru)
- care se izoleaza din mediu bazic (cei cu caracter slab bazic)
In ambele cazuri extractia se face cu solventi organici nepolari (cloroform, eter) si mai rar
cu solventi organici slab polari.
Metodele de extractie folosite sunt :
- extractia prin echilibrare (cu palnia de separare)
- extractia exhaustiva (cu aparatul soxhlet)
Analiza toxicologica:
Totalul probelor recoltate pentru analiza se imparte in doua parti egale : o jumatate este
utilizata pentru analiza, cealalta jumatate este destinata contraanalizei sau a unor cercetari
suplimentare.
Prima jumatate (destinata analizei) dupa maruntire este impartita in trei portiuni :
 portiunea A (aprox.45%) se utilizeaza pentru cerectarea toxiclor volatili, iar reziduul
ramas dupa izolarea acestora prin distilare sau antrenare cu vapori de apa, se cerceteaza toxicii
minerali (izolati prin mineralizare)
portiunea B (aprox.45%) se utilizeaza pentru cercetarea toxicilor organici ficsi (care se
izoleaza prin extractie cu solventi organici)
portiunea C (aprox.10%) se utilizeaza pentru cercetari speciale, la randul ei imartindu-se
in doua portiuni: una pentru cercetarea cloroformului si a tiocianatilor
cealalta pentru cercetarea unor toxici minerali care pot scapa mersului analizei
generale (argint, plumb, bariu, zinc) si pentru cercetarea sarurilor minerale (clorati, nitriti, nitrati).
Analiza toxicologica comporta 4 etape :
1.analiza preliminara
2.izolarea substantelor toxice
3.identificarea si determinarea cantitativa
4.corelarea si interpretarea rezulatelor.
1.ANALIZA PRELIMINARA : precede analiza toxicologica propriu-zisa, nu are caracter
de certitudine. Foloseste hartii indicatoare, tuburi indicatoare, reactii chimice pe hartie de filtru sau
chiar in eprubeta.
2.METODE DE IZOLARE :
2.1.Izolarea toxicilor gazosi
Se realizeaza de obicei in atmosfera (prelevarea unui volum de atmosfera viciata sau
barbotarea unui volum de aer printr-o solutie absorbanta sau trecerea peste un material absorbant)
dar pentru unii toxici gazosi (CO, H2S, AsH3) este necesara cercetarea prezentei lor in sange si
urina.
Toxicii din aer pot fi detectai direct din atmosfera poluat sau determinai dup recoltarea
de aer.
Detecia se realizeaz cu ajutorul hrtiilor, creioanelor, sau tuburilor indicatoare
hrtia indicatoare: se impregneaz benzi sau rondele de hrtie de filtru cu un reactiv
adecvat i se expun n atmosfera poluat sau se aspir aerul prin ele. Toxicul este detectat ca prin
modificarea culorii (rezultat din reacia dintre toxic i reactiv)
Recoltarea probelor de aer se realizeaz prin mai multe procedee:
2.1.1. Recoltarea n recipiente nchise
Procedeul este indicat pentru recoltarea toxicilor n concentraie mare. Se utilizeaz
recipiente care au un folum cunoscut, i anume:
flacoane din sticla flacoane cu dop strbtut de un tub lung (sifon) i altul scurt,
prevzute cu robinete, prin care se poate face vid
Pipete de gaz (tonometre)
Camere, saci baloane de cauciuc etc
2.1.1.1. Recoltarea prin dislocuire de lichid
Se umple complet flaconul cu ap, i se golete la locul de recoltare
2.1.1.2. Recoltarea prin dislocuire de aer
Se trece prin tubul lung al flaconului, adaptat la un dispozitiv de aspirare, aer de
cercetat, n timp ce aerul iniial iese prin tubul scurt. Se introduce un volum de aer de 10 ori mai
mare decat volumul flaconului.
2.1.2. Recoltarea prin aspirare
Procedeul este indicat pentru recoltarea toxicilor n concentraie mic, deoarece prin
aspirarea, n curent continuu a unui volum de aer printr-un mediu absorbant, toxicul se acumuleaz
n acesta, ceea ce permite determinarea concentraiilor mici
2.1.2.1. Dispozitivie de aspirare
a) aspiratoare hidraulice (vase comunicante, trompe de apa)
b)aspiratoare mecanice (aspiratoare de praf)
2.1.2.2. Dispozitive de msurare a volumului de aer:
a) Gazometre
b) Debitmetre
2.2.2.3.Dispozitive de reinere
a) Absorbitoarele (barbotoarele)
b) Plnia Palmer
c) Impingerele
2.2.Izolarea toxicilor volatili
Tehnicile de izolare sunt aceleasi ca la toxicii gazosi ; se folosesc : distilarea sau antrenarea
cu vapori de apa (pentru toxicii volatili cu puncte de fierbere mai mari de 100 grade celsius ex.fenol,
anilina, benzen)
2.3.Izolarea toxicilor minerali
Toxicii minerali se gasesc in diverse combinatii in materialul de analizat, de aceea se
deosebesc doua tipuri de operatii in analiza lor toxicologica :
izolarea toxicilor minerali din combinatii nedisociabile (combinatii intre toxicii
minerali si constituentii normali ai organismului) se poate realiza numai dupa distrugerea
(mineralizarea) prealabila a materiei organice;
izolarea toxicilor minerali din combinatii disociabile (in cazul sarurilor minerale de
genul nitritilor, nitratilor, cloratilor, acizii minerali tari, bazele caustice si se folosesc metode ca
extractia apoasa sau hidroalcoolica, macerarea, dializa).
Izolarea toxicilor minerali din combinatii nedisociabile
Deoarece toxicii minerali contracteaza combinatii cu constituentii normali ai organismului
(de regula proteinele ), caz in care proprietatile lor analitice sunt disimulate, pentru punerea in
liberatate a toxicului sub forma ionica, in vederea caracterizarii lui ulterioare prin metodele chimiei
analitice, se recurge la operatia de mineralizare (distrugere). Prin distrugereea partii organice a
materialului, metalele trec sub forma ionica, ceea ce justifica termenul de mineralizare. Operatia se
executa pe reziduul ramas din portiunea A de organe dupa izolarea toxiclor volatili.
Mineralizarea materiei organice poate fi realizata :
- pe cale uscata (prin calcinare, directa sau cu adaos de oxidanti, cu carbonat si azoatat de
sodiu, in curent de oxigen);
- pe cale umeda (cu clor nascand sau cu acizi oxigenati acid azotic, acid sulfuric).
A.mineralizarea cu clor nascand :
A.1.metoda Fresenius-Babo
Principiul metodei : distrugerea suportului organic de care este legat toxicul mineral se face
sub actiunea clorului, rezultat in reactia dintre clorat de potasiu si acid clorhidric, la cald (70 C).
A.2.metoda Ogier
Modificarea consta intr-un curent de acid clorhidric gazos peste materialul de analizat
amestecat cu clorat de potasiu (KClO3).Metoda are avantajul ca reduce considerabil timpul de
analiza.
A.3. Metoda Stepanov :
Principiul metodei consta de asemenea in mineralizarea cu clor nascand. Organele maruntite
se aduc intr-un balon Kjeldhal, inchis cu dop de pluta sau de cauciuc, prin care trece un tub in forma
de spirala, cu rol de refrigerent. Peste organele din balon se adauga acid clorhidric, apoi mici cantitati
de clorat de potasiu.
B.Mineralizarea prin metoda sulfonitrica
B.1.Metoda Deniges
Principiul metodei : distrugerea suportului organic de care este legat toxicul mineral se face
sub actiunea unui amestec de acid azotic si acid sulfuric concentrat. Acidul sulfuric concentrat are
actiune deshidratanta si oxidanta (prin continutul de trioxid de sulf liber). Acidul azotic concentrat
are actiune oxidanta, ca o consecinta a descompunerii progresive cu eliberare de oxigen.
B.2.Metoda Deniges modificata de Ioanid si Bors
Materia organica este dezagregata in prealabil cu acid azotic concentrat si apoi lichidul
rezultat se adauga picatura cu picatura intr-un amestec de acid sulfuric concentrat si acid azotic
concentrat, adus la fierbere.
B.3.Metoda Stepanov este tot o metoda sulfonitrica de distrugere, sub actiunea acidului
sulfuric si a azotatului de amoniu.
2.4.Izolarea toxicilor organici nevolatili (ficsi)
Sunt cercetati de obicei in mediu biologic si se izoleaza prin extractie cu solventi organici
nemiscibili cu apa. Extractia se realizeaza in mediu acid pentru toxicii cu caracter acid (acidularea
se face cu acizi minerali-acid clorhidric, sulfuric, acizi organici-acid acetic, acid tartric, acid citric
sau cu solutii tampon cu pH acid) sau in mediu bazic pentru toxicii cu caracter bazic (alcalinizarea
se face cu hidroxizi alcalini, carbonati alcalini, solutii tampon de pH bazic).
Extracia este operaia prin care unul sau mai muli componeni ai unei faze (lichide sau
solide) sunt transferai ntr-o alt faz (lichid), nemiscibil sau parial miscibil, adus n contact
cu prima.
In funcie de starea de agregare a produsului din care se face extracia, se
deosebete:
1. extracia solid lichid
2. extracia lichid lichid;
3. extracia gaz lichid.
Repartiia unei substane dizolvate n doua faze este dat de legea de distribuie a lui Nernst
ce const n raportul concentraiilor la echilibru a substanei n cele dou faze lichide (a i b)
nemiscibile ce este constant la o temperatur dat.

K = Ca/Cb

unde K este coeficientul de repartitie.

Extracia solid lichid

Extracia solid-lichid urmrete separarea unei substane organice ntr-un anumit
solvent n care componentul este solubil.
 Fig.1 : Extractoare Soxhlet.

Pe scar larg se aplic extracia continu n aparatur special (extractoare Soxhlet) n care,
de obicei, solventul proaspt este furnizat prin fierberea extractului.
Extractorul Soxhlet se compune dintr-un balon, un corp de extracie i un refrigerent
ascendent, legate ntre ele. Materialul solid, mrunit n prealabil pentru ca solventul s vin n
contact cu o suprafa ct mai mare, se aeaz n spaiul de extracie, fie introdus ntr-un cartu
special de hrtie de filtru, fie vrsat direct n spaiul de extracie prevzut cu un fund de sticl
poroas. Faza extractoare (solventul) din balonul de fierbere distil printr-un tub lateral, prevzut
eventual cu o izolaie termica, iar vaporii condensai n refrigerentul de reflux picur peste materialul
din cartu. Cnd spaiul de extracie se umple pn la nlimea stratului de preaplin, soluia cu
extract trece prin sifonare n balonul de fierbere i procesul se repet.
Principalii factori care influeneaz o extracie solid lichid sunt:
- solubilitatea solidului n solvent;
- viteza de transfer a solidului n faz lichid.
Extracia lichid lichid
Aceast operaie are la baz diferena de solubilitate a componentului extras n unul sau mai
muli solveni nemiscibili sau parial miscibili ntre ei.
 n laboratoare, extraciile se efectueaz prin agitarea soluiei
cu solventul de extracie n plnii de separare, care datorit formei
specifice ofer o suprafa de separaie mare se fac prin agitarea
soluiei cu solventul de extracie. Este recomandat ca umplerea cu
lichid a plniei de separare s nu se fac mai mult de din volumul
su. Pentru o extracie
eficient este necesar asigurarea unui contact optim ntre
cele dou faze este necesar agitarea intens a plniei timp de 3-5
minute, dup care aceasta se las n repaus pn la separarea
complet a celor dou faze. n cazul apariiei de emulsii nu mai este
recomandat agitarea, ci n acest caz este suficient efectuarea unor
micri circulare n plan orizontal.

Palnia de separare.

Din timp n timp este necesar efectuarea aerisirii, prin inversarea poziiei plniei i
deschiderea temporar a robinetului. Aceast operaie este absolut necesar mai ales n cazul
solvenilor extrem de volatili (eter etilic, eter de petrol etc.).
Dup separarea complet a celor dou faze, se scoate dopul de la partea superioar a plniei
i faza inferioar este separat cu grij ntr-un flacon Erlenmeyer.
Faza apoas poate fi uor deosebit de faza organic nemiscibil pe baza densitilor celor
dou faze (faza cu densitatea cea mai mare va constitui faza inferioar). Atunci cnd limita de
separaie dintre cele dou faze se apropie de robinet, se reduce mult viteza de separaie.
La final, pentru a se evita o eventual impurificare, faza superioar se toarn prin gura
plniei ntr-un alt flacon, faza organic se usuc utiliznd un agent de deshidratare convenabil
(Na2SO4 anh., CaCl2 anh., MgSO4 anh. etc.), iar ulterior se ndeprteaz solventul prin distilare.
Metode de izolare a toxicilor organici nevolatili
1.Metoda Stas-Otto-Ogier
Etape : digestia metrialului biologic cu alcool in mediu acid (pH 4-5 creat cu acid tartric)
filtrare si indepartarea alcoolului prin distilare in vid, la 50 C ;
purificarea reziduului apos prin extractie cu eter de petrol ; eterul de petrol extrage
grasimi, unele substante volatile (ex. fenol, camfor), unele insecticide (ex. organoclorurate) sau
unele medicamente (ex. glutetimida) ;
extractia lichidului cu eter etlic : in extractul organic sunt separate substante cu caracter
acid sau neutru (ex. acid salicilic, acid oxalic, acid picric, derivati barbiturici, glicozizi cardiotonici,
meprobamat, colchicina)
alcalinizarea fazei apoase la pH 8-9 urmata de extractia cu eter etilic sau cloroform, cand
se separa substante cu caracter bazic (alcaloizi si alte substante organice de sinteza cu caracter bazic).

2. Metoda Dragendorff se bazeaza pe solubilizarea substantelor toxice in apa acidulata cu

acid sulfuric si precipitarea proteinelor cu alcool, urmata de extractia selectiva cu solventi organici
la pH optim (se epuizeaza intai lichidul R acid apoi lichidul R alcalin).

3. Metoda Florance acidularea se face cu acid tricloracetic, la cald conditii in care se

asegura si deproteinizarea. Filtratul acid si apon alcalin se epuizeaza cu solventi organici, ca in
metoda clasica.
 4. Metoda Fabre (proteolizei) organele sunt intai supuse deproteinizarii enzimatice cu
tripsina. Filtratul acid si apoi cel alcalin se epuizeaza cu solventi organici ca in metoda clasica.

5. Metoda Griffon presupune extractia cu aparatul Soxhlet. Materialul de analizat se

amesteca cu sulfat de sodiu anhidru, se adauga acid tartric sau oxid de magneziu (in functie de
caracterul acido-bazic al toxicului urmarit a fi extras), iar pulberea obtinuta se aduce in cartas de
hartie de filtru si se supune extractiei cu solventi in aparatul Soxhlet.

Pentru usurarea procesului de extractie a unui toxic in material biologic exista acum sisteme
de unica folosinta care simplifica procesal de extractie : cartusele de extractie tip lichid lichid sau
solid lichid.
Cartusele pentru extractie lichid-lichid sunt tuburi mici de polipropilena umplute cu
diatomita calcinata, de inalta puritate ce contin un filtru de separare a fazelor, pentru a evita
contaminarea solventilor organici cu faza apoasa. Extractia se face gravitational (nu sunt necesare
sisteme de vid) si are urmatorii pasi :
se pipeteaza solutia apoasa care contine analitul in cartusul de filtrare
se asteapta 3-5 minute
se adauga solventul organic si se colecteaza analitul purificat.
Exista o mare varietate de umpluturi pentru cartusele de extractie lichid-lichid, adaptate
necesitatilor analitice, dintre care trebuie mentionate cartusele pre-tamponate, care simplifica
procesal de extractie si un necesita ajustarea pH-ului probei inainte de separare.
Cartusele de extractie solid-lichid sunt prevazute cu umplutura pe baza de silice, carbune
activ si rasini. Analitii sunt retinuti la nivelul sorbentului printr-o combinatie de mecanisme
permitand obtinerea unor probe concentrate, care pot fi analizate ulterior in mod optim prin metode
CSS, HPLC sau GC.
O varianta a extractiei in faza solida o constituie micro-extractia in faza solida, care se
realizeaza cu ajutorul unui sistem care are drept componenta principala o fibra de silice topita,
acoperita cu un strat polimeric, strat care contine si un material adsorbant solid (de exemplu, un
polimer de divinilbenzen sau carbune poros); fibra este fixata pe un piston si protejata prin
intermediul unui ac adaptabil la injectorul HPLC sau GC.
3. IDENTIFICAREA SI DETERMINAREA CANTITATIVA
In general, pentru dozare se utilizeaza metode :
- spectrofotometrice (in UV si vizibil)
- cromatografice (HPLC, GC).
Metode cromatografice - privire de ansamblu
Analiza chimic cromatografic este un domeniu mai recent al analizei instrumentale care
include mai multe metode de separare i totodat de analiz a componenilor amestecului din prob.
n toate variantele, separarea precede analiza i se realizeaz prin repetarea, de un numr mare de
ori, a echilibrului de distribuie ntre dou faze. Una dintre faze este imobil i poart denumirea de
faz staionar (aflat de regul ntr-un tub numit coloan) iar cealalt faza mobil - aflat n micare,
se deplaseaz prin golurile primei faze. Separarea se petrece n coloana cromatografic. Faza mobil,
denumit i eluent - scurgndu-se continuu (deci cu vitez constant) prin interstiiile fazei
staionare, adeseori poroase, poate provoca migrarea, cu viteze diferite, a celor n componeni ai
amestecului de separat de-a lungul coloanei. Amestecul supus separrii se introduce sub form de
soluie la nceputul coloanei, folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o
microsering), i se afl iniial fixat ntr-o zon ngust de la nceputul coloanei. Splai de eluent, o
parte din componenii probei migreaz apoi prin coloan cu viteze diferite. Acest lucru se datoreaz
interaciunilor fizice specifice, dintre moleculele probei i faza staionar (desigur, nu orice molecul
poate migra pe orice faz staionar). Efectul, este numit retenie i aceasta provoac o aa-numit
migrare difereniat. Aceasta face posibil sesizarea componenilor, pe rnd, la prsirea coloanei,
de ctre un instrument, analizor fizico-chimic, sensibil la mai muli (n mod ideal la oricare) dintre
componeni ce ies din coloan i care este plasat n eluent, imediat dup ieirea din coloan. Acest
analizor, denumit detector este capabil s dea un semnal proporional cu masa sau cu concentraia
soluiei de component n faza mobil. Reprezentarea grafic a semnalului detectorului n funcie de
timp poart numele de cromatogram.
Clasificarea tehnicilor cromatografice
Functie de natura fazei mobile i a celei staionare
cromatografia de lichide (LC) cnd faza mobil este un lichid
cromatografia de gaze (GC) cnd aceasta este un gaz
cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobil este un lichid aflat peste
temperatura critic.
n cadrul cromatografiei de lichide se mai face distincie ntre cromatografia pe coloan
deschis i cea pe coloan nchis Pe de alt parte, n cadrul fiecreia dintre acestea, distingem mai
multe variante.
n cadrul LC se disting, n funcie de mecanismele de separare:
Cromatografia de adsorbie, una dintre primele tehnici utilizate, veche de mai bine un
secol, utilizat pentru separarea substanelor organice cu molecule de dimensiuni mici i medii pe
adsorbeni, ca silicagel i alumin, folosindu-se, ca faze mobile, diferite amestecuri de solveni
organici.
Cromatografia ionic (de schimb ionic), care se petrece pe o faz staionar solid,
poroas, format din materiale specifice - schimbtorii de ioni - substane cu o reea solid afnat,
de natur organic sau anorganic, pe care se gsesc grefate, prin procesul de obinere, nite centre
de schimb ionic. Cele mai rspndite sunt rinile schimbtoare de ioni - organice - la care scheletul-
suport este unul organic - un polimer poros. Pe aceste centre are loc o reacie ionic sau o interaciune
ntre substana din soluie (electrolit sau neelectrolit) i funciunea legat chimic de suportul solid,
numit reacie de schimb ionic.
Cromatografia de excluziune steric se desfoar pe faze staionare poroase dar cu
porozitatea selecionat astfel nct s corespund dimensiunilor moleculelor supuse separrii. O
parte dintre molecule intr prin pori, reuind s interacioneze cu suportul solid, prin fore de
adsorbie foarte slabe, iar altele sunt excluse deplasndu-se practic nereinute odat cu faza mobil.
Se obine astfel un soi de sit la scar molecular separarea moleculelor fcndu-se n funcie de
dimensiune. Tehnica se mai ntlnete i sub denumirea de filtrare prin geluri sau permeaie prin
geluri n funcie de natura apoas sau organic a fazei mobile.
Cromatografia lichid-lichid (LLC), n care faza staionar este o faz lichid, nemiscibil
cu cea mobil i imobilizat pe un suport solid, ntr-o coloan. Aici suportul solid este, cel puin
principial, inert fa de componentele din prob. ntruct simpla impregnare a unui suport poros cu
un lichid permitea splarea acestuia n timp, s-a recurs la legarea pe cale chimic a acestora de
suport, obinndu-se nite faze cu totul specifice - faze staionare legate chimic. Molecule organice
de dimensiuni mici sunt, prin sintez, legate de suportul poros, fenomenul de pierdere prin splare
de ctre faza mobil, fiind practic anulat. Acest tehnic este cea mai rspndit devenind aproape
sinonim cu cromatografia de lichide.
Cromatografia pe coloan deschis sau cromatografia planar (PC), se refer la un grup
de tehnici nrudite cu cele din LC, care au toate n comun faptul c faza mobil circul printr-un
material poros dispus ntr-un plan i formnd un strat relativ subire, dar de compoziie asemntoare
cu cele menionate la cromatografia pe coloan. Se disting:
Cromatogafia pe hrtie, tehnic n care faza staionar este o hrtie poroas din celuloz
(iniial o hrtie de filtru) care este irigat de solvent prin fore capilare.
Cromatografia pe strat subire (TLC), n care faza staionar pulverulent este fixat de
suportul plan (sticl, aluminiu, material plastic) cu un liant, formnd un strat subire (0.1-0.5mm) de
asemenea irigat prin capilaritate.
Cromatografia pe strat subire de nalt performan (HPTLC), n care faza staionar are
granulaie extrem de fin ridicndu-se astfel eficiena separrilor dar i viteza acestora.
Toate acestea se caracterizeaz prin simplitate, accesibilitate i pre de cost cobort, dar
totodat prin performane ceva mai slabe dect cromatografia de lichide pe coloan sub presiune
ridicat (HPLC) varianta modern a LC.
n mod analog, n cazul cromatografiei de gaze, denumit prescurtat GC se disting
urmtoarele tehnici:
Cromatografia gaz-lichid n care faza staionar este un lichid nevolatil imobilizat pe un
suport solid. Aici suportul poate fi unul granular, poros, situat ntr-o coloan n aa-numita
cromatografie de gaze convenional sau chiar pe pereii coloanei, confecionat de dimensiuni
capilare, n cromatografia pe coloan capilar.
Cromatografia gaz-solid este analog cu cele discutate la cromatografia de adsorbie i la
cea de excluziune steric cu deosebirea c schimbarea gazului nu modific selectivitatea.
Faza staionar o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv sitele moleculare (nite
silicai naturali sau sintetici) respectiv granulele de carbon poros. Metoda este extrem de important
pentru separarea gazelor permanente (CO, CO2, O2, N2, gaze nobile etc.)
FR.X. defineste cromatografia ca fiind o metoda fizico-chimica de separare a unor
substante dintr-un amestec, intr-un sistem constituit dintr-o faza stationara si o faza mobila care se
deplaseaza intr-o directie data. Metoda se bazeaza pe migrarea dinamica diferentiata a substantelor
din amestecul respectiv ca urmare a unor diferente in adsorbtie, repartitie, solubilitate, presiune de
vapori, marimea moleculei etc.
Metodele cromatografice oficializate :
-cromatografia pe hartie
- cromatografia pe strat subtire
- gaz-cromatografia
- cromatografia de lichide sub presiune.
CROMATOGRAFIA PE HARTIE :
Cromatografia pe hartie este o metoda fizico-chimica de separare si identificare a unor
amestecuri de substante bazata pe repartitia lor diferita intre faza stationara constituita din hartia si
lichidul impregnat pe ea si faza mobila formata dintr-un solvent sau un amestec de solventi organici
si anorganici. Pentru o mai buna separare hartia se poate impregna cu solutii tampon, acizi, baze,
saruri, agenti de complexare, agenti de precipitare, shimbatori de ioni lichizi sau solizi.
Aplicatii :
-separarea si identificarea substantelor medicamentoase
-identificarea si separarea principiilor active din forme farmaceutice
Exemplu : solutia ce contine codeina, benzoat de sodiu, tinctura de aconit si tinctura
belladonna se preteaza separarii si identificarii cromatografice in cadrul sistemului H1 (hartie
Whatman 1 sistem se solventi specifici). Codeina se identifica prin Rf specific (UV), iar atropina si
aconitina prin vizualizare cu reactiv Dragendorff (amestec de subnitrat de bismut, acid clorhidric
concentrat, iodura de potasiu).
F.R.X prevede urmatoarele :
Aparatura : vase cromatografice din sticla, cu posibilitatea de inchidere etansa, cu
dimensiuni si forme diferite, corespunzatoare benzilor de hartie prevazute cu un dispozitiv de fixare
a hartiilor cromatografice si cu o cuva, care in cazul tehnicii ascendente se aseaza la baza vasilui
cromatografic, iar in cazul tehnicii descendente se fixeaza la partea superioara a vasului.
benzi de hartie cromatografica prevazute la fiecare monografie in parte
micropipete, microseringi sau alte dispozitive.
 Tehnica de lucru : linia pe care se aplica solutiile (linia de start) trebuie sa fie situata la o
distanta de 5-6 cm de marginea benzii de hartie pentru tehnica de developare ascendenta si de 10-
12 cm, pentru tehnica de developare descendenta. Distanta dintre doua puncte de aplicare a solutiilor
trebuie sa fie de 3-4 cm ; distanta dintre punctele marginale si latura hartiei trebuie sa fie de cel putin
2.5 cm. Solutiile se aplica pe hartia cromatografica, daca nu se prevede altfel, in pete circulare cu
diametrul de cel mult 6 mm.
Tehnica cromatografica (ascendenta, descendenta), pregatirea benzilor de hartie
cromatografica, developantul, modul de preparare a solutiilor de aplicat (probe, etalon), volumele
aplicate pe hartia cromatografica si distanta parcursa de developant sunt prevazute in monografia
respectiva.
CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBTIRE
Este o metoda de separare in care mediul adsorbant este dispus intr-un strat subtire (0.1-0.5
mm) care poate fi format dintr-o pelicula de lichid depusa pe un suport poros, suprafata unui
adsorbant sau o sita moleculara. Adsorbanti utilizati : alimina, silicagel, kieselgur, pulberea de
celuloza, silicatul de magneziu etc.
F.R.X prevede :
Apratura : placi cromatografice din sticla sau din alte materiale, de dimensiuni diferite,
cu lungimea de obicei, de 20 cm si latime variabila, pe care se aplica un strat subtire de adsorbant
de puritate cromatografica (silicagel, kieselgur, celuloza microcristalina, oxid de aluminiu etc) la
care se pot adauga lianti (sulfat de calciu, amidon, carboximetilceluloza) sau agenti fluorescenti.
vase cromatografice din sticla
pipete, micropipete sau alte dispozitive.
Tehnica de lucru : linia de start trebuie situata la o distanta de 2 cm de marginea placii.
Distanta dintre doua puncte de aplicare a solutiilor trebuie sa fie de cel putin 1.5 cm, distanta dintre
punctele marginale si laturile placii trebuie sa fie de cel putin 2 cm.
Solutiile se aplica pe placa cromatografica in pete circulare, cu diametrul de 2-6 mm sau in
benzi, conform prevederilor din monografia respectiva. Daca este cazul, solutia se aplica in fractiuni,
asteptand de fiecare data evaporarea solventului, eventual cu ajutorul unui curent moderat de aer.
Dupa evaporarea solventului, placa cromatografica se introduce in vasul cromatografic cu
developant, pe cat posibil in pozitie verticala. Petele de pe linia de start nu trebuie sa atinga suprafata
stratului de developant. Dupa ce developantul a parcurs distanta prevazuta, de obicei 10-15 cm,
placa cromatografica se scoate din vasul cromatografic, se usuca si se pun in evidenta petele,
conform prevederilor din monografia respectiva.
De obicei, punerea in evidenta a petelor de pe cromatograma se efectueaza prin examinarea
acestora ca atare sau dupa tratare cu reactivi potriviti, in lumina vizibila sau ultraviolet.
Pentru identificarea substantelor se compara pe aceeasi cromatograma valoarea Rf si cularea
sau fluorescenta petei obtinute cu solutia proba cu valoarea Rf si culoarea sau fluorescenta petei
obtinute cu solutia etalon : cele doua pete trebuie sa fie asemanatoare.
Valoarea Rf a unei substante este :

Rf = a/b

in care : a = distanta parcursa de substanta de la punctul de aplicare al solutiri pana la centrul

petei (in centimetri);
b = distanta parcursa de developant de la punctul de aplicare al solutiri pana la frontul
developantului, trecand prin centrul petei (in centimetri).
Identificarea unei substante se realizeaza in anumite cazuri, fata de o substanta de referinta
cu ajutorul Rr.
Valoarea Rr a unei substante este :
 Rr = a/c

in care : a = distanta parcursa de substanta de la punctul de aplicare a solutiei pana la centrul

petei (in centimetri).
b = distanta parcursa de substanta de referinta de la punctul de aplicare al solutiei pana la
centrul petei (in centimetri).
Dozarea substantelor separate pe cromatograma se efectueaza, dupa razuirea petelor
respective si eluarea substantelor de pe adsorbant cu un solvent potrivit, prin spectofotometrie sau
direct pe placa, de obicei prin densitometrie.
GAZ-CROMATOGRAFIA
F.R.X prevede :
Cromatografia de gaze este o metoda fizico-chimica de separare cromatografica in care
faza mobila este un gaz (gaz-purtator), iar faza stationara este un solid sau un lichid cu care este
impregnat un suport solid inert sau un lichid repartizat uniform pe peretii unei coloane capilare. Faza
stationara se afla intr- coloana cromatografica, confectionata, de obicei din sticla sau din otel
inoxidabil. Faza mobila se deplaseaza continuu prin coloana, iar la iesire, gazul-purtator trece prin
detector.
Cromatograful de gaze este compus din urmatoarele parti principale : sursa de gaz, camera
de evaporare, coloana cromatografica, termostatul, detectorul si sistemul de inregistrare.
Gazul purtator se deplaseaza cu o viteza constanta prin camera de evaporare, preia proba de
analizat si o introduce in coloana cromatografica, unde se realizeaza separarea componentelor. La
iesirea din coloana cromatografica, gazul purtator trece impreuna cu componentele separate prin
detector, care emite un semnal electric proportional cu concentratia componentei din faza gazoasa.
Detectorul este conectat la sistemul de inregistrare. Rezultatele se prezinta sub forma unui grafic
semnal-timp. Deoarece probele de analizat dizolvate intr-un solvent trebuie sa fie aduse in stare de
vapori, camera de evaporare este incalzita la o temperatura suficient de ridicata pentru a asigura o
evaporare rapida, fara a produce o degradare termica a probelor.
In timpul determinarii, temepratura coloanei cromatografice trebuie sa ramana constanta
sau, daca este necesar, trebuie sa creasca dupa un anumit program.
Detectorii sunt instrumentele analitice propriu zise din gaz cromatografe, avnd rolul de a
sesiza n mod continuu, rapid i cu o mare sensibilitate, componentele din proba supus analizei. n
corpul detectorului zonele cromatografice care ies separate din coloan, coninnd de preferin
moleculele unei singure substane, se transform n semnale electrice (picuri).
Pentru a se putea compara, ca performane, fiecare detector este caracterizat de nite mrimi
fizice: specificitate, sensibilitate, zgomot de fond, drift, limit de detecie, constant de timp,
reactivitate, efect asupra probei i altele, comune multor metode analitice. n orice gaz cromatograf
trebuie s existe cel puin un detector universal care s permit nregistrarea sigur a tuturor
componenilor. n afar de acesta mai pot exista i ali detectori specifici, care mresc sigurana
analizei componenilor de interes practic, deoarece rspund doar la anumite tipuri de molecule.
Gaz cromatografia este potrivita pentru separarea si identificarea unor compusi bazici -
alcalozi (cafeina, nicotina, papaverina, atropina, morfina, teofilina), fenotiazine, benzodiazepine
(diazepam, nitrazepam, clordiazepoxid), compusi acizi barbiturice, compusi neutri steroizi.
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA (HPLC)
Cromatografia de lichide de nalt performan acoper azi, n proporie aproximativ 80%,
analiza substanelor moleculare: organice, organo-metalice i anorganice inclusiv compuii foarte
polari sau labili termic precum i compuii cu mas molecular ridicat (naturali sau sintetici). De
aceea, mpreun cu cromatografia de gaze constituie un punct de sprijin important n analizele
chimice moderne.
 Rezervoarele coninnd unul sau mai muli solveni pompa (sau pompele), alimenteaz
coloana cu eluent (de regul un amestec de doi sau mai muli solveni). n imediata vecintate
a coloanei se introduce proba, automat. n coloana aflat ntr-o etuv termostat, are loc
separarea propriu-zis. Efluentul coloanei intr ntr-un detector de unde componentul, dac este
separat complet, poate fi colectat i izolat, cu ajutorul unui colector de fraciuni. Semnalul este
nregistrat fie cu un nregistrator, fie direct n memoria unui calculator.
F.R.X prevede :
Cromatografia de lichide sub presiune este o metoda fizico-chimica de separare
cromatografica in care faza mobila este un lichid, iar faza stationara, continuta intr-o coloana, este
constituita dintr-un solid cu granulatie fina sau un solid impregnat cu un lichid sau un solid pe care
sunt grefate grupari organice.
Cromatograful de lichide sub presiune se compune din urmatoarele parti principale :
sistemul de pompare, sistemul de injectie, coloana cromatografica, detectorul si sistemul de
inregistrare.
Faza mobila, furnizata de unul sau mai multe rezervoare, circula prin coloana
cromatografica cu un debit constant, sub efectul unei presiuni si apoi trece prin detector.
Temperatura coloanei cromatografice se mentine constanta in timpul determinarii si in
majoritatea cazurilor este temperatura camerei.
Sistemul de detectare folosit trebuie sa permita determinarea contitatilor de componente
prezente in eluent si se bazeaza pe spectofotometrie de absorbtie, refractometrie diferentiala,
fluometrie, combustie sau metode electro-chimice.
SPECTROFOTOMETRIA
F.R.X prevede : proprietatea substantelor de a absorbi selectiv radiatiile electromagnetice
sta la baza spectrofotometriei de absorbtie si este folosita pentru identificare, determinarea puritatii
si dozare.
Spectrele de absorbtie se obtin la trecerea unui fascicul de radiatii continue prin substanta
de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia.
Functie de domeniile spectrale in care are loc absorbtia luminii se deosebesc :
-spectrofotometria in ultraviolet (185-400 nm)
-spectrofotometria in vizibil (400-800 nm)
-spectrofotometria in infrarosu (peste 800 nm)
Spectrele de absorbtie in domeniul ultraviolet si vizibil, numite si spectre electronice, se
datoresc tranzitiilor dintre nivelele energetice ale starii electronice ale moleculelor.
Spectrele de absorbtie in infrarosu se datoresc tranzitiilor de rotatie, de vibratie si de rotatie-
vibratie ale moleculelor.
Spectrele de absorbtie in ultraviolet si vizibil se obtin grafic prin reprezentarea absorbantei
sau a transmitantei in functie de lungimea de unda.
Absorbanta (A) (densitatea optica, extinctia) unei solutii este logaritmul zecimal al
inversului transmitantei (T) (transimisiei) respectiv logaritmul zecimal al raportului dintre
intensitatea luminii incidente (Io) si intensitatea luminii transmise (I) si este proportionala cu
concentratia in substanta de analizat a solutiei (c) si cu grosimea stratului de absorbtie (l):

A=log 1/T = log Io/I = cl

Transmitanta (T) (transmisia) este raportul dintre intensitatea luminii transmise (I) si
intensitatea luminii incidente (Io) :

T = I/Io

Dozarile spectrofotometrice un domeniul ultraviolet si vizibil se bazeaza pe masurarea

luminii absorbite atunci cand este respectata legea Bouguer Lambert Beer, care stabileste relatia
dintre lumina absorbita, structura si concentratia in substanta de analizat a solutiei si grosimea
stratului absorbant, pentru o anumita lungime de unda exprimata in nanometri.

-cl
I = I0 10
I = intensitatea luminii transmise;
Io = intensitatea luminii incidente ;
= constanta caracteristica fiecarei substante;
c = concentratia in substanta de analizat a solutiei (%m/V)
l = grosimea stratului absorbant (in centimetri)
Spectrofotometrul de absorbtie in ultraviolet si vizibil se compune din urmatoarele parti
principale : sursa de radiatii, monocromatorul, suportul pentru cuve, detectorul, amplificatorul si
inregistratorul.
Sursa de radiatii este constituita de obicei dintr-un bec cu filament de wolfram, pentru
domeniul vizibil si dintr-o lampa de hidrogen sau deuteriu pentru domeniul ultraviolet.
Monocromatorul si cuvele sunt confectionate din sticla, pentru domeniul vizibil si din cuart
pentru domeniul ultraviolet.
Pentru detreminarile spectrofotometrice se folosesc odua cuve identice : o cuva in care se
introduce solutia substantei de analizat (solutia-proba) si o cuva in care se introduce lichidul de
compensare constituit din solventul sau amestecul de solventi si reactivi folositi la prepararea
solutiei proba.
Cauzele producerii spectrelor : energia luminoasa se absoarbe pe seama promovarii
electronilor implicati in tranzitii dintr-un orbital de legatura sau ocupati cu electroni in starea
fundamentala intr-un orbital de antilegatura * sau * neocupat in starea fundamentala, capabil de
a fi ocupat in starea excitata.
In spectroscopia UV si VIS sunt caracteristice urmatoarele patru tipuri de tranzitii :
-tranzitii -*
-tranzitii -*
-tranzitii n-*
-tranzitii n-*.
Aplicatii ale spectrofotometriei : spectrele UV-VIS ofera informatii in legatura cu structura
globala a electronilor substantei analizate. Se obtin date suplimentare in legatura cu natura
cromoforilor existenti, pozitia lor fata de alte elemente structurale, stereochimia moleculei, existenta
legaturilor de hidrogen etc.
Astfel : hidrocarburile saturate au legaturi covalente, legaturi puternice. Sunt substante
transparente (nu absorb) si de aceea au o larga utilizare ca solventi in spectroscopia UV-VIS.
substante care contin heteroatomi : O, S, N in acesti compusi au loc tranzactilor -*.
substante nesaturate : toate substantele cu duble si triple legaturi ; tranzitiile electronice
sunt -*.
substante cu caracter acid si derivati functionali
 poliene conjugate
compusi aromatici.