Tehnica ELISA

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbet Assay) reprezint la ora actual, una din cele mai
des folosite metode, de indentificare i apreciere cantitativ pentru anticorpi, antigene, hormoni,
citokine i o palet larg de alte molecule, inclusiv peptide sintetice.
Tehnica ELISA a fost inventat de un grup de cercettori de la Universitatea din Stokholm
condus de Peter Perlmann i Eva Engval, acetia publicnd primul articol despre ELISA n 1971.
Articolul descria aprecierea cantitativ a IgG n serul de iepure folosind fosfataz alcalin ca
enzim de indentificare. Avantaje de siguran crescut i cele economice, fa de testarea
radioimun(RIA) au fcut din tehnica imunoenzimatica ELISA una indispensabil pentru domeniul
medicinei clinice, biologiei si al biotehnologiei.

1. PRINCIPIUL METODEI

Principiul metodei, indiferent de tipul de ELISA ales, este n esent acelai i se bazeaz
pe reacia antigen-anticorp. Antigenul sau anticorpul de captur este fixat pe un suport solid dup
care este pus n contact cu o imunoglobulin, un antigen sau respectiv orice molecul pentru
care are specificitate. O enzim cuplat fie direct de imunoglobulin sau de un alt anticorp anti-
imunoglobulin degradeaz un substrat cromogen incolor producnd un compus colorat ce poate
fi detectat spectrofotometric la o lungime de und corespunzatoare.

2. PUNCTE CRITICE N PROTOCOLUL ELISA

n implementarea oricrei tehnici ELISA ntelegerea proceselor de baz i aplicarea

corect a acestora reprezint un factor esenial n atingerea obiectivului propus.
Etapele fundamentale ale tehnicii sunt reprezentate de:
Prepararea conjugatului
Conjugatul este reprezentat de un antigen sau un anticorp cu specificitate pentru molecula de
determinat, cuplat cu o enzim. Cuplarea enzimei se realizeaz prin cross-linkare sub aciunea
unor agenti favorizani cum ar fi glutaraldehida, di-iso-cianat toluen, p-benzochinona, etc.
Dei un grup mai mare de enzime au fost utilizate de-a lungul timpului, fosfataz alcalin i
peroxidaz din hrean(HRP-horseradish peroxidase) rmn cele mai populare datorit
randamenului oferit prin prelucrarea rapid a substratului i a gamei vaste de tehnici de
developare existente.
Alte enzime folosite n tehnica ELISA sunt -galactozidaza, glucozoxidaza, pirofosfataza, etc.
n cazul n care conjugatul folosit este reprezentat de un grup enzim-anticorp, anticorpul
respectiv trebuie s fie ales n aa fel nct s recunoasc alt determinant antigenic al moleculei
de determinat cum ar fi fragmentul Fc al imunoglobulinei sau alt epitop al antigenului.
Exist o multitudine de protocoale pentru prepararea conjugatului disponibile n literatur dar
realizarea acestora presupune experien n domeniu i timp consumat n plus. Mai convenabil
este achiziionarea conjugatului de la firme specializate n domeniu.
Fixarea anticorpului sau antigenului de captur pe plac
Pentru pregatirea unei determinri ELISA, pregatirea plcii de reacie este foarte important.

1
Cu toate c diferite tipuri de plci gata pregtite pot fi achiziionate de la productori, acestea pot
fi adesea scumpe aa c prepararea plcilor n laborator reprezint nc un punct cheie n
tehnica ELISA.
n general se folosesc plci de microtitrare cu 96 de godeuri fabricate din material plastic.
Majoritatea proteinelor pot fi adsorbite pe suprafee din plastic datorit interaciunilor hidrofobice
ntre structurile proteice nepolare i structurile nepolare ale matricei polimerului.
Exist mai multe protocoale de fixare, dar cele mai des folosite, implic incubarea unei diluii a
anticorpului sau antigenului de captur n godeul plcii de microtitrare ntr-un tampon carbonat la
pH 9-10.
o
Incubarea poate fi de cteva ore sau peste noapte i se face la 37 C sau la temperatura camerei.
o
Placa de microtitrare astfel pregtit poate fi pastrat la 4 C pn la 6 luni.
Deoarece fixarea anticorpilor de plac nu este una specific este necesar blocarea situsurilor de
legare nespecific pentru a preveni fixarea celorlali reactani de plac n locul interaciunii
acestora cu anticorpul fixat. Blocarea se realizeaz de obicei prin incubarea cu un tampon de
blocare, format de obicei dintr-o protein inert i un detergent neionic.
Incubarea antigenului sau anticorpului de determinat n plac
Adaugarea diluiei de antigen sau anticorp n placa de reacie reprezint prima etap efectiv a
tehnicii ELISA i nu un pas pregtitor.
n aceast etap molecula de determinat se ataeaz prin legturi de hidrogen, ionice,
interaciuni hidrofobice i fore de interaciune van der Waals, de anticorpul/antigenul
completentar, de captur.
Incubarea se realizeaz de obicei la temperatura camerei timp de 2 ore.
Cu toate c numrul de legari specifice n timp de 2 ore este de obicei suficient pentru a obine
un semnal puternic n reacia cromogen, saturarea situsurilor de legare(starea de echilibru) este
atins n aproximatix 5-10 ore, aa c o incubare mai lung poate duce la rezultate mai bune.
Indeprtarea reactanilor liberi din plac (Splarea)
Un pas foarte important n tehnica ELISA l reprezint etapele de splare. Moleculele nefixate fie
n timpul aderrii la plac fie n timpul legrilor specifice cu anticorpii de captur trebuiesc
eliminate din godeuri pentru a nu inhiba legarea reactanilor ce urmeaz a fi adugai ceea ce ar
conduce la un rezultat eronat.
O etap de splare presupune ncrcarea godeurilor cu o anumit cantitate de tampon de
splare i ndeprtarea tamponului de splare dup o perioad scurt de timp.
Tamponul de splare este reprezentat n general de o soluie de tampon fosfat salin(TFS) la care
se poate adaug 0,05% azid de sodiu(NaN3).
Pentru a asigura o splare bun a plcii i implicit o ndeprtare eficient a reactanilor liberi din
plac sunt necesare mai multe splri ntre etapele determinrii.
La sfritul fiecrei etape de splare, indiferent de numrul de splri din respectiva etap, este
bine s se elimine orice urm de tampon de splare din godeuri. Pentru aceasta, placa este
ntoars i scuturat energic pe un prosop de hartie.
Foarte importante rmn splrile dup fixarea antigenului pe plac, dup prima incubare i dup
incubarea cu soluia de conjugat.
Numrul de splri ntr-o etap poate fi cuprins ntre 2 i 5 dar att timp ct splrile nu sunt
fcute ntr-o manier brutal un numr mai mare de splri nu poate dect s creasc calitatea
tehnicii.

2
Splarea se poate face manual folosind o pipet multichannell sau cu un spltor automat
ELISA.
La folosirea spalatorului automat trebuie acordat atenie deosebit folosirii unor plci
recunoscute de aparat i ajustarea setrilor aparatului la tipul de godeuri cu fundul plat, conic,
rotund.
Incubarea conjugatului n plac
n funcie de tipul de ELISA aplicat, adugarea conjugatului n reacie presupune legarea
acestuia de anticorpul de determinat sau de antigenul specific.
Ca i n etapa de incubare a anticorpilor sau antigenelor de determinat prelungirea timpului de
reacie poate oferii un semnal mai puternic.
o
Dup incubare, plcile sunt splate i pot fi pstrate la 4 C cteva luni pn la adugarea
substratului cromogen.
Adugarea substratului cromogen
Adugarea substratului cromogen reprezint o etap critic n tehnica ELISA deoarece este
etapa n care rezultatul pozitiv sau negativ poate fi apreciat. Este de asemenea prima etap n
care putem semnala dac vreo etap n protocol a fost executat greit sau unul dintre reactivi nu
funcioneaz.
Substratul cromogen este adugat n godeuri i placa este incubat la ntuneric o anumit
perioad de timp, n funcie de caracteristicile enzimei i ale substratului, i reactia este oprit
prin adugarea unei soluii de stopare.
Timpul de incubare al substratului cromogen n proba cu conjugatul fixat se determin empiric
prin observarea modificrii culorii amestecului de reacie pn la o intensitate comparabil cu cea
teoretic a produsului final.
Conjugatul poate fi reprezentat de o enzim cuplat cu straptavidin, o protein tetrameric
obinut din bacteria Streptomyces avidinii, ce are o afinitate foarte mare pentru biotin(vitamina
H). Biotina poate fi cuplat prin diverse procedee la un aticorp i astfel, pe baza afinitii
streptavidinei pentru biotin, conjugatul se poate cupla la anticorpul biotinilat fr a fi nevoie de
un conjugat enzim-anticorp specific. Aceast procedur este deosebit de important n cazul
tehnicilor ELISA sandvi n care se dispune de o cantitate mic de anticorpi monoclonali,
folosirea complexului stravidin-biotin amplificnd sensibilitatea analizei de 2-5 ori.
Dei aceast incursiune presupune adugarea de pai la protocolul iniial, efortul este unul
recompensat printr-o imbuntire considerabil a sensibilitii analizei.

Interpretarea rezultatelor
Const n aprecierea culorii probei. Intensitatea culorii se apreciaz mai nti vizual, pentru
determinarea virrii de culoare dup adugarea substratului i stabilirea timpului de meninere a
lui pn la stoparea reaciei.
Densitatea optic a fiecrei probei se apreciaz la stectrofotometru, la o lungime de und
corespunzatoare.
Aprecierea rezultatelor se face prin dou metode :
1. Metoda calitativa de apreciere a pozitivitii probelor, prin calcularea valorilor prag (cut off)
fa de care se raporteaz absorbana fiecrei probe. Aceast valoare este determinat
corform formulei:
CO=X+ 2 DS

3
 unde CO este valoarea prag (cutt off), X media valorilor negative, DS este deviaia
standard. Probele cu valoarea absorbanei sub limita prag sunt considerate negative iar cele
peste aceast valoare sunt considerate pozitive.
2. Metoda cantitativa presupune folosirea unor probe standard, de concentraii cunoscute,
cu ajutorul crora se traseaz o curba standard. Aceasta se realizeaz prin introducerea
concentrailor probelor standard pe axa X a unui grafic, a valorilor densitilor optice
respective pe axa Y i stabilirea punctelor de intersecie. Curba standard se definete ca
cea mai apropriat ecuaie liniar care s intersecteze ct mai multe din punctele de pe
grafic.
Folosindu-ne de valorile cunoscute putem extrapola o funcie, a relaiei dintre densitatea
optic i concentraia probei, prin regresie liniar. Ecuaia obtinut fiind de forma:
DO=C*k + DO0
unde DO este densitatea optic a probei, C concentraia probei, k constanta, DO0
valoarea absorbanei la o concentraie a probei egal cu 0.
Valoarea lui DO0 poate fi calculat n orice program de calcul computerizat printr-o funcie
ce returneaz valoarea unei curbe n punctul de intersecie cu axa Y. n Microsoft Excel
putem folosi funcia INTERCEPT avnd ca parametri pe de-o parte valorile concentraiilor
probelor standard i pe de alt parte valorile densitilor optice respective.
Dup calcularea lui DO0 putem afla valoare lui k i de aici prin rezolvarea ecuaiei obinem
formula de calcul a concetraiei probelor n funcie de valoarea densitii optice :
C = (DO - DO0)/k

3. CLASIFICAREA TEHNICILOR ELISA

Datorit multiplelor aplicaii ale metodei imunoenzimatice ELISA, au aparut diferite

protocoale pentru executarea acesteia n funcie de particularitaile moleculei de determinat i
de modul n care procesele fundamentale ale metodei ELISA se desfasoara.
O prima clasificare a tehnicilor ELISA se poate face referitor la modul de fixare al
anticorpului la antigenul de captura, astfel facandu-se distincia intre fixare competitiva i
necompetitiva.
O alt clasificare se face n funcie de modul direct sau indirect n care conjugatul se
fixeaz de antigenul sau anticorpul de captura.
O categorie separat de tehnici ELISA o reprezint tehnicile sandvi, n care un antigen
este prins intre 2 sau chiar 3 anticorpi, dintre care primul este cel de captur i ultimul este
cel din conjugat.
Tehnica ELISA celulara, denumit de unii autori i cELISA reprezint o determinare n
care antigenul sau anticopul fie el de determinat sau de captur este o molecul exprimat la
suprafaa membranei celulare

Tehnici ELISA folosite curent

ELISA INDIRECT
Aceast tehnic este util pentru determinarea concentraiei anticorpilor serici sau din
supernatantul celulelor de tip hibridoma. Metoda se preteaz situailor n care cantitai de ordinul
miligramelor din antigenul purificat sau semipurificat sunt disponibile.
Protocolul presupune fixarea antigenului pe fundul placilor de microtitrare i blocarea situsurilor
de legare nespecific, incubarea soluiilor de testat i spalarea anticoprilor necuplati din plac

4
dup incubare. Soluia de conjugat (conjugat enzim-anticorp anti-anticorpul de determinat) se
adaug n reacie, se incubeaz i o noua etap de spalare inlatur conjugatul nefixat din plac.
Se adaug substratul cromogen i dup parcurgerea timpului de incubare reacia este stopata.
Cantitate de substrat descompus de enzim este determinat prin citire la spectrofotometru.
Valorile densitailor optice vor fi direct proporionale cu cantitatea de anticorpi din soluia testata.

ELISA COMPETITIVA DIRECTA

Aceast tehnic se poate folosii pentru a detectarea calitativa i cantitativa a antigenelor
solubile i este indeosebi util cand att antigenul ct i anticorpii specifici sunt disponibil n
cantitai de ordinul miligramelor.
Protocolul presupune fixare antigenului de captur pe fundul placii i adaugarea n acelai timp a
conjugatului enzim-anticorp specific i a soluiei de testat care contine antigene solubile.
Cuplarea conjugatului la antigenul de captur este inhibat de cuplarea la antigenul solubil. Dup
incubarea cu amestecul de conjugat i antigen solubil inhibitor, reactanii nefixati sunt indepartai
prin spalare. Se adaug subtratul cormogen i dup incubare reacia este stopata. Cantitatea de
antigen din soluia de testat este direct proporional cu gradul de inhibare al transformarii
substratului i poate fi cuantificat prin intrapolare pe o curba de inhibare generat prin realizarea
unor diluii seriale ale soluiei standard de antigen.

ELISA SANDVI
Tehnicile care folosesc principiul anticorpi-sandvi ar putea reprezent unele din cele mai utile
determinari imunoenzimatice pentru determinare antigenelor deoarece frecvent ofer o
sensibilitate de 2-5 ori mai mare decat alte tehnici de determinare a antigenulei
Protocolul presupune folosirea unor anticorpi specifici de captur fixai pe placa de microtitrare
peste care se adaug soluiile de antigen de testat. Dup incubare antigenul nelegat este
inlaturat prin spalare iar n plac se adaug soluia de conjugat(conjugat enzim-anticorp specific
pentru alt epitop al antigenului), etap creia ii urmeaz o noua incubare. Conjugatul nelegat este
inlaturat prin spalare. Se adaug substratul cromogen i dup parcurgerea timpului de incubare
reacia este blocata. Cantitatea de substrat hidrolizat este direct proportional cu cantitatea de
antigen din soluia de testat.

ELISA DUBLU-SANDVI
Tehnic folosit n special pentru detectarea anticorpilor specifici n cazul n care se dispune de
o cantitate mic de anticorp specific i nu se dispune de antigen purificat. Tehnica se poate folosi
i pentru investigarea poziiei epitopilor diferiilor anticorpi monoclonali formai impotriva unui
antigen comun.
Suportul solid este acoperit cu anticorpi anti-imunoglobulina (imunoglbulina provenit de la
speciile imunizate). Soluia de anticorpi de testat se incubeaz n plac i la sfarsit anticorpii
nelegai sunt inlaturai prin spalare. Se adaug soluia de antigen i se incubeaza. Dup inc o
etap de spalare se adaug conjugat enzim-antigen specific i se incubeaz din nou.
Conjugatul nelegat este indepartat prin spalare i se adaug substratul cromogen.
Probele din godeurile n care apare reacia de culoare sunt desemnate posibil pozitive adic ar
putea s conina anticorpi specifici. Verificarea rezultatelor fals pozitive sau a probelor cu o
pozitivitate incert se poate face prin retestarea probelor respective. Probele vor fi lucrate n patru
exemplare n godeuri n care s-a fixat anticorpul de captura. n doua dintre godeuri se va adaug
antigenul iar n celelalte doua doar un tampon de blocare. n toate cele patru godeuri se continua
cu adaugarea conjugatului i a substratului cromogen. Placile vor fi citite dup o ora. Acest

5
procedur va elimina rezultatele fals pozitive obtinute pe fondul reaciei dintre anticorpii de testat
cu anticorpii din conjugat.
Pentru a distinge rezultatele pozitive dar cu o concentraia mic de anticorpi specifici placile pot fi
citite din nou dup cateva ore sau zile de la adaugarea substratului cromogen.

ELISA CELULAR DIRECTA

Tehnica este folosit pentru evaluarea prezenei antigenelor sau a receptorilor de suprafaa pe
membrana celulelor de testat folosind anticorpi existeni sau ali liganzi specifici antigenelor
membranare.
Protocolul presupune determinarea densitaii optime a suspensiei celulare per godeu prin analiza
intersectat a diluiilor seriale i obinerea suspensiei celulare prin centrifugare i resuspendare n
volumul determinat. Un volum fix de suspensie celular este adaugat n godeurile placii de
microtitrare, placa este centrifugat i supernatantul este inlaturat. Etapele urmatoare presupun
desprinderea butolunul celular i resuspendarea celuleror n conjugatul enzim-anticorp specific
anti-molecule membranare. Dup incubare placile sunt centrifugate i conjugatul nelegat este
inlaturat printr-o spalare blanda. La acest moment se adaug substratul cromogen.
In timpul etapelor de incubare n prezena conjugatului sau a substratului cromogen placa va fi
agitat usor la interval de 15 minute pentru a asigur o buna interaciune intre reactani.
Nivelul de exprimare antigenic la suprafaa celular este direct proporional cu nivelul de
transformare a substratului.
Celulele eucariote secret cantitai variabile de fosfataz alcalina cea ar putea interfera n tehnica
ELISA din aceast cauz o evaluare a cantitaii de fosfataz alcalina exprimat de celulele de
testat va fi efectuat intr-un experiment preliminar. Dac celulele secret fosfataz alcalina la un
nivel ce ar putea interfera cu protocolul de analiza, enzim din conjugat va fi inlocuit cu o alta,
cum ar fi -galactozidaza.
Celulele folosite pot fi fixate inainte de analiz dar numai dac se poate demonstra c celulele
fixate ii pastreaz antigenicitatea membranare. Fixarea se poate face prin suspendarea celulelor
intr-o soluie de glutaraldehid 0,5% timp de 30 de minute i spalare ulterioare.
Aceast tehnic poate fi la fel de sensibil ca i citometria n flux n cuantificarea nivelului de
exprimare antigenic al unei populaii celulare dar spre deosebire de metoda citometric aceast
metoda nu face distinctia intre populaiile celulare i prin urmare nu poate fi aplicat unei populaii
heterogene de celule.

ELISA CELULAR INDIRECTA

Aceast tehnic este conceput pentru detectarea anticorpilor specifici impotriva antigenelor
mebranare.
Anticorpii anti-antigene membranare sunt detectai prin incubarea celulelor cu o soluie de
anticorpi primari de testat. Dup centrifugare i spalare pentru inlaturarea anticorpilor nelegai,
celulele sunt incubate cu o soluie de conjugat enzim-anticorp secundar(anticorp anti-anticorpul
primar). Placile sunt centrifugate i conjugatul nelegat este inlaturat prin spalare. Se adaug
substratul cromogen.
Cantitatea de anticorpi primari din soluia de testat este direct proporional cu cantitatea de
substrat transformat.

6
 4. MATERIALE I REACTIVI NECESARI n TEHNICA ELISA

Tehnicile ELISA, indiferent de tipul folosit, necesit n general acelai set de materiale i
reactivi, exceptand evident soluiile de testat i anticorpii, respectiv antigenele, complementare
care definesc fiecare protocol n parte.

Lista de materiale i reactivi necesari pentru executarea unei analize ELISA de rutina
MATERIALE:
- pipete automate de volume diferite(1-500ul) i varfuri corespunzatoare;
- pipet multichannel i varfuri corespunzatoare;
- placi de microtitrare corespunzatoare modelului experimental;
- piset de plastic;
- spectrofotometru;
- cuve plastic pentru pipeta multichannel;
REACTIVI:
- soluie agent de developare (conjugat enzim-anticorp/antigen);
- soluie antigen;
- soluie anticorpi de testat;
- TFS (tampon fosfat salin);
- ap distilat sau deionizata;
- substrat cromogen NPP(p-nitrofenil fosfat) sau TMB(tetrametilbenzidina);
- tampon de blocare a legarilor nespecifice;
- soluie de stopare (NaOH, H2SO4)
- tampon de spalare;
- tampon de fixare a anticorpilor/antigenelor pe plac;
n cazul tehnicilor ELISA celulare(cELISA) la lista de materiale i reactivi se adauga:
- soluie de suspensie celulare;
- soluie de conjugat enzim-anticorp specific
- tampon de spalare, inut pe gheaa;
- placi de microtitrare cu fundul rotund sau conic;

5. SURSE DE EROARE

Teoretic, orice etap din protocolul ELISA poate reprezenta o sursa de eroare, dar
studiile au demonstrat c numai o parte din proceduri pot fi considerate ca surse semnificative de
eroare. Aceste proceduri critice sunt pipetarea soluiei de testat i a substratului cromogen i
absorbana inerent a placilor de microtitrare. Acestea sunt totui probleme de finee pe care le
pot intampina pana i cei cu experiena n tehnica ELISA.

7
Urmeaz o trecere n revist a condiiilor de indeplinit i posibilelor surse de eroare:
Toi reactivii i placile de microtitrare se aduc la temperatura camerei inainte de utilizare;
Dei tehnica ELISA nu impune condiii de sterilitate, sticlaria i consumabilele (varfuri, cuve,
etc.) trebuiesc s fie ct mai curate i far urme de detergeni;
Concentraia reactivului ce urmeaz a fi adsorbit pe suportul solid trebuie determinat pentru
fiecare cuplu suport-proteina i pH-ul soluiei trebuie s fie unul adecvat.
Blocarea situsurilor de legare nespecific este o etap foarte important n protocol.
Tamponul de blocare asigur att saturarea suprafeei godeului, prevenind astfel fixarea
anticorpilor de detecie sau a conjugatului de faza solida, ct i inhibarea legarii anticorpilor
specifici la antigenul/anticorpul de captura.
Aranjamentul probelor n plac poate influena rezultatul determinarii. Pentru un protocol de
mare precizie este bine s lasam marginile placii(randurile A i H) libere pentru a masura
absorbana placii iar probele de control, pozitiv i negativ, pot fi distribuite aleatoriu n zone
diferite ale placii (Caciagli i Verderio, 2003).
Diluia probei pozitive cercetate trebuie s corespund unei valori a absorbanei semnificativ
pozitive.
Enzima utilizat n conjugat trebuie s aibe o specificitate ridicat i un randament ridicat n
transformarea substratului. Este de asemenea important ca problele de testat s nu conina
substane care ar putea intefera cu stabilitatea sau activitatea enzimei.
Concentraia conjugatului enzimatic trebuie s corespund celei mai mici valori care asigur
vizualizarea complexului format.
Pentru rezultate mai bune, probele se lucreaz n duplicat sau chiar triplicat. Media valorilor
absorbanei este folosit pentru determinarea concentratiei probei.
Manevrarea brusc a placii sau adaugarea prea rapid a probelor, tamponului de spalare n
plac poate duce la desprinderea moleculei de captur de pe suportul solid.
Dac folosii spalatorul automat, asigurai-v c aparatul este potrivit pentru tipul de plac
folosit i acordai atenie adancimii la care coboar acul de spalare n plac. Setarea
neadecvat a aparatului poate duce la aspirarea anticorpilor de captura, zgarierea fundului
placii sau chiar la stricarea aparatului. Este de preferat s folosii spalatorul automat doar n
cazul folosirii unor kituri ELISA cumparate al cror protocol prevede folosirea unui astfel de
aparat. Placile pregatire n laborator pot fi mai sensibile la mecanica spalatorului automat i
astfel rezultatul protocolului are de suferit.
In cazul folosirii tehnicii cELISA, etapele de spalare necesit o atenie deosita. Placile vor fi
mai intai centrifugate la parametrii specificai n protocol i supertanatul trebuie inlaturat cu
grija pentru a nu desprinde butonul celular. Adaugarea tamponului de spalare se va face
intr-un mod bland. La finalul unei etape de spalare, placa va fi agitat pentru desprinderea
butonulu celular i celulele vor fi resuspendate n reactivul aferent etapei urmatoare.
Tamponul de spalare trebuie s fie tinut pe gheata.
Concentratia soluiei de captur va fi invers proporional faa de concentraia teoretica a
soluiei de testat pentru a prevenii legarea conjugatului sau anticorpilor secundari la
molecula de captura.

BIBLIOGRAFIE

1. Bianchi A.T.J., Moonen-Leusen H.W.M, van der Heijden P.J., Bokhout B.A., The use of a
double antibody sandwich ELISA and monoclonal antibodies for the assessment of
porcine IgM, IgG and IgA concentrations, Veterinary Immunology and Immunopathology,
44, 309-317, 1995

8
2. Caciagli P., Verderio A., Experimental layout, data analysis, and thresholds in ELISA
testing of maize for aphid-borne viruses, Journal of Virological Methods, Volume 110,
Issue 2, Pages 143-152, 30 June 2003
3. Clarck M. F., Lister R.M., Bar-Joseph M., ELISA Techniques, Methods in enzymology, vol
118, 742-766, 1986
4. Eva Engval , Enzyme immunoassay ELISA and EMIT, Methods in enzymology, vol 70, p.
419-439, 1980
5. Heck F. C., Williams J. D., Pruett J. Interpretation of Spectrophotometric Absorbance
Values to Define Results of Enzyme-Linked Immunosorbent Assays, JOURNAL OF
CLINICAL MICROBIOLOGY, Apr. 1980, p. 398-401
6. John Wiley and Sons, Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA), Unit 11.2 in
Current Protocols in Molecular Biology Supplement 34, 1996
7. Kricka L.J., Selected strategies for improving sensitivity and reliability of immunoassays,
Clinical Chemistry, 40, 3, 347-357, 1994
th
8. Kuby J., Goldsby R., Kindt T., Osborne B., Immunology , 5 edition, 2003
9. Le Goff C., Thiaucourt F., A competitive ELISA for the specific diagnosis of contagious
bovine pleuropneumonia (CBPP), Veterinary Microbiology, Volume 60, Issues 2-4, Pages
179-191, 28 February 1998
10. Lequin Rudolf M. , Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
(ELISA), Clinical Chemistry 51, No. 12, 2005
11. Michael Steinitz, Lea Baraz, A rapid method for estimating the binding of ligands to
ELISA microwells, Journal of Immunological Methods, 238, 143150, 2000
12. Mire-Sluis A.R., Gaines-Das R., Thorpe R. Journal of Immunological Methods, Volume
186, Issue 2, Pages 157-160, 26 October 1995
13. Olinescu A., Dolganiuc A., Imunologia practica n clinica i experiment, subcapitolul:
Analiza imunoenzimatica ELISA, pg. 153-157, Ed. Viaa Medicala Romaneasca,
Bucureti, 2001
14. Osuchowski M. F., Remick D. G., The repetitive use of samples to measure multiple
cytokines:The sequential ELISA, Methods 38, 304311, 2006
15. Plebani A., Avanzinia M. A., Massaa M. and Ugazioa A.G., An avidin-biotin ELISA for the
measurement of serum and secretory IgD, Journal of Immunological Methods, Volume
71, Issue 2, Pages 133-140, 6 July 1984
16. Qian W., Yao D., et al., Immobilization of Antibodies on Ultraflat Polystyrene Surfaces,
Clinical Chemistry 46: 1456-1463, 2000
17. Satoh A., Kojima K., Koyama T., Ogawa H., Matsumoto I., Immobilization of Saccharides
and Peptides on 96-Well Microtiter Plates Coated with Methyl Vinyl EtherMaleic
Anhydride Copolymer, Analytical Biochemistry, Volume 260, Issue 1, Pages 96-102, 15
June 1998
18. Sittampalam S., Smith W.C., et al., Application of experimental design techniques to
optimize a competitive ELISA, Journal of Immunological Methods, 190, 151- 161, 1996
19. Voller A., Bartlett A. and Bidwell D.E., Enzyme immunoassays with special reference to
ELISA techniques, Journal of Clinical Pathology,31, 507-520, 1978
20. Wilco de Jager, Ger T. Rijkers, Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: A
comparison, Methods, Volume 38, Issue 4, Pages 294-303, April 2006
21. Yuzuru Hayashi et al. , An expression of within-plate uncertainty in sandwich ELISA,
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 36, 225229, 2004