Its PDF

DilAGN@STICUL DE LABORATOR iru SITIUS
A" .Da[e*generele :
{, Taxomonq re T"Pallidurn
2" Evoflu$fia infec$iei
3. MeeanlsPe Patogene - imunitate
:' 4. SiflflEsufl dobAndlt
F S" Utiliuanea testeflor serologice in diagnosticul sifilisului
6" Diagmostfiaul slfgBEsului la gravide
V. DiagnostfleuE sEffrEf,sului congenital
S" DiagerostEeuE sBfEBEsului- cazuri HIV pozltiv
ffi . tista-p reqeCugt d[qsuqstia:
1. MierosaoPne Pc fonrd intunecat

2. VORL
3" RPR l
4,. TPE{A
" 5" FTA"ADS
6. ELflSA SlaPlnHfles M eaPture
BOLILOR TRANSMISIBILE
OIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA
Cun PHARE 14-24 iunle 2004
INSTITUTUL NATIONAL DE CERCETARE DEZVOLTARE
PENTRU MICROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE "CANTACUZINO'
"Diagnosticul mioobiologic in supravegherea ITS'
- DocumentP€ntruuzdidaclic
A" Da&egemerale:
t" Taxononnne T.paMidum

2. Hvolu$ea fimfca$fien
3" Meeamfispe patogeme - imunitate
&" Sififlisuil dob6mdst
5" titiBtzanea tcs'ceBor serologice in diagnostieul sifilisului
6. Diagnostneul ssftInsului la gravide
7. DiagmostlauI saf[BBsului congenital
E" tliagarostneul ssfsHssttlui- eazuri HIV pozitlv
NIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPMVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBILE

Curs PHARE ,4-24 iunie 2004
PENTRU MICROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE'CANTACUZINO"
'Diagnosticul microbiok;gic in supravegherea ITS'
Document pentru uz didaclic
Sifilisul
Este o infectie contagioasa sistemica cu transmisie sexuala, dar si transplacentara, produsa de
Treponema pallidum. Se caracterizeaza printr-o succesiune de perioade simptomatice scurte, despartite
prin perioade de latenta mai lungi.
TAXONOMIE (dupa Berghey, 1984)
Ordinul SPIROCHAETALES
Familia SPIROCHAETACAEE
Genul Spirocheta
Cristispira
TREPONEMA
Borrelia
GENUL TREPONEMA
(Criteriile de diferentiere in cadrul genului: patogeniiatea om/animal si capacitatea de multiplicare in
vitro)
Speciile patogene pentru om si animal sunt necultivabile

Desi produc tablouri clinice diferite, nu s-au gasii diferente antigenice si morfologice notabile intre ele
T. pallidum subsp. pallidum

T ,pallidum subsp, endemicum
T, pallidum subsp. peftenue
T. carateum
T. paraluis-cuniculii
Speciile nepatoqene sunt cultivabile (conditii anaerobe) si au urmatoarea localizare:

Cavitatea bucala (asociate paradontozei)', T. Denticola, T.macrodentium,
T. vincentii, T. oralis,
T. scoliodontum
Mucoasa genitala (flora genitala normala) '. T. phagedenis, T, refringens,

T. minutum
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPMVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBILE

Curs PHARE 14-24 iunle 2004
PENTRU IIICROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE "CANTACUZINO'
'Diagnosticul microbiologic in supravegherea lTS"
Document pentru uz didac'lic
Evolutia infectiei treponemice
Poarta de intrare (leziune tegumentara/mucoasa) -+ X -+ diseminare

il
LEZIUNE PRIMARA
' vase limfatice + ggl. limfatici regionali -+ X + circulatie limfatica

il ->
v
ADENOPATIE
sistem venos -+ circulatie generala -+ invadeaza intreg organismul
(inclusiv tegument, sNC) -+ X + tranzitoriu circulatie -+ tesuturi

U
LEZIUNE SECUNDARA
(mai ales cele bogate in colagen -pereti vase) + X + LEZIUNE TERTIARA
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA

BOLILOR TRANS[4ISIBILE
Curs pHARE 14-24 iunie 20A4
' Diagnosticul microbiologic
in supravegherea iTS,
Document pentru uz didactic
MECANISME PATOGENE
- Molecule de adeziune ex, receptori pentru fibronectina (extra si intravasculara)
- Mucopolizaharidaza (atasare)
- Hialuronidaza (diseninare, distrugere de capilare)
- Porine (patrundere intracelulara, distrugere)
- Enzime cu activitate de hemolizina (leziuni celulare)
Leziunile (cu exceptia gomelor) sunt produse de multiplicarea treponemelor in tesut (mai eficient in
tesuturile bogate in colagen, ex perisi endartrita-+necroza),
IMUNITATEA IN SIFILIS
- Exista un anumit grad de rezistenta naturala la infectie ( anticorpii de grup fata de treponemele comensale)
- Raspuns inflamator fata de infectia primara -+ infiltrat inflamator in care predomina succesiv pMN,
macrofage, limfocite, plasmocite, macrofage
Fagocitoza
PMN + intemalizeaza rapid T.p cu formare da vacuole -+ fagolizozomi +pierderea integritatii bacteriei
Macrofaqele neactivate pot internaliza bacteria si prin alt mecanism : "coil- phgocytosis" -) nu se formeaza
fagolizozomi-+ treponeme vii, libere in citoplasma
- Raspunsul imun specific

Limfocite (T,B) + dupa activarea cel.B -+ anticorpi lgM,G,A,E fata de doua tipuride antigene
(proteice = 3 Osp si 4 flagelere = MAP si lipoproteice = cardiolipina)
Anticorpii nu opresc evolutia infectiei : ac. anticardiolipinici = martori de leziune

(hetero, auto)
ac. antiMAP = martoride infectie
Opsonizare, fixare de C'.,.
Limfocitele T citotoxice -+ cel putin DHT + gomele = granuloame
Desidupa infectia cu T,p apare imunitate, ea se instaleaza lent si este eficienta atat cat persista
stimularea antigenica (- premunitia)
EVITAREA MECANISM ELOR IMUNE

- Anvelopa externa prezinta putine proteine integrale, care se pot internaliza (greu de recunoscut)
- Bacteria este acoperita de un strat mucoid format din macromolecule de origine umana (si mai
greu)
- Poseda echipamentul genetic necesar variatiei antigenice
- Diseminarea rapida in nise protejate (tesuturi profunde, org. incapsulate) si
localizarea intracelulara ( cel, epiteliale, plasmocite, macrofage)
- Sferoplasti
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBILE

Cum PHARE 14-24 iunie 2004
'Diagncstrcul microbiologic in supravegherea lTS"
E-
f
F
C)
c\l ..- l
c"j
\(o E. F-
O '., ro F<
a+
LLl
N A /\l cr)
=
LU
Z Jca
Oa- H#
LL
d
tL
U
e S
-2.
u-r
l-t't o< =
il-E
='s
I F.A =i!
LU.q- :5
?s
N>
=t
<o_
c->
E '= =p
= =>
;r =
z.
=
H jo?
5s
CD'-
,{3 )U
co
O:_
o7
-rl rj
{+
=
><c-
l-- rf)
ft--
>'s
-r ll
L-
=
X
Y
I
a
z
LUN '<rF r LU Euz
F1 ,S; Al) uJ
O = 5i a
q)(9
LU F
c s5- d;:'i
LU z.+l :
E t-
(J -,()A
[z-Y= F= -?o
-E c)
LU
S- /. )Eo o
fr
-r u.
l!t
O tz- -& :: N';
=
d !i<
a Sxds =>
a_;l-oad>
<^J
JV
g
U
?*tsp,po
u -,,,.,. o
i gH
d'S O 6 FX{p cE
c->
rrr \J LI u)
= c/>'a
:T
:
=
()O
=2.
> lJ'
-+
a ugSEr=
q6E?=ur z'
,.1.=
'7>
r-r.rlr-u
OF--
(9 irJ;{
E
U.= () U
)+&Z
qNU-!
su=
5E
@ N
c=
..
oE
-
z. z. <. f- dPH*=F X.
<'
J.uÂZu- o od
ffiVtrP2fr = H= gHd
*
= + v) e ,.,
6EE.3g= E 6H F+E
= -
N =LL
-=
N= = € lS { rn I o
.r - <
UJ LU-r A ^
I -
c r
JJ Pe-d:8 o
=4-Y
illlil ll u il il n
r )atu
;d6 :,i > F.E
UV6
d <q I5
o
x f=!?
>.c
->N
rY.--ur' O FrF
,?
F:>O< - -u
O
92
LLI-L
F u-r 6
Lu ') __t o
E
go)
-E < z.
(9
=Y
{EUoi->
l'{ o
(o UJ
FUJ _. >,< =
JIJJL>
E
CO
z.
LU
t-Z. OZ=ri
o OUJ <O:iii
'6 LUO -O-*z-
(E OUJ
E
0)
LUO
FLU
7,*
fr89>r
<. z. 6
.: t-= iNI
:=
g
.E '#1 ,s # 9esRl
(J
I
'<a5 k
u-^FO 6 r -J
cnE+Q(l -ll
gl ^r =8. tr-H',91
=t *t at
2l J J
4LU trj
=i o-l otdl
Bl
ol
=t
Hl
il
;:,s'#
;nk'<
(g lt
cttl
:ll
lrl
il =l 2
LrJol
-t
@l
ol
trl 3l
'cnl
=l
=l -Ql
irDl
=l
c)
ETG
IIFO
r'-t
A
EI
=l
=l
al .- c.i
'al
-Ql
c.j
-j c.i
c'-j c.j
c"j
c.:
F
+
rJl
z,l
rri
G G G
E
o
o o
o o
o 0
o o o
o o o
3
o o t=
o o
5 6
E 6
Io .E
6
o
o
6
o
o
Eo<
fo-
G4
OE
o;
: .E(
pJG E5
c .E
a '= 6
ad
.-'E E
EO c
o.
E> - 5' E
g6u
3'E d
o s= .S E
b:o
6.==
c =
.E -o Eo + >ci X
E
G*=
TH
6
o 3 s;x
o
=
ox
EH
E=
P .s
-
B
a'EiEP
Q!PEs6
e
==o t6
.g
E .=
=
@ a ==
=c
::i: E; +;s8-
d?;s.3
'a
o d<
a-+ .9 6T=
'= o iqoc
o >-o
,, +€- !?
H 6<
AS
>.= 6 =>E
=@ gY x'6
s= o
E A- >g.st? I
x "Eid Ea
'=oe E
q oo
EX 3 ':*.'Pr
o
-E 5trs -=
E =F€ -E d q-ts
g€s .Y=oa
6
E Ef*E9
.E
-d@
'cdrv
o'66
c
e
c!
J*< tP
6!': P
o
€ee 5g
oooEqo
FE! O X
#
N A
dFE F S
h C= d
U
J
m
o-QE o >S a1 .o #X ;8s
ta
'=o.=
.=A- o
E ^-d)@
voo
trcg '=6 b e
: .E ,6E'P a
=
!
=oc
Q@O
q=o
=o :-
5r
o Ecc=6 E 6 :.Re: =
cn
=6i6g
-o:E 6 $.9 F o- E t< C)oO C z.
oo=
r F!E
6*=
=6o o;i E tr
9 ; J'E E
F uz.
J
:
!
o€6
oGa
ooE
oEE
oGo
ooF
o6ts !.Eg
@ GiE
E'F€ #3
h 5
eo a
E x !l
9?
x
E
a
F
cru9l
Ec:"
lqoE
E
O
oaFl
gl-
\oLt)
c= Q o o,.
-:o :G oQ =5 =-
.= E va ElrE
PI o
+ 6Sb
i o.g .a -= Ao .= I :*d--=>>uts
V-9.-- E U= != F o..e .9 =EEIJ
E El; H Ni q
' > N=
2 6'=
gr-:i d
o N
e I
6
E.E o
EE
xE
!s
X
d :AgE Ef;3 E3E Eg
= '-.2G HE
U .=
o* ii u
p bl 7
a or=
<*69:
u d,,,,,, q,-!)
_=sE E6'9, E'E.: -€ fffiEF
600!P ooOv,u o .9oEo
- EeF=l E 6 -6
6 I-Yrv^-Y HE
h+!.o=l E o7iE E o s8E sE: =da- J
E qEE € =6'a€l
6l
=- E -.e E
o-,=o
E'Eg
P rn c;il
!iF9I =r
>.=! gt =6o 6 C Ebb Ebe ER, E s
! oE o 5 g 0)E o ol
I o O€ O E G < di iii :)'^
i
'G@oG6=G=
pcoo
I Io 9b
a o tr-i-o>';,:
=
o o
e a@ c J^Luav)
=-u- o n
z<== ,u.6'E
"'t I a;
5
a (Jf <o.=
c
o ==
'E- o eEdE =
E
CN =o Y,i<m do
a
o Or
o-.
Yo 6-zQ6
!o F G*
qt
N
=ts...i( t r>.9
d=6
a>o
Î-
.6 aq O F:F
F =o
=.Q
osD
d.q
E6 .b "i
; -L:o , 2t-
o od :E b v GolY
l,
:IL -u
7 -Pa 66
.N@
6()
o=cG
oo6> P hs
65-
F
a
o
c
€ ox
c<
=E
6 c
I aH o z
- (9
o @@
OA NCJO
FC.!o
€
oo-9
G-QE o
o QE SS
l9F
oo
p.Q Ia g.q @
o -o
=o
eO 8;
G
o
€ ô
'E>
=2:
'6 a
oi6
E3E
6t -gG =o
cc o 3:
'-o=6
E .c
Cd\ g=
o= 'E'F o ooo.=
oG =60
EO6
N.= 50 o P
.!:EE
N.- '6
=
tr 'c6
o6
-G
G
!
EZ
';9
cai
+
=
=
!
o
:I
.= a:
''= o
o-E
6 O rO q)
z. a6
a6
oo
GC
o =6
c9-
€oxG
5 Qco
ooG
) 6a uo
G
co oo€
€E o E
q6 ô .a G A
-@e
a-a I
E !o 9E 6 G
LLl
I _a e -6
gYO
J N;
'='E
E E
N =o
!J OG dc o 60.=.=
G o
x, oP .go
R-9
o
o
.e.F e
ovt o
e
o
o.9
o6=O
c;=
o LU
o
ON o
c
0500
:6:!
OSc c
UJ
o o
6
o
!
.E
F
ts 6
z E.
cz.
F.
UJ o
t F>
<( Eo
e
lJ. t r!
E - P.!)
f :ao
=
o F ]F-
oH
tu = l-=
o F
U>
E
o-
t!
CD t ,2.
tu il=d
FO c
9
NEUROSIFILIS
Descriere clinica
lnfectia cu T.p la nivelul SNC (poate surveni in orice stadiu)
Criterii - diaqnostic de laborator:
- teste seroloqice pozitive si LCR cu VDRL pozitiv
Clasificare caz
Probabil: sifilis in orice stadiu cu LCR cu VDRL negativ si
- LCR cu nivel crescut de proteine/nr.celule fara alte cauze cunoscute
- Simptome clinice sau semne compatibile cu neurosifilisul fara alte cauze cunoscute
Confirmat: sifilis in orice stadiu care indeplineste criteriile de laborator pentru neurosifilis
B. SIFILIS CONGENITAL
Descriere clinica:
Afectiune produsa de T.p tn Lttero, cu spectru larg de severitate, La nastere,numai cazurile severe sunt
simtomatice
Criterii - diaqnostic de laborator

- evidentierea T,p in specimene clinice din leziuni, placenta, cordon ombillical sau material necrooptic,
prin microscopie directa (camp intunecat), imunofluorescenta ciirecta, echivalent...
Clasificare caz
Probabil: afectiunne a unui copil a carui mama avea la nastere sifilis netratat (sau tratat incomplet),
indiferent de semnele copilului sau, un nou nascut sau copil care are un test treponemic pozitiv si oricare din
urmatoarele
orice dovada de sifilis congenital la examenul fizic
orice dovada de sifilis congenital pe radiografiile oaselor lungi
LCR cu VDRL pozitiv
LCR cu nivel de proteine sau nr. celule crescut
- FTA-abs-19S-lgM sau ELISA-IgM pozitiv
Confirmat: caz care indeplineste criteriile de laborator
.La
copii mai mari de doi ani deosebirea intre sifilisul congenital si cel dobandit poate fl dificila (abuz sexual).
Semnele radiologice sunt f. importante in aceasta decizie, ca si istoricul mamei.
Pt. raportare in sifilisul congenital sunt incluse si cazurile de moarte in utero la gravide cu sifilis ca si cele de copii
cu sifilis dobandit
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPMVEGHEREA BOLILOR TRANSNIISIBILE

Cun PHARE 14-24 iunie 2004
PENTRU I/ICROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE'CANTACUZINO'
"Diagnosticul microbiologic in supravegherea ITS'
Document penlru uz didactic
10
IJTILTzAREA TESTELoR snRor,ocrcp ix

DIAGNOSTICUL SIFILISULUI
A. Se utilizeazi pentru diagnostic in toate stadiile dar

cuplate: netreponemic + treponemic; singur, niciunur nu acoperi
toate stadiile
B. Urmarirea pacienfilor dupi tratament: test netreponemic,
(semi)cantitativ
1L'
VDRL / RPR, teste netreponemice, nespecifice, identificd anticorpi lgG gi lgM

antilipoidali (VDRL: ser inactivat gi LCR; RPR: ser gi plasmd neinactivate).
- reactivitatea depinde de stadiul infec{iei, rdspunsul gazdei
- se pozitiveazd dupd 3-6 sdptdmdni
-+ sensibilitate scdzutd stadiu precoce
- specificitate scdzutd +reac{ii BFP <- confirmare cu test treponemic
- teste de depistare (exceptie VDRL-LCR confirmd neurosifilisul), infectii
active (martori leziune)
- in sifilisul secundar poate apdrea fenomenul de prozond
- titrul scade -+ negativ cdtre stadiul tardiv sau dupd tratament corect
- titrul RPR mai mare decdt cel vDRL, seroreversia VDRL mai rapidd
TPHA / FTA'Abs, teste treponemice, specificitate inaltd, confirmi serurile

reactive cu VDRL /RPR
- identifica anticorpi treponemici rpHA:rgM+lge; FTA-Abs lgG, alte
variante lgM
- ca gi pentru testele netreponemice, titrul variazd cu stadiul infectiei
dar,
dupi o scddere spre stadiultardiv, rdm6n pozitive ani de '
zile
(martori de infeclie); seroreversia se produce extem de rar (excepfie,
rPHA la pacienli HIV pozitiv, tratafi). FTA-Abs pantd mai bruscd,'
- Sensibilitate :
o FTA-Abs crescutd in sifilisul primar (g5%), scade in tardiv
o TPHA = VDRL/RpR in sifilisul primar precoce (65%), rnai
mare in stadiile tardive (100%).
-+ Nu se utilizeazi in urmdrirea evolutiei bolii gi dupi tratament
(excepfie sifilisul congenital -+ 18-24 luni)
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSN,lISIBILE

Cum pHARE 1 4 -24 iunie 2A04
PENTRU MIOROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE "CANTACUZINO'
"Diagnosticul microbiologic in supravegherea ITS',
1l
UTI LIZAREA TESTELOR SEROLOGICE
B. Urmirirea pacientilor dupi tratament
Pacienliitrebuiesc informati despre importanla testirilor repetate pentru a se

confirma vindecarea.
Urmdrirea se face la cazurile confirmate cu VDRURPR cantitativ, obligatoriu cu acelagi test

gi preferabil, in acelagi laborator.
Proba de control, la care se raporteazi rezultatele succesive, se recolteazi in ziua 0 de

tratament; o scidere a titrului de > 4x este semnificativi (doar 2 dilulii),
Testele cardiolipinice (semi)cantitative se repeti la 1,3,6 si 12luni, sau cdrteste necesar, pdnd
se negativeazS.
ln urma unui tratament eficient in sifilisul primar-secundar, leziunile se vindeca rapid,

titrul testelor VDRURPR scade, testele pot devin negative in medie in g-12 luni.
Testele treponemice rdmAn pozitive de cele mai multe ori ani de zile sau uneori permanent.
seroreversia TPHA la 3 ani in 13% din pacienli cu sifilis primar tratali agresiv; se mai
semnaleaza la HIV pozitiv gi alte tipuri de imunodepresii
Dacd testul VDRL rdmane pozitiv la titru mare > 1an sau dacd titrul continud sd creascd
(4x) se recomandd un nou tratament, mai intensiv.
Reciderea clinici gi serologici nu este frecventd dar uneori apare, in special in lunile 6-9
dupi tratament, afectand de obicei sistemul nervos. Trebuie luatd in consideratie 9i
posibiliiatea de reinfeclie, Ambele cazuri necesitd un nou tratament intensiv.
Daci toate examenele clinice 9i serologice riman satisfacatoare pentru o perioadi

de doi ani dupi tratament, bolnavul poate fi considerat vindecat.
Pacien!ii cu sifilis latent sunt !inuti sub observatie gi testali la 3,6,12,18, si 24 luni; cei
cu teste persistent pozitive (serofast) vor fi vdzuli anual pe perioadS nedeterminatd. Dacd
titrul se pistreaza constant sau scade lent, prognoza este foarte bund.
Pacienfii cu sifilis tertiar benign vor fi examinali regulat dupd tratament iar cei cu sifilis
cardiovascular toata viala.
Pentru neurosifilis asiptomatic examinarea LCR se face la 6 luni pdnb c6nd este normal
timp de 2 ani; LCR anormal se examineaza la 3 luni p6nd devine normal gi apoi la 6 luni
incd doi ani.
Ca gi anevrismul aodic, tabes dorsalis nu se remite in urma tratamentului. r
Este necesar ca toti pacientii cu sifilis si fie sfatui{i s6-9i faci testirile pentru HIV;
cei cu sifilis primar sau secundar care au rezultat negativ trebuie retestafi la 6.9 luni.
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHERFA BOLILOR TRANSMISIBILE

Curs PHARE 14-24 iunie 2004
'Diagnosticul microbiologic in supravegherea ITS'
12
Teste pentru diaqnosticul seroloqic de rutini al sifilisului:
o La depistare : VDRL (sau RPR)giTPHA
REZULTATE POSIBILE INTERPRETARE
VDRL negativ TPHA negativ Exclude infeclia sau

Debut de boali, se repetl peste 21zile
VDRL pozitiv* TPHA negativ Debut de boald, se repeti peste 21zile
BFP, daci rimAne la fel
VDRL pozitiv*, TPHA pozitiv sifilis confirmat, in evolufie, tratat?
VDRL negativ, TPHA pozitiv sifilis confirmat, tratat?
*
Serurile VDRL pozitive se repeti (semi)cantitativ
. Urmdrire pacienti confirmati, tratament :VDRL (semi)cantitativ ; se continui pdni titrul

scade cel putin de 4x (doui ditulii, ex. 1i16 -+1141
. urmirire gravide pentru prevenirea gi controlul sifilisului congenital:
Doui testiri obligatorii pentru gravide: una la prima viziti antenatali a doua in
9i
trimestrul lll
Daci nu a fost posibil, obliqatoriu la internare gravida gi copilul la nagtere.
Datele asupra prevalenlei sifilisului la femeile gravide pot fi considerate ca o

aproximafie asupra prevalentei sifilisului in populafia generali
(WH0/CDS/CSR/lSR/99.2, Anexa Aso.sz)

Curs PHARE 14-24 iunie 20A4
"Diagnosticul microbiologic in supravegherea lTS"
13
Toli pozitivii serologic au lgG fala de 6 polipeptide antigenice
treponemice majore (MAP):
Ef 45, 33, 30, 1 5, 42, 16,5
X2, latent recent 6 MAP + alte 16 polipeptide
E latent tardiv 6 MAP + alte 4-5 polipeptide
in toate stadiile apare gi P37 - polipeptidul filamentelor axiale

PENTRU h4ICROBIOLOGIE SI I[/UNOLOGIE'CANTACUZINO'
t4
DIAGNOSTICUL SIFILISULUI LA GRAVIDE
' 9e
gtie cd infec{ia poate trece de la mamd la
(considerat in principiu necontagios),
fit in stadiile :primar, secundar gi latent
. Teoretic nu pune probleme : dacd nu existd in antecedente sau dacd nu a fost tratatd
corespunzdtor, depistarea/confirmarea se face la prima viziti antenatal6 sau la inceputul
trimestrului trei, prin VDRL fiPHA gi se hateazi corespunzdtor.
. O mamd perfect sdndtoasi poate prezenta BFP clasic; VDRL pozitiv repetat cu TPHA
persistent negativ, deci neconfirmat.
. La gravidele cu sifilis in antecedente, tratat, titrul are tendinia sd creasci nespecific dar <
4x nu este semnificativ pentru recddere sau reinfeclie.
. Lipsa urmdririi atente, corecte, a gravidelor, duce insd la aparilia unor numeroase cazuri de
sifilis congenital gi ceeace este maigrav la intdzierea tratdrii acestor cazuri-+ ganse mai
mici de rezolvare rapidd
in cazurile cu serologie confirmati este obligatoriu si se faci testarea in paralel a mamei

gi a copilului la nagtere + testare HIV
Datele asupra prevalentei sifilisului la femeile gravide pot fi considerate ca

o
aproximatie asupra prevalenfei sifilisului in populafia generali

Curs pHARE 14-24 iunie 2004
Document pentru uz didaclic
15
X congenital
- lnfeclia hematogend a fitului via placenta -+ direct X secundar
- Transmisia
- in primele 10 siptdmini de gestalie

- frecvenla transmisiei cregte cu cAt infecfia gravidei este
mai recenti (nr. Treponemelor circulante este mai mare)
*
in I an de infeclie -+ transmisie 80-90%
*
dupi 2 ani -+ transmisia scade rapid
- Z rz gravidi netratatd -+ 25-30% moarte intrauterind
25-30% moarte dupi nagtere
dintre supravieluitorii infectali 4A% -+X simptomatic
Patogenezi
- Unele defecte la nagtere rezulti din interferenla Treponeme-
producfia de mucopolizaharide (mpz), foade activi in perioada
fetali
- multiplicarea perivasculard suslinuti -+ colabare (tromboza)
-) necrozd - ulceratii, reflectd tropismul T, pentru mpz (acid
hialuronic)
Acid hialuronic: [N-acetil glucosamind - acid glucuronic]n
M: 200-500 000
substan[a fundamentali a lesutului conjunctiv
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSN4ISIBILE

PINTRU h,4ICROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE'CANTACUZINO'
t6
X congenital clinic - doud stadii evolutive
Diferentele dintre stadiile I gi ll -+ reflectd stadiul infecfiei gravidei gi
fitului
STADIUL RECENT - primii 2 ani - leziuni de Iz
- moade in cAteva zile
- prematuritate (greutate redusd)
- dermatologic: * pemfigus sifilitic palmo-plantar (lichid cu T.)

n
macule-papule periorificiale
- ORL: riniti mucopurulent5 - sanghinolenti, laringitd
- hepatomegalie
- leziuni osteo-afticulare 4A%
- SNC: meningiti
- Ochi: corioretinitd
- SAnge: * anemie (20T0)

*
trombocitopenie, limfocitozi
*
macroglobulinemie
- Renal: sindrom nefrotic
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSN4ISIBILE

Curs PHARE 't4-?4 iunie 2004
T7
STADIUL TARDIV
- keratitd interstiliald
- leziuni osteo-articulare (tibia)
- SNC: * neurosifilis (20%), LCR modificat

*
crize epileptiforme (dupi meningitd in primul an)
* paralizii nervi periferici
* parenchim: tabes dorsalis (reflexe oculare, osteo-
tendinoase)
* paralizie general5
- ORL: ureche medie + internd (surditate, echilibru)
- dermatologic: gome
- Sdnge: hemoglobinurie paroxistici la frig
STIGMATE - cicatrici, deformiri ale leziunilor din:
Stadiul I - nas in ga
- palat arcuit, subdezvoltare maxilard
- dinli Hutchinson
- ragade, unghii subliri
- corioretiniti cicatriciald
Stadiul ll - leziuni corneene

- leziuni osoase (de la osteo-periostita)
- atrofie opticS - iridoplegie
- surditate
D|AGNosrcuL MrcRoBroLocrc rlfJt,li;/'ffi[l[EA BoLrLoR TRANSMTSTBTLF

PENTRU t\,llCROBlOLOGlE SI ll/UN0L0GlE'CANTACUZINO"
"Diasnosticurrnicrori?:fl|ili:ir,j:H:herea rTS"
t8
Diagnostic laborator E congenital
Dificil la nou niscufii asimptomatici
Neinfectat sau infectat -+ lgG specifice materne
(transplacentar)
Neinfectat:
Titru seric < mamd sau in scidere -+ sugereazbtransfer pasiv
VDRL -+ negativ in 3 luni
TPHA -+ negativ in 6-12 luni

Testare continud 6 luni - in 6 luni lgG materne dispar
lnfectat:
Titru seric > mami sau in cre$tere
stadiul I lgG + lgM specifice - interpretarea este dificili
lgM specifice au mare valoare diagnostica dar, teoretic se poate
produce supresia sintezei de lgM datorita catititii mari de lgG
transferate placentar
Teste pentru lgM: 195 lgM-FTA-Abs
CAPTIA Syphilis M
Stadiul ll tratat sau netratat - serologie ondulatorie
VDRL, TPHA, FTA-Abs - titruri mici

Curs PHARE 1 4 -24 iunie 2004
PENIRU MICROBIOLOG}E SI IMUNOLOGIE "CANTACUZINO'
'Diag nosticul microbiologic in supravegherea ITS'
I9
DTAGNOSTTCUL $t URMARTREA StFtLtSULUt CONGENTTAL

sE BAzEAZA pr coMBtNATlt ixrRe:
IDENTIFIcAREA SIFILISULUI LA unuA
APREcIEREA TRATAMENTULUI MAMEI- cAuo exlsrn
PREZENA DATELOR SUGESTIVE ALE EXAMENULUI FIZIC,

RADTOLOGTC $t DE LABORATOR ALE NOULUT titASCUr
COMPARAREA REZULTATELOR CANTITATIVE VDRL ALE

coPrLULUr $rALE MAME|
o Toti nou nasculii mamelor cu serologie pozitivd (majoritatea sunt asimptomatici la nagtere) se
testeazd in prima luni de la nagtere : VDRL cantitativ, in ser, in paralel cu mama
. SAngele de cordon ombilical nu este indicat pentru aceastd testare deoarece, dacd este
contaminat cu sAngele mamei, poate da rezultate fals pozitive
. Se apreciazi ci titrul > 4x fald de al mamei = sifilis conqenital -+ daci este posibil,
microscopia cu fond intunecat poate confirma direct prin evidenfierea L pallidum in sectrelii
nazale, faringiene, etc,
. Dacd noul ndscut este stmpfo matic: anomalii sugestive la examenul fizic, titrul serologic mai
mare ca al mamei, eventual microscopie pozitivd, indiferent de istoricul mamei - infectie tratament
SE RECOMANDA:
o Analiza LCR: VDRL, numdr celule, nivel proteine

Hemogramd completi
Examen radiologic, oftalmologic, func{ii hepatice, etc,
in cazul in care exista anomalii ale LCR impreund cu oricare din celelalte se trateazd ca
neurosifilis
in sifilisul congenital este utild eviden{ierea lgM specifice, dar testele

disponibile dau un procent destul de ridicat de rezultate fals pozitive
(10%) sau negative (35%).
URMARIREA SEROLOGICA:
Se face la 1-2lunipAnd cAnd testele netreponemice devin negative sau titrulscade de 4x: la copil
neinfectat sau tratat corect sunt negative la 6 luni, rdspunsul la tratament fiind mai lent la copii care nu
au fost tratati in perioada neonatal6.
Dacd titrul rdmAne gi/sau in cregtere la6-12luni, se examineazi LCR gise retrateazd mai agresiv
La cazurile cu anomaliiale LCR, acesta se reexamineazdla6luni pAna redevine normal;in cazul
persisten{ei VDRL pozitiv/ indicii LCR rdmAn anormali, se retrateazd pentru neurosifilis,
ln cazul neurosifilisului congenital, urmdrirea serologicd se poate face in paralel gi cu TPHA. Daca
rdmAne pozitiv dupa 18 luuni confirmd diagnosticul.
INS'!-ITUTUL NATIONAL DE CERCETARE DEZVOLTARE
PENTRU r\'llCROBIOLOGlE Sl IMUN0L0GIE "CANTACUZINO'
'Diag nosticul microbiologic in supravegherea ITS'
20
DIAGNOSTICUL SEROLOGIC AL SIFILISULUI

iru cnzuntlE Htv poztnv
SIFILISUL, ca gi celelalte lTS, favorizeazdtransmiterea HlV,

in consecinld este deosebit de important sd ne convingem gi si convingem pacienlii cu sifilis conflrmat
sd respecte recomandarea pentru testarea HIV gi invers ca pacienfii HIV pozitiv sd se asigure de
absenla sau sd trateze corespunzitor sifilisul
PARADOXAL din toate punctele de vedere:

. in ciuda imunodepresieicaracteristice, la majoritatea pacientilor, diagnosticulserologic pe
schema VDRLiTPHA dd rezultate corecte
. Evolulia infecfiei netratate primare, secundare nu este agravatd
. S-a descris insd seroreversie destul de rapida a TPHA, dupa tratament, acompaniata de
pantd mai lentd a VDRL
. S-a descris in caz de neurosifilis, dupd tratament, seroconversia VDRL
. S-au descris rezultate fals pozitive (datorate hipergamaglobulinemiei nespecifice) mai
frecvente decAt fals negative (numar scdzut de CD+).
in ciuda acestor aspecte neagtepiate, este foarte important ci se pot totugi depista gi urmdri cu
grlji infecliile duble, mai ales c6nd se pune problema stabilirii exacte a etiologiei modificarilor nervoase
care apar la pacienlii HIV pozitiv
DIAGNOSTICUL MICROBIOTOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBILE

PENTRU MICROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE "CANTACUZINO"
f
21
Reactii Biologic Fals Pozitive (BFP)
. Se definesc ca reac{ii netreponemice VDRL / RPR repetat pozitive 9i reaclii treponemice

TPHA persistent negative care apar la persoane fdra sifilis dar cu alte alterdri func[ionale la
nivel celular, de lesut sau organ.
. Responsabili pentru reactivitatea acestor seruri in VDRL sunt anticorpii lipoidali prezen{i in
proba respectivS, anticorpi aparu{i ca rdspuns al organismului la o agresiune non self sau
chiar a selfului.
o Titrurile sunt in general mici, uzual < 1/8 dar, cam in 10% din totalul cazurilor pot dep5gi
acest titru.
. in lipsa testului de confirmare, persoane cu reactivitate BFP sunt tratate de sifilis.
. in funclie de durata acestei seroreactivitefl BFP, apare mai frecvent la femei, se descriu:
. BFP acute, dureazd 2- 6 luni, afecteazd persoane pAnd la 30 ani;
BFP cronice care depdgesc aceastd perioadi 9i pot ramAne pozitive ani, cu mici fluctua{ii,
afecteazd persoane mai vArstnice.
o ex. BFP acute : sarcina, infecliivirale (mononucleozd, varicel5, pneumonii, hepatitd),
vaccindri;
. ex. BFP cronice: "inaintarea in vArstd", consum de droguri injectabile, boli autoimune,
colagenovasculare, boli asociate cu anomalii ale imunoglobulinelor (inclusiv HIV), procese
maligne avansate, infectii cronice cu bacterii gi protozoare intracelulare (leprd,
m icoplasmoze, toxoplas moz6, malarie, leish man iozd)
" La persoanele cu aceste afecliuni specificitatea testelor netreponemice scade cu aproximativ

25%
. in principiu ar trebui sb existe o ra{ionala dupd care sd se facd managementul acestor
persoane care de fapt sunt suferinde gi care ar trebui ajutate sd se adreseze mai exact.
. in descrierea fenomenului de zoni se spune: reacfie slab pozitivd sau

negativd cu aspect grunjos ca serurile negative "tari" (rough)
Acest tip de seruri negative, in urma contactului cu antigenul
cardiolipinic capdta un aspect grunjos omogen, fbrd clarificarea lichidului,
asemdndtor cu fenomenul de zond, pot fi interpretate ca dubioase,

Curs PHARE 1 4-24 iunie 2A04
PENTRU MICROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE'CANTACUZINO'
22
B. LISTA DE PROCEDURI
7. Microscopie pe fond intunecat
8. VDRL
9. RPR
10. TPHA
11. FTA-Abs
12. ELISA Syphilis M Capture
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC iN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSL4ISIBILE

C us PHARE 1 4 -24 iunie 2004
23
Un diagnostic de sifilis se confirma folosind microscopia in camp intunecat pentru a demonstra prezenta
Treponemeipallidum in materialuldin leziunile suspecte sau din ganglioniilimfaticiregionali (Creighton,
1 ee0).
Un rezultat pozitiv in microscopia cu fond intunecat semnifica un diagnostic de sifilis primar, secundar
sau congenital recent aproape cu siguranta. ln sifilisul primar, examinarea la microscopulcu camp
intunecat poate furniza mijlocul prin care se identifica agentul etiologic al sifilisului si diagnosticul bolii
inainte ca aparitia anticorpilor fata de Treponema pallidum sa poata fi detectata.
Pentru evidentierea prezentei Treponemei pallidum in materialul lezional este nevoie de echipament
adecvat si de personal cu experimenta,
Este posibil sa fie nevoie de examinarea mai multor lame (de regula se pregatesc trei lame),
Principiile microscopiei in camp intunecat (termenul vechi, iesit din uz, este ultramicroscopie).
Microscopul cu lumina directa (standard) poate fi echipat pentru examinare in camp intunecat prin
inlocuirea condesatorului pentru lumina directa cu un condensator cu camp intunecat (cardioid).
lluminarea pentru camp intunecat se obtine cand razele de lumina lovesc obiectul din camp oblic, astfel
ca in obiectivul microscopului nu intra raze directe ci numai razele reflectate de catre obiect. Deaceea
obiectul apare stralucitor pe un fond intunecat, de unde termenul de camp intunecat, Cand un fluid
continand particule, inclusiv bacterii sau treponeme, este pus pe o lama, razele oblice sunt reflectate de
pe suprafete, ascendent si aceste particule apar iluminate stralucitor pe un fond negru,
Microscopia cu fond intunecat se aplica microorganismelor viabile, transparente, invizibile in
microscopia obisnuita
Recoltarea de probe
Leziuni, in general
a, Se indeparieaza orice crusta care acopera leziunea
b. Exudatul leziunilor secundare, daca exista, se indeparteazacu un tampon de tifon
c. Daca este necesar se comprimabaza leziunii sau se aplica o cupa de succtiune pentru a favoriza
acumularea lichidului interstitial pe suprafata ulceratiei,
d. Se aplica o lama de sticla (grosime maxima 1mm)pe leziunea umeda, sau se foloseste o ansa
bacteriologica pentru a transfera fluidul din leziune pe lama de sticla. Din fiecare leziune se
recolteaza cate trei specimene,
e. Se aplica o lamela de sticla peste specimen si se apasa pentru a se indeparta bulele de aer,
f. Lama se examineaza imediat,
g. Pentru a se evita uscarea lamelor aditionale, se pastreaza intr-o camera umeda (de ex. o cutie
Petri de dimensiuni potrivite, cu o hartie de filtru umezita).
Preparatul nu trebuie sa contina o cantitate prea mare de fluid dar nici nu trebuie sa fie prea putin ca
se se usuce inainte de o examinare corecta.
La femeie pentru leziuni cervicale. vaginale se procedeazalalel, utilizandu-se pentru vizualizarea

leziunii un specul (bivalva), Este foarte importania etapa de curatire a leziunii inainte de recoltare,
pentru indepartarea resturilor tisulare, florei locale (inclusiv Treponema vaginalis)
Pentru leziunile pielii, chiar pe cale de vindecare, se precedeaza astfel :

PENTRU MICROBIOLOGIE SI I[,IUNOLOGiE "CANTACUZINO'
24
se face o incizie liniara superficiala cu varful unui ac de seringa steril si se recolteaza exudatul
seros dupa indepartarea celuisanguinolent sau se injecteaza labazaleziunii 1-2 picaturide SF
steril, care apoi se aspira si se depune pe lama,
Leziunile mucoasei bucale: se insista asupra curatirii leziunii pentru indepartarea florei locale,
inclusiv Treponema denticola si alte eventuale spirochete bucale sau faringiene.
':.' Daca examinarea microscopica a exudatului lezionaleste negativa se poate recomanda
' examinarea produsului de punctie a ganglionilor sateliti superficiali.
Ajustarea microscopului trebuie sa fie facuta INAINTE de colectarea probei de la pacient pentru
examinare,
Procedura de reqlare a microscopului
1. Se pune o lama goala pe platina microscopului si se ridica condensatorul de camp intunecat pana
la inaltimea maxima. Capatul condensatorului ar trebui sa fie putin sub nivelul platinei dar in
apropierea lamei fara insa sa o impinga,
2. Se deschide transformatorul in asa fel incat sa furnizeze maximum de intensitate
luminoasa.
3. Se coboara usor condensatorul si se pune pe suprafata lui ulei de imersie.
4, Se pune lama cu proba pe platina centrandu-se deasupra condensatorului.
5, Se ridica cu grija condensatorul pana cand exista contact complet intre suprafata
condensatorului si suprafata inferioara a lamei.
6. Deasupra probei se centreaza un obiectiv cu marire mica.
7. Se focalizeaza proba cu macroviza
B. Se centreaza lumina in camp
9. Se centreaza condensatorul ridicand sau coborand condensatorul pana se obtine cel mai mic
diametrul al arieicirculare de lumina intensa.
10. Se plaseaza deasupra probei un obiectiv mai mare (40x) uscat.
11. Se focalizeaza imaginea cu microviza
12' Daca se obtine o imagine satisfacatoare, se pune o picatura mica de ulei de imersie peste
lamela
13' Se aduce deasupra probei obiectivul cu imersie in contact cu uleiul de imersie de pe lamela.
Daca obiectivulcu imersie are diafragma iris, se inchide diafragma pentru a reduce apertura
numerica sub aceea a condensatorului cu camp intunecat
14' Se focalizeaza imaginea cu microviza. lntensitatea luminoasa a sursei de lumina poate fi
crescuta sau scazuta pentru a se obtine cel mai bun contrast.
1. se pune lama de examinat (proba pacientului) pe platina microscopului reglat,

(Este posibil sa fie nevoie de mici ajustaride reglare).
2' Se examineaza metodic intreaga proba cu obiectivul uscat cautandu-se organisme spiralate cu
caracteristici morfologice si motilitate caracteristice Treponemei pallidum :
- microorganism spiralat (tirbuson) avand, in functie de lungime, 8-14 spire, regulate,
stranse,
adinci si rigide
- lungime : 6-14 p cu o medie de 10p (ceva mai mare decat diametrul
unui eritrocit)
- foarte subtire : diametrul aproximativ de 0,25-0,3Sp
- in timpul miscarilor active spirele nu se deformeaza
D'AGNosTrcuL MrcRoBrolocrilIfJitrxffil?:EA BoLrLoR TRANSMTsTBTLE

'Diagnosticul rnicrobiologic in supravegherea lTS,
25
- mobilitatea : nu se deplaseaza rapid in campul microscopic, poate fi imobila dar are miscari de
translatie lente (inainte-inapoi); rotatie lenta in jurul axului longitudinal (tirbuson) cu sau fara
inaintare, cu flexie usoara sau ondulatie de la un capat la celalalt; flexie mediana cu revenire
brusca (ca un resort elastic).
o Orice organism cu spirale grosolane care manifesta mare flexibilitate si miscari rapide dintr-un
loc in altul al campului microscopic nu este Tieponema pallidum
. Un criteriu practic pentru diferentierea T. pallidum de alte organisme spiralate nespecifice care
se pot gasi in cavitatea bucala sau in vagin este acela ca organismele relativ uniforme ca
marime, forma si motilitate vor fi de regula T. pallidum,
Pe de alta parte este posibil ca in preparat sa apara alte tipuride bacterii spiralate de forme, marimi
si motilitati variabile; in unele leziuni pot coexista flora amestecata si T.pallidum.
Este de preferat sa se evite examinarea lezunilor orale dat fiind morfologia asemanatoare a
T.pallidum si T. denticola si sa se examineze cu atentie speciala leziunile vaginale
o lnainte de a da un rezultat negativ, proba trebuie examinata sistematic, in intregime,
0 schema tipica sistematica pentru examinarea adecvata a probeieste de a incepe din coltul
superior stang al lamelei, traversare spre latura dreapta a lamelei, coborare usoara si traversare
spre stanga; se continua in aceeasi maniera pana cand se acopera toata lamela.
3. Daca se observa un organism suspect, se centreaza in camp pentru examinarea

ulterioara cu obiectivul cu imersie
4. Fiecare din cele 3 specimene colectate trebuie sa se examineze minimum 10 min. inainte de a se
da un rezultat negativ. Lamele aditionale se pun intr-o camera umeda pana la examinare.
5. Trebuie sa se ia masuri de precautie : inclusiv manusi pentru cel care examineaza, containere de
bioprotectie, potrivite pentru aruncarea lamelor,
Raportare Rezultate
Camp intunecat pozitiv 0rganisme care au caracteristicile morfologice si de
motilitate ale Treponemei pallidum
Camp intunecat negativ /neconcludent Nu s-au gasit organisme treponemice sau spiralate; nu
s-au gasit organisme care au caracteristicile
morfolooice si de motilitate ale Treoonemei pallidum
Camp intunecat nesatisfacator Nu s-a gasit Treponema pallidum dar proba a avut prea
multe elemente refractile (hematii, leucocite, bule de
aer, fraqmente de tesut) sau lama era uscata.
0rice leziune genitala trebuie considerata sifilitica pana la proba contrarie. Leziunile extragenitale
nedureroase sau putin dureroase, induratiile si adenopatia regionala trebuie considerate ca probabil
sifilitice. lmposibilitatea de a sasi treponemele nu exclude diagnosticul de sifilis,
Rezultatele neqative inseamna ca :
1. Numarul organismelor era insuficient pentru detectie

2, Pacientul a primit tratament antitreponemic local sau sistemic
3. Leziunea este veche, in curs de rezolutie sau disparitie naturala,
DIAGNOSTICUL MICR0BIOL0GIC lN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSN,IISIBlLE

INSTITIJTUL NATIONAL DE CERCETARE DEZVOLTARE
PENTRU TilICROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE "CANTACUZINO"
26
4. Leziunea este de sifilis tardiv

5. Leziunea nu este sifilitica,
Surse de eroare.
' Eroride preqatire a preparatului microscopic,

a. Daca proba contine prea multe hematii si leucocite, bule de aer sau fragmente de tesut, aceste
elemente refractile pot masca prezenta Treponemei pallidum
b, Daca lamele de microscop sunt maigroase de 1mm, sau daca lamele sau lamelele sunt murdare
sau zgariate, este greu sa se faca o examinare reusita.
c. Daca in proba este o cantitate de fluid excesiva sau insuficienta, examinarea va fi dificila.
Erori de microscopie
a. Daca nu se pune ulei de imersie intre condensator si lama, lumina nu va ajunge la proba
b. Daca condensatorul de camp intunecat nu este bine centrat sau focalizat, iluminarea nu va fi
optima
c, Daca ajunge ulei pe obiectivele uscate, imaginea obtinuta va fi tulbure
Erori de interpretare
a. Daca examinatorul nu este familiarizat cu caracteristicile morfologice si de motiliiate ale

Treponemei pallidum poate sa dea un rezultat fals pozitiv sau fals negativ
b. Daca se confunda organisme sau obiecte spiralate nespecifice, fragmente de tesut, fibre textile
sau alte obiecte exogene cu treponemele, se poate ajunge la un rezultat fals pozitiv
c. Daca se observa miscari ocazionale, eratice, ale Treponemei pallidum se poate ca sa fi trecut
prea mult timp intre pregatirea preparatului si examinarea lui,

PENTRU N4ICROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE'CANTACUZINO"
"Diagnosticul mioobiologic in supravegherea lTS"
27
Microreactia VDRL
Principiul testului
Antigenul cardiolipinic VDRL (Venereal Disease Research Laboratory, Atlanta,USA) este o solutie
etanolica de cardiolipina, lecitina sicolesterol intr-o cantitate optima pentru a avea specificitate si
sensibilitate maxima cu serul si LCR provenit de la bolnaviide sifilis,
Prin suspensionare intr-o solutie salina tamponata, colesterolul precipita sub forma de microcristale,
carc absorb pe suprafata lecitina si haptena cardiolipinica (lipozomi). Anticorpii antiocardiolipinici din
serul/LCR bolnavilor de sifilis in contact cu suspensia antigenica produc microaglutinarea cristalelor de
colesterol.
Materiale
- placi de pastic cu godeuri (diameru 14mm)

- seringa 1ml sau flacon de plastic cu ac pentru repartitia antigenului
- ace de seringa calibrate : 1 picatura 1i60ml, pentru probele de ser
1 picatura 1/100m1, pentru probele de LCR
- flacoane sticla 30ml cu dop rodat sifundul interior plat
- pipete gradate de sticla 1ml si 5ml
- lupa
- agitator rotativ cu 180 rotatii/min
- centrifuga
- ceas laborator
- hartie de filtru
- vas cu solutie dezinfectanta pentru materialele utilizate
Reactivi
1, Diluent pentru antigen : solutie salina formolata si tamponata, pH = 6.0 + 0.1

2. Antigen tip VDRL
Prepararea solutiei antigenice de lucru
Temperatura laboratorului, a diluentului si a antigenului : intre 23-290 C.
a. ln flaconul de 30ml cu dop rodat se pipeteaza direct la fund 0,4mldiluent.
Prin rotirea usoara a flaconului se asigura raspandirea uniforma a diluentului.
b. Se adauga 0.5m1 antigen, picatura cu picatura, direct in diluent (cu varful pipetei in treimea
superioara a flaconului), in timp ce flaconul se roteste continuu dar usor pe o suprafata plana.
Durata operatiei este de aproximativ 6 secunde (18-20 rotatii)
c. Se sufla ultima picatura de antigen sise continua rotirea flaconuluiinca 10 sec.
d. Se adauga 4,1m1 diluent dupa care se astupa flaconul cu dopul rodat si se agita prin rasturnare de
aproximativ 30 x, in 10 sec.
e. Suspensia antigenica este gata de utilizare pentru tot cursul zilei. Ori de cate ori este folosita,
suspensia se amesteca usor numai prin rotirea flaconului,
3, Solutie salina 0.9% pentru diluarea serurilor in reactia semicantitativa si pentru martorul antigen.
4. Solutie salina 10% pentru testarea LCR
DIAGNOSTICUL N4ICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBILE

iNSTII UTUL NATIONAL DE CERCETARE DEZVOLTARE
PENTRU MICROBIOLOGIE SI IMUNOTOGiE'CANTACUZINO'
28
Prelucrarea probelor (seruri, LCR)

'1. lnainte de testare se contoleaza aspectul serurilor si daca este nevoie se clarifica prin centrifugare.
2. Serurile de testat, serurile de control pozitiv, slab pozitiv si negativ se inactiveaza

30min. la +560C.
3, Dupa inactivare serurile se reexamineaza si se centrifugheza din nou daca se constata aparitia unor
particule in suspensie.
4. Daca au trecut mai mult de 4 ore de la momentul inactivarii, serurile se reinactiveazala 56oC timp de
10min,
5. Serurile care au maifost lucrate se inactiveaza la 56oC numai 10min.
7, Serurile se testeaza cand au ajuns la temperatura camerei.
8. LCR nu se inactiveaza.
9. Nu se testeaza seruri hemolizate, contaminate bacterian sau LCR amestecat cu sange.
Procedura microreactiei calitative
1. Se recomanda ca temperatura de lucru a camerei sa fie de 23-290C, variatii sub sau

peste aceste limite influenteaza in mod evident reactivitatea testului,
2, Testul se executa pe ser nediluat (semicantitativ se executa pe dilutii binare)
3, Se numeroteaza godeurile placii si se pregateste schema de lucru in care se includ obligatoriu si

martorii : seruri de controlde reactivitati diferite si martorul de antigen
4. ln fiecare godeu se pun cate 0.05m1 ser : pentru martorul antigen se pun 0.05m1 solutie salina 0.9%.
5. Se agita usorflaconulcu suspensie antigenica, prin rotire; se umple seringa de 1ml

prevazuta cu acul calibrat si flaconul se astupa cu dopul rodat.
6. Se detaseaza pistonul seringii si utilizandu-se ca o pipeta, dupa ce se lasa primele

doua-trei picaturi sa curga in flaconul cu antigen, se depune cate o picatura
de suspensie antigenica (1/60m1) in fiecare godeu.
7, Se acopera placa cu capacul sise agita pe agitatorul rotativ (180 turatii/min.)timp de

4min. ln lipsa agitatorului operatia se poate executa si manual, cu acelas numar de
rotatii pe minut, diametrul de rotatie fiind 4-5cm, pe o suprafata plana, ln acest
caz, placa va fi protejata de zgarieturi, fixandu-se pe fundul ei o hartie.
B, Rezultatul se citeste imediat cu ajutorul unei lupe, prin transiluminare pe fond negru,
Deoarece dupa cateva minute poate apare un grad de aglutinare si la serurile
negative, se recomanda sa se executa maximum 20 reactii odata.
Citirea rezultatelor incepe obligatoriu cu martorii negativ, slab pozitiv, pozitiv, si
martorul de antigen (solutie salina +antigen).
Aprecierea rezu ltatelor
1, Rezultat negativ: lichid slab turbid, fara flocoane (aspect asemanator martorului negativ si martorului
antigen),
2. Rezultat slab pozitiv (1+; = llotoune mici in lichid slab turbid
3. Rezultat pozitiv mediu (2+1 = flocoane evidente in lichid partial clar
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOI-ILOR TRANSMISIBILE
INSTITUTUL NATIONAL DE CERCETARE DEZVOTTARE
29
4. Rezultat intens pozitiv (3 sau 4+) = flocoane mari in lichid clarificat.

Reactiile slab pozitive (sau dubioase) vor fi repetate.
Daca se banuieste posibilitatea unui fenomen de prozona (inhibitia totala sau partiala a aglutinarii prin
exces de anticorpi), testarea se va repeta pe dilutii de ser.
Tehnica microreactiei VDRL pentru LCR
Microreactia VDRL pentru LCR comporta urmatoarele modificarifata de tehnica pentru ser :
'l , Antigenul, preparat ca pentru ser, se va dilua 112
cu solutie salina 10% : o parte suspensie antigenica
+ o parte solutie salina 10%, Se roteste usor flaconul pentru omogenizare si se lasa Smin in repaos pe
masa.
2. Suspensia antigenica este utilizabila maximum 2 ore
3, Se repartizeaza cu aculcalibrat astfelca o picatura = 1/100m1
4, Agitarea placiise face la 1€0 rotatii/min, timp de 8min.
lnterpretarea rezu ltatelor
1. Pentru pune diagnosticul de sifilis, clinicienii combina testul VDRL cu rezultatul altor teste
serologice (teste treponemice), ale examinarii in camp intunecat, semne clinice si simptome si
factorii de risc.
Fara alt suport pentru diagnosticul de sifilis, un test VDRL reactiv este de obicei nelegat de
infectia cu T,pallidum, Valoarea predictiva a unui VDRL reactiv creste, cand se combina cu un
test treponemic reactiv ( FTA-Abs sau TPHA),
2. Un test VDRL reactiv singular poate sugera :
- o infectie in antecedente sau prezenta, cu T.pallidum',

- o reactie fals pozitiva (BFP).
BFP pot aparea datorita unor'erori de laborator ca si datorita unor anticorpi serici
antifosfolipidici fara legatura cu infectia sifilitica.
Erorile tehnice pot fi detectate pdn repetarea pe alta proba de ser cu rezultat nereactiv,
BFP datorate unor infectii netreponemice sau altor stari patologice se detecteaza in
conditiile obtinerii unui rezultat negativ la un test treponemic.
3. Un test VDRL nereactiv fara evidenta clinica de sifilis poate sugera :
- absenta infectiei
- o infectie corect tratata in antecedente.
Un test VDRL nereactiv cu manifestari clinice sugestive poate sa apara :
- in sifilisul primar recent;
- in sifilisul secundar ca rezultat al fenomenuluide prozona (vezi limitele testului);
- in unele cazuri de sifilis tardiv.
Un test VDRL negativ nu elimina posibilitatea unei infectii cu sifilis in perioada de incubatie sau
a unui sifilis latent (care se poate evidentia printr-un rezultat pozitiv la TPHA)
4. Cand se executa testul VDRL (semi)cantitativ la pacientii cu sifilis :
- cresterea de patru ori a titrului (doua dilutii) la repetarea testului pe o noua proba poate sugera
evolutia infectiei active, o reinfectie sau tratament ineficient;
- scaderea de patru ori a titrului (doua dilutii) in sifilisul recent indica de obicei un tratament
adecvat pentru sifilis.
DIAGNOSTICUL MICROtsIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBILE

'Diag nosticul microbiologic in supravegherea lTS"
30
Po;sibilitafi de eroare in executia testutui VDRL
Factorul implicat Sensulerorii

A. Reactivi
- antigen : evaporat
hidratat
expus la lumina
- suspensia antigenica :
Pastrata la +40 C +
- diluent : alcalinizat +
acidifiat
precipitat +
- ser: neclarificat +
neinactivat
lipemic +
hemolizat
contaminare bacteriana +l-
B, Tehnica
- diluarea incorecta a antigenului +l-
- decalibrarea acului de +l-
repartizare
- agitarea placii : prea rapida +
prea lenta
- lipsa martori +l-
- citire dupa mai mult de 4 minute +
de la terminarea agitarii
C. Altifactori
- temperatura mediului si a
reactivilor:
mai mica de 23oC
mai mare de 29oC +
- placa uzata (zgariata, opacifiata) +
- urme de detergent de la spalare
DIAGNOSTICUL MiCROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBILE

PENTRU MICROBIOLOGIE SI IMUNOTOGIE'CANTACUZINO'
31
Limitele testului
1. Poate sa apara ocazional reactie de prozona, Fenomenul de prozona (inhibitia completa sau
partiala a reactivitatii), apare cu serul nediluat, maximum de reactivitate obtinandu-se numai cu
serul diluat. Fenomenul de prozona poate fi atat de pronuntat incat in testul calitativ poate sa
apara doar un aspect usor grunjos (rough) la un ser, care diluat are o reactivitate puternica.
Toate probele de ser, care la testul VDRL calitativ dau o reactie cat de cat grunjoasa, trebuie
retestate prin procedura (semi)cantitativa,
2, Testul VDRL poate fi pozitiv la persoane din tari in care sunt endemice sifilisul nevenerian,
pinta, pian-ul
3, Reactiile biologic fals (BFP) pot sa apara ocazional la persoane care abuzeaza de
medicamente sau folosesc droguri; in cazul unor afectiuni ca lupus eritematos, mononucleoza,
lepra, malarie, viroze, hepatita virala, pneumonii atipice, tuberculoza, bruceloza, tifos sau la
persoane care au fost vaccinate recent. Sunt destul de frecvente si in sarcina.
4, Titrul testelor netreponemice la persoanele care au fost tratate pentru stadiul latent sau tardiv al
sifilisului sau care s-au reinfectat nu scad tot atat de repede ca la cele tratate pentru stadiile
recente ale unei infectii primare. Aceste persoane pot ramane "serofast", pastrand un titru scazut
de reactivitate pentru toata viata.
DIAGNOSTICUL I/ICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBILE

Curs PHARE 14'24 iunie 2004
PENTRU h4ICROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE'CANTACUZINO"
Documenl pentru uz didactic
32
Testul RPR (Rapid Plasma Reagin) card
Principiile testului
Testul (RPR) executat pe carduri cu cercuride 18mm este un test netreponemic de floculare,
macroscopic, folosit pentru depistarea sifilisului (Creighton,1990). Antigenuleste preparat dintr-o
suspensie antigenica de VDRL modificata, continand :
- choline chloride, pentru a elimina nevoia de inactivare prin caldura,

- EDTA pentru a creste stabilitatea suspensiei si
- particule fine de carbune ca agent de vizualizare,
Pentru test, antigenul RPR este amestecat pe un card din material plastic cu ser (inactivat sau nu)
sau plasma (neinactivata). Ca si VDRL, testul RPR detecteaza'anticorpi anti material lipoidal
eliberat de celulele distruse ale gazdei si posibil cardiolipina eliberata de treponeme.
Daca sunt prezenti anticorpii, ei se combina cu particulele lipidice din antigen, producand aglutinarea
lor. Particulele de carbune coaglutineaza cu anticorpii si apar ca granule negre pe fondul alb al
cardului. Daca nu sunt prezenti anticorpi, mixtura reactantilor arata gri uniform,
O reactie RPR pozitiva trebuie confirmata obliqatoriu cu un test treponemic pentru stabilirea
diaqnosticului de sifilis
RPR reditest (biokit,sa)
Reactivii (alsi materialele (b) din kit

ar. Suspensia antiqenica :
- 0.003% cardiolipina
- 0.020-0.-22% lecitina
- 0.09% colesterol
.0,0125M EDTA
- 0.01M NazHPO+
- 0.01MKHzPOq
- 0.01% thiomersal
- 10% choline chloride (w/v)
- 0,01% microparticule de carbune
- Apa distilata ad 100m1
az, Martor pozitiv : preparat din ser imun de iepure cu 0,1% azida de sodiu
b. - flacon pentru repartizarea antigenului
- ac pentru repartizarea antigenului(17p1)
- "pipete" de unica folosinta pentru repartizarea (cap deschis) si intinderea probei (cap inchis)
- carduri de unica folosinta
Pastrarea kitului
- Reactivii din kit raman stabili pana la data expirarii (marcat pe ambalaj si etichete), daca se
pastreaza corespunzator = 2-8oC
- NU se ingheata
- Daca antigenul este expus temperaturilor care depasesc 30oC pot sa apara reactii fals pozitive
DIAGNOSTICLJL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBILE

Cum PHARE 14-24 iunie 2004
"Diagnosticul microbiolog ic in supravegherea ITS'
33
- Dupa transferul in flaconulde repartizare antigenulramane stabil3lunidaca se pastreazala2-

BoC (sau pana la data expirarii)
- ln timpul stocarii antigenul este complet sedimentat; dupa agitare suspensia trebuie sa fie
uniforma
- Cu toate ca reactivii contin prezervanti, se pot totusicontamina; in consecinta trebuie sa se
lucreze cu precautiile necesare,
Materiale necesare, nefurnizate de kit

- agitator rotativ mecanic in plan orizontal (100rpm)
- ceas de semnalizare
- ser fiziologic (0.9% NaCl) pentru tehnica (semi)cantitativa (SF)
- pipete automate - pentru tehnica (semi)cantitativa
- ser normalde om pentru dilutia probelor peste 1/16
Recoltarea probelor
S€I : se foloseste ser proaspat recoltat, obtinut prin centrifugarea sangelui coagulat,
Daca nu se lucreaza in aceeasi zi :
- se ooate oastra maximum 48h la 2-8oC
- se poate ingheta (-200C) pentru o perioada mai lunga
Plasma : se obtine prin centrifugarea sangelui recoltat pe anticoagulant (numai EDTA, citrat de sodiu -
folosirea altor substante necesita testari anterioare),

Probele se pot pastra maximum 24hla2-80C
NU se testeaza probe hemolizate, contaminate sau lipemice
Proceduri de lucru pentru testul RPR reditest
Preqatirea spatiuluide lucru :

1. Se elibereaza locul de obiectele care nu sunt necesare,
2, Se aduce vasul cu dezinfectanUdetergent pentru dispenserele si tipsurile folosite + stative
potrivite,
3. Se verifica functionarea agitatorului si a lampii de citire
Prepararea antiqenului
1. Se agita cu grija flaconul cu antigen pentru resuspendarea particulelor de carbune
(suspensia trebuie sa fie omogena)
2. Se ataseaza acul de repartizare la flaconul corespunzator si se aspira cantitatea de antigen
necesara (aproxim ativ)
3. Se noteaza pe flaconul de repartizare nr, lotului de antigen, data de expirare si data
transferarii din flaconul initial,
Controlul suspensiei antiqenice

1, Este indicat ca in fiecare zi de lucru, sa se controleze antigenul RPR, inainte de testarea
probelor curente, cu martorul pozitiv inclus in kit
2, Controlul se face prin tehnica calitativa
3, ln urma testarii, martorul pozitiv trebuie sa produca o floculare clara.
Daca rezultatul nu este satisfacator, se repeta testul de control si in cazul unui nou rezultat
nesatisfacator, suspensia antigenica se arunca'
.Diagnosticurmicrobi?:il.,]1,:r,r,
j:HlherearrS"
34
Proeedura testului calitativ
1. lnainte de inceperea testarilor, reactivii si probele se aduc la temperatura camerei (23-290C)
2. Cu dispenserul se reparlizeaza o picatura (50p1) din proba de testat intr-un cerc de pe card.
3. Cu capatul astupat si latit al dispenser-ului se intinde picatura pe toata suprafata cercului

(NU kebuie depasita limita cercului).
4. Se arunca dispenser-ul in dezinfectant.
5, Se agita usor flaconul de repartizare cu antigen dupa care, tinandu-l in pozitie verticala se
lasa sa cada cateva picaturi in capaculflaconului (pentru eliminarea aerului din ac).
6, Apoi , se repartizeaza , prin cadere libera cate o picatura de antigen in fiecare cerc peste proba de
testat. NU se amesteca
7. Se recupereazaantigenul din capacul flaconului
B. card-ul se pune pe agitator, se acopera cu capac (atmofera umeda) si se agita

8 min la 100rpm
9. Dupa agitare cardul se roteste si se halanseaza scurt cu mana pentru a reusi diferentierea
rezultatelor minim reactive de cele nonreactive,
10, Citirea se face macroscopic sub o lumina puternica
11. Dupa terminarea lucrului, acul se spala cu apa distilata (se usuca in termostat), se inchid
flacoanele cu reactivi si se pun in frigider (2-80C)
Citirea si interpretarea rezultatelor testului calitativ
Citire nterpretare/ n reqistrare

I I
Prezenta de flocoane (agregate) caracteristice Reactiv (R)/ pozitiv

negre, de carbune, care pot sa fie foarte fine sau
loarte pronuntate,
Suspensia are aspect omogen, de culoare gri sau Nereactiv (N)/ negativ
poate prezenta un aspect usor grunios.
Pentru toate serurile rgactive (agregare), minim reactive sau cu un aspect grunjos ,,rough" se
executa testul cantitativ
Unele probe nereactive pot sa prezinte un aspect usor grunjos care are tendinta sa fie mai pronuntat
spre periferia cercului si omogen in centrul cercului. O rotire scurta si balansarea carduluicu mana
poate sa ajute in diferentierea fata de un tip de reactie minim reactiva.
Procedura testului (semi)cantitativ
1. lnainte de inceperea testarilor reactivii si probele se aduc la temperatura camerei (23-290C)
2. Prepararea dilutiilor de ser/plasma (cf, schema) :

35
Nr. cerc 1 2 3 4 5
SF (ul) 50 50 50 50
Proba (ul) 50 50
Amestc si
transfer (ul) -+50 +50 -+50 -+50
Dilutie 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16
- se reparlizeaza cate 50pl de ser fizilologic (SF) in cercurile de pe card de la 2-5

- folosind o pipeta automata se repartizeaza aceeasi cantitate (50p1) din proba in cercul 1 si peste
SF din cercul 2
- folosind aceeasi pipeta cu acelas varf, se amesteca bine serul cu diluentul din cercul 2 prin
cateva cicluri aspirare-respingere
- se transfera 50pldin amestec direct peste SF din cercul 3
- se repeta operatiunea, cu transferarea de cate 50pl in cercurile 4 si 5, dupa care se arunca
ultimii50pl
3, lncepand de la dilutia cea mai mare (cercul 5) sifolosind capatul inchis si latit al unui
dispenser se intinde proba pe toata suprafata cercului. Se continua in sensul 4-+1
4, Dupa terminarea operatiunii se arunca dispenser-ulfolosit
5. Se agita usor flaconul de repartizare cu antigen dupa care, tinandu-l in pozitie verticala se
lasa sa cada cateva picaturi in capaculflaconului (pentru eliminarea aeruluidin ac).
6. Apoi , se repartizeaza , prin cadere libera cate o picatura de antigen in fiecare cerc in care
s-a repartizat anterior proba de testat. NU se amesteca
7. Se recupereaza antigenul din capaculflaconului
B. Card-ul se pune pe agitator, se acopera cu capac (atmofera umeda) si se agita

8 min la '100 rpm
g. Dupa agitare cardul se roteste si se balanseaza scurt cu mana pentru a reusi diferentierea
rezultatelor minim reactive de cele nonreactive.
10, Citirea se face macroscopic sub o lumina puternica

'l 1. Dupa terminarea lucrului, acul se spala cu apa distilata (se usuca in termostat), se inchid
flacoanele cu reactivi si se pun in frigider (2-B0C)
lnterpretarea rezultatelor testului cantitativ

Titrul aproximativ = dilutia cea mai mare care prezinta inca o reactie vizibila clara.
Daca dilutia 1 :16 este pozitiva, se continua titrarea dar se dilueaza mai departe cu ser norrnal de om :
1 . Se prepara intr-un tub o dilutie 1:16 din proba = 0.1m1 ser

+ 1.5m1 SF; se amesteca
2. Se prepara o dilutie 1:50 de ser normalde om = 0.1m| ser + 4'9ml SF
3. Se repeta procedura calitativa, folosind dilutia 1 :16 ca o noua proba si dilutia 1 :50 de ser
normal ca diluent,

'Diagnosiicul microbiologic in supravegherea lTS"
Document Pentru uz didactic
36
lnterpretarea rezultatelor testului RPR
1, Testul RPR este unul din testele curent utilizate pentru diagnosticul sifilisului. Pentru stabilirea
diagnosticului de sifilis, se integreaza rezultatul testului RPR cu rezultatul altor teste serologice, cu
examinarea microscopica in camp intunecat, prezenta semnelor clinice si datelor epidemiologice.
Valoar,ea',predictiva a testului RPR reactiv in diagnosticul serologic al sifilisului creste cand se combina
cu un test treponemic reactiv, cum ar fi TPHA sau FTA-Abs.
2. Un test RPR reactiv poate sugera o infectie in antecedente sau prezenta, cu Treponema pallidum;
totusi poate sa fie deasemenea o reactie fals pozitiva (BFP), BFP pot sa apara din cauza unor erori de
laborator ca si datorita unor anticorpi serici fara legatura cu infectia sifilitica. Erorile tehnice pot fi
eliminate prin repetarea testarii pe aceeasi proba si pe o proba de ser sigur nereactiv, BFP datorate
unor infectii netreponemice sau alte stari patologice se detecteaza in conditiile obtinerii unui
rezultat repetat negativ la testul treponemic.
3. Un test RPR nereactiv fara evidenta clinica de sifilis poate sugera :
- absenta unei infectii curente sau

- o infectie corect tratata in antecedente,
4. Un test RPR nereactiv_ cu manifestari clinice sugestive,

- poate sa apara in sifilisul primar recent;
- in sifilisul secundar ca rezultat alfenomenului de prozona (vezi limitele testului);
,I - in unele cazuri de sifilis tardiv.
Un test RPR nereactiv nu elimina posibilitatea unei infectii cu sifilis in perioada de incubatie.
5, Cand se executa testul RPR (semi)cantitativ la pacientii cu sifilis,

o crestere de patru ori a titrului la repetarea testului pe o noua proba poate sugera:
- infectia activa;
- o reinfectie sau
- tratamentineficient;
o scadere de patru ori a titrului in sifilisul recent indica de obicei un tratament adecvat,
Surse de eroare
1. Daca temperatura serurilor, a reactivilor sau a laboratorului, unde se face testarea este mai mica
de 230C, reactivitatea testului scade; daca temperatura depaseste 290C, reactivitatea testului creste.
2. Daca viteza aqitatorului rotativ mecanic este prea mare sau prea mica, conditiile improprii ale
interactiunii antigen-anticorp vor da rezultate imprevizibile
3. Daca ltnpUl_drcgjlare este prea lung, reactivitatea testului poate sa fie crescuta, daca este prea
scurt, reactivitatea poate scadea.
4. Daca se aqita excesiv (rotativ sau inainte inapoi) cardul cu mana dupa scoaterea de pe agitatorul
mecanic, poate sa apara o reactie fals pozitiva.
5. Daca lumina nu cade corect pe card si se produce umbra sau stralucire excesiva reactia poate fi
mascata.

Curs PHARE '14-24 iunie 2004
PENTRU h4ICROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE'CANTACUZINO"
37
6. Daca antigenul este vechi (depasit termenulde valabilitate) sau daca nu s-a testat corect pentru
reactivitatea standard (martor pozitiv), rezultatele sunt imprevizibile
7. Daca serul nu este uniform distribuit pe suprafata cercului, antigenul si anticorpii nu se amesteca
corect.
8. Daca probele de ser sau plasma sunt hemolizate, contaminate sau recoltate incorect, reactivitatea
tesctului poate fi mascata.
9. Daca nu se foloseste capacul in timpul rotatiei mecanice, si nu se mentine umiditatea necesara,

componentele testului se pot usca pe card (mai ales pe margine), putand aparea reactiifals pozitive,
Limitele testului
1. Testul RPR nu este folosit pentru LCR
2, Poate sa apara ocazional reactie de prozona, Fenomenul de prozona (inhibiiia completa sau
partiala a reactivitatii), apare cu serul nediluat, maximum de reactivitate se obtine numai cu serul
diluat. Fenomenul de prozona poate fi atat de pronuntat incat in testul calitativ poate sa apara doar
un aspect usor grunjos (rough) la un ser, care diluat, are o reactivitate puternica, Toate probele de
ser, care la testul RPR calitativ dau o reactie cat de cat grunjoasa, trebuie retestate prin procedura
cantitativa.
3, Testul RPR poate fi pozitiv la persoane din tari in care sunt endemice sifilisul nevenerian, pinta,
pian
4 Ocazional, fata de antigene cardiolipinice pot sa apara reactii biologic fals (BFP), in special la
persoane care abuzeaza de medicamente sau folosesc droguri; care au boli cum ar fi lupusul
eritematos, mononucleoza, lepra, pneumonii virale sau care au fost vaccinate receni.
5. Titrul testelor netreponemice la persoanele care au fost tratate pentru stadiul latent sau
tardiv al sifilisului sau care s-au reinfectat nu scad tot atat de repede ca la cele tratate pentru
stadiile recente ale unei infectii primare. Aceste persoane pot sa ramana "serofast',, pastrand
un titru scazut de reactivitate pentru toata viata.
Parametri tehnici obligatorii pentru testele VDRL si RPR
Test Proba Suport Picatura Ag O Rotatie Rpm Timp

aqitare
VDRL SER Godeu A 14mm 1/60m1 19-20mm 180 t 2 4min
LCR Godeu Q 14mm 1/100m1 19-20mm 180t2 8 min
RPR SER Card Z 18mm 1/60m1 19-20mm 100+2 Smin
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPMVEGHEREA BOLILOR TRANSMISiBILE

38
Testul rPHA (Treponema pallidum Haemaqtutination)

test treponemic. de confirmare seroloqica
Principiile testului
ln prezenta anticorpilor fata de antigenele proprii de suprafata sau fata de antigene adsorbite pe
membrana lor, hematiile aglutineaza in retele caracteristice formate din complexe imune.
ln diagnosticulsifilisului, testulde hemaglutinare pasiva (TPHA)a fost introdus de catre Rathlev in 1g65
si in prezent folosirea lui este generalizata, deoarece este simplu de executat, prezinta specificitate si
sensibilitate comparabile cu FTA-Abs si este relativ ieftin.
Antigenul treponemic solubil extras din lrepone ma patlidum (tulpina Nichols) este absorbit pe suprafaia
hematiilor de oaie sau pasare fixate/stabilizate (hematii sensibilizate), Ca martor sunt folosite hematii
nesensibilizate (fara antigene treponemice).
ln cazul reactiilor specifice, anticorpii antitreponemici din serurile de testat determina aglutinarea
hematiilor sensibilizate intr-o retea caracteristica, iar hematiile nesensibilizate, neaglutinate,
sedimenteaza sub forma unui buton compact pe fundulgodeului de reactie.
ln cazul aglutinarii ambelor tipuri de hematii sau doar a hematiilor nesensibilizate este probabila o
reactie nespecifica,
Pentru evitarea reactiilor incrucisate cu treponeme nepatogene, majoritatea truselor include in diluent si
un extract de treponeme nepatogene .
Procedura testului "svphagen TpHA"
(test de hemaglutinare indirecta pentru detectia de anticorpi fata de Treponema paltidum

in ser sau
plasma umana)
Reactivi din trusa
a. Antigenul = suspensie de hematii de cocos sensibilizate, gata de folosit

b' Martor de control = suspensie de hematii de cocos nesensibilizate, gata de folosit
c. Diluent = solutie de tampon fosfat salin continand componente sblubite
din T,Reiter si agenti de stabilizare
d' Ser martor pozitiv = ser imun de iepure, prediluat 1/20; titrul este indicat pe eticheta,
o diferenta de + o dilutie este admisibila
e. Ser martor negativ = ser normal de iepure , prediluat 1i20
*
Totireactiviicontin <0.1o/o azida de sodiu
Precautii : datorita azidei de sodiu, reactvii se arunca la canal, sub jet puternic de apa;
materialele utilizate in timpul lucruluise arunca in containere de bioprotectie
si se autoclaveaza sau se decontamineaza in solutii de detergent sau
dezinfectante inainte de spaiare
DiAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBILE

Curs pHARE 14-24 iunie 2004
'Diagnosticul microbiologic in supravegherea lTS,,
39
Pastrare : reactivii NU se ingheata; raman stabili daca se pastreaza la 2-8oC
Materiale necesare
- placide microtitrare cu fund in forma de U cu capac

- pipete automate si varfuri de 200p1
- vas cu dezinfectant/detergent pentru varfurile folosite
Recoltarea probelor
Ser : este proba de electie, se foloseste ser proaspat; poate fi pastrat la 2-8oC maximum 5 zile sau se
congeleaza (- 200C)
Plasma : obtinuta dupa centrifugarea sangelui recoltat pe EDTA, poate fi pastrata la 48h 2-BoC
Controlul calitatii kilului
Este recomandabil ca inaitea executarii unui set de determinari sa se testeze reactivii cu flecare din
martorii inclusi in kit urmand operatiile descrise de procedura. Daca rezultatele nu sunt cele asteptate,
kitul nu se mai ulilizeaza,
Procedura testului calitativ.

Pentru fiecare proba sunt necesare 4 godeuri de pe placa de microtitrare
1. Reactivii si probele se aduc la temperatura camerei

2. Se omogenizeaza suspensiile de hematii sensibilizate si martor (fara sa se produca spuma)
3. Se executa dilutia (exemplu pentru un ser) :
- Se pun 25pl de diluent in godeul 1, 3 si 4
- Se pun 100plin godeul2
- Se adauga 25prlde ser in godeul 1 (dilutie 112),se amesteca sise transferaZsplin godeul2
- Se amesteca bine (dilutie 1/10)siin continuare se transfera2Spl in godeul3 din care, dupa
amestecare, se arunca 25pl (dilutie 1/20)
- Se transfera alti 25pldin godeul 2 in godeul4 din care, dupa amestecare, se arunca 25pl
(dilutie 1/20)
4. Se repartizeaza direct, pe alte 2 siruri orizontale, in godeurile 3 si4, cate 25pl din ser martor negativ
si respectiv martor pozitiv (prediluate 1120)
5. se omogenizeaza din nou, usor, pe rand, suspensiile de hematii si se adauga :
- 7iStl din suspensia de hematii martor in godeurile 3
- 75pl din suspensia de hematii sensibilizate in godeurile 4
Dilutia finala pentru toate serurile va fi 1/80
6. Se amesteca, cel putin 30sec,, continutul godeurilor pe un agitator mecanic sau batand usor
marginile placii
7. Placa se acopera cu capaculsise incubeazalatemperatura camerei45-G0min, pe o suprafata
plana, departe de o sursa de caldura si evitandu-se orice sursa de vibratie
L Citirea rezultatelor se face macroscopic (cu ochiul liber)
DIAGN0STICUL MICROBIOLOGIC iN SUPMVEGHEREA BOLTLOR TRANST\,llSlBrLE

PENTRU MICROBIOTOGIE SI IMUNOLOGIE'CANTACUZINO"
'Diagnosticul microbiologic in supravegherea lTS,
Documenl pentru uz didactic
40
Procedura testului (semi)cantitativ

Fiecare test necesita I godeuri
1. Pregatirea dilutiilor de ser : se porneste de la dil 1/10 ramasa in godeul 2 - uezi procedura pentru
testul calitativ
- Se pun cate 25pl diluent in goderile 1-8 (un sir orizontal separat)
- Se transfera in godeul 1,Zipldin dilutia 1/10 facuta anterior, se amesteca bine sise transfera
25pl in godeul 2, se amesteca sise repeta operatiunile pana la godeul 8, din care se arunca
25pl
- Se recomanda folosirea in paralel a dilutiilor binare de ser martor pozitiv, tinand cont de faptul ca
este prediluat 1120 (in godeul 1 nu se mai adauga diluent)
2, Se omogenizeaza suspensia de hematii sensibilizate si se adauga cate 75pl in fiecare godeu 1-8
3. se amesteca, cel putin 30sec., continutul godeurilor pe un agitator mecanic sau

batand usor marginile placii
4.Placase acopera cu capaculsise incubeazalatemperatura camerei45-60min, pe o suprafata plana,

departe de o sursa de caldura si evitandu-se orice sursa de vibratie
5. Citirea rezultatelor se face macroscopic
Citirea probelor (test calitativ) Notare lnterpretare

Reteaua de aglutinare acopera tot fundul godeului; 4+ Pozitiv
marginile pot uneori sa cada spre interior
Reteaua de aglutinare acopera partialfundul godeului 3+ prezenti anticorpi
anti -T.pallidum
Reteaua de aglutinare este inconjurata de un inelde 2+
hematii lnfectie activa
Retea de aglutinare de diametru redus, inconjurata de un 1+ sau in
inel gros de hematii antecedente
Buton de hematiicu o deschidere in centru + La limita
nivel de anticorpi scazut
sau rezidual
(se repeta)
Buton de hematii cu / fara o foarte mica gaura in centru Negativ
absenti anticorpi
anti -T.pallidum
(vezi limite test)
Q{irca testu I u i (semi)cantitativ
Titrul aproximativ = cea mai mare dilutie cu rezultat 1+ Pozitiv
Citirea martorilor
Diluent + hematii sensibilizate Negativ
Diluent + hematii nesensibilizate Neqativ
li4artor ser pozitiv + hematii sensibilizate 4+ Pozitiv
Martor ser negativ + hematii sensibilizate Neqativ

Curs PHARE 14-24 iunie 2C04
PENTRU [,lICROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE "CANTACUZINO'
4t
Utilizarea testuluiTPHA pentru probe de LCR

(A. Paris-Hamelin. lnst. A,Fournier, Paris)
- DilutiiLCR:
1. Dilutia ll1-final = 25pl LCR + T5plhematiisensibilizate
2, Dilutia 1120final = 5plLCR + 20pldiluent + T5plhematiisensibilizate
- lnterpretarea rezultatelor :
Rezultatul este pozitiv numai daca dilutia 1/20 este pozitiva.

Probele care prezinta aglutinare numai la dilutia 1/4 trebuie repetate in
dinamica pentru a se verifica o eventuala evolutie
Limitele testului TPHA
1, S-au semnalat rezultate fals pozitive pe probe de plasma; pentru repetarea testarilor la probe de
plasma initial pozitive sau la limita, trebuie sa se foloseasca probe de ser.
2, Anticorpii anti-treponemici pot sa persiste perioade lungi de timp, chiar dupa tratament eficient. Din
acest motiv pentru evaluarea tratamentului se utilizeaza testele cardiolipinice
(RPR / VDRL) (semi)cantitative. Testul TPHA (semi)cantitativ este util doar pentru cazuri probabile de
sifilis congenital
3. ln principiu, numai cu TPHA nu se poate diferentia intre o infectie activa si o infectie tratata sau nu in
antecedente; in acest scop trrebuie asociat cu un test cardiolipinic
4, Sensibilitatea testului in sifilisul recent este mai scazuta cu 4-B% decat a FTA-Abs, deci poate sa nu
evidentieze prezenta anticorpilor in unele cazuri de infectii primare
5. TestulTPHA poate da reactii incrucisate cu alte forme de infectii treponemice si deasemenea s-au
descris rezultate fals pozitive la unele cazuri cu mononucleoza infectioasa, lepra, tuberculoza, boli
_ autoimune, la persoane aparent sanatoase, dupa viroze sau persoane care folosesc droguri
Surse de eroare
'1. Eroride repartizare/pipetare
2. Ccintaminarea reactivilor
3. Nerespectarea conditiilor de pastrare a reactivilor
4. Utilizarea unor probe lipemice, icterice sau contaminate
5, Utilizarea unor microplaci necorespunzatoare : cu godeuri zgariate, defecte sau refolosite,
DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBlLE

42
MASTAFLUOR - FTA.ABS
Principiul
Kit-ul MASTAFLUOR - FTA-ABS este un test de imunofluorescen(d indirecta utilizat in vitro pentru
diagnosticul de certitudine al sifilisului.
Probele de ser gi1sau LCR de la pacienli se absorb inilial cu un sorbent, care conline antigene
treponemice de grup, comune treponemelor patogene gi comensale,
Aceastd operalie inlatura anticorpii nespecifici din proba de testat,
Probele de ser gi/sau LCR absorbite gi martorii corespunzdtori se pun pe spoturile cu antigen
(T,pallidum) fixat pe lame. Dacd in seriLCR se gdsesc anticorpi specifici, acegtia se vor lega de
treponemele fixate formAnd complexe antigen-anticorp. Dupd indepdrtarea materialului nelegat prin
spaldri repetate, anticorpii legali se detecteazi prin incubare cu un conjugat fluorescent anti lg umane,
Dupd indepartarea prin spalare a conjugatului nelegat de complexele antigen-anticorp, lamele se
examineazd la microscopul cu fluorescenla (UV).
Reac{ia pozitiva = treponeme fluorescente, galben vezui,
Materiale/reactivi kit
1 . Lame de microscop cu 12 spoturi pe care sunt fixate T. pallidum, ambalate individual in plicuri
cu silicagel.
2. Ser uman, martor pozitiv
3. Ser uman, martor nespecific
4. Conjugat FITC 200x (se dilueazi in diluentul special, este stabil pAnd la g0 zile la 2-B0C)
5. Diluent pt, conjugat
6. PBS, pulbere (se dizolva in 1l AD, se poate pdstra 3Ozile la +40C)
7. Mediu de montaj
8. Sorbent FTA = un flacon cu extract liofilizat de culturi T,Reiter. Se reconstituie cu SmlAD dupa
care se repartizeazd in cantitifi mici care se pdstreaza la -200C (stabil 90 zile),
Materiale necesare
- Microscop echipat pentru fluorescenta :
- obiectiv uscat 40x, ocular 10x,

- condensator cu fond intunecat,
- lampa HBO200 sau H8050
- filtre de excitatie 2mm BG 12 si BG 3,
- filtre baraj GG g si GG 9 +OG 1
- baie apa +560C pentru inactivarea serurilor
- termostat 37oC
- camera umeda cu stativ pentru lame (placa Petri cu diametrul de 20cm cu
capac si hartie de filtru umezita)
- flacon pentru lichidulde spdlare
- pipete gradate 5-10m1

'Diagnosticul microbiologic in supravegherea lTS,
43
- microplaci de plastic pentru dilutia serurilor

- pipete automate reglabile (25-100p|)
- anse bacteriologice de unica folosinta de 1pl
- lamele (25mmx60mm)
- hartie filtru
- apa distilata
- container cu detergent/dezinfectant pentru pipete, tips-uri utilizate
Precaufiile obignuite pentru lucru cu material potenfial infecfios.
- Atentie ! nu se incurca dopurile de la flacoanele cu reactivi

- lntre spalari si incubdri, spoturile nu se usuca complet ci numai spatiile dintre ele !
- in timpul gi dupa incubarea cu conjugat lamele se lin la intuneric (acoperite cu hirtie neagrd).
- Spoturile de pe lame trebuiesc acoperite complet cu probd/martor/conjugat
- Probele/martorii/conjugat nu trebuie si curgd dincolo de conturul spotului
- Lama nu se atinge cu tips-ul la repartizarea probei/martor/conjugat
- Nu se lucreazd probe hemolizate, lipemice, contaminate sau pdstrate in condifii
necorespunzdtoare
Procedura de lucru
1, Probele de ser/LCR pot fi pdstrate max. 48h la 2-8oC inainte de testare, pdstrare mai
indelungati la -200C
2. Toate materialele de lucru (probe +componentele din Kit + sorbentul din congelator) se aduc la
temperatura de lucru (temperatura camerei = 23-290C)
3. Se pregdtegte PBS : un plic din kit se dizolvd in 1l AD (sau se scoate de la +4oC dacd a fost
pregatit anterior gi se aduce la temp.camei'ei)
4. Se dilueazd serurile martor'1/5 in sorbent giin PBS (1Oplser+40plsorbent/PBS)
a. ser martor pozitiv + sorbent
b. ser martor pozitiv in PBS
c. ser martor nespecific + sorbent
d, ser martor nespecific + PBS
5. Se dilueazd probele de testat ?n sorbent 9i se incubeazd 30min la 370C
a, ser 1/5 = lOFlser+40plsorbent
b. LCR 1/3 = 20pl LCR +40plsorbent
6, Se scot lamele din plicuri (cu atenlie = nu se pun degetele pe spoturi), se marcheazd
corespunzitor cu schema de lucru gi se aseaza in camera umedd
7. Se pun probele gi martorii pe lame (20-2sStllspot) se acoperd camera umedd cu capac ai se
incubeazd 30min la 370C. Cdnd se lucreazd cu un kit nou se mai pune martor de PBS gi martor
de sorbent pe alte doud spoturi.
8, Spdlarea lamelor se face cu PBS, cu jetul pe mijlocul lamei nu direct pe spoturi, de 3 ori cAte 5
minute in camera umedd
9, in timpul procedurii de spilare se dilueazd conjugatul 11200 =
1pl conjugat + 200p1 diluent de conjugat din kit
10. Se scot lamele, pe rAnd, din camera umedd gise scurge excesulde PBS pe o hArtie de filtru,
se usuc5 9i spa{iile dintre spoturi tot cu hArtie de filtru (fAgii subliri). Nu se atinqe suprafala
sPoturilor!
11. Se adauga imediat 20-25p1conjugat diluat peste fiecare spot,

Curs PHARE 14-24 iunle 2004
PENTRU [,IICROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE "CANTACUZINO'
, Document pentru uz didactic
44
12, lncubare 30min la 37oC in camera umedd acoperitd

13, Se aprinde microscopul (lampa UV)cu 15 min inainte de examinare
14. La terminarea incubdrii cu conjugat lamele se spali cu PBS ca mai sus (pct.8)gi se usucd
15. Lamele se pot monta cu lichid de montare kit + lamela. (Maibine nu!)
17. Examinare la microscopulde fluorescenfi
lnterpretarea rezu ltatelor
Validarea testului : inainte de citirea probelor se examineazd martorii. Dacd rezultatele citirii nu
corespund tabelului, testul nu este valid
Martor Rezultat asteptat

Martor reactiv + sorbent 3+...4+
Martor reactiv + PBS 4+
Martor nespecific + sorbent neqativ
Martor nespecific + PBS 2+....4+
Martor neqativ + sorbent neqativ
Martor neqativ + PBS ativ
Martor PBS neqativ
Martor sorbent neqativ
lnterpretarea rezu ltatelor.probe
Rezultatele probelor de testat se apreciazi prin comparatie cu martorii inclugi in test.

Cazurile "la limitd" (+l) care prezintd o fluorescenti palidd, dar perceptibild se repeta pe altd
probd de ser.
La cazurile negative se verifici daci existi treponeme pe spot inainte de a se inregistra
rezultatul.
Probele reactive se noteazl de la 1+ la 4+,
1+ se consideri minim reactiv; <1+ se consideri negativ; >1+ se consideri pozitiv
Limitele testului
1. Testul poate da uneori rezultate fals pozitive (sarcind, leprd, sLE, etc.)
2. Testuls-a demonstrat a fi sensibil (este primul care devine pozitiv) 9i specific dar, pentru a fi
semnificativ pentru diagnostic, rezultatele trebuiesc considerate in contexul tuturor rezultatelor
serologice (VDRL/RPR gi TPHA), a istoricului clinic, tratament in antecedente, date
epidemiologice.
3, ln cazurile neurologice suspecte, LCR pozitiv nu certificd infec{ia activd (numai VDRL pozitiv) in
schimb un rezultat negativ exclude neurosifilisul.

Curs PHARE 14"24 iunie 2004
PENIRU MICROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE "CANTACUZINO'
45
PATHOZYME - SYPHILIS M CAPTURE OMEGA DIAGNOSTICS
TEST IMUNOENZIMATIC PENTRU DETECTAREA lN SERUL UMAN A ANTICORPILOR lgM ANTI

Treponema pallidum
Utilizarea testului :
pATHozyME - sypHtlts M cAnTURE este un test de diagnostic in vitro pentru detectarea anticorpilor lgM
care apar ca rispuns la infeclia cu Treponema pallidum
Poate fi utilizat pentru:
1. Detectarea rdspunsului imun primar in cadrul infecliei cu Treponema pallidum
2. Confirmarea infecliei active, deoarece poate face distinclia intre lgM 9i lgG fdra sd fie necesard
fraclionarea serului (ca pt. FTA-ABS-19S).
3. Confirmarea infec[iei la nou-niscufi, deoarece lgM nu poate traversa placenta prin
transfer pasiv
Principiul testului:
Pe suprafala godeurilor s-au legat anticorpi anti lgM uman (anti-lanluri p ), peste care se adaugd proba
de ser diluata 1/100. Moleculele de lgM prezente in ser sunt "capturate"/fixate/legate pe suportul solid.
Materialul nelegat se indepdrteazi prin spalari. Se adaugd apoi conjugatul care este compus din
antigen de T.pallidum conjugat cu peroxidazd de hrean (HRP) care se va lega numai de anticorpii lgM
specifici (fata de T.pallidum, dacd exista). Dupd adiugarea substratului enzimatic (TMB), va apirea o
culoare numai in godeurile in care existd enzima, indicAnd prezenla anticorpilor umani anli - T,pallidum.
Reaclia enzimaticd se stopeazd prin addugare de acid sulfuric diluat iar apoi se mdsoard
absorbanla(OD) la 450nm.
Materiale/Reactivi kit
1. placd microtitrare cu capac (giruri de godeuri detagabile) sensibilizatd cu anticorpi anti-lanturi p

pentru captura lgM
2. diluent pentru seruri, dilulie de lucru, portocaliu, R1
3. ser martor negativ, dilu{ie de lucru, albastru, R2
4. ser martor slab pozitiv, dilulie de lucru, verde, R3
5. ser martor intens pozitiv, dilulie de lucru, rogu, R4
6. tampon de spdlare 20x, R5
7. diluent pt. conjugat, dilulie de lucru, mov, R6a
8, conjugat T. palhdum 100x, R6b
L antigen de control, 100x, R6c
10. substrat TMB, dilu{ie de lucru, R7
11, solufie de stopare, dilufie de lucru, R8
Componentele kitului se pdstreazd la 2-80C, se feresc de expunere prelungitd la !umina puternic6.

Se folosesc numai pAni la data de expirare, Dupd scoaterea godeurilor necesare, microplaca se
reintroduce in plic ai se inchide ermetic
Precautii necesare pentru lucru

Kit-ul con{ine reactivi de origine umani care vor fi considerali cu potenlial patogen
Prezervativii forosi!i
"il:1:3+ f 3ifr J-%$SSL1; 1l,H:Jr,:i??:l J,i Pi[?*o*,,,,,,,,.,
Cun PHARE 1 4-24 iunie 2004
PENTRU MICROBIOLOGIE SI IN4UNOLOGIE'CANTACUZINO"
46
Solulia de stopare este corozivd, se manipuleazd cu grij6, in cazde accident se

clitegte cu multi apd
Nu se lucreazd cu reactivi din kit-uri diferite
CAnd se lucreazi nu se atinge suprafala godeurilor
i*int. Or in.rprr.a lucruluireaciiuii se aduc la temperatura de lucru (20-250C), nu se congeleazd
iniint. de {olosire flacoanele cu reactivi se agitd cu grijd evitAndu-se formarea de spuma
se incurci
Capacele flacoanelor cu reactivi se pun la loc imediat dupi folosire 9i nu
de lucru
Dupi inceperea procedurii, godeurite nu trebuie sd se usuce intre etapele
contaminarea incrucigatd
F.i..,ttu fiecare probi/reactiv se folosegte un singur tip pentru a se evita
albastru inainte de repartizare,
Substratul TMB se folosegte atAta vreme cAt esie incoior, dacd este
testul nu se Poate valida
pentru controlul reacliei 9i pentru
oouta cu probele, in mod obligatoriu se testeazd 9i martorii de test
calcularea valorii "cut off''
Materiale necesare
1. microPiPete: 10p1, 100Prl, 1000Prl

2. termostat 37oC
3. apa distilaid sau bidistilatd pentru diluarea tamponului de spdlare
4, sticldrie de laborator curatd
5. cititor ELISA cu filtru de 450nm
6, hArtie de filtru
Pregitirea probelor pentru testare
Serurile se dilueazd 1/100 = 1Opl ser + 1000p1 diluent pentru ser la dilulia de lucru,
dupi diluare se
folosesc maximum Bh, nu se pdstreazd

Atenlie!
Se folosesc numai seruri proaspete
Serurile inghefate/dezghefate de mai multe ori pot da rezultate fals pozitive
Nu se folosesc seruri liemolizate, contaminate sau lipemice care ar putea altera rezultatele
Pregitirea reactivilor Pt. lucru
Tamponul de spilare (R5): se dilueazd 1:19 cu AD, Pentru un gir de I godeuri, spdlate manual se
pregdtesc 40ml tampon = 2ml tampon2Ox + 38mlAD
Se pregdteste tampon nou in fiecare zi de lucru.
Coniuqatut (R6a, R6b, R6c) : pentru fiecare gir de B godeuri se pregdtegte 1ml de dilulie = 1000p|
Otf r.nt de conjugat (R6a) + 1Opl Lp.conjugat HRP (R6b)
+ 1Opl antigen de control (ROc)
Procedura de lucru
1. Toate serurile gi reactivii se aduc la temperatura camerei (20-250C) inainte de inceperea testdrii
Z, in fiecare zi de lucru in paralel cu probele de testat se lucreazd serurile martor din kit pentru
validarea performanlei iestului gi pt. calcularea valorii de referin{d (cut off), Se face Schema de
lucru considerAnd ci pentru martorul slab pozitiv se lucreazi obligatoriu in duplicat
(nr.
+
godeuri = 1 martor negativ, 2 martor slab pozitiv, 1 martor intens poaitiv nr. probe de
iestat).Se detageazi godeurile necesare din microplacd, se sigileazd din nou plicul'

"Diagnosticul microbiolog ic in supravegherea ITS'
47
3. Se dilueazd serurile de testat cu diluentul de probd R1 (martorii din kit nu se dilueazd, se

folosesc ca atare). Se repartizeazd serurile, inclusiv martoriicAte 100p1/godeu, conform
schemei. Serurile martor (R2-4) se pun ultimele. Se agita ugor placa, 5 secunde. Placa cu
godeuri se acoperd cu capac, se pune in camerd umedd gi se incubeaza th la 37oC
4. ln timpul incubdrii se pregdtegte conjugatul (1ml pt, 8 godeuri) R6a,6b,6c
5. Se dilueazd tamponul de spilare R 5 (40mltampon dilulie de lucruiS godeuri) 9i se spald
godeurile de 5x cu cate 250p1/godeu. Con{inutul godeurilor se golegte in vasul cu dezinfectant,
Dupd spalari se inl5turd excesul de tampon prin scuturare pe hArtie de filtru,
6. Se repartizeazb cdle 100p1 de dilulie conjugaVgodeu, se agitd ugor 5 sec,, se acoperd cu
capacul gi se reintroduce placa in camera umedd care a rdmas in termostat. Se incubeazd t h
la 370C.
7. La sfArgitul incubdrii se repetd procedura de spdlare (pct. 5)
8, Se repartize azd cdle 100p1 /godeu substrat TMB (R7), se agitd ugor 5 sec, inainte de a acoperi
placa cu capacul, Reac{ia de culoare are loc la intuneric, 20-300C, timp de 30min,
9. Stoparea reaclieicu 100p1/godeu solulie de stopare (R8). in godeurile care con[in enzima
culoarea albastrd vireazd spre galben,
10, Citirea rezultatelor: blank-ul se face pe aer, Masurarea absorbanlei se face la 450nm, imediat
dupi adaugarea solufiei de stopare, Este preferabil sd nu se foloseascd un al doilea filtru de
referinld care ar putea schimba valorile martorilor,
Calcularea 9i interpretarea rezultatelor.

Validarea testului : ca testul sd fie valid, media OD pt, martorul slab pozitiv > 0.2
Nivelul cut off = media OD martor slab pozitiv
t
Rezultat la limita : valori egale sau intre cut off 10%
Rezultat neqativ = rezultat mai mic decAt rezultat la limitb
Rezultat posibil pozitiv/slab = rezultat in zona rezultat la limitd
Rezultat pozitiv = rezultat mai mare decAt rezultat la limitd
Pentru compararea rezultatelor intre testdri se calculeazi indexul de anticorpi:
Al= OD probd / media OD martor slab pozitiv
Limite test
PATHOZYME - SYPHILIS M CAPTURE este un ajutor pentru diagnosticul serologic al sifilisului,
lnterpretarea testului se face numai in contextul tuturor datelor clinice.
O proba cu rezultat probabil/slab pozitiv se retesteazS. Nu se pune diagnosticul numai cu rezultatul
unui singur test ( + VDRLIRPR, TPHA).

.Diagnosticul
microbiologic in supravegherea lTS"
48
BIBLIOGRAFIE
1, European STD Guidelines, lntl.J. STD&AIDS, 2001:12(suppl)

Z. Laboratory Tests for the Detection of Reproductive Tract lnfections, WHO 1999
3. Gudelines for STD Prevention, Medicaland Laboratory Services, CDC, 1999
4. Manual for Tests for Syphilis, APHA USA' 1998
5, Directives de Laboratoire Applicables au Diagnostic des Maladies Sexuellement
Transmissibles, WHO/VDT/89.443
6. Clinical Practice in Sexuatly Transmissible Diseases, Robedson et al., 1989

PENTRU t\,IICROBIOLOGIE Sl IMUNOLOGIE "CANTACUZINO'
r
R
R
$r
!.-
\ tf,
{
k +q\
S
S
e-
u1-
lr
;1.,i;
&i
F
rDl H
f;i
it HI
l }i
Fll
ui i;
4..i
a'"j.
HI
lr
tl
CIl
ir.
i,il
jun- Sr
il FI
gau t
E
r
il
I
i
$.
11,
t,
fil F;
f- i
I
sl
i'- }
H.i
ll
elE
le fi
lll rto
rbl - ll:
fi
Hl
ti
1e
b,\ \
9p- si (o &
LU q 0D
FI s
ro1
s
\t
I1 -+
H
s $
-F
I
I
_*
N
\
Ii
sF
&
fr
f,-
x
$
I
I
Diagnosticul serologic al neurosifilisului
in momentul de fali se consideri ci neurosifilisur se poate

instala in oricare din stadiite clasice ale sifilisului; primar,
secundar, tertiar.
ln funclie de durata infec{iei netratate, 30% pdna la7}o/odin

indivizii cu
neurosifilis pot prezenta anomalii ale LCR in privinla numdrului
de celule
gi a nivelului de proteine.
Dintre testele serologice aplicabile in LCR, testul VDRL pozitiv

reprezintd cel
mai sigur mijloc de diagnosticare a neurosifilisului degi, sensibilitatea
realS a acestul test nu este bine cunoscutd.
in condi{iile in care LCR nu a fost contaminat cu sange seropozitiv

in
momentul puncliei rombare, LCR-VDRL pozitiv este iproape intotdeauna
diagnostic pentru neurosifilis prezent sau in antecedente; se normalizeazd
la -1 an dupd tratament, mai greu decat pleiocitoza 6 runi.
-
sugestivd pentru neurosifiris este gi situalia in care LCR-VDRL este
negativ ciar se constati alte anomalii ale LCR gi serologia pozitivd :
confirmatd.
Testele treponemice sun-t aproape intotdeauna pozitive in LCR pacienlii

la
cu serologie pozitiva dar fdri ca semne neurologice sau anomalii
ale LCR
carg sd indice un ngurosifilis -+ nu se noate diannncrina narrrnciriri
LCR-TPHA pozitiv.
ln schimb,
Este absolut neces"l9" tofi pacienlii cu neurosifilis si fie testati pentru

Hlv; cei cu o primi determinare negativi trebuie retestali la 6 luhi.
Traseul informaliilor din Programul de Supraveghere 9i Control al ITS
Medic Familie
LCIUUI rtor
Figi lnvt lstioatie
Epidemit rlogici (FlE)
Medic specialist DV
Comunicd in 24h
DSP Epidemiolog ITS ->

Codificare
Centralizeazd
rse c27 nolt
uni cu FIE DV Coord fnr lnformeazd
Statistica DSP
Figi declarare
caz nou ITS bazd FIE
Statistica MS
DSP
lnstitute de Sdndtate Publicd
CNR. IC

Its PDF

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Its PDF

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

DilAGN@STICUL DE LABORATOR iru SITIUS

ffi . tista-p reqeCugt d[qsuqstia:

1. MierosaoPne Pc fonrd intunecat

t" Taxononnne T.paMidum

NIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPMVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBILE

TAXONOMIE (dupa Berghey, 1984)

Speciile patogene pentru om si animal sunt necultivabile

T. pallidum subsp. pallidum

Speciile nepatoqene sunt cultivabile (conditii anaerobe) si au urmatoarea localizare:

Mucoasa genitala (flora genitala normala) '. T. phagedenis, T, refringens,

DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPMVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBILE

Poarta de intrare (leziune tegumentara/mucoasa) -+ X -+ diseminare

' vase limfatice + ggl. limfatici regionali -+ X + circulatie limfatica

sistem venos -+ circulatie generala -+ invadeaza intreg organismul

(inclusiv tegument, sNC) -+ X + tranzitoriu circulatie -+ tesuturi

(mai ales cele bogate in colagen -pereti vase) + X + LEZIUNE TERTIARA

DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA

- Raspunsul imun specific

Anticorpii nu opresc evolutia infectiei : ac. anticardiolipinici = martori de leziune

EVITAREA MECANISM ELOR IMUNE

DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBILE

Criterii - diaqnostic de laborator:

- teste seroloqice pozitive si LCR cu VDRL pozitiv

Criterii - diaqnostic de laborator

DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPMVEGHEREA BOLILOR TRANSNIISIBILE

IJTILTzAREA TESTELoR snRor,ocrcp ix

A. Se utilizeazi pentru diagnostic in toate stadiile dar

VDRL / RPR, teste netreponemice, nespecifice, identificd anticorpi lgG gi lgM

TPHA / FTA'Abs, teste treponemice, specificitate inaltd, confirmi serurile

DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSN,lISIBILE

UTI LIZAREA TESTELOR SEROLOGICE

B. Urmirirea pacientilor dupi tratament

Pacienliitrebuiesc informati despre importanla testirilor repetate pentru a se

Urmdrirea se face la cazurile confirmate cu VDRURPR cantitativ, obligatoriu cu acelagi test

Proba de control, la care se raporteazi rezultatele succesive, se recolteazi in ziua 0 de

ln urma unui tratament eficient in sifilisul primar-secundar, leziunile se vindeca rapid,

Daci toate examenele clinice 9i serologice riman satisfacatoare pentru o perioadi

DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHERFA BOLILOR TRANSMISIBILE

Teste pentru diaqnosticul seroloqic de rutini al sifilisului:

o La depistare : VDRL (sau RPR)giTPHA

REZULTATE POSIBILE INTERPRETARE

VDRL negativ TPHA negativ Exclude infeclia sau

VDRL negativ, TPHA pozitiv sifilis confirmat, tratat?

. Urmdrire pacienti confirmati, tratament :VDRL (semi)cantitativ ; se continui pdni titrul

. urmirire gravide pentru prevenirea gi controlul sifilisului congenital:

Datele asupra prevalenlei sifilisului la femeile gravide pot fi considerate ca o

(WH0/CDS/CSR/lSR/99.2, Anexa Aso.sz)

DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBILE

Toli pozitivii serologic au lgG fala de 6 polipeptide antigenice

treponemice majore (MAP):

Ef 45, 33, 30, 1 5, 42, 16,5

X2, latent recent 6 MAP + alte 16 polipeptide

E latent tardiv 6 MAP + alte 4-5 polipeptide

in toate stadiile apare gi P37 - polipeptidul filamentelor axiale

DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBILE

DIAGNOSTICUL SIFILISULUI LA GRAVIDE

in cazurile cu serologie confirmati este obligatoriu si se faci testarea in paralel a mamei

Datele asupra prevalentei sifilisului la femeile gravide pot fi considerate ca

DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC IN SUPRAVEGHEREA BOLILOR TRANSMISIBILE

- in primele 10 siptdmini de gestalie

25-30% moarte dupi nagtere

dintre supravieluitorii infectali 4A% -+X simptomatic

producfia de mucopolizaharide (mpz), foade activi in perioada