Sunteți pe pagina 1din 53

DETERMINAREA SPECTRULUI DE

SENSIBILITATE LA ANTIBIOTICE A SPECIILOR


MICROBIENE. ANTIBIOGRAMA
DETERMINAREA SPECTRULUI DE SENSIBILITATE LA
ANTIBIOTICE A SPECIILOR MICROBIENE. ANTIBIOGRAMA

Datorita specificitatii lor de actiune, antibioticele manifesta eficienta diferita fata


de diferite specii microbiene; totalitatea speciilor microbiene sensibile la un anumit
antibiotic defineste spectrul de activitate al antibioticului respectiv. In functie de numarul
si diversitatea speciilor microbiene afectate, spectrul de activitate al antibioticelor poate fi
:

 larg (de exemplu, spectrul de actiune al tetraciclinei este reprezentat de bacterii


Gram-negative, inclusiv chlamidii si rickettsii si specii Gram-pozitive; penicilinele
sunt active in special fata de specii Gram-pozitive, dar si Gram-negative, inclusiv
chlamidii; nitrofuranii, rifampicina, sulfamidele sunt active pe un numar mare de
specii bacteriene Gram-pozitive si Gram-negative si pe bacteriile acido-alcoolo-
rezistente);

 ingust (novobiocina este activa pe bacteriile Gram-pozitive, mai ales stafilococi, dar
si pe coci si bacili Gram-negativi, cum ar fi hemofilii si pasteurelele; glicopeptidele,
bacitracina, pe bacterii Gram –pozitive);

 limitat (nitroimidazolii sunt activi doar pe microorganismele anaerobe).

Chiar in cadrul aceleiasi specii microbiene, pot exista diferente mari de


sensibilitate a diferitelor tulpini fata de un anumit antibiotic, astfel ca stabilirea
tratamentului cu antibiotice in clinica necesita izolarea tulpinii microbiene care reprezinta
agentul etiologic al infectiei respective (mai ales daca acesta apartine unor genuri si
specii supuse fenomenului de dobandire a rezistentei clinice) si determinarea spectrului
sau de sensibilitate la antibiotice.

Evaluarea in vitro a eficientei unui antibiotic se realizeaza prin masurarea a 3


parametri, care variaza in functie de concentratia antibioticului si de timpul sau de
actiune:

 concentratia minima activa (= C.M.A.) - este concentratia la care antibioticul


poate induce anumite perturbari in activitatea metabolica a
microorganismelor, fara a afecta capacitatea de multiplicare si viabilitatea
microorganismelor;

 concentratie minima inhibitorie (= C.M.I.) - este concentratia la care un antibiotic


inhiba multiplicarea microorganismelor (efect bacteriostatic);
 concentratie minima bactericida (= C.M.B.) - este concentratia la care un antibiotic
are actiune letala asupra microorganismelor (efect bactericid).

Cunoasterea acestor parametri prezinta o importanta clinica deosebita, deoarece,


pentru unele antibiotice, concentratia bactericida este foarte greu de atins in vivo. Din
acest motiv, unele antibiotice ca tetraciclina, cloramfenicolul, rifampicina sunt
considerate antibiotice bacteriostatice.

Pe langa valoarea C.M.I. determinata in vitro, in alegerea tratamentului cu un anumit


antibiotic, trebuie sa se tina cont si de calitatile farmacologice ale antibioticului respectiv
(de exemplu, posibilitatea realizarii concentratiei active la nivelul focarului de infectie),
de eventualele efecte secundare si de starea fiziologica a bolnavului.

Tehnica de evidentiere a sensibilitatii la antibiotice a unei tulpini microbiene se


numeste antibiograma. Antibiograma trebuie practicata in mod obligatoriu in cazul
microorganismelor patogene, supuse fenomenului de dobandire a rezistentei, inaintea
inceperii oricarui tratament cu antibiotice.

Dupa determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice prin tehnici


calitative (in care tulpina microbiana de testat este pusa in contact cu diferite
antibiotice aflate intr-o anumita concentratie), se pot practica teste cantitative
pentru determinarea valorii C.M.I. (in care tulpina microbiana este pusa in
contact cu concentratii crescatoare ale aceluiasi antibiotic).

1. Metode calitative de determinare a spectrului de susceptibilitate la antibiotice

Metoda difuzimetrica (Kirby-Bauer)

Este o metoda foarte simpla si rapida, care permite determinarea concomitenta a


spectrului de sensibilitate a microorganismului si a valorii C.M.I. in vederea calcularii
dozelor terapeutice de antibiotice. Metoda are mai multe variante, in practica folosindu-se
curent tehnica discurilor impregnate cu antibiotice, standardizata, recomandata de
NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standardisation).

O serie de factori, ca de exemplu, tulpina microbiana studiata (densitatea


inoculului, specia, varsta culturii), mediul de cultura (compozitia mediului, pH-ul,
densitatea si grosimea stratului de mediu), tehnica folosita si criteriile de interpretare a
rezultatelor obtinute, pot influenta rezultatele unei antibiograme. Din acest motiv, tehnica
trebuie efectuata in conditii standardizate, reproductibile, conform indicatiilor forurilor
internationale in domeniu.

Pe suprafata unui mediu agarizat insamantat “in panza” cu un inocul standardizat,


obtinut din tulpina de testat, se plaseaza la distante egale discuri impregnate cu solutii de
antibiotice de o anumita concentratie care vor difuza in mediu, realizand un gradient de
concentratie invers proportional cu diametrul zonei de difuzie, deci cu distanta fata de
disc. Daca tulpina este sensibila la un anumit antibiotic, cresterea microbiana va fi
inhibata pe o anumita suprafata in jurul discului impregnat cu antibioticul respectiv,
suprafata denumita zona de inhibitie a cresterii.

Citirea rezultatelor se realizeaza prin masurarea diametrelor zonelor de inhibitie a


cresterii determinate de diferite antibiotice, cu ajutorul unei rigle gradate. In cazuri de
urgenta clinica se poate realiza o prima citire la 6-8 h de la incubare. Interpretarea
rezultatelor se face in functie de dimensiunea zonelor de inhibitie a cresterii, exprimand
rezultatul cu termenii de tulpina sensibila (S), rezistenta (R) sau intermediar sensibila (I),
conform tabelelor cu puncte critice standardizate si corespunzatoare metodei de lucru:
tabelele NCCLS pentru metoda difuzimetrica recomandata de NCCLS (National
Committee for Clinical Laboratory Standards, USA), in prezent CLSI (Clinical
laboratory and Standards Institute)

Termenii S, I, R definesc de fapt si categoriile de antibiotice, in functie de efectul


lor clinic, dupa cum urmeaza:

 categoria S, inseamna ca exista o mare probabilitate ca antibioticul, administrat in


doze obisnuite, sa elimine infectia determinata de tulpina testata (C.M.I. are valori
net inferioare celor ale concentratiilor umorale obtinute in urma administrarii unei
doze obisnuite);

 categoria I, semnifica probabilitatea ca antibioticul sa fie eficient in vivo prin


administrare locala sau prin realizarea in mod fiziologic a concentratiilor mari in
organe sau tesuturi (rinichi, ficat, cai biliare), la nivelul carora este localizat
procesul infectios;

 categoria R inseamna ca, cel mai probabil, administrarea antibioticului nu va


determina eliminarea din organism a agentului infectios, a carui sensibilitate a fost
testata sau rezultatul tratamentului este imprevizibil.

La citirea si interpretarea rezultatelor se iau in considerare diametrele zonelor de


inhibitie, lipsite complet de colonii vizibile cu ochiul liber.

Aparitia coloniilor la marginea sau in interiorul zonei de inhibitie se poate datora


urmatorilor factori: cultura este mixta sau suprainfectata; cultura este pura, dar prezinta
celule heterorezistente; aparitia mutantelor rezistente; dezvoltarea tardiva a unor celule,
de fapt sensibile, si aparitia coloniilor dupa ce antibioticul s-a diluat prin difuzie in
mediu.

2. Metode cantitative de determinare a valorii C.M.I.

2.1. Metoda dilutiilor in mediul lichid sau in agar

Principiul metodei: un inocul standardizat al tulpinii testate este insamantat intr-


un gradient discontinuu de concentratii ale antibioticului, fie in placi cu mediu agarizat,
fie in tuburi cu bulion nutritiv. Dupa incubarea adecvata, se citeste valoarea C.M.I. prin
observarea macroscopica a tuburilor: in primele tuburi, cu concentratii mari de
antibiotic, cresterea culturii nu este vizibila, microorganismele fiind omorate sau inhibate
in prezenta antibioticului. Concentratia de antibiotic corespunzatoare tubului cu cea mai
mica concentratie, care inhiba cresterea vizibila a culturii microbiene, reprezinta valorea
C.M.I. (mcg/ml) pentru antibioticul respectiv. In tuburile urmatoare, inclusiv tubul martor
de crestere, mediul se tulbura ca urmare a cresterii microbiene. In tubul martor de
sterilitate, obligatoriu mediul trebuie sa ramana steril (limpede), iar pe placile cu mediu
agarizat, coloniile lipsesc. Determinarea C.M.I. se utilizeza pentru stabilirea dozei
terapeutice si a caii de administrare in cazul infectiilor severe, supravegherea evolutiei
rezistentei bacteriilor la antibiotice, cuantificarea activitatii bactericide a substantelor
antimicrobiene. Aceasta metoda permite si aflarea valorii C.M.B. (concentratia minima
bactericida) pentru antibioticul testat. Pentru aceasta, se preleveaza 0.01 ml sau 0.1 ml
din tuburile utilizate pentru tehnica dilutiilor in mediu lichid (din tubul la care s-a stabilit
valoarea C.M.I. si din tuburile anterioare care prezinta concentratii superioare de
antibiotic) si se insamanteaza pe suprafata unor placi cu mediu solid nesuplimentat cu
antibioticul testat. Dupa incubare, se va observa dezvoltarea microorganismelor la dilutia
corespunzatoare C.M.I. Valoarea C.M.B. este data de cea mai mica concentratie de
antibiotic care reduce numarul coloniilor pana la 99.9%.

2.2. Metoda E-test

La ora actuala, exista variante ale metodei difuzimetrice pentru determinarea


valorii C.M.I.. O astfel de varianta este E-testul (Epsilometer test), ce utilizeaza benzi
impregnate cu diferite antibiotice ale caror concentratii variaza exponential si sunt
inscrise pe banda respectiva. Zona de inhibitie a cresterii microorganismului testat are
aspect de elipsa, al carei diametru variaza direct proportional cu gradientul de
concentratie a antibioticului difuzat in mediu, diminuandu-se odata cu scaderea
concentratiei astfel ca, la o anumita valoare, zona de inhibitie a cresterii va intersecta
banda, concentratia inscrisa pe banda la acest nivel indicand valorea C.M.I.

3. Controlul de calitate in testarea sesibiltatii la antibiotice

Obiective:

- QC (quality control)are drept scop sa asigure:

- precizia si fiabilitatea tehnicii de testare a sensibilitatii

- performanta reactivilor utilizati

- performanta personalului care efectueaza testele.

Pentru a raspunde acestor deziderate, laboratoarele care realizeaza antibiograma


trebuie sa dispuna de tulpini de referinta :

- Escherichia coli ATCC 25922 CIP 7624


- Escherichia coli ATCC 35219

- Staphylococcus aureus ATCC 25923 CIP 7625

- Staphylococcus aureus ATCC 43300

- Staphylococcus aureus ATCC 25923 CIP 76110

- Enterococcus faecalis ATCC 29212 CIP 103214

- Haemophilus influenzae ATCC 49247

- Haemophilus influenzae ATCC 49766

- Neisseria gonorrhoae ATTC 49226

- Neisseria gonorrhoae ATTC 49226

- Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

Proceduri de control:

 Controlul de calitate trebuie sa fie realizat pentru fiecare sarja noua de mediu Mueller Hinton si /
sau antibiotic.
 Tulpinile de referinta care trebuie sa fie obligatoriu testate sunt:

o - Escherichia coli ATCC 25922

o - Staphylococcus aureus ATCC 25923

o - Staphylococcus aureus ATCC 25923

 Aceste tulpini vor fi testate in aceleasi conditii ca si cele bacteriene a caror rezistenta se evalueaza
 Antibiogramele vor fi efectuate zilnic pentru fiecare dintre aceste tulpini
 Principalele surse de eroare sunt: utilizarea unui inocul bacterian de densitate necorespunzatoare,
insamantarea (striuri rare) si masurarea neadecvata a diametrelor zonelor de inhibitie.
 Daca rezultatele nu sunt satisfacatoare, trebuie controlati urmatorii parametri:

1. citirea si interpretarea diametrelor zonelor de inhibitie

2. mediul de cultura

3. inoculul

4. discurile de antibiotice

5. tulpinile de referinta
Citirea si interpretarea

- citirea antibiogramei trebuie realizata cu ajutorul unei rigle precise si sa se evite la


maximum erorile, mentinandu-se instrumentul de masura perpendicular pe axa optica;

- trebuie verificat daca interpretarile (S, I, R) corespund diametrelor masurate;

- trebuie evitate erorile prin confuzia diferitelor tabele de citire.

Controlul mediului:

pH:

- trebuie sa fie 7,2 - 7,4

- variatiile de pH influenteaza activitatea aminozidelor, macrolidelor si fenicolilor

- controlul trebuie facut pentru fiecare sarja de mediu Mueller Hinton, cu ajutorul unui
pH-metru: se plonjeaza electrodul intr-un flacon de MH semilichid (atentie: temperatura
nu trebuie sa fie prea ridicata pentru a evita riscul aprinderii electrodului), geloza trebuie
sa se solidifice in jurul extremitatii electrodului; in acest moment se inregistreaza pH-ul.

Umiditatea:

- placile cu mediu trebuie sa fie uscate iinainte de inoculare

Concentratia in timidina sau timina:

- o concentratie prea crescuta de timidina determina o reducere a diametrelor zonelor de


inhibitie in jurul discurilor de sulfamide si trimetoprim

- pentru aceasta trebuie testat mediul MH cu o tulpina de referinta Enterococcus faecalis


ATCC 29212; diametrul de inhibitie in jurul discului de cotrimoxazol trebuie sa fie >/=
20 mm.

Concentratia in cationi divalenti:

- o concentratie prea crescuta in ioni bivalenti (in principal de Ca 2+ si Mg2+) determina o


reducere a diametrelor zonelor de inhibitie in jurul discurilor de aminozide (testate pentru
P. aeruginosa), in timp ce concentratii mai mici favorizeaza aparitia unor zone de
inhibitie prea mari

- ionii de Zn influenteaza activitatea carbapenemelor

- concentratiile trebuie sa fie : Ca2+ = 50 – 100 mg si Mg2+ = 20 - 35 mg.


Controlul inoculului:

- etalonul 0,5 Mc Farland - se poate obtine astfel:

0,5ml Mg Cl2 sol 1% (10 g/l) +

95,5 ml H2SO4 1% (10 ml/ l);

etalonul astfel preparat trebuie sa prezinte o DO de 0,08 - 0,1 la 625 nm.

- se repartizeaza aceasta solutie in volume de 10 ml, in tuburi identice cu acelea care vor
servi la prepararea inoculului

- tuburile se inchid ermetic pentru a evita evaporarea (parafilm, adeziv etc.)

- se marcheaza nivelul lichidului cu un marker si se controleaza periodic masurandu-i DO

- se conserva tuburile la temperatura ambianta, ferit de lumina (hartie de aluminiu)

- tubul etalon se agita inainte de a-l compara cu inoculul preparat: inoculul si etalonul
trebuie sa aiba aceeasi turbiditate atunci cand sunt comparate pe un fond cu dungi.

Discurile de antibiotice (tabelul 10, 11):

- inainte de utilizare, cartusul de antibiotic trebuie verificat pentru data valabilitatii,


mai ales pentru -lactamine, si pentru incarcatura discului;

- stocul de cartuse de antibiotice trebuie sa fie pastrat la -20 oC; aplicatorul incarcat
cu antibiotice trebuie pastrat la + 4 oC;

- discurile umede sau in contact direct cu gheata, sau care au fost conservate la
temperatura ambianta nu trebuie utilizate;

- cartusele trebuie scoase din frigider sau congelator cu 1-2 h inainte de utilizare.
Tulpinile de referinta:

- de la primirea lor, tulpinile de referinta vor fi izolate pe un mediu adecvat; plecand de la


aceasta cultura se fac 12 subculturi care se repartizeaza in 12 tuburi si se conserva prin
congelare la - 70 C.

Tulpina de referinta Mod de conservare Observatii


E. coli ATCC 25922, - liofilizare - conservare pe termen lung

S. aureus ATCC 25923, - congelare la - 70 oC - conservare pe termen lung

P. aeruginosa ATCC - geloza profunda - trecere regulata a tulpinii


27853
S. pneumoniae ATCC - liofilizare Alternativ se poate insamanta o
49619 - congelare la -70 oC GSC* inclinata, incubata 24 h,
apoi conservata la –20 oC.
Aceasta tehnica permite
conservarea pana la 6 luni.
*
GSC = geloza sange Columbia

In fiecare luna se va scoate un tub congelat cu tulpina / tulpinile care vor fi


testate; se refac 12 tuburi cu culturi pentru congelare, pentru anul viitor, pornind de la al
12-lea tub consevat.

Tabelul 10: Antibiotice de testat pentru cocii Gram-pozitivi


Staphylococcus Streptococcus spp Streptococcus Enterococcus spp

aureus (altii decat S. pneumoniae) pneumoniae Lista standard

Lista standard Lista standard Lista standard - ampicilina

Penicilina* penicilina G penicilina G - gentamicina

Eritromicina ampicilina sau amoxicilina ampicilina sau amoxicilina - nitrofurani

Lincomicina oxacilina oxacilina Antibiotice optionale

Pristinamicina tetraciclina cefotaxim sau ceftriaxon - oxacilina*

Kanamicina eritromicina tetraciclina - streptomicina

Tobramicina lincomicina sau clindamicina eritromicina - kaanamicina

gentamicina pristinamicna lincomicina sau clindamicina - cloramfenicol

cloramfenicol clindamicina pristinamicina - tetraciclina

etraciclina Antibiotice optionale Antibiotice optionale - eritromicina

cotrimoxazol rifampicina imipenem) - lincomicina* sau


clindamicina*
acid fusidic cefotaxim streptomicina
- pristinamicina (E. faecium)
rifampicina cefepim kanamicina
- linezolid
*- se testeaza pe geloza streptomicina gentamicina
Mueller Hinton cu 4% - cotrimoxazol
NaCl si 6 g/ml oxacilina kanamicina cloramfenicol
- rifampicina
gentamicina telitromicina
- fluorochinolone
cloramfenicol linezolid
- vancomicina (Hteicoplamina
spiramicina cotrimoxazol*
* - ajuta la identificarea
telitromicina fluorochinolone
E. faecalis (rezistenta naturala
linezolid fosfomicina

cotrimoxazol* vancomicina

ofloxacin teicoplamina
Fenotipuri de rezistenta la antibiotice la cocii Gram-pozitivi

Streptococi: Pneumococi:

Rezistenta naturala: Rezistenta naturala:

- nivel scazut la aminozide; polimixine, acid fusidic, acid nalidixic; sensibilitate -de nivel scazut la aminozide, acid
moderata la fluoroquinolone; sensibilitate scazuta la acid fusidic. fusidic, polimixina, acid nalidixic,

NB: Activitatea SXT inhibitata de prezenta timidinei in mediu (geloza Mueller Hinton - putin sensibil la pefloxacina si
cu adaos de 5% sange de cal). norfloxacina (sensibil la
sparfloxacina), bacitracina
Rezistenta dobandita la stafilococi:

rezistenta la penicilina G; fenotip MLSb inductibil la eritromicina; fenotip KT.

Rezistenta dobandita la streptococi :

la toate clasele de antibiotice cu exceptia glicopeptidelor. Rezistenta la penicilina decelata cu ajutorului discului de
Oxacilina (5/ 1 µg), incrucisata cu toate beta-lactaminele, dar de niveluri diferite (se calculeaza C.M.I.).

Tabelul 11: Antibiotice de testat pentru Enterobacteriaceae si bacili Gram


negativi nonfermentativi

Escherichia coli Salmonella Klebsiella P. aeruginosa Vibrio Haemophilus


influenzae**
Amoxicilina/ Amoxicilina/ Acinetobacter spp. Ampicilina
Cotrimoxazol Ampicilina/
Ampicilina Ampicilina Ticarcilina
Acid nalidixic Amoxicilina
Gentamicina/ Geentamicina/ Piperacilina
Tetraciclina Cefalotin
Tobramicina Tobramicina Ceftazidim Gentamicina
Cloramfenicol
ftazidim/ Ceftazidim/ Imipenem
Pristinamicina
Cefotaxim/ Cefotaxim/ Amikacina Eritromicina
Tetraciclina
Ceftriaxon Ceftriaxon Gentamicina Pefloxacina
Sulfametoxazol
Ofloxacin/ Ofloxacin/ Tobramicina Rifampicina.
Ofoxacin
Ciprofloxacin Ciprofloxacin

Cotrimoxazol Cotrimoxaszol

Acid nalidixic
*
inocul McFarland 0,5.in bulion Mueller Hinton sau in solutie salina ( 0,9% Na Cl)
pornind de la o cultura de 18 - 24 h pe mediu solid neselectiv

**
Rezistenta constitutiva: la aminopeniciline, carboxipeniciline, ureidopeniciline- -
lactamaza sensibila la inhibitori, frecvent asociata cu multirezistenta; la aminopeniciline,
cefalosporine generatia I – nonenzimatica, sensibilitatea nu este restabilita in prezenta
inhibitorilor de beta-lactamaze.

Asadar, antibiograma difuzimetrica poate permite determinarea pattern-urilor


de rezistenta constitutiva, intrinseca, nativa, precum si detectarea fenotipica a unor
mecanisme de rezistenta dobandita.

Plasarea antibioticelor pe placa intr-o anumita ordine permite citirea


interpretativa a testelor de sensibilitate la antibiotice (concept introdus de Patrick
Courvalin in 1992) si detectarea fenotipica a unor mecanisme de rezistenta la antibiotice.
4. Aplicatii practice ale citirii interpretative in evidentierea
fenotipica a diferitelor mecanisme de rezistenta la
principalele specii microbiene de interes clinic
Rezistenta S. aureus la β-lactamice

S-au evidentiat mai multe mecanisme de rezistenta la β-lactamice (tabelul 12, 13).

Tabelul 12: Mecanismele de rezistenta la agenti antimicrobieni la S. aureus


(dupa Lowy, 2003).

Genele Produsele genelor


Antibiotice rezistente Mecanismele de
rezistenta
ß-lactame blaZ ß-lactamaza 1) Hidroliza enzimatica
mecA PBA2a a nucleului ß-lactamic
(fig. 24)
2) Reduce afinitatea
pentru PBP
Glicopeptide VISA 1) Peptidoglican 1) Legarea
- alterat vancomicinei in
2) D-Ala-D-Lac peretele celular
2) Sinteza dipeptidelor
cu reducerea afinitatii
pentru vancomicina
Quinolone 1) parC 1) Componentul par 1, 2) Mutatii care au loc
2) gyrA sau gyrB C al topoizomerazei in regiunea QRDR
IV reduc afinitatea
2) Componentele Gyr complexului ADN-
A sau GyrB ale enzima pentru
girazei quinolone
Trimethoprim- 1) Sulfonamide: 1) Dhidropteroat 1) Supraproductia de
sulfamethoxazol sintaza acid amino-benzoic de
sal A 2) Dhidrofolat catre enzime
reductaza 2) Reducerea afinitatii
2)TMP:dfrB pentru DHFR
Quinopristin- 1)Q:ermA 1) Metilaze 1) Reduce legarea la
dalfopristin ribosomale subunitatea ribosomala
(Q-D) ermB 2) Acetiltransferaze 23S
2) Modificarea
ermC enzimatica a
dalfopristinului
2)D:vat, vatB
Tabelul 13: Mecanismele de rezistenta la ß -lactamice la S. aureus (dupa Lowy,
2003).

Mecanism Penicilina G Antibiotic + Penicilina Cefalosporine


inhibitor de M Carbapeneme
Penicilina A β-lactamaze

Carboxipenicilina

Ureidopenicilina
Salbatic S S S S
Penicilinaza R S S S
Modificarea R R R R
PLP,
gena mecA
BORSA R S/R R S
MODSA S S R S

BORSA = S. aureus borderline; MODSA = S. aureus modificat.

Rezistenta la meticilina (respectiv oxacilina) este considerata un marker al


polirezistentei incluzand: cefalosporinele, eritromicina si clindamicina, iar
izbucnirile intraspitalicesti cu acest tip de tulpini au creat probleme deosebite
terapeutice, antiepidemice si de cost al spitalizarii (Codita, 1993).

Detectarea producerii de β-lactamaza este obligatorie pentru toate tulpinile de


stafilococ care prezinta un diametru la penicilina mai mare de 28 mm sau tulpinile de N.
gonorhoeae sau Hemophilus spp.

- exista mai multe tehnici: acidimetrice, cromogenice si iodometrice

- testele pentru detectarea β-lactamazei trebuie sa fie rapide (implicatii terapeutice) si sa


preceada realizarea antibiogramei.
Fig. 24. Inducerea sintezei ß-lactamazei stafilococice in prezenta penicilinei.

BlaI se leaga de regiunea operator, astfel incat se represeaza transcrierea ARN atat pentru
blaZ, cat si pentru blaR1-blaI; II Legarea penicilinei la BlaR1 stimuleaza activarea
autocatalitica a BlaR1; III-IV BlaR1 cliveaza BlaI in fragmente inactive permitand
transcrierea blaZ si blaR1-BlaI; V-VIII ß-lactamaza, enzima extracelulara codificata de
blaZ (V) hidrolizeaza ciclul ß-lactamic al penicilinei (VI), in consecinta produce
inactivarea (VII); Schema operonului care codifica rezistenta la meticilina a S. aureus.
Expunerea MecR1 la un antibiotic ß-lactamic induce sinteza MecR1; MecR1 inactiveaza
MecI, permitand sinteza lui PBP2a (dupa Kernodle, 2000).

Testul treflei:

Se insamanteaza o tulpina de S.aureus ATCC 25923 pe o geloza Muller-Hinton


(sau M-H cu sange Chocolat pentru N.gonorroeae si Haemophilus); Se aplica un disc de
peniciclina G in centrul placii (sau de ampicilina in cazul Haemophilus); Se insamanteaza
in striuri radiale (din centrul placii spre periferie) tulpina de testat, o tulpina S. aureus
ATCC 25923 (sensibila la penicilina G), o tulpina de S. aureus ATCC 43300 (rezistenta la
penicilina G) (fig. 25). Se incubeaza placa 18 h la 35°C in atmosfera normala (sau 24 h in
atmosfera imbogatita cu CO2 pentru Haemophilus si N. gonorrhoeae).
Fig. 25. Reprezentarea testului de detectare a producerii de β-lactamaza prin metoda
treflei

(dupa Codita si colab., 2005)

Se suspecteaza existenta β- lactamazei daca se observa o diferenta intre diametrul


de inhibitie realizat in cele 2 cazuri, in favoarea AMC, cele 2 diametre fiind in categoria
sensibila a valorilor critice admise pentru tulpina testata.

Rezistenta la meticilina in cazul stafilococului auriu este de multe ori asociata cu


mecanisme de rezistenta care determina inactivarea altor familii de antibiotice. S. aureus
rezistent la meticilina prin modificarea PLP este adesea rezistent la aminozide (amikacina
si tobramicina si in peste peste 90% din cazuri la gentamicina), la fluoroquinolone,
macrolide, lincosamide si ketolide, la fosfomicina si uneori la rifampicina. Ca regula
generala, raman active pe stafilococ glicopeptidele, acidul fusidic, streptograminele,
rifampicina si oxazolidinonele.

Rezistenta enterococilor la β-lactamice

La enterococi, rezistenta la β-lactamine se realizeaza prin producerea β-


lactamazei si prin modificarea tintei (ce confera rezistenta naturala la cefalosporine,
oxaciline si monobactami si sensibilitate diminuata la peniciline).

Streptococcus pneumoniae prezinta rezistenta dobandita la penicilina prin


producerea de -lactamaze, evidentiata fenotipic prin testarea sensibilitatii la oxacilina,
utilizand discuri de oxacilina (Ox , 5µg). Rezistenta la penicilina este incrucisata pentru
toate β-lactaminele, dar prezinta diferite niveluri de expresie in functie de antibiotic.
Activitatea amoxicilinei si cefalosporinelor din generatia a treia a este mai putin
modificata decat cea a penicilinei G.

In ceea ce priveste cefalosporinele din prima si a doua generatie si cele orale,


indiferent de generatie, cu exceptia cefpodoximului, ele sunt mai putin active decat
penicilina G.
β-lactamine active Penicilina G -lactamine mai putin
active
Imipenem Ampicilina Piperacilina
Amoxicilina Cefpodoxin Cefuroxim
Cefotaxim Cefoperazon
Ceftriaxon
Oxacilina

Cefixim

Cefaclor

Cefotetan

Rezistenta la β-lactamine este asociata in proportie de peste 50% cu rezistenta la


alte antibiotice ca: tetraciclinele, macrolidele, cloramfenicolul sau trimetoprim-
sulfametoxazolul (fig. 26). Unele esecuri terapeutice ar putea fi date de fenomenul de
toleranta la penicilina, datorat modificarilor controlului activitatii autolitice, ducand in
vivo la selectarea mutantelor peni-R (raportul CMB/CMI > 32).

Toate tulpinile cu diametrul de inhibitie <26 mm trebuie testate CMI pentru


penicilina, amoxicilina, cefotaxim si toate antibioticele utilizate in tratament.

AMX CXM CTX MNO


amoxicilina cefuroxim cefotaxim minociclina
SXT
CPD CEC
trimetroprim-
cefpodoxim cefaclor
sulfametoxazol
OXA CFM RA
DTM
oxacilina cefixime rifampicina
C KAN CRO PT
cloranfenicol kanamicina forte cefpiroma pristinamicina
AMX PIP CTX OXA
GM KAN GEN SXT
RA VA TEC FOS
Fig. 26. Tulpini de Streptococcus pneumoniae multi-rezistente la antibiotice (original)
Tulpinile de Streptococcus pneumoniae sunt foarte sensibile la optochin, testul la optochin
constituind unul dintre testele simple de identificare sau de confirmare a speciei si de diferentiere fata de
ceilalti streptococi α – hemolitici (testul Lund 1959). La concentratii de 1 / 500.000 – 1 / 1.000.000,
optochinul are actiune bactericida pentru pneumococi, in timp ce pentru ceilalti streptococi este nevoie de
doze mult mai mari de 1 / 5.000. Se insamanteaza tulpina de testat pe o placa cu geloza sange continand
optochin 0.05% in paralel cu insaamantarea pe o placa de control fara optochin. In jurul pulberii de optochin
apare o zona de inhibitie a cresterii, cu un diametru de peste 20 mm (Fig. 27).

Fig. 27. Pneumococ α-hemolitic sensibil la Optochin (original).

Rezistenta la β-lactamine la alte specii de streptococi


Se pare ca doar un numar redus de specii ( streptococi orali; S. oralis, S. sanguis,
S. mitis) prezinta sensibilitate diminuata la penicilina G (dupa CLSI).

Evidentierea fenotipica a rezistentei la -lactamice a


enterobacteriilor
Dupa sensibilitatea lor naturala la antibioticele β-lactamice, Enterobacteriile sunt
clasificate in 4 grupe. Clasificarea are la baza comportamentul fata de urmatoarele
antibiotice β-lactamice: aminopeniciline, aminopeniciline + inhibitori ai β-lactamazelor
(IBL), carboxipeniciline, ureidopeniciline, cefalosporine din prima generatie (CIG),
cefalosporine din a II a generatie (CIIG), cefalosporine din a III a generatie (CIIIG),
cefalosporine din a IV a generatie CIVG (cu spectru larg), CIIIG + IBL, carbapeneme,
cefamicine.

Grupa I

In aceasta grupa sunt clasate tulpinile de Escherichia coli, Proteus mirabilis,


Salmonella ssp. si Shigella spp. (tabelul 14 ). Aceasta grupa prezinta 4 fenotipuri mai
frecvente:

Fenotipul 1: tulpini sensibile la toate β-lactamicele (au fost evaluate la


aproximativ 60% din frecventa acestei tulpini);

Fenotipul 2: tulpini producatoare de cefalosporinaze cromosomale de nivel scazut


(aproximativ 5% din tulpini).

Fenotipul 3: tulpini producatoare de penicilinaze. Aceasta enzima este in general


transferabila si poate fi exprimata la nivele mai mult sau mai putin importante (au o
frecventa de aproximativ 30% din tulpini).

Fenotipul 4: tulpini producatoare de penicilinaze rezistente la inhibitori.

Grupa II

Aceasta grupa este reprezentata de tulpinile de Klebsiella spp., Citrobacter koseri,


C. amalonaticus, E. Hermannii (tabelul 15).

Fenotipul 1: tulpini rezistente la concentratii scazute de amoxicilina si de


ticarcilina.

Fenotipul 2: tulpini producatoare de penicilinaze plasmidiale. Nivelul de


producere al acestor penicilinaze este variabil, dar in general scazut.

Fenotipul 3: tulpini producatoare de BLSE β-lactamaze de spectru larg. Aceste


tulpini sunt rezistente la o concentratie relativ scazuta de cefalosporine de a III a
generatie. Pot fi evaluate frecvent la aceste tulpini la aproximativ 15% din toate speciile
de Klebsiella.

Grupa III

Este reprezentata de tulpini de Enterobacter spp., Serratia spp., Proteus indol (+)
si Morganella, Providencia spp., Citrobacter freundii (tabelul 16).

Fenotipul 1: tulpini cu rezistenta naturala la amoxicilina si la cefalotin, ca urmare


a exprimarii de cefalosporinaze cromosomale;

Fenotipul 2: tulpini rezistente la amoxicilina, cefalotina si la ticarcilina, prin


producerea unei penicilinaze plasmidiale;

Fenotipul 3: tulpini rezistente la cefalosporinele de generatia a III a;

Fenotipul 4: tulpini de Proteus vulgaris producatoare de cefalosporinaze sensibile


la acid clavulanic (cefuroximaze).

Grupa IV

Grupeaza tulpini de Yersinia rezistente la amoxicilina, ticarcilina, cefalotin si


cefoxitin, dar sensibile la pipercilina (tabelul 17).

Tabelele urmatoare exprima diferitele fenotipuri de rezistenta (ca si


fenotipurile salbatice) stabilind manifestarea fenotipica a productiei de β-
lactamaze in fiecare grup. Cateva fenotipuri particulare pot fi datorate altor
mecanisme. Producerea unei enzime de catre o bacterie nu raspunde la legea
tot sau nimic ci exista niveluri intermediare de exprimare ce pot fi detectate
fenotipic prin citire interpretativa foarte utile in intelegerea dinamicii
fenomenului de antibiorezistenta.

Tabelul 14: Fenotipuri de rezistenta la antibioticele beta-lactamice la


enterobacteriile din grupa I . E.coli, P.mirabilis, Salmonella spp., Shigella spp.

Antibiotic Fenotip Penicilinaza nivel Penicilinaza nivel


salbatic scazut ridicat
Aminopeniciline S R R
Aminopeniciline + S S I/R
IBL
Carboxipeniciline S R R
Ureidopeniciline S I/R I/R
CIG S I I/R
CIIG S S S/R
CIIIG S S S
CIIIG + IBL S S S
Cefamicine S S S
CIVG (1) S S S
Carbapeneme S S S

R = rezistent, S = sensibil, I = intermediar, (1) cefalosporine cu spectru larg :


cefepim si cefpirom

Antibiotic Cefalosporinaza1 TRI 2 BLSE3 CHN4


Aminopeniciline R R R R
Aminopeniciline + IBL R R R R
Carboxipeniciline S R R R
Ureidopeniciline S R R R
CIG R S R R
CIIG S S R R
CIIIG S S R R
CIIIG S S S R
Cefamicine S/R S S R
CIVG S S R S
Carbapeneme S S S S

1-E.coli si Shigella, 2-TEM rezistent la inhibitori, 3-β-lactamaza cu spectru extins, 4-


cefalosporinaza de nivel ridicat

Tabelul 15: Fenotipuri de rezistenta la antibioticele beta-lactamice la


enterobacteriile din grupa a II a : Klebsiella spp.,Citrobacter koseri, C.amalonaticus,
E.hermannii

Antibiotic Fenotip Penicilinaza BLSE CHN


salbatic (1) nivel ridicat

Aminopeniciline R R R R
Aminopeniciline +IBL S R R R
Carboxipeniciline R R R R
Ureidopeniciline I R R R
CIG S R R R
CIIG S I/R R R
CIIIG S S R R
CIIIG + IBL S S S R
Cefamicine S S S R
CIVG S S R S
Carbapeneme S S S S

(1) penicilinaza de nivel scazut


Tabelul 16: Fenotipuri de rezistenta la antibioticele beta-lactamice la
enterobacteriile din grupa a III a : Enterobacter spp., Serratia spp., Providencia spp.,
Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, P. penneri, Morganella. spp.

Antibiotic Fenotip Penicilinaza BLSE CHN


salbatic (1) de nivel
ridicat
Aminopeniciline R R R R
Aminopeniciline + IBL R (2) R R R
Carboxipeniciline S R R R
Ureidopeniciline S R R R
CIG R R R R
CIIG S/R R R R
CIIIC S S R R
CIIIG + IBL S S S R
Cefamicine S/R S/R S/R R
CIVG S S R S/I
Carbapeneme S S S S

(1) cefalosporinaza inductibila, (2) cefalosporinaza inductibila numai pentru P.


vulgaris si P. penneri

Sinergismul dintre augmentin si cefotaxim si/sau aztreonam si/sau cefepim si/sau


cefpirom, permite detectia anumitor BLSE. Cefepimul sau cefpiromul sunt utile in
detectia unei BLSE in prezenta unei CHN.

Tabelul 17: Fenotipuri de rezistenta la antibioticele -lactamice a


enterobacteriilor din grupa a IV a: Yersinia enterocolitica

Antibiotic Fenotip salbatic BLSE


Aminopenicilina R R
Aminopeniciline + IBL R R
Carbeniciline R R
Ureidopeniciline I/R R
CIG R R
CIIG S R
CIIIG S R
CIIIG + IBL S S
Cefamicine S S
CIVG S R
Carbapeneme S S

Unele tulpini de K.oxytoca, P.vulgaris, P. penneri si Citrobacter koseri sunt


hiperproducatoare de <aztreonamaza>, o penicilinaza cromosomala (tabelul 16).
Tabelul 18: Fenotipuri de rezistenta la -lactamice a tulpinilor producatoare de
“aztreonamaza”:

Antibiotic Fenotip
Aminopeniciline R
Aminopeniciline + IBL R
Carboxipeniciline R
Ureidopeniciline R
CIG R
CIIG R
Ceftriaxon R
Cefotaxim S/R
Ceftazidim S
AZTREONAM R
Cefamicina S
Carbapeneme S

Rezistenta la carbapeneme apare prin urmatoarele mecanisme:

- impermeabilitate ( P. mirabilis, E.aerogenes)

- impermeabilitate si producere de cefalosporinaza de nivel ridicat ( E.


cloacae, E. aerogenes, P. rettgeri)

- carbapenemaze : de tip penicilinaza, inactiva asupra CIIIG (E. cloacae); de


tip metalo-enzima, care hidrolizeaza CIIIG si carbapenemele.

Rezistenta P. aeruginosa la β-lactamice

La P. aeruginosa, rezistenta naturala este indusa prin mecanisme de


impermeabilitate, eflux, producerea enzimelor inactivatoare si modificarea tintelor.

Fenotipul salbatic este legat de producerea unei cefalosporinaze inductibile in


prezenta aminopenicilinelor si cefalosporinelor din prima si a doua generatie, cuplata cu
o impermeabilitate mai mult sau mai putin marcata si de un sistem de eflux constitutiv,
care determina aparitia unui fenotip rezistent la aminopeniciline, ca atare sau asociate cu
inhibitori ai β-lactamazelor si la cefalosporine de prima si a II a generatie, cu conservarea
sensibilitatii la carboxipeniciline, ureidopeniciline, la anumite cefalosporine de generatia
a III a, la monobactami si carbapeneme.

Rezistenta dobandita apare in urma manifestarii mecanismelor enzimatice


(penicilinaze, cefalosporinaze, BLSE, metalo-enzime) sau neenzimatice
(impermeabilitate, eflux si modificarea tintelor) (tabelul 19 ).

Rezistenta dobandita enzimatica este mediata de:


a) penicilinaze plasmidiale transferabile cum ar fi: PSE, TEM, OXA (nivel
scazut sau ridicat) care se materializeaza prin rezistenta la carboxipeniciline,
ureidopeniciline, cefoperazona si sensibilitate la: ceftazidim, cefepim, imipenem si
inhibitori de β-lactamaze.

b) BLSE:

- tip penicilinaza (TEM, SHV, PER, VEB) care dau sensibilitate la imipenem,
carboxipeniciline+ IBL si ureidopeniciline+ IBL

- tip oxacilinaza (OXA-2, OXA-10) : sensibilitate la imipenem

c) cefalosporinaze cromosomale derepresate:

- hiperproduse care confera rezistenta la toate β-lactamicele,cu exceptia cefepimului si


imipenemului

- hiperproduse cu nivel inalt care confera sensibilitate doar la imipenem

d) carbapenemaze care dau sensibilitate doar la aztreonam

Rezistenta dobandita neenzimatica este indusa prin:

a) trei sisteme de eflux: MexA, MexB si OprM, constitutiv, confera rezistenta


naturala la carboxipeniciline si aztreonam; MexC, MexD si OprJ, confera rezistenta la
cefepim si cefpirom; MexE, MexF si OprN, cuplata adesea cu D2, confera rezistenta la
imipenem.

b) deficit de porine - se refera la pierderea porinelor - care dau rezistenta


variabila la carbapeneme (uneori asociata cu o cefalosporinaza derepresata)

c) modificarea LPS-ului duce la permeabilitate diminuata pentru toate β-


lactamicele, cu exceptia imipenemului.

d) modificarea PLP-urilor 2 si 4 caredau rezistenta la imipenem si 3 care


genereaza rezistenta la toate β-lactamicele, cu exceptia imipenemului

Tabelul 19: Evidentierea fenotipurilor de rezistenta la betalactamice pe baza


citirii interpretative la Pseudomonas aeruginosa

Antibiotic Fenotip Penicillinaza(1) CHN(2)


salbatic
Aminopeniciline R R R
Aminopeniciline +IBL R R R
S R R
Carboxipeniciline
Ureidopeniciline S R R
Cefalosporine 1a generatie R R R
Cefalosporine 2a generatie R R R
Cefalosporine 3a Cefoperazona S R R
generatie Ceftazidim S S R
Cefsulodin S S R
(4)
Cefalosporine de spectru larg S S Cefepim
S/R
Aztreonam S S R
Carbapeneme S S S

(1) Ticarcilina +acid clavulanic: S ; Piperacilina+tazobactam : S

(2) Cefalosporinaza de inalt nivel

(3) IBL : inhibitor de beta-lactamaza

(4) in functie de nivelul de producere

Tabelul 20: Fenotipuri de rezistenta la β-lactamice la Stenotrophomonas


maltophilia

Fenotip Hiper- Sensibil Imipenem-S Altele


sensibil
CAZ-S/CAZ-
R
Amoxicilina R R R R R
Amoxicilina-AC R R R S R
Ticarcilina S R R R R
Ticarcilina-AC S S S S V
Ceftazidim S S R S R
Aztreonam S R R R R
Imipenem R R R S R
Frecventa (%) 5-10 20-30 ; 40-50 <1 5-20

Activitatea si expresia β-lactamazelor

L1 (rezistenta la AC) + + + - V
L2(sensibilitate la AC) +/- + ++ + V

S = sensibil; R = rezistent; I = intermediar; V = variabil; AC= acid clavulanic;


CAZ = ceftazidim

Rezistenta la β-lactamine la Acinetobacter spp.


Rezistenta naturala se manifesta aproape fara exceptie la aminopeniciline,
cefalosporine de prima generatie si de generatia a II a.

Rezistenta dobandita (tabelul 21) este indusa prin mai multe mecanisme :

 producerea de β-lactamaze de tipul penicilinazelor plasmidiale TEM (1 si


2), CARB5

 oxacilinaze: OXA21

 cefalosporinaze cromosomiale ACE 1 – ACE 4 care hidrolizeaza toate


cefalosporinele

 combinarea mecanismelor de tipul: impermeabilitate, modificarea PLP-


urilor, producerea de enzime (induc rezistenta la imipenem)

Tabelul 21: Fenotipuri de rezistenta la β-lactamice la Acinetobacter spp

Fenotip I II III IV V
Mecanism - Penicilinaza Cefalosporinaza Penicilinaza+ Acumulare
cefalosporinaza de
mecanisme
Carboxi si S R S R R
ureidopeniciline
Cefalosporine S S R R R
din gen. a III a
Aztreonam S S R R R
Carbapeneme S S S S R
Frecventa 5% 4% 35% - -

Rezistenta la β-lactamine la Haemophilus influenzae

Se datoreaza mai multor mecanisme, cel mai frecvent fiind producerea de β-


lactamaze, care a aparut la 30% dintre tulpinile izolate din infectii bronho-pulmonare la
adulti. Aceste β-lactamaze sunt plasmidiale de tip TEM, mai rar ROB care inactiveaza
aminopenicilinele, carboxi- si ureidopenicilinele. In general raman active asociatia
amoxicilina-acid clavulanic si cefalosporinele din generatia a III-a. Producerea β-
lactamazelor este usor de evidentiat prin teste cromogenice (nitrocefin).

Un alt mecanism de rezistenta destul de frecvent este modificarea tintei. De


obicei sunt tulpini necapsulate, rezistenta datorandu-se alterarii uneia sau mai multor
PLP-uri si confera rezistenta de nivel scazut la toate antibioticele din aceasta clasa.

Rezistenta la imipenem
Se pare ca s-ar datora diminuarii permeabilitatii membranei externe printr-un
mecanism inca neelucidat. Exista in acest sens printre tulpinile sensibile la ampicilina un
numar de tulpini rezistente la imipenem.

5. Metode fenotipice calitative si cantitative de evidentiere a beta-lactamazelor

Identificarea definitiva a acesor enzime este posibila numai prin tehnici de


secventiere a proteinelor si genelor, tehnici care sunt totusi mult prea costisitoare pentru a
fi utilizate in clinica si diagnostic. Totusi, metode mai simple de evidentiere si
caracterizare a β – lactamazelor sunt disponibile pentru laboratoarele clinice.

A.1.Teste fenotipice bazate pe antibiograma difuzimetrica


 Antibiograma difuzimetrica calitativa clasica (metoda Kirby – Bauer)

BLSE pot fi sintetizate in cea mai mare parte de catre enterobacterii si


sunt reproduse cel mai adesea in antibiograma prin imaginea uni sinergism (dop
de sampanie) intre un disc de cefalosporina de generatia a III-a si /sau
monobactam si un disc de amoxicilina + acid clavulanic.

Dar aceasta imagine poate fi discreta sau atipica. Secretia de BLSE va fi


suspectata mai intai, de micsorarea tuturor diametrelor de inhibitie la toate
cefalosporinele de generatia a 3-a : CTX ≤ 27 mm, CAZ ≤ 22mm, CRO ≤ 25mm,
ATM ≤ 27mm (tabelul 22). O tulpina de referinta trebuie testata in aceleasi
conditii in scopul verificarii validitatii discurilor de antibiotice. Prezenta unei BLSE
indica faptul ca tulpina este rezistenta la toate β lactaminele cu exceptia
imipenemului si cefamicinei (Fig. 28).

Antibiotic ESBL tip TEM ESBL tip SHV


Amoxicilina / Ampicilina R R
Amoxicilina + acid clavulanic S S
Piperacilina R R
Cefoxitina S S
Cefuroxima S R
Cefotaxima S S/I/R
Ceftazidima S R

Aztreonam S R
Cefepima S S/I/R
Imipenem S S

Tabelul nr 22: Diferentierea ESBL tip TEM de ESBL tip SHV prin metoda
difuzimetrica
Fig. 2 Aspectul antibiogramei la tulpini de E. coli producatoare de ß-lactamaze de spectru
larg:

stg. – aspecte de sinergism (original).

 Antibiograma difuzimetrica cantitativa prin metoda


E-test.
Principiu: Aceasta metoda se bazazeaza pe proprietatea ESBL de a fi sensibile la
inhibitori de β-lactamaze (acidul clavulanic). Exista si exceptii de la aceasta regula –
enzimele de tip IRT (Inhibitor Rezistant TEM β–lactamase).

Benzile E-test contin un gradient de Cefotaxim la un capat si un gradient de


Cefotaxim si acid clavulanic la celalat capat. Concentratia de Cefotaxim este mai mica in
cazul in care acesta este asociat cu acidul clavulanic conform tabelului 23:

Tabelul 23: Concentratiile de antibiotic pe strip-urile E-test

Cefotaxim (mg/L) Cefotaxim (mg/L) + ac. Clavulanic


0,50 0,125
0,75 0,19
1 0,25
1,5 0,38
2 0,5
3 0,75
4 1
6 1,5
8 2
12 3
16 4
24 6
32 8

Benzile similare continand gradiente de ceftazidim / ceftazidim + clavulanat (TZ /


TZL) sunt deasemenea disponibile si sunt mai potrivite pentru detectarea tipului
enzimatic CTX-M.

Daca raportul dintre concentratia minima inhibitorie (CMI) de Cefotaxim si CMI


de Cefotaxim + clavulanat este mai mare de 8 rezulta ca tulpina respectiva este
producatoare de ESBL-uri.

Alternativ, se pot inregistra urmatoarele aspecte ale placii in urma incubarii:

 Crestere bacteriana de-a lungul intregii benzi (lipsa elipsei de inhibitie)


indica faptul ca valoarea respectiva de CMI este mai mare decat cea mai mare
valoare din scala (Fig. 29).

 O elipsa de inhibitie dedesubtul gradientului arata o valoare a CMI mai


mica decat

cea mai mica valoare din scala.

 Aparitia unei “zone fantoma” plasata sub gradientul CT, desi o zona de
inhibitie clara in jurul capatului CT nu s-a evidentiat, indica producerea de ESBL
(Fig. 30).

 Aparitia unei elipse de inhibitie deformate inspre capatul tiparit indica


producerea de ESBL, datorita sinergismului dintre cefotaxim (CT) si acidul
clavulanic difuzat dinspre regiunea CTL (Fig 31).
Fig. 32. Aspectul E-Test la o tulpina de E.coli J53 (SHV-2) producatoare de ESBL
(dupa L. Stratchounski, I si colab., 2003)
CMIAMC 12 mg/L
CMIPTZ 1,5 mg/L
CMICPS1 mg/L

Fig. 33. Aspectul E-Test la o tulpina de K.pneumoniae producatoare de ESBL (dupa


L. Stratchounski, I si colab., 2003)
(SHV-2 + SHV-1 + TEM-1)
CMIAMC 48 mg/L
CMIPTZ 64 mg/L
CMICPS 4 mg/L

A.2. Metoda discurilor duble

Aceasta metoda presupune compararea diametrelor zonelor de inhibitie date de


un disc impregnate cu o cefalosporina de spectru larg singura cu un alt disc impregnat cu
acelasi antibiotic asociat cu un inhibitor de β–lactamaze (acidul clavulanic). Daca tulpina
testata produce o enzima de tip ESBL, diametrul zonei este mai mare pentru discul ce
contine antibiotic + inhibitor. NCCLS recomanda compararea diametrelor zonelor de
inhibitie date de catre cefotaxim 30 µg/disc cu cele ale cefotaximului + acid clavulanic
30 +10 µg/disc, precum si ceftazidim 30 µg/disc cu cele ale ceftazidimului + acid
clavulanic 30 + 10 µg/disc. M’zali si colab., 2000 au evaluat discuri cu antibiotice si
inhibitori tip MAST DD, folosind metode conform indicatiilor NCCLS, si au obtinut o
sensibilitate de 93% a acestei metode pentru tulpini bacteriene control, producatoare de
ESBL–uri, in timp ce perechile de ceftazidim si cefotaxim s-au dovedit a avea o
sensibilitate mai scazuta: 86% si respectiv 66%.

O varianta a metodei discurilor duble cu antibiotice (produse de OXOID) se


bazeaza pe compararea diametrelor zonelor de inhibitie produse de cefpodoxim 10
µg/disc si cefpodoxim + clavulanat 10 + 1 µg/disc. Producerea de ESBL-uri este
confirmata daca diametrul zonei de inhibitie data de discul ce contine si clavulanat este
cu 5 mm mai mare decat diametrul zonei discului fara inhibitor (Carter si colab., 2000).

 Testul dublei difuzii pentru detectarea ESBL

Pe o placa cu mediu Mueller Hinton inoculata cu tulpina de testat (cultura de 24 h,


insamantare pe placa prin tehnica tamponului) se aplica discuri cu amoxicilina /
clavulanat (AMC) si ceftazidim (CAZ) la 25 -30 mm distanta (Jarlier si colab., 1988 ). De
cealalta parte a discului AMC se plaseaza un disc continand o alta cefalosporina, de
preferat cefotaxim (CT ).

Se incubeaza peste noapte la 37oC.

Producerea de ESBL este certificata daca diametrul zonei de inhibitie este extins
din cauza clavulanatului ( inhibitorul de β-lactamaze) (Fig 34, 35).

Avantajul acestei metode simple este costul scazut; dezavantajul este acela ca
separarea optima a discurilor poate varia cu fiecare tulpina. Izolatele cu ESBL-uri de tip
TEM si SHV dau rezultate pozitive, in schimb cele cu enzime de tip CTX-M dau un
rezultat pozitiv numai atunci cand cefotaximul sau cefpodoximul inlocuiesc ceftazidimul,
ca indicator de cefalosporine.
Tulpinile producatoare de ApmC si majoritatea tulpinilor hiperproducatoare de
enzime K1, dau rezultate negative, cu toate cele trei cefalosporine.

Fig. 34. Detectarea producerii de ESBL prin testul dublei difuzii.

Discuri cu antibiotice: stanga: CAZ, centru: AMC, dreapta: CT (original).

Fig. 35. Detectarea ESBL prin testul dublei difuzii AMC-amox. si acid clavulanic
in centru; . CAZ-Ceftazidim. ATM-Aztreonam, CTX-Cefotaxim, CRO-Ceftriaxone
(dupa Shah si colab., 2003).

Se recomanda utilizarea discurilor de cloxacilina pentru detectarea


penicilinazelor (acest antibiotic inhiba cefalosporinazele);

N.B. – inoculul dens poate masca hiperproductia de beta-lactamaze;


N.B.- cand sinergismul nu este vizibil din cauza fuzionarii zonelor de inhibitie, se
indeparteaza discurile (30 mm) sau se taie discurile de antibiotic in patru.

N.B.- existenta unor discrepante mari intre diametrul zonelor de inhibitie la CAZ
si CTX se datoreaza prezentei unei alte enzime pe langa ESBL (ex. β-lactamaze AmpC la
Enterobacter cloacae).

Teste pentru confirmarea prezentei β-lactamazelor cromosomale inductibile (β-


lactamaze tip AmpC)

Cefalosporinele de generatie I (ampicilina si amoxicilina) induc exprimarea


enzimelor tip AmpC si sunt distruse de catre acestea, la majoritatea speciilor de
Enterobacteriaceae. Consecutiv, tulpinile bacteriene producatoare de β-lactamaze
inductibile tip AmpC devin rezistente constitutiv. Speciile producatoare de β-lactamaze
inductibile tip AmpC segrega mutante derepresate care produc enzime AmpC fara
inductie (derepresie stabila). Aceste mutante sunt rezistente la aproape toate penicilinele
si cefalosporinele (Livermore si colab, 2001) si sunt de asemeni frecvente in izolatele
clnice.

Speciile producatoare de β-lactamaze tip AmpC pot fi recunoscute prin teste de


antagonism intre cefoxitim si cefotaxim (Sanders si colab. 1982). Pentru efectuarea
acestui test se inoculeaza placi, conform protocolului din metoda antibiogramei, si se
plaseaza discuri cu ceftazidim si cefoxitim, pe acceasi placa, la o distanta de 25 mm.
Inductia de β-lactamaze este evidentiata prin aplatizarea zonei de inhibitie a
ceftazidimului in dreptul discului de cefoxitim. Astfel, cefoxitimul a determinat
producerea de β-lactamaze iductibile care au hidrolizat ceftazidimul (Fig 36).

Acidul clavulanic este un inductor al β-lactamazelor tip AmpC si de aceea aparitia


unor mici colonii in interiorul zonei de inhibitie a discului AMC (amoxicilina - acid
clavulanic) poate fi un indicator util pentru detectarea prezentei enzimelor AmpC.
Fig. 36: Detectarea β-lactamazelor inductibile tip AmpC. Discul cu diamterul
zonei de inhibitie mare este ceftazidim (CAZ). Cel cu diamtrul foarte mic este
cefoxitim (FOX) (original).

Au fost concepute numeroase teste directe de detectare a activitatii β-lactamazice,


dar numai o parte se preteaza ca analize de rutina. Majoritatea folosesc cefalosporine
cromogene, sau coreleaza hidroliza penicilinei cu o schimbare a culorii mediului de
reactie, mediata de iod sau detectata cu un indicator de pH.

Cefalosporinele cromogene sunt foarte specifice, in timp ce acidifierea mediului


si reducerea iodului se poate datora si altor cauze decat actiunii β-lactamazelor, generand
rezultate fals pozitive. Datorita slabei specificitati a testului iodometric ar trebui realizate
in paralel controlale pozitive si negative pentru toate testele.

Testul la nitrocefin

Nitrocefinul este o cefalosporina care poate functiona ca substrat cromogen pentru


β-lactmaze, si isi schimba culoarea de la galben la rosu atunci cand este hidrolizat. Acesta
reprezinta testul cel mai sensibil pentru majoritatea β–lactamazelor, exceptand
penicilinazele stafilococice. Avantajul folosirii acestui antibiotic in testele de evidentiere
consta in faptul ca el este hidrolizat de toate β – lactamazele cunoscute, indiferent de
specificitatea acestora.

Nitrocefinul este disponibil sub forma de pudra purificata de la Becton Dickinson


(Oxford, UK) sau discuri imbibate cu antibiotic (OXOID).

Coloniile bacteriene sunt raclate de pe mediul nutritiv solid si resuspendate in


tampon fosfat obtinandu-se o suspensie densa, peste care se adauga solutie nitrocefin.
Activitatea β-lactamazica este evidentiata prin aparitia culorii rosii in 1 - 2 minute. In
cazul enzimelor cu activitate mai mica raspunsul poate intarzia, insa rezultatele pozitive
aparute la mai mult de 10 minute trebuie tratate cu scepticism intrucat ele pot fi cauzate
de o activitate β–lactamazica secundara a proteinelor care leaga penicilina (penicillin
binding protein - PBP) care formeaza complexe acil instabile (O’Callaghan si colab.,
1972).

Avantajul acestei metode consta in rapiditatea cu care se pot obtine rezultate


despre prezenta β-lactamazelor.

Testul iodometric

Hidroliza penicilinei determina formarea acidului peniciloic, care reduce iodul,


decolorand complexul iod–amidon. Aceasta proprietate poate fi exploatata pentru a
detecta activitatea β–lactamazica in tuburi sau pe hartie. Aceste teste sunt sensibile pentru
penicilinazele stafilococice, dar sunt mai putin sensibile decat nitrocefinul pentru
majoritatea β–lactamazelor provenite de la bacterii Gram negative.
 Metoda in tub: Se poate efectua in cantitati mici atat in tuburi, cat si in
placi cu godeuri. Se distribuie benzilpenicilina (penicilina G) in tampon fosfat, in
godeurile unei placi. In aceasta solutie se suspenda cultura bacteriana, solida (de
pe agar) si se pastraza la temperatura camerei pentru aproximativ 30 – 60 minute.
Se adauga amidon solubil in apa distilata si ulterior iod in solutie de iodura de
potasiu. Activitatea β – lactamazica este demonstrata prin decolorarea iodului in
maxim 5 minute (Catlin, 1975). Sunt necesare teste de control pozitive si negative
deoarece alte proteine pot de asemenea reduce iodul, iar un inocul concentrat
poate da rezultate fals pozitive.

 Metoda pe benzi de hartie: Se foloseste hartie de filtru Whatman nr.3,


imbibata in solutie de amidon dizolvat in apa distilata la fierbere, la care s-a
adaugat benzil – penicilina la racire. Cand benzile de hartie iodometrica s-au uscat
(aproximativ 2 ore), acestea sunt inmuiate in solutie de iod in iodura de potasiu.
Pe acestea se aplica colonii dintr-o cultura de 24 de ore. Decolorarea apare in 5
minute si indica activitate β – lactamazica (Jorgensen si colab. , 1977).

Testul acidimetric

Hidroliza nucleului β-lactamic genereaza o grupare carboxil care acidifica un


mediu netamponat. Acidifierea rezultata poate fi detectata in tuburi sau pe hartie de filtru.

 Metoda in tub: Se foloseste solutie de rosu fenol la care s-a adaugat


benzilpenicilina, cu pH 8,5. Solutia de culoare violet este distribuita in godeuri si
inoculata cu bacterii din cultura solida pentru a forma o suspensie densa. Activitatea β-
lactamazica este indicata de virajul culorii de la rosu la galben in maxim 5 minute (Duma
& Kinz, 1968).

 Metoda pe benzi de hartie: benzi mici, de hartie de filtru Whatman sunt


imbibate intr-o solutie proaspat preparata de benzilpenicilina, bromo-crezol si NaOH.
Benzile se usuca si se pastreaza pentru mai multe luni. Inainte de folosire ele trebuiesc
rehidratate in apa distilata si apoi se aplica cultura bacteriana de pe agar solid. Aparitia
culorii galbene in maxim 5 minute indica activitate β-lactamazica (Livermore, 1995).

A.3. Metode de identificare a diferitelor tipuri de β-lactamaze: cinetica enzimatica

Obtinerea extractului proteic:

Tulpinile bacteriene care expima constitutiv β-lactamaze se cultiva in bulion


Mueller-Hinton peste noapte la 37oC, din care se recolteaza celulele prin centrifugare.
Suspensia celulara obtinuta din fiecare preparat se supune sonicarii urmata de
ultracentrifugare. Supernatantul este dializat si concentrat daca este nevoie (Iaconis si
colab., 1989).

Purificarea β-lactamazelor:
Intr-o prima etapa, β-lactamazele se purifica prin focusare isoelectrica orizontala
(IEFO), intr-un gradient de pH cuprins intre 6.5 si 10.5 obtinut prin metoda amfolitilor.

Dupa migrare, gelul este impartit in 30 de segmente egale in care se testeaza


activitatea β–lactamazica cu nitrocefin sau benzilpenicilina (O’Callaghan si colab. ,
1972). Fractiile din gel care prezinta activitate β – lactamaizica se incarca pe o coloana
cromatografica de carboxi – metil Sephadex si se elueaza cu tampon fosfat conform
protocolului descris de Iaconis si colab., 1989. Fractiile care au prezentat activitate β –
lactamazica se concentreaza prin ultrafiltrare si au fost trecute in continuare pe o coloana
schimbatoare de ioni.

Hidroliza antibioticelor β-lactamice este examinata prin spectrofotometrie UV


(Beckman DU-7). Se folosesc cuve de cuartz, de 1cm, la lungimea de unda maxima de
absorbtie a inelului β-lactam, pentru fiecare antibiotic in parte, iar densitatea optica se
masoara la intervale de 10 secunde, timp de 5 minute.

Maximul de absorbtie pentru pricipalele antibiotice folosite sunt:

 cefalotin (265 nm)

 cefuroxim (274 nm)

 cefotaxim (254 nm)

 ceftazidim (254 nm)

 imipenem (299 nm)

 cloxacilin (260 nm)

 aztreonam (292 nm)

 nitrocefin (489 nm)

Rata de hidroliza a benzilpenicilinei este masurata la 233 nm. Solutiile de


antibiotic sunt preparate in tampon 0,1M, pH 7.0. Pentru stabilirea profilelor substratelor,
toate antibioticele se examineaza la o concentratie de 100 uM, mai putin benzilpenicilina
care este testata pentru 500 uM.

O unitate de activitate β-lactamazica, este definita ca fiind cantitatea de enzima


care hidrolizeaza un nmol de substrat / min in etapa liniara a reactiei la 37 oC in tampon
fosfat 0,1M, ph 7.0.

Constanta Michaelis (Km) si rata maxima de hidroliza (vm) se determina cu


ajutorul transformarii Lineweaver-Burk a vitezei initiale (v) pentru sase concentratii
diferite ale substratului. Susceptibilitatea β-lactamazelor de a fi inhibate de clavulanatul
de potasiu si cloxacilina este masurata cantitativ prin preincubarea enzimei cu
concentratii diferite de inhibitor pentru 10 minute. Pentru masurarea activitatii enzimatice
reziduale se adauga ulterior ca substrat benzilpenicilina (500 uM) sau imipenem (100
uM).

Concentratia de inhibitor necesara pentru a inhiba 50% din activitatea enzimatica


se determina prin teste statisitice de certitudine (Iaconis si colab., 1989).

Evidentierea fenotipica a rezistentei la aminozide la cocii Gram-pozitivi

La S. aureus rezistenta la aceste antibiotice este enzimatica fiind evidentiate mai


multe fenotipuri (tabelul 24).

Tabelul 24: Rezistenta S. aureus la aminozide

Fenotip Enzime Kanamicina Tobramicina Gentamicina


Netilmicina
Amikacina

Isepamicina
salbatic - S S S
K APH3’-III R S S
KT ANT-4’-4’’ R R S
KTG APH 2”- R R R
AAC6’

APH = aminozid-fosfotransferaza; ANT = aminozid nucleotidiltransferaza; AAC =


aminozid acetiltransferaza

Rezistenta la aminoglicozide la enterococi

Rezistenta naturala de nivel scazut (intrinseca) se datoreaza unui transport


ineficient al acestora prin membrana citoplasmatica, insa activitatea lor este sinergica cu
β-lactaminele si glicopeptidele. Specia E. faecium produce in mod natural o
acetiltransferaza cromosomala AAC(6’) care inactiveaza aminozidele gentamicina
ramane activa).

Un numar din ce in ce mai mare de tulpini de enterococi manifesta rezistenta de


nivel inalt la aminoglicozide (HLR) - definita ca CMI ≥2 mg/mg si, concomitent,
rezistenta la sinergismul cu beta-lactamicele (Tabelul 25). Mecanismul de rezistenta
preponderent este modificarea enzimatica a aminoglicozidelor, ca urmare a achizitionarii
uneia sau mai multor gene. Enzimele codificate de aceste gene sunt sintetizate constitutiv
si au localizare citoplasmatica. Modificarea enzimatica a antibioticului este asociata cu o
diminuare a afinitattii sale pentru proteinele ribosomale (Shaw si al., 1993) si cu alterarea
transportului antibioticului.

Tabelul 25: Principalele fenotipuri de rezistenta ale enterococilor la aminozide

Enzime Kanamicina Gentamicina Netilmicina Tobramicina Amikacina


- S S S S S
APH3’ R S S S R
ANT-4’ R R S R S/R
APH2”- R R R R R
AAC6’

APH = aminozid fosfotransferaza; ANT = aminozid nucleotidiltransferaza; AAC


= aminozid acetiltransferaza

Enterobacteriile cu exceptia speciei Providencia stuartii, sunt in mod natural


sensibile la aminoglicozide. Cele patru aminozide utilizate in terapia infectiilor cu
enterobacterii sunt: gentamicina (GM), tobramicina (TM), netilmicina (NET) si
amikacina (AN).

P. stuartii are o rezistenta cromosomala la gentamicina, netilmicina si


tobramicina. Rezistenta dobandita la aceste antibiotice este putin frecventa (tabelul 26).

Anumite fenotipuri de rezistenta sunt generate in functie de prezenta anumitor


enzime care modifica aminozidele:

Fenotipul 1: tulpini rezistente la gentamicina (GM), asociate cu prezenta unei 3-


aminoacil-acetiltrensferazei AAC;

Fenotipul 2: tulpini rezistente la gentamicina (GM) si la netilmicina (NET)


asociate cu o 2-nucleotidiltransferaza ANT;

Fenotipul 3: tulpini rezistente la tobramicina (TM), netilmicina (NET), si la


amikacina (AN) asociate cu o 6-aminoacilacetiltransferaza AAC.

Tabelul 26: Fenotipurile de rezistenta dobandita ale enterobacteriilor la aminozide

Fenotip Enzime Gm(G) To(T) Nt Ak(A) Is(I) Specii implicate


G AAC(3)-I R S S S S E.coli,
P.mirabilis,
K.pneumoniae,
E. cloacae
A APH(3)-VI S S S R R E. cloacae
GT AAC(3)-VI R R S S S E.coli
TA ANT(4’)-II S R S R R TOATE
GTNt AAC(2’)-I R R R S S P.stuartii
AAC(3)-IV R R R S S E.coli
KTG ANT(2’’)-I R R S S TOATE
KTANt AAC(6’)-I S R R R S S.marcescens

E.coli,
E.cloacae

K. pneumoniae

E. aerogenes
KTGNt AAC(3)-II R R R S S TOATE
KTGANt Impermeabilitate R R R R R TOATE
Asociatie de R R R R R TOATE
enzime

Gm = gentamicina, To = tobramicina, Nt = netilmicina, Ak =amikacina, Is


=isepamicina, AAC = aminozid acetiltransferaze, ANT = aminozid
nucleotidiltransferaza, APH = aminozid fosfotransferaze In fiecare clasa, enzimele
sunt desemnate prin tipul lor de activitate, numarul carbonului purtand gruparea
modificata (cifre arabe de la 1 la 6) si ciclul afectat de modificare (primar, secundar
sau deloc). Cifra romana care urmeaza indica spectrul de substrat al enzimei (adica
ansamblul de molecule hidrolizate).

Evidentierea fenotipurilor de rezistenta la aminoglicozide la Pseudomonadaceae

Fenotipul salbatic este sensibil la toate aminozidele.

Fenotipurile de rezistenta dobandita se datoreaza mai multor mecanisme:


impermeabilitate, eflux, inactivare enzimatica, mutante respiratorii, combinatii ale
acestor mecanisme (tabel ul 27, 28). La P. aeruginosa cel mai intalnit mecanism este cel
de impermeabilitate (tabelul 27).

Tabelul 27: Principalele fenotipuri de rezistenta ale P. aeruginosa la la aminozide

Fenotip Enzima G T Nt A I
G AAC(3)-I R S S S S
GNt AAC(3) R S R S S
GT ANT(2”)-I R R S S S
GNtT AAC(6)-II R R R S S
AAC(3)-II,IV,V
TNtA AAC(6 )-I S R R R ?
GTNtA AAC(6)+ANT(2”)-I R R R R ?
Eflux(30-40%) R S R R R
G = gentamicina ; T= tobramicina ; Nt =netilmicina ; A =amikacina ; I =
isepamicina

AAC = amioacid-acetiltransferaza ; ANT = aminoacid- nucleotidiltransferaza.


Tabelul 28: Fenotipuri de rezistenta la aminozide la Acinetobacter spp

Fenotip de rezistenta Enzime Prevalenta ( %)


G AAC(3)-I 29,5 - 40
GN AAC(3)-? 61- 67
GTN AAC(3)- II 0-8,3
AAC(3)- V 0 -11
TNA AAC(6’)-I 28-35
GTN AAC(6’)- II 0-5
GT ANT(2 )-I 27-29,5
- APH(3’)-I 34 -40
AI APH(3’)-VI 48- 48,5

G = gentamicina; N = netilmicina; T = tobramicina; A = amikacina; I =


isepamicina; APH = aminozidfosfotransferaza; ANT =
aminozidnucleotidiltransferaza; AAC = aminozidacetiltransferaza.

Evidentierea fenotipurilor de rezistenta la quinolone

Stafilococii sunt natural rezistenti la quinolone de prima generatie, in


schimb sunt sensibili la fluorochinolone.

Sunt descrise 2 mecanisme de rezistenta:

- afinitate scazuta prin modificarea tintei, ADN giraza. Dobandirea rezistentei


este legata de aparitia mutatiilor cromosomale in genele gyrA si parC care
provoaca o diminuare a legarii quinolonelor la tintele lor intracelulare,
complexele ADN giraza si ADN topoizomeraza 4.

- eflux

Pneumococii prezinta rezistenta naturala la quinolonele din prima generatie si au


sensibilitate redusa la pefloxacin, ofloxacin si ciprofloxacin. Foarte active pe pneumococ
sunt levofloxacina si moxifloxacina.

Mecanismele rezistentei dobandite sunt: efluxul activ si mutatiile topoizomerazei


IV (gena parC) si girazei (gena gyrA)

Toate enterobacteriile prezinta rezistenta incrucisata la toate chinolonele, dar


nivelul de exprimare variaza pentru fiecare substanta antimicrobiana in functie de
bacterie. Pentru a pune in evidenta diferite fenotipuri se testeaza acidul nalidixic (NAL) si
doua florochinolone: de exemplu: pefloxacina (PEF) sau ofloxacina (OFX) si
ciprofloxacina (CIP) sau norfloxacina (NOR) (tabelul 29).
Au fost identificate urmatoarele fenotipuri de rezistenta la chinolone la
enterobacterii:

Fenotipul 1: tulpini sensibile la toate chinolonele;

Fenotipul 2: tulpini rezistente la acid nalidixic, dar sensibile la fluorchinolone;

Fenotipul 3: tulpini cu sensibilitate diminuata la pefloxacina si la ofloxacina, dar


sensibile la ciprofloxacina.

Fenotipul 4: tulpini rezistente la toate chinolonele.

Tabelul 29: Fenotipuri de rezistenta a enterobacteriilor la chinolone

Fenotipuri Ac. Norfloxacin Pefloxacin Ofloxacin Ciprofloxacin


nalidix
(1)
I S S S S S
II R S S S S
III R I/R I/R S S
IV R R R R R
Rar eflux (E. S R S S S
coli)

(1) Ac. Nalidix si toate chinolonele clasice (prima genetatie).

Fenotipurile de rezistenta la chinolone la P. aeruginosa

Fenotipul salbatic este sensibil la toate fluorochinolonele desi in terapie cel mai
utilizat este ciprofloxacinul (tabelul 30). Rezistenta dobandita se datoreaza urmatoarelor
mecanisme: impermeabilitate (porine si LPS); modificarea afinitatii tintei (subunitatile A
si B ale ADN-girazei si Cssi D ale topoizomerazei IV; Eflux activ (OprM, OprJ, OprN
confera rezistenta de nivel scazut)

Tabelul 30: Principalele fenotipuri de rezistenta ale P. aeruginosa la chinolone

Fenotip Nofloxacin Pefloxacin Ofloxacin Ciprofloxacin


Levofloxacin
I (salbatic) S S S S
II I I I S
III R R R S
IV R R R R
eflux R S S R

Se considera ca aproape 70% din tulpinile de A. baumanii au dobandit rezistenta


incrucisata la fluoroquinolone, prin mutatii la nivelul tintei.
Evidentierea fenotipurilor de rezistenta la glicopeptide
Rezistenta stafilococilor la glicopeptide

Cazuri de rezistenta sporadica la glicopeptide au fost descrise la stafilococii


coagulazo-negativi inca din 1981. In primele cazuri rezistenta la vancomicina si
teicoplanina a fost de nivel scazut (CMI 8-16mg/ml). Tulpinile raportate ulterior aveau
CMI intre 16 si 64 mg/ml la teicoplanina si o sensibilitate mentinuta la vancomicina.
Fenotipul de rezistenta a fost asociat cu prezenta unei proteine membranare de 35 000-39
000da la S.epidermidis si S.haemolyticus.

Cateva tulpini sunt intermediare la vancomicina (tulpini GISA) si au o rezistenta


crescuta la teicoplanina. Acestea au fost izolate de la pacienti care au urmat multiple
tratamente cu vancomicina. Aceste tulpini GISA nu au genotipul VanA, VanB, VanC,
mecanismul de rezistenta fiind inca necunoscut. Articole recente raporteaza tulpini de
S.aureus cu sensibilitate redusa la teicoplanina (cresterea CMI de 8 ori) si la vancomicina
(CMI dublu), tulpini care sintetizeaza o noua proteina de 39 000da (Fig. 36).

In schimb, tulpini de S.aureus sensibile la vancomicina si cu sensibilitate redusa


la teicoplanina poseda o proteina membranara de 35 000da si prezinta o crestere a
exprimarii PLP 2-1 si PLP 2-2.

Rezistenta la glicopeptide este uneori greu de depistat prin antibiograma


difuzimetrica. Comitetul de Antibiograma al Societatii Franceze de Microbiologie (CA-
SFM) recomanda determinarea CMI pentru toate tulpinile al caror diametru de inhibitie
este mai mic de 17 mm. Detectarea rezistentei pare sa dea rezultate mai bune pe mediu
semi-gelozat.

Rezistenta enterococilor la vancomicina

Rezistenta enterococilor la vancomicina a inceput sa fie semnalata din anul 1988


(Leclercq si al., 1988 & 1989). Supravegherea clinica, biochimica si genetica a rezistentei
la glicopeptide in cadrul genului Euterococcus a evidentiat o mare heterogenitate
fenotipica si genotipica. Cele trei fenotipuri (VanA. VanB & VanC) sunt definite prin
nivelul de rezistenta la vancomicina si sensibilitate sau rezistenta la teicoplanina.

Rezistenta intrinseca (naturala) la glicopeptide numita VanC se caracterizeaza prin


rezistenta de nivel scazut la vancomicina si sensibilitate la teicoplanina intalnita la
speciile: E. gallinarum, E. casseliflavus si E. flavescens. Gena VanC codifica o ligaza
care substituie –D-Ala-D-Ser in locul D-Ala-D-Ala ca precursor al peptidoglicanului.

Mecanismul rezistentei dobandite este legat de producerea unui nou precursor al


peptidoglicanului in care dipeptidul terminal ( D-Ala-D-Ala) este inlocuit de D-Ala- D-
Lac, a carui afinitate pentru glicopeptide este redusa. Sunt descrise sase fenotipuri de
rezistenta dobandita: VanA, VanB, VanD, VanE,VanG, Van E (la E. faecalis si E.
faecium).
otip VanA (HLR) VanB (MLR) VanC VanD VanG VanE
I Va(mg/l) 64->1024 4-1000 4 64 16 16
I Tec(mg/l) 16-512 0,5- 1 4 4 16 0,5
resie Inductibila Inductibila Constitutiva Constitutiva Inductibila Inductibil
ort genetic Plasmidial Cromosomal Cromosomal Cromosomal Cromosomal Cromosom
transpozon Tn1546
nsferabil prin + + - - - -
ugare
cii bacteriene E. faecium E. E.faecalis E. vanC1  ­  E. E.faecium E.faecium E. faecalis
faecalis E. faecium gallinarum, E. faecalis
gallinarum E. vanC­2  ­  E.
flavescens E.avium casseliflavus,
E. durans E. hirae and vanC­3 ­ E.
flavescens

Transpozonul Tn1546 codifica 9 proteine:

- doua necesare transpozitiei (ORF1 si ORF2)

- doua implicate in reglarea expresiei inductibile a rezistentei ( VanR siVanS)

- cinci implicate in rezistenta (VanH-dehidrogenaza, VanA-ligaza, VanX-


peptidaza, majore si VanY si VanZ, considerate minore).

A fost descrisa o tulpina de S. bovis rezistenta la vancomicina care poseda gena


vanB.

Cea de-a doua forma a rezistentei la vancomicina a rezultat probabil din


transferul conjugativ al operonului vanA de la Enterococcus faecalis vancomicin-
rezistent (fig. 37). Showsh si colaboratorii au demonstrat ca plasmidul de la
Enterococcus faecalis care contine vanA codifica de asemenea un feromon del
sex care este sintetizat si de catre S. aureus, sugerand posibilitatea transferului
conjugal. Aceste izolate VRSA au rezistenta de nile inalt la vancomicina, cu CMI
de 128 µg/ml. Rezistenta la aceste izolate este cauzata de catre alterarea
peptidului terminal la D- Ala-D-Lac in loc de D-Ala-D-Ala (fig. 38). Sinteza D-Ala-
D-Lac se produce doar prin expunerea la concentratii mici de vancomicina.
Fig. 37. Mecanismele de rezistenta la vancomicina a tulpinilor VISA. Acestea
sintetizeaza in exces peptidoglican, avand ca rezultat cresterea numarului de
resturi D-Ala-D-Ala care leaga vancomicina (dupa Walsh si Howe, 2002).
Fig. 38: Mecanismul de rezistenta la vancomicina a tulpinilor VRSA. (dupa
Hiramatsu si colab., 1997).

Evidentierea rezistentei la macrolide, streptogramine, lincosamide (MLSb)

Trei mecanisme sunt implicate in rezistenta la aceste molecule:

1. Modificarea tintei ribosomale (sub-unitatea 50S)

Tulpinile rezistente produc o metilaza responsabila de o dimetilare specifica a


adeninei din ARNr 23S. Aceasta provoaca o schimbare de conformatie a ARN, care
reduce afinitatea MLS pentru ribosomi. Metilarea se produce la toate macrolidele si
lincosamidele. Aceasta rezistenta depinde de diferiti determinanti genetici. La stafilococ
gasim genele ermA, ermB, ermC. Aceste gene sunt purtate de transpozoni (ermA) sau
plasmide (erm). Exprimarea fenotipica a rezistentei poate fi inductibila (rezistenta
crescuta pentru toate macrolidele cu 14 si 15 atomi de carbon si sensibilitate la
macrolidele cu 16 atomi de carbon), sau constitutiva (rezistenta crescuta la toate
macrolidele cu 14-16 atomi de carbon, lincozamidele si streptograminele B – rezistenta
de tip MLSB) (tabelul 31). Rezistenta compusului B nu modifica sinergia a doi compusi ai
streptograminelor.

Tabelul 31: Fenotipuri de rezistenta la MLS dobandite de catre stafilococi

14C
Mecanism Genotip
Fenoti 1
16C LI PRI PRI
PRIi5
3
p 15C CLIN B A
2

erm
MLSB R S S S S S S
inductibil
Modificare
erm
a tintei
constituti MLSB R R R R S S S
v
linA L S S R S4 S S S
Inactivare Vat/vatB (L)SA S S S S S R ?
vgb SB S S S S R S ?
vga R/I/
(L)SA S S S/I/R S R S/R
Eflux S
msrA Erm R S S S S S S

(1) 14C: eritromicina, roxitromicina, claritromicina, diritromicina

(2) 15C: azitromicina

(3) 16C: spiramicina, josamicina, midecamicina, tilosina


(4): antibiotic a carui activitate bacteriostatica sau bactericida este
diminuata

(5) Pri : pristinamicina

2. Inactivarea antibioticului

Streptogramin A acetiltransferaza confera rezistenta la factorul A astfel incat


streptogramin B hidrolaza, codificata de catre gena vgb, inactiveaza factorul B. Cel putin
2 gene vat si vatB sunt responsabile pentru acetilarea streptograminelor A. Rezistenta
izolata la lincosamide, exceptionala la S.aureus dar detectata la stafilococii coagulazo-
negativi (S.sciurii, S.cohnii, S.xylosus), este datorata achizttionarii unei enzime care
modifica prin adenilare lincomicina si clindamicina. Fenotipul LS A poate fi confundat cu
fenotipul L, ambele rare la S.aureus. Lincosamidele sunt inactivate de catre
nucleotidtransferaze codificate de catre 2 gene plasmidiale foarte apropiate, linA si linA’.

3. Efluxul activ de molecule

Exprimarea acestei rezistente depinde de gena msrA, care codifica pentru proteina
MsrA responsabila de eliminarea crescuta a eritromicinei intrabateriene. Au fost izolati
stafilococi rezistenti doar la streptogramina A. Rezistenta dependenta de gena vga este
datorata unei diminuari intracelulare a antibioticului.

La enterococi, rezistenta naturala se manifesta la lincosamide si la compusul A al


streptograminelor (la toate speciile cu exceptia E. faecium si E. durans, astfel ca acest tip
de rezistenta poate fi utilizat ca test de orientare pentru identificare).

Rezistenta dobandita se manifesta prin doua mecanisme: modificarea tintei si


inactivarea antibioticului.

Modificarea tintei (subunitatea 50S ribosomala) este mecanismul principal care


explica rezistenta incrucisata la MLSK. La enterococi gena ermB este responsabila de
aceasta rezistenta.

Inactivarea antibioticului se manifesta la E. faecalis prin actiunea unei


lincomicinnucleotidiltransferaze (codificate de gene linA) care confera rezistenta la
streptograminele A.

Rezistenta dobandita a pneumococului la macrolide este MLSB, datorita metilarii


ARNr 23S, care diminueaza afinitatea macrolidelor pentru tinta. Aceasta rezistenta este
incrucisata pentru toate macrolidele, lincosamidele si streptograminele B si poate fi de tip
inductibil sau constitutiv.

- Tulpinile care au gena erm imductibila sunt sensibile la ketolide la fel ca


cele rezistente prin mecanismul de eflux .
- Alte tulpini, care poseda gena mefE, codifica o rezistenta prin mecanism de
eflux ele fiiind rezistente la eritromicina, dar sensibile la clindamiciaa,
quinupristina si la ketolide. Genele erm si mefE sunt rareori asociate.

- Al treilea fenotip de rezistenta a fost descris la un grup de 10 tulpini care nu


au genele erm sau mefE dar sunt ery-R constitutiv si clinda-R.

La S.pyogenes mai putin de 10% dintre tulpini sunt rezistente la eritromicina, cu o


mare heterogenitate

de la o zona la alta (18,3% in Asia, 10,6% in Europa de Est, 9,8% in Europa de Vest).

Doua mecanisme sunt responsabile de aceasta rezistenta: modificarea tintei, care


da fenotipul MLSB constitutiv, codificat de gena ermB si un mecanism de efux care da
fenotipul M codificat de gena mefA.

Telitromicina are o activitate intrinseca superioara celei a macrolidelor.

Evidentierea fenotipurilor de rezistenta la tetracicline

Sunt descrise 2 mecanisme de rezistenta la tetracicline:

 primul este legat de o insuficienta concentrare intracelulara a antibioticului datorita


unui eflux excesiv al antibioticului prin membrana citoplasmatica, sub actiunea unei
proteine membranare TET. Acest mecanism confera o rezistenta la tetraciclina, dar nu
si la minociclina.

 al doilea mecanism este datorat unei modificari a tintei ribosomale a acestor


antibiotice. In acest caz, exista o rezistenta crescuta la toate tetraciclinele.

La streptococi si enterococi au fost evidentiate 3 gene de rezistenta la tetraciclina, si


anume: tetM, tetO (Zilhao si colab., 1988) si tetL (Chopra si colab., 1992).

Rezistenta la trimetoprim-sulfometoxazol

Rezistenta stafilococului la acesti 2 compusi se realizeaza prin mai multe


mecanisme:

- modificarea enzimelor tinta (DHFR si THFR)

- hiperproducerea acestor enzime

Rezistenta la fosfomicina

Rezistenta stafilococului la fosfomicina este rezultatul unor mutatii foarte


frecvente ce tintesc ransportul de antibiotic. A fost raportata o rezistenta plasmidiala la
tulpini de stafilococ coagulazo-negativi si la S.aureus (gena fosB la S.aureus).
Mecanismul, prin analogie cu cel descris la bacilii Gram negativi, ar putea fi inactivarea
antibioticului prin conjugare cu glutation. Specia saprophyticus este natural rezistenta la
fosfomicina.

Rezistenta la acid fuzidic

Rezistenta stafilococului la acidul fusidic este datorata unor mutatii care au loc cu
frecventa mare, fapt pentru care in clinica acest antibiotic se utilizeaza numai in asociere
cu alte antibiotice.

Rezistenta la rifampicina

Se disting doua niveluri de rezistenta:

- de nivel inalt cu CMI > 32mg/l

- sensibilitate diminuata (CMI 1- 4mg/l), tulpini izolate rar

Mecanismele de rezistenta la S.aureus nu sunt inca cunoscute.

La pneumococ, rezistenta la rifampicina, este legata de o mutatie a lantului β al


ARN polimerazei care impiedica fixarea antibioticului pe tinta sa.

Rezistenta la cloramfenicol
Este predominant plasmidiala si se datoreaza prezentei la enterococi a unor gene cat omologe cu
cele de origine stafilococica catpC221, catpC194 si catpSCS7 (Trieu-Cuot et al., 1993). CatpC221, este o
gena, cu expresie inductibila. cu secventa cunoscuta (Shaw si al.1985), identificata pe plasmidul pC221 din
S.aureus. Plasmidul conjugativ pIP501 (30,2 kb), cu spectru larg de gazda, a fost izolat pentru prima data
din tulpina B96 de S. agalactiae (Horodniceanu si al., 1976). Prezenta sa confera tulpinii gazda fenotip Cmr-
Emr. Studii bazate pe hibridizari ADN-ADN au evidentiat diseminarea determinantului catpIP501 pe
plasmide izolate din enterococi (Pepper si al.,986).

Spre deosebire de stafilococi si enterococi unde este codificata plasmidial, la


pneumococi cloramfenicol acetil transferaza este de natura cromosomala.

Rezistenta la oxazolidinone

La stafilococi, pana in prezent nu a fost evidentiata rezistenta incrucisata intre


linezolid si alte antibiotice inhibitoare ale sintezei proteice, mai mult oxazolidinonele
raman active asupra tulpinilor de MRSA.

Oxazolidinonele s-au dovedit a fi active asupra tulpinilor de E. faecalis si E.


faecium fie ca sunt sensibile fie ca nu la glicopeptide. In vitro s-au obtinut mutante
rezistente cu o frecventa de 10-9- 10-11 ( mutatii la nivelul subunitatii 23S ribosomale).

La penumococi nu s-a semnalat pana in prezent nici o tulpina rezitenta


indiferent de sensibilitatea la penicilina G si macrolide.
6. Fenotipuri de rezistenta la alte microorganisme

B. cepacia este rezistenta, de asemenea, la aminozide, fosfomicina si polimixine,


dar sensibila la fluoroquinolone si cotrimoxazol si, intr-un anumit procent, la
carbapeneme in special la meropenem. Fenomenul de eflux inactiveaza asupra
cloramfenicolul, trimetoprimul si ciprofloxacinul.

H. influenzae este rezistent la lincosamide si moderat sensibil la macrolide si


ketolide. La aminozide sensibilitatea este variabila iar fata de cloramfenicol, tetracicline,
rifampicina, quinolone si cotrimoxazol se manifesta o rezistenta de nivel scazut.

Biologul sau medicul de laborator care executa antibiograma are obligatia de a


prezenta clinicianului rezultatul sub forma unui document usor de citit si de inteles, care
trebuie sa urmeze logic rezultatului examenului microscopic direct si al culturii.

Mentiunile obligatorii din buletinul de analiza al antibiogramei sunt: metoda


utilizata, lista antibioticelor conform DCI-urilor (denumire comuna internationala),
raspunsul interpretat ca sensibil , intermediar , rezistent, CMI –uri in anumite cazuri (in
special pentru microorganismele izolate din infectii severe), mentionarea anumitor
fenotipuri de rezistenta si consecintele lor terapeutice. In anumite cazuri este mai
avantajos ca biologul sau medicul de laborator sa prezinte clinicianului doar rezultatele
pentru anumite antibiotice, pentru a evita selectarea si emergenta unor fenotipuri de
rezistenta in mediul spitalicesc (tabelul 33).

Antibiograma este inutila de fiecare data cand tulpina izolata nu poate fi


considerata responsabila de infectia care a determinat prelevarea (ex. -microorganism
comensal sau contaminant, cum este cazul streptococilor orali sau Haemophilus
parainfluenzae in expectoratii, Bacillus intr-o singura hemocultura); cand numarul de
UFC/ml este inferior pragului semnificativ (urina si expectorati); daca tulpina izolata
poate fi considerata ca patogena, dar face parte dintre speciile sensibile in mod obisnuit la
tratamentul de referinta si cand nu exista nici o corelatie in vitro-in vivo (ex. Legionella);
in infectiile cutanate pentru care tratamentul este local sau chirurgical.

Antibiograma trebuie practicata in acord cu clinicianul:

-Daca o bacterie comensala este izolata de la un pacient imunodeprimat;

- In prelevatele plurimicrobiene care contin specii aerobe/anaerobe


(tabelul 32);

Tabelul 32: Criterii de decizie pentru realizarea unei antibiogramein functie de


natura prelevatului

Prelevat Necesitatea Fara antibiograma Observatii


antibiogramei
Daca sunt
Hemocultura Pentru toate speciile contaminanti
izolate cu exceptia normali
contaminarii evidente
(Bacillus,
corineformi), iar o
singura hemocultura
este pozitiva
Daca sunt S. pneumoniae / N.
LCR Toate speciile contaminanti meningitidis:
considerate ca normali investigarea
responsabile de sistematica a
meningite comunitare (Bacillus, rezistentei la
sau nosocomiale corineformi ) penicilina G

SCN H.influenzae
investigare β
Daca examenul lactamaze
citochimic este
normal Efectuare de CMI la
antibioticele utilizate
pentru tratament
Daca numarul de Daca numarul de
Cateter colonii este ≥ 1000 colonii este < 1000
ufc/ml UFC/ml

(Brun Buisson) sau ( Brun Buisson) sau

15 colonii (Maki) 15 colonii ( Maki)


Leucocituria ≥ 10000 Daca leucocituria = Se realizeaza la:
Urocultura UFC/ml si bacteriuria 10000 UFC/ml si
bacteriuria ≤ 1000 -pacientii
≥ 100000 UFC/ml UFC/ml imunodeprimat,
dializati, diabetici,
Daca > 3 specii batrani, gravide,
bacteriene diferite sau pacienti cu
antecedente
endoscopice sau
chirurgicale pe caile
urinare si
leucociturie <
10000 si bacteriurie

≥ 100000 UFC/ml

-la pacientii
simptomatici si
izolare de specii
uropatogene sau
pacientii cu
antecedente de
interventii
endoscopice si
chirurgicale pe caile
urinare sau
nefropatii
subiacente si
leucociturie ≥
10000/ml si
bacteriurie ≥ 1000
si < 100000 UFC/ml

Secretii naso- Investigare de


faringiene SAMR, Streptococ A
la pacient alergic la
penicilina
Prelevate din otite
Puroi din otite si S. pneumoniae, externe, puroi S.pneumoniae
sinuzite Haemophilus recoltat prin investigarea
influenzae, S. aureus, paracenteza rezistentei la
Enterobacterii, penicilina
Pseudomonas SCN
≥10000000 UFC/ml
Expectoratii Specii comensale Idem
nr. leucocite sau patogene
>25/camp <10000000 UFC/ml

nr. celule bucale <


10/camp (10x)
H. influenzae
Secretii bronsice specii patogene <1000 UFC /ml
≥1000 UFC /ml (β – lactamaza)

Lichid bronho- specii patogene <10000 UFC /ml Idem


alveolar ≥10000 UFC /ml

Aspirate traheo- specii patogene <10000 UFC /ml Idem


bronsice ≥10000 UFC /ml
Coprocultura Speciile responsabile
de gastroenterite Speciile comensale Interes
Coprocultura epidemiologic in
cantitativa la Toate speciile izolate special
pacienti ≥1000 UFC /ml
neutropenici
Prelevate cutanate biopsie cutanata
escare profunde
(panaritii, arsuri, arsi prelevare
ulcere chirurgicala
varicoase,escare) dermatomiozite

Prelevate Sistematic daca Fara antibiograma la Conservarea


osteoarticulare prelevarea e realizata orificii si fistule tulpinilor timp de
chirurgical sau din 1an
situsuri profunde
Lichide de punctie Se determina CMI
In functie de Speciile comensale
(ascite, pleural) examenul microscopic (SCN, Pentru antibioticele
si de nr. UFC corinebacterii) R
Colectii inchise
Cu prioritate pe
(abcese craniene si speciile predominante
pulmonare)
N. gonorrhoeae
Prelevate genitale sistematic Gardnerella

-in functie de
examenul microscopic
nr. UFC pentru alte
specii

Sperme UFC >1000 /ml

Prelevate oculare Ulcere corneene, Speciile comensale


conjunctivite,
endoftalmii

Tabelul 33: Agenti antimicrobieni de prima alegere pentru tratamentul


infectiilor cu bacterii patogene antibiorezistente

Bacterii patogene Antibioticul indicat Antibiotice alternative daca


pentru organismul organismul este rezistent la
susceptibil medicamentul indicat
Staphylococcus aureus Cloxacilina sau Vancomicina
meticilina
Streptococcus pneumoniae Penicilina Cefotaxima, ceftriaxon sau vancomicina
*
Haemophilus influenzae† Ampicilina Cefalosporine de generatia III,
eritromicina, TMP/SMX‡, Cefaclor§,
Amoxicilina/clavulanat, Claritromicina
Enterococcus fecalis Ampicilina si Vancomicina
gentamicina
Moraxella catarrhalis Ampicilina La fel ca si pentru H. influenzae
Mycobacterium tuberculosis Izoniazida (in O combinatie de 3-6 medicamente la
combinatie cu rifamfin care organismul este susceptibil
si alte medicamente)
Specii de Shigella Ampicilina sauCefixim, ceftriaxon, cefotaxim,
TMP/SMX ciprofloxacin¶
Specii de Salmonella Ampicilina TMP/SMX, cloramfenicol, ceftriaxon
Pseudomonas aeruginosa Ticarcilin si tobramicina Ceftazidim, cefoperazon, quinolone¶,
imipenem
* Alegerea este determinata de localizarea infectiei si de rezultatele antibiogramei;

terapie orale;

Trimetoprim/sulfametoxazol (TMP/SMX);
§
Sau alta cefalosporina orala de a doua sau a treia generatie;

A nu se folosi in cazul copiilor