REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Fenotipuri de rezistenţă întâlnite

la specii de Enterococcus izolate
din diferite produse patologice

Doctorand LIA SORINA PEPELEA

Conducător de doctorat Prof.dr. LIA MONICA JUNIE

CLUJ-NAPOCA 2015
2 Pepelea Lia Sorina

CUPRINS

INTRODUCERE 13
STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII
1. Generalităţi despre genul Enterococcus 17
1.1. Scurt istoric 17
1.2. Habitat şi implicaţii în patologia infecţioasă 18
1.3. Caractere morfotinctoriale 19
1.4. Caractere de cultură 20
1.5. Caractere de patogenitate 25
1.6. Identificarea unor markeri epidemiologici 26
2. Rezistenţa enterococilor la antibiotice 28
2.1. Rezistenţa la beta-lactamine 29
2.1.1. Rezistenţa intrinsecă 29
2.1.2. Toleranţa 30
2.1.3. Beta-lactamazele 30
2.2. Rezistenţa la aminozide 31
2.2.1. Rezistenţa intrinsecă 31
2.2.2. Rezistenţa dobândită 32
2.2.3. Evidenţierea rezistenţei de nivel înalt la animozide 33
2.2.3.1. Incorporarea antibioticului în agar 33
2.2.3.2. Microcomprimate cu concentraţie crescută de antibiotic 33
2.2.3.3. Metoda diluţiilor în bulion 34
2.3. Rezistenţa la macrolide, lincosamide, streptogramine şi ketolide (MLSK) 34
2.4. Rezistenţa la glicopeptide 35
2.4.1. Metode de screening pentru detectarea enterococilor rezistenţi
la vancomicină
37
2.5. Rezistenţa la oxazolidinone 38
2.6. Sinergismul antibioticelor 38
2.7. Alternative terapeutice pentru enterococii multiplu rezistenţi la
antibiotice
39

CONTRIBUŢIA PERSONALĂ
1. Ipoteza de lucru/obiective 43
2. Studiul 1. Implicarea tulpinilor de Enterococcus spp. în
45
etiologia infecţiilor la pacienţi spitalizaţi şi din ambulator
2.1. Introducere 45
2.2. Ipoteza de lucru/obiective 45
2.3. Material şi metodă 45
2.4. Rezultate 54
Fenotipuri de rezistenț ă întâlnite la specii de Enterococcus izolate din diferite produse patologice 3

2.5. Discuţii 66
2.6. Concluzii 71
3. Studiul 2. Testarea sensibilitaţii la antibiotice şi evidenţierea
73
fenotipurilor de rezistenţă ale tulpinilor de Enterococcus spp.
3.1. Introducere 73
3.2. Ipoteza de lucru/obiective 73
3.3. Material şi metodă 74
3.4. Rezultate 80
3.5. Discuţii 109
3.6. Concluzii 114
4. Concluzii generale 115
5. Originalitatea şi contribuţiile inovative ale tezei 117

REFERINŢE 119

Cuvinte cheie: enterococi, rezistenţă, vancomicină, infecţii

4 Pepelea Lia Sorina

STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII

1. GENERALITĂŢI DESPRE GENUL ENTEROCOCCUS

Enterococii au fost clasificaţi iniţial drept coci Gram pozitivi aparţinând genului
Streptococcus1.
Numiţi ulterior “streptococi de provenienţă fecală” sau “enterococi”, au fost
consideraţi pentru mult timp o subdiviziune a genului Streptococcus (streptococci de
grup D), diferenţiindu-se de aceştia prin rezistenţa crescută la agenţi chimici şi fizici 2.
La începutul anilor 1930, enterococii au fost clasificaţi ca streptococi de grup D
şi au fost diferenţiaţi de grupul D de streptococi non-enterococi prin teste biochimice
auxiliare2.
În anii următori, Sherman a recomandat ca termenul “enterococi” să fie utilizat
în mod specific pentru streptococii care se dezvoltă atât la 10°C cât şi la 45°C, la un
pH de 9.6, în prezenţa NaCl 6.5%, supravieţuiesc la 60°C timp de 30 de minute şi
hidrolizează esculina3.
Diferenţierea evidentă a S.faecalis și S.faecium de ceilalţi membrii ai genului a
făcut posibilă includerea acestor specii într-un gen bacterian nou, ale cărui
caracteristici au fost foarte bine studiate prin tehnici de biologie moleculară2.
Metodele ce stabilesc criteriile de includere a bacteriilor în genul Enterococcus
cuprind recombinarea ADN-ADN, secvenţierea genică a subunităţii 16S ARNr, analiza
proteică şi testele fenotipice obişnuite4, 5.
Bacteriile din genul Enterococcus au fost catalogate ca bacterii cu un grad scăzut
de patogenitate, dar in anii 1990 au devenit importanţi agenţi etiologici ai infecțiilor
nosocomiale6.
La pacienţii spitalizaţi, enterococii pot fi evidenţiati la nivelul leziunilor
ţesuturilor moi, ulcerelor și tractului gastro-intestinal7.
Sindroame infecţioase care recunosc enterococi în etiologie pot fi reprezentate
de infecții ale tractului urinar la pacienţii cu uropatii obstructive, infecții mixte ale
plăgilor mai ales la pacienţii aflaţi sub tratament antimicrobian 8, 9.
Pot sa apară bacteriemii la vârstnici și pacienţii imunocompromiși 10.
Studii efectuate în Statele Unite au demonstrat că majoritatea pacienţilor
infectaţi cu tulpini deosebit de rezistente la antibiotic provin din unităţile de terapie
intensivă11.
Factorii de risc ce pot fi adăugaţi celor deja menţionaţi regăsim: durata crescută
a spitalizării, colonizarea gastro-intestinală cu VRE, expunerea la echipamente
medicale contaminate, transplantul medular, afecţiunile hematologice, tratamentul cu
cefalosporine de generatia a 3-a și antibiotice cu acţiune asupra bacteriilor anaerobe16.
Fenotipuri de rezistenț ă întâlnite la specii de Enterococcus izolate din diferite produse patologice 5

Enterococii cauzează rar infecții ale tractului respirator, osteomielită sau

celulită, în schimb au devenit a treia cauză a infecțiilor nosocomiale în Statele Unite12.
Infecțiile enterococice pot fi cauzate de cel puţin 19 specii incluzând E. avium, E.
casseliflavus, E. durans, E.faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. hirae, E. malodoratus, E.
mundtii, E. pseudoavium, E. raffinosus, E. solitarius13.
O serie de alte specii au fost adăugate ulterior acestei liste: E. cecorum,
E.columbae, E. saccharolyticus, E. dispar, E. sulfurous, E. seriolicida și E. flavescens14.
Majoritatea infecțiilor clinice sunt cauzate de E. faecalis (80-90%) sau
E. faecium (5-15%)16.
Speciile E. durans, E. avium și E. hirae sunt mai rar intâlnite, iar celelalte specii
amintite sunt izolate doar ocazional17.

2. REZISTENŢA ENTEROCOCILOR LA ANTIBIOTICE

Implicaţi din ce în ce mai frecvent în infecțiile nosocomiale, enterococii

prezintă rezistenţă naturală sau dobândită la antibiotice, ceea ce le permite
supravieţuirea în faţa unor multiple scheme de tratament cu antibiotice15.
Enterococii au dobândit rezistenţă la un număr de agenţi antimicrobieni,
inclusiv tetracicline, eritromicină, cloramfenicol, niveluri ridicate de trimetoprim,
clindamicină, niveluri ridicate de aminoglicozide și peniciline (prin penicilinază și
mecanisme non-penicilinază) și mai recent la vancomicină16.
Toate aceste rezistenţe adaugă noi semne de întrebare terapiei cu antibiotice în
cazul infecțiilor enterococice, deoarece apare o scădere a numărului de opţiuni
terapeutice17.

CONTRIBUŢIA PERSONALĂ

Obiective
Enterococii, deși fac parte dintre comensalii florei intestinale pot deveni
patogeni nosocomiali.
În ultimele 3 decenii s-a constatat o creștere constantă a incidenței acestor
infecții, fenomen cauzat probabil de creșterea populației care prezintă factorii de risc
(inflaţii cronice, intervenţii chirurgicale, neoplazii intestinale)dar și de apariția
tulpinilor de enterococi cu rezistență multiplă la antibiotice, în special la Vancomicină.
În această lucrare am urmărit evaluarea implicării tulpinilor de Enterococcus
spp. în etiologia infecțiilor și sensibilitatea la antibiotice a acestor microorganisme.
În acest scop, au fost luate în studiu atât tulpinile izolate din infecții de pe
secţiile spitalului, cât și tulpini izolate de la pacienţi din ambulator.
În al doilea rând, am urmărit evidențierea fenotipurilor de rezistență ale
6 Pepelea Lia Sorina

tulpinilor de enterococi circulante izolate de pe secţiile spitalului cât şi din ambulator,

cu rol în ameliorarea antibioterapiei empirice a infecțiilor produse de aceste tulpini.

Material şi metodă
Studiul a fost realizat prospectiv, urmărindu-se tulpinile de Enterococcus spp.
implicate în etiologia infecțiilor atât la pacienții spitalizați cât și la pacienții din
ambulator.
În acest scop, au fost luate în studiu infecțiile enterococice diagnosticate la
pacienţii internaţi pe secţiile institutului, precum și infecțiile diagnosticate în
ambulator în perioada ianuarie 2010- decembrie 2012.
În cadrul spitalului, s-au utilizat date ale Compartimentului de Microbiologie
al Laboratorului Clinic. Pentru colectarea datelor din spital am folosit fișa tip de
supraveghere, prezentată în anexa Ordinului Ministerului Sănătăţii 10/2005.
Pentru fiecare an studiat (2010, 2011 şi 2012) s-au cules date atât despre
tulpinile de enterococi care s-au dovedit a fi agent etiologic unic cât și despre tulpinile
de enterococi izolate în asociere cu alte microorganisme.
În spital, toate tulpinile de enterococi izolate au fost identificate cu sistemul
automat Vitek 2 Compact (bioMérieux).
Speciile de Enterococcus identificate de VITEK 2 GP: E.avium, E. casseliflavus,
E.cecorum, E.columbae, E.durans, E.faecalis, E.faecium, E.gallinarum, E.hirae,
E. raffinosus, E. saccharolyticus.
În ambulator, bacteriile din genul Enterococcus au fost identificate rapid pe baza
prezenței antigenului de grup D, cu truse PASTOREXR STREP (BioRad) şi al galeriilor API 20
STREP (bioMérieux).

Metodologia statistică
Datele obţinute în urma cercetării au fost introduse şi stocate în baze de date tip
Microsoft Acces 2010 (format *.mdb) şi au fost exportate spre prelucrare în fişiere de
tip worksheet Excel 2010 (*.xls).
Prelucrarea statistică a fost efectuată cu ajutorul pachetelor software Microsoft
Excel 2010, EPI-INFO versiunea 6.04 şi IBM SPSS versiunea 10, rezultatele prelucrării
fiind exportate în toate cele trei cazuri în fişiere de tip worksheet Excel 2010.
Variabilele de tip dihotomic, caracterizate prin procentaj, au fost comparate prin
aplicarea tabelelor de contigență, cu calcularea testului χ2 și utilizarea, la nevoie, a
corecției Fisher18.
Toate testele statistice au fost calculate cu 2 extremități iar valoarea semnificației
statistice p s-a luat în considerare la valori ≤ 0,01.
Fenotipuri de rezistenț ă întâlnite la specii de Enterococcus izolate din diferite produse patologice 7

Studiul 1. Implicarea tulpinilor de Enterococcus spp. în

etiologia infecţiilor la pacienţi spitalizaţi și din ambulator

1. Cele mai izolate specii de enterococi au fost E. faecalis (74,88%) și

E. faecium (20,09%), atât în spital cât și în ambulator.
2. Alte specii de enterococi izolate numai în spital au fost E. gallinarium,
E. durans , E. casseliflavus și E. avium.
3. La pacienții spitalizați enterococii au fost mai frecvent implicați în etiologia
infecțiilor postoperatorii (30,72%), urmate de infecțiile tractului urinar (29,19%).
4. În spital, cele mai multe infecții enterococice au provenit din secțiile de ATI și
chirurgie.
5. Cele mai frecvente infecții enterococice diagnosticate în ambulator au fost
infecțiile tractului urinar (75,6%).
6. În timp ce infecțiile din ambulator au fost în totalitate monomicrobiene, la
pacienții spitalizați enterococii au fost relativ frecvent asociați bacililor Gram-negativi.

Studiul 2. Testarea sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de

Enterococcus spp. şi evidenţierea fenotipurilor de
rezistenţă circulante

Tulpinile sălbatice sunt extreme de semnificativ statistic mai prezente în

ambulator (47,56%) decât în mediul de spital (11,67%), p<0,001.
Alterarea sensibilității la beta-lactamine a fost identificată la 43,06% din
tulpinile de Enterococcus spp. provenite din spital și la 29,26% din enterococii izolați
în ambulator.
Studiul rezistenței la aminoglicozide a evidențiat 46,71% tulpini de
Enterococcus spp. rezistente în mediul spitalicesc și respectiv 24,39% în ambulator.
Cele 7 tulpini VRE identificate în secția de ATI, pe parcursul studiului,
reprezintă 3,19% din totalul enterococilor izolați și respectiv 5,1% din tulpinile
provenite din spital.
Numai 8,02% dintre enterococii testați au fost rezistenți la linezolid, în
timp ce niciuna din tulpinile cuprinse în studiu nu a fost rezistentă la tigeciclină, aceste
două antibiotice fiind recomandate în tratamentul infecțiilor produse de tulpini de
enterococi multirezistente.
Numărul mare de tulpini de Enterococcus spp. rezistente la beta-lactamine
și aminoglicozide, izolate în prezentul studiu, este îngrijorător datorită faptului că
aceste antibiotice sunt considerate de primă intenție în tratarea infecțiilor
enterococice.
8 Pepelea Lia Sorina

Concluzii generale
Tulpinile de Enterococcus spp. izolate din spital au reprezentat 15,6% din
totalul germenilor implicați în etiologia unor infecții, în timp ce în ambulator 7,05%
din infecțiile diagnosticate au fost determinate de enterococi.
Enterococii deși nu sunt printre cei mai frecvent izolați agenți patogeni,
prin rezistența lor naturală la cefalosporine, fac parte din flora implicată în etiologia
unor infecții grave la pacienți spitalizați.
Stabilirea fenotipurilor de rezistență circulante în spital dar și în
ambulator este importantă în elaborarea terapiei antiinfecțioase în regim de urgență.
Diferențele semnificative statistic privind rezistența la chimioterapicele
antiinfecțioase în favoarea spitalului comparativ cu ambulatorul, sunt legate de
administrarea mai frecventă a antibioticelor la pacienții spitalizați, dar și de prezența
altor factori de risc privind transmiterea tulpinilor multirezistente.
Enterococii dețin numeroase mecanisme de rezistență capabile să le
asigure supraviețuirea în prezența chimioterapicelor antiinfecțioase, ceea ce impune
identificarea unor posibile noi ținte de acțiune pentru antibiotice.
Controlul emergenței și răspândirii antibiorezistenței reprezintă o
prioritate în sănătatea publică, la nivel mondial.

Elemente de originalitate şi contribuţii personale

S-a pus în evidenţă importanţa utilizării metodelor moderne de identificare şi
testare ale enterococilor prin sistemul automat VITEK 2 COMPACT, ceea ce a permis
încadrarea tulpinilor în fenotipuri de rezistenţă, evidenţiind avantajele introducerii
acestei metode moderne de testare a sensibilităţii la antibiotice, uşor de utilizat,
performantă şi cu rezultate rapide.
Pentru izolarea şi identificarea bacteriilor au fost utilizate medii moderne,
cromogene, ca şi alternativă la metodele clasice de izolare ale bacteriilor, relevându-se
avantajele utilizării acestora şi necesitatea introducerii lor şi în alte laboratoare
pentru identificarea rapidă a unor microorganisme.
Aplicarea şi compararea metodelor moderne de identificare a bacteriilor cu
metodele clasice, are o deosebită aplicabilitate practică, eficientizând astfel munca din
laborator.
Precizarea etiologiei infecţiilor la pacienţi spitalizaţi şi din ambulator,
incidenţa speciilor şi a asocierilor bacteriene, a demonstrat importanţa cunoaşterii
enterococilor, lucrarea de faţă fiind un ghid orientativ şi pentru alte spitale din Cluj-
Napoca dar şi din alte regiuni.
Elucidarea aspectelor epidemiologice privind infecţiile enterococice,
urmărindu-se frecvenţa şi repartiţia acestor infecţii pe diferite servicii medicale şi
Fenotipuri de rezistenț ă întâlnite la specii de Enterococcus izolate din diferite produse patologice 9

ambulator, reprezintă o premieră pentru spitalele universitare şi laboratoarele private

din Cluj-Napoca dar şi la nivel național.
Precizarea frecvenţei şi a etiologiei diferitelor tipuri de infecţii
enterococice (infecţii urinare, infecţii postoperatorii, infecţii respiratorii,
bacteriemii/septicemii, infecţii ginecologice, peritonite, colecistite, infecţii de CVC)
este de un real folos pentru prevenirea şi controlul acestor infecții, în special al celor
produse de tulpini de VRE.
Evidenţierea tulpinilor VRE precum şi a rezistenţei multiple la antibiotice
a acestor microorganisme, izolate de la pacienţii spitalizaţi, este o contribuţie
personală importantă, cu deosebite repercusiuni practice, fiind un ghid orientativ
pentru medicii de laborator şi clinicieni.
Precizarea fenotipurilor de rezistenţă pe clase de antibiotic (beta-
lactamine, aminoglicozide, glicopeptide, MLSB), precum şi a fenotipurilor circulante
ale tulpinilor de Enterococccus spp. este de un real folos putând orienta clinicianul spre
o terapie antimicrobiană cât mai eficientă.
10 Pepelea Lia Sorina

SUMMARY OF THE PH.D.THESIS

Resistance phenotypes found in

Enterococcus species isolated
from different pathological
products

Doctorand LIA SORINA PEPELEA

Conducător de doctorat Prof.dr. LIA MONICA JUNIE

CLUJ-NAPOCA 2015
Fenotipuri de rezistenț ă întâlnite la specii de Enterococcus izolate din diferite produse patologice 11

CONTENTS

INTODUCTION 13
THE CURRENT STATE OF KNOWLEDGE
1.Generalities about the genus Enterococcus 17
1.1. Short history 17
1.2. Habitat and implications in infectious pathology 18
1.3. Morfotinctorial characters 19
1.4. Culture characters 20
1.5. Pathogenicity characters 25
1.6. Identifing epidemiological markers
26
2. Resistance of Enterococci to antimicrobial agents 28
2.1. Resistance to beta-lactams 29
2.1.1. Intrinsec resistance 29
2.1.2. Tolerance 30
2.1.3. Beta-lactamase 30
2.2. Resistance to aminoglycoside 31
2.2.1. Intrinsec resistance 31
2.2.2. Acquired resistance 32
2.2.3. High level aminoglycoside resistance 33
2.2.3.1. Incorporating antibiotic in agar 33
2.2.3.2. Microtablets with high concentration of antibiotic 33
2.2.3.3. Broth dilution method 34
2.3. Resistance to macrolides, lincosamides, streptogramines and
Ketolides (MLSK)
34
2.4. Resistance to glycopeptides 35
2.4.1. Screening methods for Vancomycin- resistant enterococci 37
2.5. Resistance to oxazolidinone 38
2.6. Antibiotics synergism 38
2.7. Alternative treatments for multiple antibiotic-resistant 39
enterococci
12 Pepelea Lia Sorina

PERSONAL CONTRIBUTION
1. Assumption of work/Objectives 43
2. Study 1. The Involvement of Enterococcus spp. Strains in the Aetiology of
Infections in Hospitalized Patients and outpacients 45

2.1. Background 45
2.2. Working hypothesis/Objectives
45
2.3. Material and Methods 45
2.4. Results 54
2.5. Discussions 66
2.6. Conclusions 71
3. Studiul 2. Testing the sensitivity of Enterococcus spp. strains to
antibiotics and highlighting the circulating resistance phenotypes. 73

3.1. Background 73
3.2. Working hypothesis/Objectives 73
3.3. Material and Methods 74
3.4. Results 80
3.5. Discussions 109
3.6. Conclusions 114
4. General conclusions 115
5. The originality and innovative contributions of the thesis 117

REFERENCES 119

Keywords: enterococci, resistance, Vancomycin, infections, aetiology, hospital, patients

Fenotipuri de rezistenț ă întâlnite la specii de Enterococcus izolate din diferite produse patologice 13

THE CURRENT STATE OF KNOWLEDGE

1. Generalities about the genus Enterococcus

Enterococci were initially classified as gram-positive cocci of the genus
Streptococcus.1
Were mainly related to the „streptococci of fecal origin”.
They were considered for a long time to be a major division of the Streptococcus
(group D streptococci), differentiated by their higher resistance to chemical and
physicalagents.2
In the early 1930s, the enterococci were splitting as group D streptococci and
they were differentiated from non-enteococcal group D streptococci by auxiliary
biochemical tests.2
Over the next decade, Sherman recommended that the term enterococcus had
been used for streptococci that grow at 10º to 45º C, in 6,5% NaCl and at pH=9.6, and
wich survived 60º from 30 minuets and had the ability to split esculin.3
Definitive evidence of S.faecalis and S.faecium from the other members of the
genus made possible the inclusion into a separate genus, whose characteristics have
been very studied by molecular biology tehniques.2
Current criteria for inclusion in the genus Enterococcus include a combination
of DNA-DNA reassiciation values, 16rRNA gene sequencing, conventional phenotypic
test, whole-cell protein analysis.4,5
Microorganism that are now included in the genus Enterococcus have been
categired as a low pathogenicity bacteria, but in the 1990s the prevalence of these
organsim as nosocomial pathogens is clearly increasing. 6
In the case of hospitalized patients, enterococci can be distinguished at the level
of soft tissue wounds, ulcers, and the gastrointestinal tract.7
Infectious syndromes that recognize enterococci in their aetiology can be
represented by urinary tract infections in the case of patients with obstructive
uropathies and by mixed wound infections, especially in the case of patients
undergoing antimicrobial treatment8,9.
Bacteraemias may occur in the elderly and in immunocompromised patients. 10
Studies conducted in the United States demonstrated that the most pacients
infected with Vancomycin-resistant enterococci strains coming from ICU.11
Among the risk factors that may be added to the ones already mentioned are:
prolonged hospitalization, gastrointestinal colonization with VRE, exposure to
contaminated medical equipment, medullary transplant, haematological conditions,
treatment with third-generation cephalosporins and antibiotics acting on anaerobic
bacteria.11,12
14 Pepelea Lia Sorina

Enterococci rarely cause respiratory tract infections, osteomyelitis or

cellulite; however, they have become the third cause of nosocomial infections in the
United States.13
Enterococcal infections can be caused by at least 19 species including: E.
avium, E. casseliflavus, E. durans, E.faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. hirae, E.
malodoratus, E. mundtii, E. pseudoavium, E. raffinosus, E. solitarius 14.
A number of other species were subsequently added to this list: E. cecorum,
E.columbae, E. saccharolyticus, E. dispar, E. sulfurous, E. seriolicida și E. flavescens.15
Most clinical infections are caused by E. faecalis (80-90%) or E. faecium (5-
15%) .16

E.durans, E. avium și E. hirae species are less common, and other species
mentioned are only isolated ocazional.17

2. Resistance of Enterococci to antimicrobial agents

Being involved ever more frequently in nosocomial infections, enterococci
present natural or acquired resistance to antibiotics, which allows them to survive in
the face of multiple antibiotic treatment schemes.18
Enterococci have acquired resistance to a number of antimicrobial agents,
including tetracycline, erythromycin, chloramphenicol, high levels of trimethoprim,
clindamycin, high levels of aminoglycosides and penicillins (via penicillinase and non-
penicillinase mechanisms), and, more recently, to vancomycin.
All of these resistance instances only raise new questions in connection with
antibiotic therapy in the case of enterococcal infections, because there occurs a
decrease in the number of therapeutic options 19.

PERSONAL CONTRIBUTION

1. Assumption of work/Objectives

Enterococci, although they are part of the intestinal flora commensals, may
become nosocomial pathogens.
In the past three decades, a constant growth in the number of infections
caused by species of the genus Enterococcus has been reported, a phenomenon
probably caused by a growth in the population that shows risk factors (chronic
inflammations, surgery, intestinal neoplasia), but also by the emergence of enterococci
strains with multiple resistance to antibiotics, especially Vancomycin 20.
The present paper is concerned with the assessment of the involvement of
Enterococcus spp. strains in the aetiology of infections, and these microorganisms’
sensitivity to antibiotics.
Fenotipuri de rezistenț ă întâlnite la specii de Enterococcus izolate din diferite produse patologice 15

To this end, both the strains isolated from hospital ward infections as well as
the strains isolated from outpatients were taken into study.
Secondly, the present paper attempts to highlight the circulating resistance
phenotypes of the enterococci strains isolated from the hospital wards as well as from
outpatients, which phenotypes play a role in the improvement of the empirical
antibiotherapy of the infections caused by these strains.

Material and Methods

The present study was conducted in a prospective manner, in that the
Enterococcus spp. strains involved in the aetiology of infections in hospitalized
patients were observed, by ward, during the period January 2010 – December 2012.
The hospitalized patients were from:
The Intensive Care ward (54 beds)
2 General Surgery wards (130 beds)
The Orthopaedics ward (60 beds)
The Gastroenterology ward (50 beds)
The Neonatal ward (40 beds)
The Obstetrics and Gynaecology wards (85 beds)
In the hospital, data from the Clinical Laboratory’s Microbiology
Compartment was used. In order to collect data from the hospital, we used the
standard surveillance data sheet, presented in the annex of Health Ministry Order no.
10/2005.
For each year studied (2010, 2011, and 2012), data was collected both about
the enterococci strains that proved to be a unique etiological agent and the
enterococci strains isolated in association with other microorganisms.
The samples were normally collected from patients by specialized hospital staff,
on account of the fact that the observance of sample-collecting and transportation
rules for pathological products intended for bacteriological analysis influences the
different stages and the accuracy of the diagnosis.
Urine, blood, and cephalorachidian fluid samples were collected, as well as
samples from purulent collections, bronchial aspirate, sputum, and central venous
catheters.
The collected samples were sown on Columbia gelose supplemented with sheep
blood (5%), and then incubated at 37 C for 24 hrs.
In order to isolate the enterococci, we also used the Bile Esculin Azide Agar (Sanimed)
medium, CPS (bioMérieux), Trypticase Soy Agar with 5% sheep blood (bioMérieux),
and the Uriselect (BioRad) chromogenic medium21.
The identification of bacteria belonging to the genus Enterococcus was done
based on culture and biochemical characters.
The observance of the culture characters involved the presence of the following
types of colony:
16 Pepelea Lia Sorina

on gelose-blood, type S, small, white-grey, non-haemolytic colonies - E.

faecalis, beta-haemolytic colonies – E durans, or alpha-haemolytic colonies;
on the Bile Esculin Azide Agar medium, the enterococci develop white-grey
colonies with a black halo;
by wiping with a wad the 24 hour culture obtained on the Trypticase Soy
Agar medium and 5% sheep blood, one can notice the medium’s yellow colouring- E.
casseliflavus, E. mundtii, E. sulfureus;
On the chromogenic CPS medium, the enterococci colonies are green and
small.
In the hospital, the isolated enterococci cultures were identified via the Vitek 2
Compact automatic system (bioMérieux).
The Vitek 2 cards for the identification of Gram-positive cocci are standardized
products that contain miniature biochemical tests.
The Enterococcus species identified by VITEK 2 GP: E.faecalis, E.faecium,
E.avium, E.casseliflavus, E.cecorum, E.columbae, E.durans, E.gallinarum, E.hirae,
E. raffinosus, E. Saccharolyticus.

Statistical methodology
The data obtained as a result of research was entered into and stored in
Microsoft Access 2010-type (*.mdb format) databases and was exported for processing
to Excel 2010 (*.xls) files.
Statistic processing was carried out with the aid of Microsoft Excel 2010, EPI-
INFO version 6.04 and IBM SPSS version 10 packages, and the results of this processing
were exported in all three cases to Excel 2010 worksheet files.
The dichotomous variables, characterized by percentage, were compared by
applying contingency tables and calculating the χ2 test, and using the Fisher correction
where necessary 22.
All these statistical tests were calculated with two extremities, and the
statistical significance value p was taken into account in the case of values ≤ 0.01.

Study 1. The Involvement of Enterococcus spp. Strains in the

Aetiology of Infections in Hospitalized Patients and
outpacients

The species most frequently isolated in hospitalized and outpatients was

E. faecalis (74.88%), followed by E. faecium (20.09%).
8.04 % were other Enterococcus species encountered only in the hospital
environment: E. durans (2.19%), E. casseliflavus (2.19%), E. gallinarium (2.19%), and
E. avium (1.45%).
Fenotipuri de rezistenț ă întâlnite la specii de Enterococcus izolate din diferite produse patologice 17

In hospitalized patients Enterococci were more frequently involved in the

etiology of postoperative infections(30.72%) followed by urinary tract infections
( 29.19 %).
In the hospital, most of enterococcal infections came from the ICU and surgery.
The most common enterococcal infections that were diagnosed in outpatient
were urinary tract infections (75.6 %).
While in outpacients infections were fully monomicrobiene, hospitalized
patients Enterococci were relatively commonly associated Gram -negative bacilli.

Studiul 2. Testing the sensitivity of Enterococcus spp. strains

to antibiotics and highlighting the circulating resistance
phenotypes.

Wild strains are more frequently present in outpatients in an extremely

statistically-significant manner (47.56%) than they are in a hospital setting (11.67%),
p<0.001.
The alteration of the sensitivity to beta-lactams was identified in 43.06%
of the Enterococcus spp. strains coming from the hospital and in 29.26% of the
enterococci isolated in outpatients.
The study of resistance to aminoglycosides showed 46.71% resistant
Enterococcus spp. strains in a hospital setting and 24.39% in the case of outpatients.
The 7 VRE strains identified in the Anaesthesia – Intensive Care ward, in
the course of the study, represent 3.19% of the total enterococci isolated and 5.1% of
the strains coming from the hospital.
Only 8.02% of the enterococci tested were resistant to linezolid, while
none of the strains comprised in the study was resistant to tigecycline, these two
antibiotics being recommended in the treatment of infections produced by
multiresistant enterococci strains.
The large number of Enterococcus spp. strains resistant to beta-lactams
and aminoglycosides isolated in the present study is alarming due to the fact that
these antibiotics are considered to be the first option in the treatment of enterococcal
infections.

General conclusions

The Enterococcus spp. strains isolated in hospital represented 15.6% of

the total germs involved in the aetiology of certain infections, while in the case of
outpatients, 7.05% of the infections diagnosed were caused by enterococci.
18 Pepelea Lia Sorina

Although they are not among the most frequently isolated pathogenic
agents, enterococci, through their natural resistance to cephalosporins, are part of the
flora involved in the aetiology of certain serious infections in hospitalized patients.
The establishment of the circulating resistance phenotypes in hospital
but also in outpatients is important in the urgent development of the anti-infective
therapy.
The statistically-significant differences regarding the resistance to
antibiotics in favour of the hospital, as opposed to outpatients, are connected to the
more frequent administration of antibiotics in the case of hospitalized patients, but
also to the presence of other risk factors regarding the transmission of multiresistant
strains.
Enterococci hold numerous resistance mechanisms capable of ensuring
their survival in the presence of antibiotics, which calls for the identification of certain
possible new action targets for antibiotics.
The control of the emergence and spread of antibioresistance is a public
health priority, worldwide.

Original elements and personal contributions

The study highlights the importance of using modern methods to identify

and test enterococci through the automatic VITEK 2 Compact system, which allowed
the strains to be classified as resistance phenotypes and showed the advantages of
introducing this modern, easy-to-use, accurate method of testing sensitivity to
antibiotics, which yields quick results.
For the isolation and identification of bacteria, modern, chromogenic
media were used as an alternative to the classical methods of isolating bacteria, and
the study points out the advantages of using them and the necessity of introducing
them in other laboratories as well, for a quick identification of certain
microorganisms.
The application and comparison of modern methods of identifying
bacteria with classical methods has a special practical applicability, in that it makes
laboratory work more efficient.
The specification of the aetiology in hospitalized patients and
outpatients, and of the incidence of species and bacterial associations, has proven the
importance of knowledge on enterococci, the present paper also being also an
“indicative guide” for other hospitals in Cluj-Napoca and other regions.
The elucidation of the epidemiological aspects regarding enterococcal
infections, which involved tracking the frequency and distribution of these infections
Fenotipuri de rezistenț ă întâlnite la specii de Enterococcus izolate din diferite produse patologice 19

by different medical and outpatient services, represents an all-time first for university
hospitals and private laboratories in Cluj-Napoca and also nationwide.
Specifying the frequency and aetiology of different types of enterococcal
infections (urinary infections, post-operative infections, respiratory infections,
bacteraemias/septicaemias, gynaecological infections, peritonitis, cholecystitis, CVC
infections) is genuinely useful in the prevention and control of these infections,
especially those caused by VRE strains.
The highlighting of the VRE strains as well as of the multiple resistance
to antibiotics of these microorganisms isolated from hospitalized patients is an
important personal contribution that has outstanding practical repercussions, as it is
an “indicative guide” for laboratory doctors and clinicians.
Specifying the resistance phenotypes by antibiotic class (beta-lactams,
aminoglycosides, glycopeptides, MLSB), as well as the circulating phenotypes of the
Enterococcus spp. strains is really helpful, because it can point the way for clinicians to
a highly efficient antimicrobial therapy.
20 Pepelea Lia Sorina

Referinţe
1. Lucia Martins Teixeira, Carvalho M. G. S., Merquior V. L., Steigerwalt A. G. and al., 1997.
Recent approaches on the taxonomy of the enterococci and some related microorganisms.
Adv. Exp. Med. Biol. 418: 397-400
2. Schleifer, K.H., R. Kilper-Balz. 1984, Transfer of Streptococcus faecalis and Streptococcus
faecium to the genus Enterococcus nom. rev. as Enterococcus faecalis comb.nov. and
Enterococcus faecium comb.nov. Int. J. Syst.Bacteriol. 34:31-34
3. Sherman JM. The streptococci. Bacteriol Rev 1937;1: 3-97
4. Devrise, L. A., Collins M. D., Wirth R., 1992, The genus Enterococcus, p.1465-1481. In A.
Balows, H. G. Truper, Dworkin M., Harder W., Schleifer K. H. (ed), The Prokaryotes. A
Handbook on the Biology of Bacteria: Ecophysiology, Isolation, Identification, Applications,
2nd ed. Springer-Verlag, New York, N.Y
5. Facklam R. R, Carvalho G. S., Teixeira L. M.,2002. History, taxonomy, biochemical
caracteristics and antibiotic susceptibility testing of enterococci, p.1-54. In Gilmore M. S,
Clewell, Courvalin P., Dunny G. M., Murray B. E, Rice L. B (ed), The Enterococci: Pathogenesis,
Molecular Biology and Antibiotic Resistance., ASM Press, Washington, D.C
6. Merquior V. L. C, Peralta J. M., Facklam R. R., Teixeira. 1994. Analysis of electrophoretic
wholecell protein profiles as a tool for characterization of Enterococcus species. Curr.
Microbiol. 28: 149-153
7. Patel R., Piper K. E., Rouse M. S., Steckelberg J. M., Uhl J. R., Kohner M. K., and al., 1998.
Determination of 16 rARN sequences of enterococci and application to species identification
of nonmotile Enterococcus gallinarum isolates. J. Clin. Microbiol. 36:3399-3407
8. Noble, C. J. 1978. Carriage of group D streptococci in the human bowel. J. Clin. Pathol.
31:1182-1186.
9. Kurrie, E., S. Bhaduri, D. Krieger, W. Gaus, H. Heimpel, H.Pflieger, R. Arnold, and E. Vanek.
1981. Risk factors for infections of the oropharynx and the respiratory tract in patients with
acute leukemia. J. Infect Dis. 144:128-136.
10. Smyth, C. J., M. A. Docent, M. K. Halpenny, and S. J. Ballagh. 1987. Carriage rates of
enterococci in the dental plaque of haemodialysis patients in Dublin. Br. J. Oral Maxillofacial
Surg. 25:21-33.
11. Edwards DD. Enterococci attract attention of concerned microbiologists. ASM News 2000;
66: 540-5
12. Warren, R. E. 1988. Difficult streptococci. J. Hosp. Infect.II(Suppl. A):352-357
13. Harding, G. K. M., and A. R. Ronald. 1974. A controlled study of antimicrobial prophylaxis of
recurrent urinary infection inwomen. N. Engl. J. Med. 291:597-601.
14. Warren, J. W., J. H. Tenney, and J. M. Hoopes. 1982. Aprospective microbiologic study of
bacteriuria in patients with chronic indwelling urethral catheters. J. Infect. Dis. 146:719.
15. Maki, D. G., and W. A. Agger. 1988. Enterococcal bacteremia:clinical features, the risk of
endocarditis, and management.Medicine (Baltimore) 67:248-269.
Fenotipuri de rezistenț ă întâlnite la specii de Enterococcus izolate din diferite produse patologice 21

16. Hoffmann, S. A., and R. C. Moellering. 1987. The enterococcus: "putting the bug in our ears."
Ann. Intern. Med. 106:757-761.
17. Schaberg DR, Culver DH, Gaynes RP. Major trends in the microbial etiology of nosocomial
infection. Am J Med 1991; 91:72S-75S
18. Evans, A. C., and A. L. Chinn. 1947. The enterococci: with special reference to their
association with human disease. J.Bacteriol. 54:495-512.
19. Facklam, R. R., and M. D. Collins. 1989. Identification of Enterococcus species isolated from
human infections by a conventional test scheme. J. Clin. Microbiol. 27:731-734.
20. Collins, M. D., D. Jones, and J. A. E. Farrow, R. Kilpper-Balz,and K. H. Schleifer. 1984.
Enterococcus aivium nom. rev.,comb. nov.; E. casseliflavus nom. rev., comb. nov.; E. durans
nom. rev., comb. nov.; E. gallinarurn comb. nov.; and E.malodoratus sp. nov. Int. J. Syst.
Bacteriol. 34:220-223.
21. Barbara E. Murray, Beta-Lactamase-Producing Enterococci. In Antimicrobial Agents And
Chemotherapy, 2002, 36: 2355-2359
22. Sharma, R., L. Sharma, and B. Kapoor. 2005. Antibacterial resistance: current problems and
possible solutions. Indian J. Med. Sci. 59120-129.
23. Fritsche TR, Sader HS, Jones RN. Epidemiology of Antimicrobial Resistance: Species
Prevalence, Susceptibility Profiles, and Resistance Trends. In: Lorian V. Antibiotics in
laboratory medicine. Lippincott Williams &Wilkins. 2005; Chapter 17: 815-850
24. Knapp R, Miller III MC. Test of Statistical Significance: chi-square Procedure in Clinical
Epidemiology and Biostatistics, Williams &Wilkins, Baltimore, Maryland 1992; 209-21
25. Buiuc D, Neguţ M. Tratat de Microbiologie Clinică. Editura Medicală, Bucureşti, 1999