Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Bacteriile Lactice
Bacteriile Lactice
În ultimii ani, pentru specia Leuconostoc oenos s-a propus o nouă denumire:
Oenococcus oeni, pentru moment singura specie a genului Oenococcus.
Determinarea genului bacteriilor lactice izolate din vin
Morfologie Celule rotunjite Celule alungite
Coci Bacili
Aranjarea celulelor Perechi sau şiraguri Tetrade Perechi sau lănţişoare
Fermentarea glocozei Heterofermentativă Homofermentativă Heterofermentativă sau
homofermentativă
Izomerul acidului lactic D L sau D, L L, D sau D, L
Genul Leuconostoc Pediococcus Lactobacillus
(Oenococcus)
DEZVOLTAREA BACTERIILOR LACTICE ÎN VIN
- Tărie alcoolică ridicată > 12% vol. - Tărie alcoolică scăzută < 12°C
Scopul lucrării
Lucrarea are ca scop monitorizarea desfăşurării procesului de fermentaţie malolactică,
prin îndeplinirea următoarelor obiective:
- estimarea degradării acidului malic prin cromatografie pe hârtie (metoda Michaud) şi
prin dozare enzimatică;
- dozarea enzimatică a acidului lactic produs în urma fermentaţiei malolactice
- monitorizarea evoluţiei populaţiei bacteriene în decursul fermentaţiei malolactice prin
metode de numărare directe (cu camera Thoma) şi indirecte (prin examen cultural)
Introducere
Fermentaţia malolactică este un proces de dezacidifiere biologică a vinului şi constă în
degradarea acidului malic din vin în acid lactic şi CO2, conform următoarei reacţii:
HOOC – CH2 – CHOH – COOH CH3 – CHOH – COOH + CO2
acid malic acid lactic dioxid de carbon
Din această reacţie reiese că prin decarboxilarea acidului malic, care este un acid
dicarboxilic (cu două funcţii acide), se formează acid lactic, care este acid monocarboxilic (cu o
singură funcţie acidă) şi CO2. Odată cu îndepărtarea uneia din funcţiile acide, se reduce şi
jumătate din aciditatea imprimată de acidul malic.
Plusul de calitate care apare după desăvârşirea fermentaţiei malolactice nu se datorează
numai reducerii acidităţii, ci şi formării acidului lactic, care impresionează mai plăcut papilele
gustative, spre deosebire de acidul malic, care imprimă o aciditate crudă şi o anumită nuanţă de
verdeaţă.
Dacă se derulează în condiţii optime, fermentaţia malolactică prezintă efecte importante
asupra calităţii vinului şi anume:
reduce aciditatea vinului şi măreşte uşor pH-ul;
creşte stabilitatea biologică a vinului, asigurând evitarea unei eventuale fermentaţii
malolactice nedorite în vinurile îmbuteliate;
modifică aroma şi gustul vinului, mărindu-i complexitatea.
Bacteriile lactice produc mici cantităţi de acetoină, din care o parte poate fi oxidată în
diacetil, substanţă cu miros specific de unt.
Creşterea concentraţiei de diacetil reprezintă una dintre cele mai importante contribuţii
ale bacteriilor lactice la aroma vinului. În concentraţii mari, aceasta conferă vinului o aromă
puternică de unt, în timp ce în concentraţii mici, diacetilul contribuie la aroma de nuci, de drojdii
sau de caramel.
Ca urmare a scăderii acidităţii, culoarea vinurilor roşii seci se modifică, devenind mai
puţin aprinsă.
Aroma vinurilor fermentate malolactic se modifică şi ea. Astfel gustul acerb, dur,
determinat de aciditate şi taninuri dispare treptat, fiind înlocuit de un gust mai fin şi mai catifelat
datorat eliberării de către bacteriile lactice în vin a unor polizaharide, aminoacizi, acizi nucleici.
În ansamblu, vinurile după fermentaţia malolactică devin mai armonioase, mai pline şi
mai evoluate.
Declanşarea şi desăvârşirea procesului de fermentaţie malolactică se datorează bacteriilor
lactice din genurile: Lactobacillus, Leuconostoc şi Pediococcus.
Fermentaţia malolactică evoluează diferit în vinurile albe şi roşii. Dacă la vinurile roşii
seci, fermentaţia malolactică trebuie privită ca o operaţie integrată în tehnologia de elaborare a
vinurilor roşii, la vinurile albe demidulci şi dulci trebuie privită ca un „promotor de defecte”,
putând conduce la borşire sau manitare.
Parte experimentală
I. Estimarea acidului malic prin cromatografie pe hârtie
Principiul metodei
Se bazează pe solubilitatea diferită a acizilor faţă de anumiţi solvenţi, când aceştia
străbat prin capilaritate un suport solid-hârtia.
Antrenarea şi separarea acizilor organici din vin se face cu ajutorul amestecului butanol-
n-acid acetic-apă, iar punerea în evidenţă prin intermediul albastrului de bromfenol. După
apariţia petelor de acizi, ce apar galbene pe un fond albastru, se observă următoarea poziţionare:
acidul tartric aproape de linia de start;
acidul malic în centru;
acidul lactic şi succinic la partea superioară.
Prin comparare cu soluţii etalon de acid malic se poate aprecia conţinutul de acid malic în
vin.
Reactivi
soluţie albastru de bromfenol în n-butanol 0,1 %;
acid acetic-apă 1:1 (volume);
acid malic 0,5 g/100 ml: într-un balon cotat de 100 ml se aduc 0,5 g acid malic, 85 ml
apă şi alcool etilic 96 % vol până la semn.
Mod de lucru
Pe o fâşie de hârtie cromatografică, cu înălţimea de circa 20 cm şi lăţimea
corespunzătoare numărului de probe de vinuri şi de probe etalon, se trasează o linie cu creionul
la 4 cm de marginea inferioară pe care se punctează la 3 cm de marginea laterală poziţiile unde
urmează să depunem probele, distanţate cu 2 sau 3 cm.
Cu ajutorul unei micropipete se depune 1 μl din soluţiile etalon cu 1, 2, 3, 4 şi 5 g/l acid
malic, apoi 1 şi 3 μl din probele de vinuri (după fiecare depunere de 1 μl pata se usucă, după care
urmează o nouă depunere). În acest caz petele de pe hârtie trebuie să aibă un diametru de circa 5
mm. În funcţie de concentraţia în acizi a vinului se depun circa 5 pete pentru fiecare probă,
având grijă ca hârtia să fie uscată când se depune o nouă pată de vin.
Într-o capsulă Petri cu diametrul corespunzător se aduce solventul format din 50 ml
butanol cu indicator şi 20 ml acid acetic diluat (1:1), se plasează cilindrul de hârtie şi se acoperă
etanş cu un clopot de sticlă. Când solventul a ajuns la circa 2 cm de marginea superioară (circa 3
ore) se scoate hârtia şi se usucă în aer liber sau în nişă.
Se apreciază conţinutul de acid malic, respectiv evoluţia fermentaţiei malolactice în
vinuri.
II. Dozarea enzimatică a acidului L-malic
Principiu
Acidul L-malic este oxidat la oxaloacetat de către NAD+ în prezenţa L-malat
dehidrogenazei (L-MDH):
L-MDH
(1) L-malat + NAD+ Oxaloacetat + NADH + H+
Dacă reacţia este catalizată de enzima glutamat-oxaloacetat-transaminază (GOT),
oxaloacetatul este transformat în L-aspartat în prezenţa L-glutamatului.
L-MDH
(2) Oxaloacetat + L-glutamat L-aspartat + 2-oxoglutarat
Compoziţia kitului
1. Sticla 1 cu 30 ml soluţie, formată din: tampon glicilglicină (pH 10); acid L-glutamic
(440 mg).
2. Sticla 2 cu 210 mg NAD, liofilizat.
3. Sticla 3 cu 0,4 ml suspensie glutamat-oxaloacetat-transaminază (GOT), 160 U.
4. Sticla 4 cu 0,4 ml soluţie L-malat dehidrogenază, 2400 U.
5. Soluţie de control pentru analiza acidului L-malic. Se foloseşte nediluată.
Soluţiile ce urmează a fi folosite se pregătesc astfel:
1. Se foloseşte conţinutul sticlelor 1, 3 şi 4 nediluat.
2. Se dizolvă conţinutul sticlei 2 cu 6 ml apă bidistilată.
În procedeul de lucru am utilizat o lungime de undă de 365 nm, cuve de sticlă cu
lungimea de 1 cm, o temperatură cuprinsă între 20-25 0 C, iar citirea la spectrofotometru se face
faţă de aer (fără cuvă)
Se determină diferenţele de absorbanţe (A 2-A1) atât pentru blank, cât şi pentru probă.
Apoi se scade diferenţa obţinută pentru blank din diferenţa obţinută pentru probă şi se obţine ΔA.
ΔA = (A2-A1) proba - (A2-A1) blank
Pentru obţinerea unor rezultate precise, diferenţele de absorbanţă obţinute trebuie să fie
de cel puţin 0,100 unităţi absorbanţă.
Pentru calcularea conţinutului de acid L-malic din vin, se utilizează următoarea formulă:
c = 2,977 / ε ∙ ΔA acid L-malic [g acid L-malic/l soluţie probă]
unde: ε = coeficientul de extincţie al NADH la lungimea de undă utilizată = 3,4 [l x
mmol-1 x cm-1]
ΔA = diferenţa de absorbanţă
În cazul în care probele au fost diluate, rezultatele trebuie înmulţite cu factorul de diluţie
III. Dozarea enzimatică a acidului L-lactic
Principiu
Acidul L-lactic este oxidat la piruvat de către NAD+ în prezenţa enzimei L-lactat
dehidrogenază (L-LDH).
Compoziţia kitului
1. Sticla 1 cu 30 ml soluţie, formată din: tampon glicilglicină (pH 10); acid L-glutamic
(440 mg).
2. Sticla 2 cu 210 mg NAD, liofilizat.
3. Sticla 3 cu 0,7 ml suspensie glutamat-piruvat-transaminază (GPT).
4. Sticla 4 cu 0,7 ml soluţie L-lactat dehidrogenază, 3800 U.
5. Soluţie de control pentru analiza acidului L-lactic. Se foloseşte nediluată.
Soluţiile ce urmează a fi utilizate se pregătesc astfel:
1. Se foloseşte conţinutul sticlelor 1, 3 şi 4 nediluat.
2. Se dizolvă conţinutul sticlei 2 cu 6 ml apă bidistilată.
În procedeul de lucru am utilizat o lungime de undă de 365 nm, cuve de sticlă cu
lungimea de 1 cm, o temperatură cuprinsă între 20-25 0 C, iar citirea la spectrofotometru se face
faţă de aer (fără cuvă).
Pipetare Blank Probă
Soluţia 1 1,000 ml 1,000 ml
Soluţia 2 0,200 ml 0,200 ml
Suspensia 3 0,020 ml 0,020 ml
Probă - 0,100 ml
Apă bidistilată 1,000 ml 0,900 ml
Toate aceste soluţii se amestecă şi după aproximativ 5
minute se citesc absorbanţele soluţiilor (A1). Apoi se mai
adaugă şi ultima soluţie.
Soluţia 4 0,020 ml 0,020 ml
După adăugarea ultimei soluţii amestecul se agită, iar
după aproximativ 30 minute se citesc absorbanţele
blankului şi ale probei (A2), imediat una după alta.
Se determină diferenţele de absorbanţe, (A2 – A1) atât pentru blank, cât şi pentru
probă, după care se scade diferenţa obţinută pentru blank din diferenţa obţinută pentru
probă şi vom obţine ΔA.
ΔA = (A2 – A1) proba - (A2 – A1) blank
Pentru calculul conţinutului de acid L-lactic din vin, se utilizează următoarea formulă:
c = 2,018 / ε ∙ ΔA acid L-lactic [g acid L-lactic/l soluţie probă]
În cazul în care probele de vin au fost diluate, pentru ca rezultatele să fie corecte, acestea
trebuie înmulţite cu factorul de diluţie.
III. Numărarea bacteriilor lactice cu ajutorul camerei de numărat Thoma
Camera de numărat THOMA este o lamă de sticlă cu trei platforme, dintre care platforma
centrală este denivelată faţă de celelalte două cu 0,10 mm. Pe platforma centrală este gravată o
reţea de linii perpendiculare care delimitează o anumită suprafaţă divizată de către linii
perpendiculare de formă pătratică. Suprafaţa platformei este de 1 mm2, iar suprafaţa unei
microcelule este de 1/400 mm2.
Mod de lucru
Pentru determinarea numărului de bacterii lactice, pe platforma centrală se pune o
picătură de de vin, după care se acoperă cu o lamelă. Preparatul astfel obţinut se fixează pe
platina microscopului cu ajutorul unor cleme şi apoi se examinează cu obiectiv de 45x şi ocular
de 10x.
Într-un câmp microscopic se observă 16 microcelule, se numără celulele de bacterii
lactice de pe 10 câmpuri microscopice diferite şi se calculează numărul mediu de celule de
bacterii lactice de pe fiecare microcelulă.
Cunoscând suprafaţa unei microcelule şi denivelarea platformei, se poate calcula volumul
microcelulei:
V = 1/400 x 1/10 = 1/4000 mm3
În funcţie de volumul unei microcelule şi de gradul de diluţie al probei, se calculează
numărul de celule de bacterii / ml vin:
N = n x 4000 x 1000 x k
unde : N = numărul de celule de bacterii / ml vin;
n = numărul mediu de celule de bacterii de pe microcelule;
4000 = inversul volumului, [mm3];
1000 = factorul de transformare din mm3 în cm3;
k = factorul de diluţie;
IV. Numărarea coloniilor de bacterii lactice prin examen cultural
Din probele de vin şi din diluţiile decimale ale acestora, se inoculează căte 1 ml în cutii
Petri sterile, şi se face omogenizarea cu mediu MRS agar fluidificat şi răcit la 45 0 C
După însămânţare, cutiile se introduc în termostat la temperatura de 37 0 C, timp de 48-
72 ore. După termostatare, se numără coloniile de pe fiecere placă Petri şi se estimează
numărul total de bacterii lactice cu formula
UFC/ml vin = ∑ n* d/ N
unde n- numărul de colonii de bacterii lactice formate
d- diluţia probelor inoculate
N- numarul de plăci Petri luate în considerare
Rezultate şi discuţii
În cadrul primului experiment, de estimare a acidului malic prin cromatografie pe hârtie,
s-au analizat mai multe probe de vin pentru a urmări desfăşurarea fermentaţiei malolactice la
diferite momente de timp.
Fig. 1 Acid malic-Oporto-Merlot- Băbească neagră-Burgund-Cabernet Sauvignon-
Cadarcă-Blauerzweigelt 19.04.2007
Fig. 2 Acid malic-Oporto-Merlot- Băbească neagră-Burgund-Cabernet Sauvignon-
Cadarcă-Blauerzweigelt
28.04.2007
Fig. 3 Acid malic-Oporto-
Merlot-Burgund-Cabernet Sauvignon-
Sangiovese-Blauerzweigelt
05.05.2007
Figura 1 Figura 2
Figura 3
În figura 1 se poate observa că singurul vin care şi-a terminat fermentaţia malolactică este
cel obţinut din soiul Cadarcă, deoarece se separă doar acid tartric şi acid lactic.
În cazul vinului obţinut din soiul Băbească neagră, putem spune că fermentaţia
malolactică este în plină desfăşurare, deoarece se separă atât acid malic, cât şi acid lactic.
În figura 2, în care am urmărit stadiul fermentaţiei malolactice a vinurilor după 9 zile,
putem constata că de data aceasta şi vinul obţinut din soiul Băbească neagră (inoculat cu bacterii
lactice selecţionate) şi-a finalizat fermentaţia malolactică. În acest caz se separă doar acid lactic,
ceea ce înseamnă că acidul malic s-a transformat integral în acid lactic.
În figura 3 am urmărit desfăşurarea fermentaţiei malolactice a unor probe de vin, după ce
acestea au fost însămânţate cu un preparat comercial INOFLORE R (ce contine specia
Leuconostoc oenos) şi au fost lăsate la fermentat timp de 7 zile.
Se poate observa că, în acest caz, doar o singură probă de vin şi-a încheiat procesul de
fermentaţie malolactică şi anume, proba obţinută din soiul Merlot, la care se separă doar acid
tartric şi acid lactic.
În cadrul experimentului legat de dozarea enzimatică a acidului L-malic şi L-lactic, am
dozat conţinutul de acid malic şi lactic din mai multe probe de vin.
La vinul obţinut din soiul Băbească neagră, înainte de fermentaţia malolactică, rezultatul
este următorul: conţinutul de acid malic Băbească neagră = 0,730 g/l
La vinul obţinut din soiul Băbească neagră, după fermentaţia malolactică, am obţinut
următorul rezultat: conţinutul de acid lactic Băbească neagră = 1,051 g/l
De asemeni, am monitorizat evoluţia populaţiei bacteriene înainte de fermentaţie
malolactică, prin însămânţarea probelor de vin nefermentate malolactic pe mediu MRS agar şi
numărarea coloniilor de bacterii lactice. Astfel, s-au obţinut următoarele rezultate, care pot fi
observate şi din figurile de mai jos:
Băbească neagră – număr mic de colonii de bacterii lactice
Cabernet Sauvignon – număr mediu de colonii de bacterii lactice
Merlot, Cadarcă- număr mare de colonii de baterii lactice
Merlot Cadarcă
Concluzii
În concluzie, putem spune că momentul finalizării fermentaţiei malolactice diferă în
funcţie de tipul de vin şi de soiul de struguri din care a fost obţinut vinul respectiv. Momentul
desăvârşirii fermentaţiei malolactice este influenţat de temperatură, pH, aciditatea totală,
concentraţia alcoolică, conţinutul în bioxid liber şi total al vinului. De asemeni, momentul
terminării fermentaţiei malolactice, depinde şi de varianta de fermentare: spontană sau dirijată
(cu bacterii lactice selecţionate).
De remarcat, este faptul că vinul Băbească neagră, deşi are o microfloră indigenă, destul
de redusă, reuseşte să fermenteze malolactic mult mai repede, comparativ cu celelalte vinuri.
Acest lucru se întămplă, deoarece a fost inoculat cu bacterii lactice selecţionate, care au reuşit sa
degradeze total acidul malic. În varianta fermentaţiei malolactice spontane (cu microfloră
indigenă), acest vin nu reuşeşte să fermenteze malolactic.
Determinând cu precizie, concentraţiile de acid malic şi lactic din vinuri şi totodată
printr-o utilizare judicioasă a culturilor starter de bacterii malolactice, putem iniţia şi finaliza o
fermentaţie malolactică în condiţii de siguranţă, mărind stabilitatea microbiologică a vinului şi
îmbunataţind profilul senzorial al acestuia.