Marius Bojita Liviu Roman

Robert Sandulescu Radu Oprean

UNIVERSITATEA DE MEDICINASl FARMACIE

JULIU HATIEGANU" CLUJ-NAPOCA

Volumul 2. Metode instrumentale in analiza

si controlul medicamentelor

Editura Intelcredo 2003

DEVA
ISBN 973-8197-15-5
Copyright Intelcredo © 2003

Publicata de Intelcredo SA 2700-Deva

Editura tel: 0264/594914 FAX: 0264/594914
Serv. comercial tel. 0722-234058

INTRODUCERE

Lucrarea „Analizas. i controlul medicamentelor" afost conceputa in dona volume,

Toale drepturile asupra acestei lucrari apartin autorilor si editurii Intelcredo S.A. dintre care primul trateaza problematica generala a analizei si controlului medica-
Deva. mentelor, aducand in discufie cele mai noi date referitoare la calitatea s.i siguranta
medicamentului. Aceste aspecte includ date specifice privind prelevarea si esantionarea
Nici o parte din acest volum nu poate fi copiata sau transmisa prin nici un mijloc, probelor de inedicamente si pretratamentul lor pana la faza de masurare a semnalului
electronic sau mecanic, inclusiv fotocopiere, inregistrare audio sau prin orice alt analitic. De asemenea, o importanta aparte s-a acordat In volumul 1 stabilitatii medi-
sistem de stocare si redare a informatiei, fara permisiunea scrisa din partea autorilor camentelor, normelor, cerintelor si performantelor actuate in domcniul analizei si
si editurii Intelcredo Deva. controlului inedicarnentelor in conexiune cu legislatia nafionala, a Comunitatii
Europene, a SUA si Japoniei, a OMS etc.
In prezent nu se poate vorbi de calitatea si siguranja medicamentelor fara o inalta
calitate profesionala a specialistilor din acest domeniu. Calitatea presupune pe de o parte
multa stiinja, iar pe de alta parte multa constiinta. lar stiinta implica o mare cantitate de
informatie, care asigura profesionalismul specialistilor care lucreaza in acest domeniu,
iar constiinfa impune responsabilitate, onestitate si o Tnalta moralitate. Aceste concepte
c
T,tya?ita in sunt formulate sub forma unor criterii dc calitate si acceptanta a calitatii medicamen-
telor, de acreditare a laboratoarelor de analizS si control si de atestare a competentei
prin Intelcredo SA Deva si Imprimeria Ardealul Cluj-Napoca speciaiistilor.
In elaborarcaacestui al doilea volum, care poarta subtitlul ,,Metode instnimentale
de analiza si control" s-a tinut seama de programa analitica in vigoare a acestei spe-
cialitati si de evolu{ia tehnologica a instrumentelor de masurare, de progresele rapide
din domeniul electronicii si informaticii in general si information analitice in particular.
Aceasta lucrare se bazeaza pe experienta acumulata de autori in cateva dcccnii de
activitate in invatamantnl farmaceutic romanesc, considerand ca cine nu cunoaste
problematica generala a analizei (calitative si cantitative), bazele teoretice si practice ale
Lucrarea execulata acesteia, nu poate intelege procesele complexe care stau la baza metodelor instrumenlale
la Imprimeria ,,ARDEALUL" Cluj moderne. Multora dintre speciali^ti le ,,scapa" faptul ca peste 90% din cuantumul erorii
B-dul 21 Decembrie nr. 146 Cluj-Napoca finale a unei analize se datoreaza esantionarii si pretratainentului probelor in etapele ce
Tel.: 413871; Fax: 413883
Comanda nr. 3077/2003 premerg masiiratoarea analitica propriu-zisa. Far aceste erori sunt in mare masura erori
personale ale celor care lucreaza, datorandu-se In principal neatenjiei si lucrului nein-
grijit.
 CUPRINS
Pentru a veni Tn sprijinul Tnfelegerii si cunoasterii metodelor de analiza instrumeii-
tala, pentru fiecare tip de metoda se expun principiile tcoretice, aparatura, principalii
parametri operational! si importanfa lor, avantajele si limitele metodelor tratate, ca si
aplicatiile lor, in primul rand in analiza si controlul mcdicamenlelor. De asemenea, sunt
expuse si unele date referitoare la selectivilalea, exactitatca, precizia si sensibilitatea lor,
in comparatie cu alte metode, cu sublinierea necesitatii de a sc asigura Tntotdeauna un CUPRINS
raport costuri/beneficii acceptabil, iar in acest context si necesitatea reducerii lucru-
lui/probS.
Desi acest volum include o mare cantitate de informajii, acestea sunt tratate intr-o 1NTRODUCERE 3
maniera inteligibila pentru a putea f i infelese si asimilate. Pe dc alta parte, aceasta lucrare ABREVIERI 12
ofera o baza teoretica si practica polivalenta, adaptata cerintelor si exigentelor actuale
ale analizei si controlului de medicaments. CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APL1CAT1I IN ANALIZA SI
Ambele volume ale lucrarii ,,Analiza si controlul medicamentelor" se adreseaza CONTROLUL MEDICAMENTELOR 17
in primul rand sttiden}ilor facultatilor $i colegiilor de farmacie, dar ele sunt utile prin 1.1. Notiuni generale 17
problematica tratata si pentru studentii facultatilor de cliimie, de chimic alimentara etc. 1.2. Bazele teoretice ale cromatograf iei 26
cat si pentru cloctoranzii din aceste domenii, pentru cercetatori §i cadre didactice univer- 1.2.1. Parametri i cromatograf ici 26
sitare, inclusiv din domeniile biomedicale.
1.2.2. Eficacitatea coloanei cromatograf ice 44
Aducem calde multumiri tuturor celor care ne-au sprijinit in elaborarea acestei 1.2.3. Simetria picurilor si modificarea formei lor 50
lucrari, Tntre care Agentia Nationala a Medicamentului, sponsorilor nostri si colegilor 1.2.4. Largirea picurilor si dilutia cromatografica 53
apropiaji.
1.2.5. Rezolutia separarii cromatografice 55
1.2.6. Detectia analitilor separaji cromatografic 62
Cluj-Napoca 1.2.7. Aplicafiile metodelor cromatografice 63
Decembrie 2002 1.3. Cromatografia de lichide de inalta performanta 65
1.3.1. Cromatografia HPLC pecoloana 66
Autorii
1.4. Unele preocupari actuale privind optimizarea continua a metodelor
cromatografice de analiza 77
1.4.1. Dezvoltarea fazelor stationare pe baza de carbon poros grafitat 77
1.4.2. Utilizarea in HPLC a unor faze stationare cu acces restrictiv 79
1.4.3. Aplicatii ale HPLC pe coloane Discovery™CIS si RP-Amide C16
in analiza si controlul medicamentelor 85
1.4.4. Cresterea eficientei separarilor de medicamente utilizand dona
coloane cu sistem de comutare rapida si gradienti 96
1.4.5. Separari cromatografice ale moleculelor chirale 104
1.5. Electrocromatografia capilara (CEC) 115
1.5.1. Cuplajul electrocromatografiei capilare cu spectrometria de masa 122
1.6. Cromatografia cu fluide supercritice (SFC) 127
1.7. Cromatografia de excludere sterica 139
1.7.1. Notiuni generale. Definite, clasificare, tipuri de geltiri 139
1.7.2. Mecanismul separarii pe geluri. Parametrii mai impoftanti 146
1.8. Cromatografia de scliimb ionic 155
1.8.1. Definitia si structtira schimbatorilor de ioni 155
1.8.2. Proprietati fizico-chimice ale schimbatorilor de ioni..... 159
F CUPRINS CUPRINS

1.8.3. Deplasarea echilibrelor de schimb ionic si factorii care o 2.7.7. Utilizarea electroforezei, in preconcentrarea tinor medicamente
influenteaza 162 prin bio sau imunoafinitate 281
1.8.4. Fenomenul Donan 163
1.8.5. Modul de operare in ioncromatografie 165 CAPITOLUL 3 NOTIUNI GENERALE REFERITOARE LA METODELE
1.9. Cromatografia planara 173 OPTICE SPECTRALE DE ANALIZA 289
1.9.1. Cromatografia pe hartie 173
1.9.2. Cromatografia pe strat subtire (CSS) :. 174
CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE [N ULTRAVIOLET
1.9.3. Evaluarea densitometrica a cromatogramelor CSS 188 SI IN VIZIBIL 296
1.10. Cromatografia de gaze 198 4.1. Oomeniul spectral UV - VIS. Originea absorbtiei 296
1.10.1. Definite. Aparatura 198 4.2. Absorbtia luininii. Tranzitii electronice 298
1.10.2. Coloane, faze stationare si mobile 202
4.3. Producerea culorii. Cromofori. Solvatocromie.Deplasari bato $i
1.10.3. Conditii de operare in Cromatografia de gaze 209 hipsocrome 302
1.10.4. Detector! utilizati in Cromatografia de gaze 213 4.4. Spectrofotometria UV-VIS 306
1.10.4.1. Detectori.il de conductibilitate termicS 213
1.10.4.2. Detectorul cu ionizare In flacarS 215 4.5. Legea fundamentals a absorbtiei 308
1.10.4.3. Detectoul termoionic 216 4.6. Abater) de la legea Lambert-Beer. Erori datorate instrumentelor 310
1.10.4.4. Detectorul prin fotometrie de flacara 217 4.7. Determinari cantitative. Curba de calibrare 312
1.10.4.5. Detectorul cu captura de electron! 218 4.8. Utilizarea spectrelor electronice pentru studii de structural - activitate 315
1.10.5. Aplicatii ale cromatografiei de gaze In controlul medicamentului 221 4.9. Inregistrarea spectrelor 318
1.10.6. CuplaJLiI GC-MS pentru analiza rapida in radiatii moleculare 4.10. Determinarea valorii pK a din masur3tori spectrofotometrice 321
supersonice 226
4.11. Exemple de spectre UV ale unor substan}e inedicamentoase 324
1.10.7. Cuplaju) LC-GC 234
4.12. Spectrometria derivatS 327
1.10.8. Cuplajul HPLC-HRGC 237

CAPITOLUL 2. ELECTROFOREZA 240 CAPITOLUL 5 SPECTROMETRIA ATOMICA 333

2.1. Notiuni introductive 240 5.1. Spectrometria de absorbtie atomica si de emisie atomica in flacara 333
2.2. Electroforeza zonala... 243 5.2. Spectrometria de absorbtie atomica electrotermala 338
2.3. Factorii care influenteaza electroforeza 245 5.3. Spectrometria atomica de emisie in plasma 346
2.4. Imunoelectroforeza 250 5.4. Aplicatii ale spectrometriei atomice 350
2.5. Electroforeza prin izofocalizare 251
2.6. Electroforeza bidimensionala 252 CAPITOLUL 6 SPECTROMETRIA IN INFRAROSU 353
2.7. Electroforeza capilara 252 6.1. Regiuni spectrale IR. Moduri de vibratie moleculara .„ 353
2.7.1. Electroforeza capilara zonala 256 6.2. Obtinerea spectrelor IR si interpretarea lor ." 356
2.7.2. Electroforeza capilara micelara 257 6.2.1. Etape in Inregistrarea spectrelor IR 362
2.7.3. Electroforeza capilara pe gel 258 6.2.1.1. Etape la inregistrarea spectrelor in IR - apropiat 365
2.7.4. Separarea enantiomerilor prin CE in contracurent 259 6.3. Spectrometre cu transformare Fourier 366
2.7.5. Aplicarea electroforezei capiiare in analiza ?i controlul 6.4. Spectrometria de difuzie Raman 373
medicamentelor ilicite : 264 6.5. Intocmirea unei biblioteci de spectre IR de referinfa pentru
2.7.6. Separari CE chirale 277 medicamente ...382
8 CUPRINS CUPRINS

CAPiTOLUL 7 SPECTROFLUORIMETRIA 383 11.7.1. Cuplajul gazcromatografie-spectrometrie de masa (GC-MS) 467

7.1. Notiuni generale 383 11.7.2. Cuplajul cromatografie de lichide-spectrometrie de masa
7.2. Masurarea intensitalii fluorescentei 385 (UPLC-MS) 469
7.3. Polarizatia de fluorescenta 394 11.7.3. Identificarea unei molecule de analit 472
11.7.4. Determinarea formulelor brute 473
CAPITOLUL 8 SPECTROMETRIA DE FLUORESCENTA CU RAZE X 400 11.7.5. Stabilirea formulei moleculare 474
8.1. Notiuni introductive 400 11.7.6. Utilizarea spectrometriei de masa in analiza cantitativa 478
8.2. Spectrul de fluorescenta X 402 11.7.7. Delerminarea rapoartelor izotopice 479
8.3. Detectoare de fluorescenta X 407 11.7.8. Identificarea unui compus cu ajutorul spectrotecii MS 481
8.4. Analizorul cu raze X cu energie dispersive (EDX) 411 11.7.9. Alte aplicatii ale spectrometriei de masa in analiza ?i controlul
medicamentelor ....482
CAPITOLUL 9 SPECTRE DE M1CROUNDE 415
9.1. Studiul cantitativ al energiei de rotatie ..415
CAPITOLUL 12 SPECTROMETRIA DE REZONANTA MAGNETICA
NUCLEARA 489
12.1. Producerea spinului nuclear 489
CAPITOLUL 1 0 METODE OPTICE NESPECTRALE 420
12.2. Absorbtia de radiatii s.i variatia energiei. 491
I O . I . Polarimetria 420
12.3. Grupuri sau populatii de nuclee 495
I O . I . I . Notiuni generale 420
l O . l . l . l . Lumina polarizata 420
12.4. Ecuatia Larmor 497
10.1.2. Stereoizomerie, enantiomeri 422 12.5. Deplasarea chimica si relaxarea 498
I O.I.3. Polarimetrul 425 12.6. Deplasarea chimica si masurarea ei 501
10.2. Dispersia rotatorie 429 12.7. Factorii care influenteaza deplasarea chimica 502
10.3. Dicroismul circular 431 12.8. Cuplajul spin-spin si structura hiperfina 505
10.4. Refractometria 432 12.8.1. Cuplajul heteronuclear 506
10.5. Turbidimetria sj nefelornetria 440 12.8.2. Cuplaje homonucleave 509
12.9. Unele aplicatii cantitative ale RMN 512
CAPITOLUL 1 1 SPECTROMETRIA DE WIASA 445 12.10. Procedee utilizate in RMN 516
11.1. Notiuni generale 445 12.10.1. Rezonan{a magnetica nucleara cu unde continue 516
11.2. Apar'atura. Spectrometrul de masa 446 12.10.2. Rezonanta magnetica nucleara cu impulsuri 516
11.3. Procedee de fragmentare a moleculelor 448 12.10.3. Rezonanfa magnetica nucleara cu rezolutie joasa ...,...,_ 517
12.10.4. Unele date importante in analiza si controlul medicamentelor 517
11.4. Detectoare 455
1 1.5. Performanfele spectrometrelor de masa 456
CAPITOLUL 1 O METODE ELECTROCHIMICE IN ANALIZA SI
11.6. Tipuri de analizoare de masa 458 CONTROLUL MEDICAMENTELOR 528
11.6.1. Analizorul cu camp magnetic 458
13.1. Notiuni generale 528
11.6.2. Analizorul electromagnetic 459
13.2. Procese redox in electroanaliza 53 I
1 1.6.3. Analizori cu capcane de ioni 460
13.3. Titrarea potentiometrica 536
11.6.4. Analizorul cu filtru cvadrupol 462
13.3.1. Montajul in titrarea potentiometrica 536
11.6.5. Analizorul cu timp de zbor 464
13.3.2. Masurarea diferentei de potenfial 537
11.7. Unele aplicatii analitice ale spectrometriei de masa 466
 CUPRINS CUPRINS 11
10

13.3.3. Eroti sistematice si aleatoare in titrarea potenfiometricS 541 15.4. Analiza tennomecanica (TMA) 659
13.3.4. Electrozi indicator! si de referinta in titrarea potentiometrica 545 15.5. Titrare entalpica sail termometrica 667
13.3.4.1. Electrozi indicator! 545 15.6. Titrarea calorimetrica izoterma 675
13.3.4.2. Electrozi de referinta 552
13.3.4.3. Electrozi membrane cationi §i anioni selectivi 555 CAPITOLUL 1 6 UTILIZAREA CHEMOMETRIEI IN ANALIZA SI
13.3.4.4. Electrozi membrana modificata substante medicaincntoase sensibili569 CONTROLUL MEDICAMENTELOR 677
13.3.5. Senzori microcip de siliciu 571 16.1. Preprocesarea probelor 677
13.4. VoUamperometria si coulometria 573 16.1.1.Normalizarea 677
13.4.1. Dozarea voltamperometrica 573 16.2. Netezirea sau curafirea semnalului analitic de zgomotul de fond 680
13.4.2. Polarografia 576 16.2.1. Curatirea medie 680
13.4.2.1. Polarografia la curent contiiiuu 576
13.4.2.2. Polarografia impulsionala (cu impulsuri, pulspolarografia) ... 579 16.2.2. Curatirea medie succesiva (continua, ciclica) 681
13.4.3. Voltamperometria cu redizolvare anodica (stripping voltainetria) 584 16.2.3. Curatirea mediana succesivS 682
13.4.4. Voltainetria stripping puls diferenjjala adsorbtiva 587 16.2.4. Curajirea polinomiala succesiva 684
16.2.5. Cura{irea cu filtrul Fourier 685
13.4.5. Electrozi pasta de carbon utilizati in metodele voltamperoinetrice.... 589
13.5. Titrarea couloinetrica 596 16.3. Corectia liniei de baza 689
13.5.1. Coulometria potentiostatica 596 16.3.1. Abordarea prin modelare explicita 689
13.5.2. Coulometria galvanostatica 597 16.3.2. Derivarea 691
16.3.3. Diferenfa simpla continua (succesiva) 692
13.6. Determinarea coulometrica a apei, Karl Fischer 598
16.3.4. Diferen^a medie succesiva (continua) 693
13.7. Aplicatii ale metodelor electroanalitice in analiza si controlul
medicamentelor .602 16.3.5. Metoda Savitzky-Golay si metodaGorry 694
16.4. Tipuri de funcjii de calibrare 695
CAPITOLUL I 4 METODE DE ANALIZA PRIN MARCAREA 16.4:1. Nivelul unic de calibrare 695
SUBSTANTELOR 608 16.4.2. Calibrareanivel tnultiplu (multi-level) 695
14.1. Nofiuni introductive 608 16.5. Controlul calitajii formularilor farmaceutice 697
14.2. Tehnici izotopice de analiza 609 16.5.!. Controlul calitafii formularilor farmaceutice continand
14.2.1. Marcarea cu un radioizotop 609 catecolamine 697
14.2.2. Tehnica imunoenzimatica 614 16.5.2. Designul statistic experimental aplicat la medicamente 697
14.2.3. Analiza radioimunologica (RIA) 615 16.5.3. Aplicarea designului statistic la determinarea nimesulidei si a
combinafiei diazepam-otiloniu 698
14.2.4. Analiza fluoroimunologica (IFA) 616
16.5.4. Determinarea CZE a clorhidratului de rufloxacina 699
14.2.5. Analiza prin activare neutronica (NAA) 616
14.2.5.1. Detectia $i dozarea cu un spectrometru NAA 618 16.5.5. Utilizareastatisticii variate pentru determinarea altor medicamente..701
14.2.5.2. Determinarea prin dilutie izotopica 619 16.5.6. Designul Plackett-Burmann 704
14.2.5.3. Tehnica dozimetrica 620
DICTIONAR TEHNIC DE SPECIAL1TATE 707
"41 IS.
CAPITOLUL I D WIETODE TERWIICE iN ANALIZA §1 CONTROLUL
MEDICAMENTELOR 622 B1BL1OGRAFIE.... ....765
15.1. Notiuni introductive 622
15.2. Analiza termogravimetrica si termogravimetrica derivata 623
15.3. Calorimetria cu scanare diferentiala (DSC) 634
 12 ABREVIERI ABREVIERI 13

ABREVIERI D: D (sau Da) = Dalton, imitate de masiira a masei egala cu 1/12 din masa atomului de
"C, utilizata in biologie, microbiologie etc.
A: AASf = spectrometrie de absorbjie atomica in f lacara DAD = detector cu diode in linie (bareta)
AASe = spectrometrie de absorbtie atomica electrotermala DCV = voltametrie la curent direct
Ac = acetat DEG = dietilenglicol
ACP = polarografie la curent alternativ (DF) = suma totala a patratelor gradelor de libertate
AdSV = voltamctrie stripping adsorbtiva DMA = analiza mecanica dinamica
AES = spectrometrie atomica de emisie DME = electrod picurator de mercur
AFM = microscopie atomica fortata DPP = polarografie pulsdiferentialS
AMD = developare multipla automata DPV = voltametrie pulsdiferentiala
ANCOVA = sistem de analiza a cqvarianjei
AP = alcalin fosfataza E: EAS = spectrometrie electronica de absorbfie
APC1 = ionizare chimica la presiune atmosferica ECHP =electroforeza capilara de inalta performanta
ASV = voltametrie stripping anodica EC1 = injectie electrocinetica
EDX = energia dispersive a razelor X
B: BGE = electrolit suport sau de fond (background electrolyte) EELS = spectroscopie electronica, cu pierdere de energie (a electronului)
BioFETS = biosenzori - tranzistori cu efect de camp EF = electroforeza prin izofocalizare
EIA = analizfi imunoenzimatica (test imunoenzimologic)
ELSD = detector evaporator cu lumina dispersata
C: CASM = analiza calorimetrica cu microscopie de scanare EOF = flux electrbosmotic
CCPE = electrod compozit carbon-polimer ERE = eiectrod de referinta extern
(CC) = suma corectata a patratelor concentratiilor ES = extracfie sinergica
CCD = project compus central (in designul experimental)
ESC = electrod saturat de calomel
CCS A = analiza stripping la curent constant
ESH (NHE) = electrod saturat de hidrogen (sau normal de hidrogen)
CCZE = electroforeza zonaia capilara chirala
CD = ciclodextrine neutre
CDs = ciclodextrine incarcate negativ F: FA = analiza frontala
CE = electroforeza capilara FAB = bombardare cu atomi rapizi (fast atomic bombardment)
CIE = captura interna de electroni in fluorescenja cu raze X FCD = design fafa centrata
C1EF = concentrare capilara izoelectrica (Capillary isoelectric focusing) f.e.m. = fortS electromotrice (electromotoare)
C1T = citrat FFT = filtru de netezire/curatire Fourier, a semnalului analitic (in chemometrie)
CPE = electrod pasta de carbon FIA = analiza cu injecfic in flux
(CR) = suma corectata a patratelor produselor incrucisate ale concentrafiilor (C) FR= flavin reductaza
si semnalelor analitice (R) FSOT = coloana tubulara deschisa din silice topita
CRM = material standard de referinta FTIR = spectroscopie in infrarosu cu transformare Fourier
CSV = voltametrie stripping catodica
CUT = test de conformitate al continutului G: GC = cromatografie in faza gazoasa (gazcromatografie)
CVD = depunere chimica de vapori
GCE = electrod de carbon sticlos (glassy carbon electrode)

1
14
GC-ICP-MS = cuplaj gazcromatografie-plasma cuplala inductiv-spectrometrie de
masa
GC-MS-MS = cuplaj gazcromatografic - masspectrometrie - masspeetrometrie
OFF = glicil-L-fenilalanil-L-fenilanil
GOD = glucozoxidaza
H: HIS = ionizare selectiva hipertermala de suprafata
HPCE = electroforeza capilara de inalta performanta
HMDE = electrod picatura de mercur suspendata/stationara
IIPLC = cromatografie de lichide de inalta performanta
HPTLC = cromatografie pe strat subtire de inalta performanta
HRGC = gazcromatografie de Tnalta rezolujie
I: IDT = analizor cu capcana de ioni (iontrape detector)
IEC = captura interna de electron!
IFA = analiza fluorimunologica (fluorimetric immunologic analysis)
IMS = spectrometru cu mobilitate de ioni
IR = infrarosu (spectroscopie in infrarosu)
IRE = electrod de referinta intern
ISE = electrod ion selectiv (EIS)
L: LAMMA = spectrometru (analizor) de masa cu microsonda
LAMPA = metilpropilamidaacidului lisergic
LC = cromatografie de lichide
LIF = fluorescenta laser - indusa
LLE = eluent organic continuu
LOMO = orbital molecular eel mai putin ocupat
LSD = dietilamida acidului lisergic
LSV = voltametrie cu scanare liniara
M: MALD1 = desorbtia cu ionizare a matricei asistata de laser
MASM = analiza mecano-termala cu microscopic de baleiaj
MCA = analiza multicomponent
MCPE = electrod pasta de carbon mod if icat
MEB = microscopic electronica cu baleiaj
MEKC = cromatografie capilara electrocinetica in mediu micelar
MGCE = electrod de carbon sticlos modificat
ABREVIERI ABREVIERI 15
MS = spectrometrie de masa
(MS) = media totala a patratelor (SS)10(aia/(DF)tot!1|a, in statistica
MTDSC = calorimetria de scanare diferenjiala la temperatura modulata
N: NAA= analiza prin activare cu neutron!
NADH = nicotinamid-adenin dinucleotida, forma redusa
NIST = National Institute for Standards and Technology - USA
NPD = detector termoionic
NPLC = lichid-cromatografie pe faza normala
NPP = polarografie cu puls normal
NPBP = N-propil-p-hidroxibenzoat (standard intern)
O: OES = spectroscopie de emisie optica
OPTLC = cromatografie pe strat subjire suprapresurizata (over pressure TLC)
P: PCA = analiza component principal
PCP = fenilciclidina
,. PDMS -polidimetilsiloxan
PEEK = polietercetona
PET = polietilentereftalat
PLD = depunere puls-laser
PLM = microscopic cu lumina polarizata
PMD = developare multipla programata
PMT = tub fotomultiplicator
PP = fenilfosfat
PPD = polarografie impulsionala diferentiala
PPN = polarografie impulsionala cu puls normal
PPO = polifenoloxidaza
PSA = analiza stripping potentiometrica
PtE = electrod de platina
PTFE = politrifluoretena (teflon)
R: R1A = analiza radioimunologica (test radioimunologic)
RGCE = electrod rotitor de carbon sticlos
RMS = substanta de referinta/standard
RPLC = lichid cromatografie pe faz5 inversa
16 ABREVIERI

(RR) = Simla corectata a patratelor semnalelor analitice

RSD = deviajia standard relativa (%)
RSM = metodologia raspunsului suprafefei/ariei (pentru dcterminarea robustejii)

S: SAM = autoasamblare monostrat (cu referire la senzori electrochimici)

SCE = cromatografie de excludere de marline
SCSI = sistem computer mic cu interfata pentru prelucrarea rapida a datelor
SDU = imitate de eliberare (livrare) a solventului (in SPE si si SPME)
SEC = concentrafia electrolitului suport
SEF = factor rapid dc intensificare
SEM-EDX = microscopie cu scanare electronica, cu energie dispersiva a razelor X
SFA = analiza in flux segmentat
SFC = cromatografie cu fluide supercritice
SFE = extracfie cu fluide supercritice
SMBs = radiatii supersonice moleculare
SPE = extractia in faza solida
SPME = microextractia in faza solida
(SS) = suma patratelor regresiilor (aclica a patratelor regresiilor si a mediilor 1.1. Notiuni generate
patratelor reziduale)
Cromatografia este una din ramurile mari, vaste ale analizei instrunientale cu
(SS)| = SSi = eroarea instrumental^
aplicatii largi in separarca, detecjia si determinarea substan{elor chimice in general si in
(SS)L = SSL = eroarea cle neconordanta analiza si controlul medicamentelor in particular. Tehnicile cromatografice de analiza
(SS)O = SSO = eroarea generala (SS( + SSp + SSL) sunt in primul rand tehnici cle separare dintre cele mai selective si mai eficiente. inclusiv
(SS)p = SSP = eroarea procedurala (sail de metoda) pentru urrnele de substance. Asociate cu metode de detecjie, tehnicile cromatografice sunt
capabile sa sesizeze cantitati infime de substanta, ceea ce le confera o mare sensibilitate
precum §i capacitate sigura de clozare pana la nivele cle ppb, ppt, in functie de sensibili-
T: TLC = cromatografia pe strat subtire tatea detectorului. Tehnicile cromatografice de analiza" se numara printre metodele
TOF = timp de zbor instrunientale cele mai performante de analizS, raspunzancl unor cerinfe majore ale
TOFA = analiza (analizor) cu timp de zbor societatii care se pot formula astfel:
TXRF = spectrometria de fluorescenta cu raze X, cu reflexie totals - mai repede (citius), deci cu viteza mai mare;
- eficienta mai inalta (altius), deci mai buna;
U: UV = ultraviolet - forla mai mare (fortius) in ceea ce privesle:
UV-V1S = spectrometrie Tn UV si VIS - selectivitatea;
- sensibililatea;
V: VIS = vizibil - automatizarea;
- miniaturizarea senzorilor si altor componente;
W: WCOT = coloana tubulara deschisa cu perete acoperit - tratarea datelor analitice;
- scopul aplicatiilor tehnicilor instrunientale cle analiza, inclusiv acelor
X: XRD = difractie cu raze X cromatografice.
18 CAPITOL.UL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATM IN ANALIZA 51 CONTROLUL MEDICAMENTELOR CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII TN ANALIZA 51 CONTROLUL MEDICAWIENTELOR 19

Pentru realizarea acestor objective sunt necesare sisteme de analiza complexe, sau • pregatirea fazei sta{ionare;
chiar de analiza totala, care trebuie sa includa uii numar important de ,,unilati" destinate • fixarea inijiala a analijilor in capul coloanei, pe faza stationara, dupa
unor etape precizate de analiza, asa cum rezulta din schema urmatoare (Figura 1.1): introducerea solutiei de proba;
• deplasarea selectiva - caracteristica a anali|ilor, care sunt antrenati de sus in
jos de catre faza mobila, In cadrul procesului de elufie (developare).
• identificarea anali}ilor separafi, pe masura ce acestia ies din coloana separa-
toare si tree in detector
• inregistrarea cromatogramelor, calcularea ariilor picurilor si a altor para-
metrisidozareaanalitilorcorespunzatori, concomitentcuevaluareastatistica
a rezultatelor (regasirilor) etc.
Tinand seama de cele expuse, ca si de numerosii factori care sunt implicati in
Figura 1.1 Sistem de analiza complexa separare, in asigurarea selectivitatii si rezolujiei, ca si de caracteristicile detectorilor
1 = imitate de tratare a probei; 2 ~ imitate de injectie a probei; 3 = imitate de purificare utilizafi, respectiv de sensibilitatea lor, de reproductibilitatea proceselor de separare,
a probei; 4 = unitate de separare analitica (coloana); 5 = imitate de reacfic (bio) chimica; detec{ie si de dozare, este greu de dat o clasificare atotcuprinzatoare.
6 = unitate de detectie; 7 = unitate de prelucrare a datelor
Totusi, avand in vedere natura fazelor stationare ^i a celor mobile se poate da o
clasificare acceptabila si rezonabila a metodelor cromatografice, asa cum se observa din
Cromatografia a Cost descoperita (inventata) de botanistul rus Tswet care Tn 1906 a figura 1.3. In figura 1.2 se prezinta o schema mai explicita si niai intuitiva a aceslei
separat o serie de pigment! vegetali cum sunt dorofilele si xantofilele, din extracte Tn clasificari.
eter de petrol, pe o coloana de carbonat de calciu fin pulverizat. Introducand un sol-
vent in partea superioarS a coloanei, el a constatat ci zona intens colorata din capul
coloanei se deplaseaza de sus in jos, iar componentii se separS In functie de viteza lor
de migrare si afinitatea lor fa(a de faza stationara (CaC03), Tn zone colorate distincte,
sub forma de inele, care corespund diversilor pigment! separati. Tswet a denumit
aceste proces de separare ,,cromatografie", termen care provine de la grecescul
,,chroma" (culoare) si ,,graphein" (a scrie). Pentru detectia pigmen(ilor separati se poate
izola fiecare zona de concentra(ie (inel) din care se poate extrage pigmentul separat, sau
se poate ,,elua" fiecare pigment succesiv prin adaugarea unor solvent! potriviti, iar eflu-
endi (fractiunile) se culeg separat, procedandu-se apoi la detectia lor.
Un rol important In dezvoltarea cromatografiei 1-au avut Martin si Synge (premiul Nobel
- 1962) care au dcscoperit (1941) cromatografia de reparlitie, care a stimulat cerce-
tarile In acest domeniu, ceea ce a dus la descoperirea proceselor intime de separare,
la stabilirea parametrilor cromatografiei si la dezvoltarea continue a performantelor
de separare, detectie si de dozare ale metodelor cromatografice.
Datorita complexitatii proceselor de separare, a numarului mare de factori care
influenteaza separarea, a numarului inaredetehnici si dedetectori estedificila formula-
rea unei clefinitii general valabile a cromatografiei. Se poate spunc insa ca toate tehnici le
cromatografice au ca elemente comune o .,faza stationara" si o ,,faza mobila", iar compo-
nentii unui amestec de analizat sunt antrenati in lungul coloanei de un flux de faza mobila
(gazoasa sau lichida), cu viteze diferite, ceea ce constituie procesul fundamental al separarii.
Pe de alta partc, la baza tuturor metodelor cromatografice de separare stau patru procese
fundamentale: adsorbtia pe suporturi solide, repartitia intre faza stationara si aceea mobila,
schimbul ionic si excluderea-difuzia. Prin urmare, principiul separarii poate sa fie diferit,
dar etapele analizei cromatografice sunt acelcasi si anume:
Figura 1.2 Clasificarea intuitiva a tehnicilor cromatografice
20 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR 21

In acest context, trebuie precizat ca alegerea fazelor stationare se face in functie

Faza Procesul de masa moleculara a analitilor, de solubilitatea lor in solvent! organic! si Tn apa, de
stationary cromatografic Tip u I
'<
caracterul lor nepolar/polar sau ionic etc., asa cum se poate observa Tn figurile 1.4 si 1.5
(dupa E. Merck).
\ ^ anorganic solulfi
De remarcat ca, exista posibilitatea utilizarii unei scheme simplificate de alegere
adsorbtie "^L a fazei stationare, pentru un an limit tip de proces cromatografie.
organic solids
. Asa de cxemplu, pentru cromatografia de adsorbtie se poate u t i l i z a o schema ..triun-
i
ghiularS" pentru alegerea fazei stationare si a celei mobile in functie dc activitatea fazei
K
\ >»
i
*x"
anorganic solida stationare adsorbante si de polaritalea analitilor asa cum se, poate observa Tn figura 1.6;
\ excludere s*\
\i din aceasta figura se constats ca activitatea fa/.ei stationare este Impartita in cinci sec-
I s organic solida toare.

• Destul de frecvent analistul este pus Tn situatia de a alege pentru un anumit tip de
lichid vokilil
analiti tehnici cromatografice de adsorbjie sau de repartitie. Pentru aceasta trebuie sa se
cunoasca structure analitilor, respectiv tipul de grupari functionale, numarul acestora si
lichid ncvolatil
I > polaritatea lor.
Pentru exemplificare, tn figura 1.7 se da un ghid de alegere pentru procedcele de
I/ cromatografie de afiniuue adsorbtie si de repartitie.
adsorbtie si
r\ Cu cat polaritatea compusilor este mai mare adsorbtia lor este mai accentuata. iar

K
x elutia mai dificila; de aceea procedeele de adsorbtie sunt utilizate mai ales Tn cazul
anorganic solida
compusilor nepolari sau cu polaritate mica, Tn timp ce procedeele de repartitie sunt
I utilizate pentru separarea compusilor cu polaritate mare. Pe de aha parte trebuie avut Tn
/ organic solida vedere ca dubla legatura C = C nu mareste polaritatea unei molecule Tn masura Tn care
:/
o mareste o grupare functionala, in schimb ciclul aromatic mareste polaritatea Intr-o
Solids excludere A separiiri polarc
\ i \; masura mai mare decat trei difcle legaturi izolate Tntr-o catena liniara.
\ \
In functie de procesele care stau la baza separarilor cromatografice exista:
\ separSri ncpolarc
\ - Cromatografie de adsorbtie, faza stationara f iind un suport solid (ex. A^O-), SiOj
\ / ion cromatografie etc.) care are proprietati adsorbante.
' schimb ionic x.
- Cromatografie de repartitie, in care faza stationara este o pelicula de lichid fixata
^^ pe un suport solid (ex. SiCy, faza stationara lichida nefiind miscibila cu faza
I ^ ra?ini chelalante
I mobila.
i
fuza adsorbiia normals sau - Cromatografle de schimb ionic, Tn care faza stafionara este un compus macro-
inversa molecular reticulat, care contine un numar mare de grupari functionale acide
/
/
/ sau bazice, capabile sa schimbe protoni sau ioni alcalini cu cationi bi si trivalenli
fa/.a leaiita normala sau (gruparile acide) sau anioni precum OH~, Cl~ etc. cu anioni mai grei si cu sarcina
inversa mai mare (gruparile bazice); schimbatorii de ioni se mai numesc si rasini
cationice (sau cationiti) sau anionice (sau anioniti).
ciotnalografie in coniracureni - Cromatografie de excludere sterica sau de excludere - difuzie, Tn care faza stal ionara
i este dc regula un gel, care se comporta ca o sita moleculara fixand anumite
molecule si eliminancl altele Tn functie de marimea, respectiv masa lor
moleculara.
Figura 1.3 Clasificarea metodelor cromatografice
 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA $l CONTROLUL MEDICAMENTELOR CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICAT" IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR 23

faziS dircctd normala:

Liclirospher/Superspher Si, CN,
DIOL.NH;, AliispherAl
H nepolari fazfi invcrsA: Lichrospher/Superspher
CN, RP-8, RP Select B, RP 18 cromatografie de gel permeatie (GPC,
SEC), cu eluent organic, Lichrogel PS
PAH faza inversa: Lichrospher PAH
faza inversa cu sorbenti cu pori mari:
fazil invcrsS: Uchrospher/Supersphei- Lichrospher WP300RP18
—I neionici CN, RP 8, RP Select B, RP 18, RP 8e,
RP I8e, Purospher RP 18, RP 18e fazS inversa cu sorbenti cu pori mari:
fazi inversil - percchi dc ioni: neonc Lichrospher WP300RP18
Lichrospher/Superspher RP 8, RP
H polari Select B, RP 18. RP 8e, RP 18e cromatografic de gel permeatie (GPC,
ionizabili fn/.a inversa cu control de pll: SEC), cu eluent apos: Fractogel EMD
Lichrospher/Superspher RP 8, RP
Select B, RP 18, RP 8e, RP 18e GPC
cromatografie de excludere ionica:
ionizabil • fazil Uircclii minmila: Fractogel EMD-TMAE, DEAE, DMAE,
Aliispher A, AI
ionizabili ionizabil - fazil invcrsa: SO *~ , -COO", hidroxilapatit
Purospher RP 18, RP 18e, Aluspher
RP - Select B cromatografie hidrofobica (HIC): \
ionizabil - faza inversii cu clucnp' I proteine, peptide [ Fractogel EMD-Propyl, Phenyl I
alcalini: Aluspher R - Select B
faza inversa cu sorbenfi cu pori mari:
faza invcrsa: Lichrospher RP 8, RP 18, Purospher RP 18
cu apa ca eluent, Lichrospher NH : , D10L cu apa/solv. Lichrospher WP300 RP18
neionici org. eluent
cromatografie de afinitate: Fractogel
faza invcrsa cu control de pH: Licherosphei/Superspher EMD Chelat, TA, Epoxy, Azlacton,
ionizabili RP 18, RP 18e, cu eluent de tampon: Lichrospher NH?, Heparine
D1QL cu eluent/ tampon solv. org
puternic I'azS inversii, pcrcchi dc ioni: Lichrospher/Superspher cromatografie de schimb ionic:
acid/bazic RP 8, RP Select B. RP 18, RP8e, RP 18e —I acizi nucleic! Fractogel EMD-DMAE,
Hydroxylapatite
cationi cromatografie de schimb ionic: Lichrospher ICCA,
Polyspher ICCA cromatografie de gel permeatie (GPC,
anorganici SEC), cu eluent apos: Polyspher CH
anioni anorg. cromatografic dc .schimb ionic: Polyspher 1C AN-1 NA, BIOGPC, DIOL 500
ac. org. cromatografie de schimb ionic:
3C1Z1 cromatografie dc cxcluderc ionica: Polyspher OA HY, zaharide Fractogel EMD-TMAE
OAKC
organic! faza directs (normals): Lichrospher
NH,
monozaha- cromatografie de excludere: Polyspher CHOH
ride faziS inversa: Lichrospher NH;
Nota: GPC = gel permeation chromatography
romat. sch-ligand: Polyspher CHCA, CHPB SEC = size exclusion cromatography
mono-, di-
zaharide vcrsa: Lichrospher NH 3
Figura 1.5 Alegerea fazelor stationare pentru molecule cu mase moleculare
Analiti Chira-Dex, Chira-Dex GAMMA, Whelk-01, ChiraSep DNBPG, Chira-
Spher NT, Celulose triacetat mai mari de 1000 u.a.m.
chindi
Nota: RP - fazS inversS
igura 1.4 Alegerea fazei stationare pentru molecule cu mase moleculare < 1000 u.a.m.
 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA §l CONTROLUL MEDICAMENTELOR 25

inalta polar& In afara de aceste tipuri fundamentale de metode cromatograf ice exista inca unele
Faza Faza mobila procedee cromatograf ice specifice, caracteristice unor specii chimice, datorita unor
stationary interactiuni foarte selective; dintre acestea se pot mentiona cateva:
- cromatografia de aflnitate care se bazeaza pe proprietalea unor adsorbanti macro-
activitate molecular! de a manifesta o afinitate specifics pentru anuiniti analiti. Cromatografia
de afinitate exploateaza caracteristicile functionate ale analifilor, respectiv interac-
(iunile specifice dintre moleculeie de analit ?i un ligand fixat pe un suport inert
insolubil (numit curent,.suport imunoadsorbant"); in fapt liganzii (CLI diferite mase
moleculare) sunt inclu;i In suportul solid, caruia Ti confers specificitate (sau eel pufin
o mare selectivitate) pentru anumite molecule de analit, fata de care manifesta o
slabs afinitate, legandu-le prin covalenta.
nepolarS
- cromatograflachiraia, de adsorbtie sau repartitie care se caracterizeaza prin structure
chiraia a fazei stationare sau a fazei mobile, ceea ce permite separarea selectiva a
analitilor chirali, respectiv a enantiomerilor.
nepolari polari - cromatografia cu lichide supercritice, care exploateaza solubilitatea analitilor Tntr-un
amestec de
fluid supercritic (ex. COi) ca atare sau modificat (ex. cu metanol), care asigura
analiti
extragerea analitilor din matrice, ce sunt apoi separati cromatografic.
- electrocromatografia capilara micelaHi care este o tehnica hibrida care inibina croma-
Figura 1.6 Schema triunghiulara de alegere a fazei stajionare tografia cu electroforeza.
adsorbante si a fazei mobile
Desigur ca se poate face o clasif icare a metoclelor cromatograf ice ?i in f unctie de
procedeul practic utilizat si anume:
- cromatografla pe coloana, in care faza stationara este plasata intr-o coloana
(tub) de metal sau de sticla, sau de silice topita.
- cromatografia planurS sau de suprafata pe hartie sau pe strat subtire.

polaritntea gniparilor function fil In functie de migrarea fazei mobile se disting:

• cromatografia prin developare in care analitii raman pe faza stationara sau sunt loca-
Hielrocarburi Do-ivati oxigennti ai Douoi'i tie Coinpu.;i lizati pe aceasta (ex. separarea clorof ilelor si xantofilelor pe carbonat de calciu) in
5,1 derivati hiilrocarlmrilor proton i iouici functie de directia de migrare; exista developare ascendenta sau descendants,
monodimensionala sau bidimensionala (migrari in directii perpendiculare, deci la
i,l"H
O O I O !„,,„
, / /// // I // i 90°), circulars etc.
F<H RX RNO, , R O R RC-OR RG-R RC-H i H C - W H R R j N H , ROH Ho AT OH RCftH i Neudeoflde MH.-E-CO,
• cromatografia de elude, in care analitii sunt eluati pana la iesirea lor completa din
compusii cei coloana, deci din faza stationara, fiind posibila culegcrea succesiva a fracjiunilor
msuputin polar! de analiti; in acest caz detectia se face in efluenti.
—.......•**-— \ jy ii|>a functionsila
•—•JJT-......- ZgrupSri function ale Din toate clatele prczentate pana aici rezulta ca intr-adevar nu este posibila o
ADSORBTIE clasificare unica, atotcuprinzatoare, general valabila pentru toate tehnicile si procedeele
_vt_._ 3 gj-unftri functioiuile REPARTITIE
cromatografice de analiza; dar este posibila intelegerea complexitatii si nestitafii
x» 4 grupiiri fimctionata domeniului analizei cromatografice, de unde si intelegerea aplicabilitatii largi in diverse
coinpu.yii cci domenii a acestor metode, datorita seleclivitatii (uneori a specif icitatii) lor, ca si datorita
^s.— 5 saj| lna j innite oj'upai-i funclionale ,naj ,,oial.j
sensibilitatii si in general a performantelor proceselor de separare, detectie, clozare,
purificare-preparare etc.
Figura 1.7 Ghid de alegere a procedeelor de adsorbfle $i repartitie
 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICAT" IN ANALIZA §l CONTROLUL MEDiCAMENTELOR CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA $1 CONTROLUL MEDICAMENTELOR 27

.2. Bazele teoretice ale cromatografiei [B] CBs

Bin ± Bs KDB = [B] s (1.2)

1.2.1. Parametrii cromatografiei

CBs si CBm au acelea?! semnificajii ca pentru A
Pe langa datele prezentate anterior trebuie sa se cunoasca o serie de nojiuni
;oretice general valabile, referitoare la procesele de separare cromatografica, notiuni
are se pot transforma (adapta) tuturor metodelor cromatografice. De aceea, in cele ce proba faza mobila
rmeaza se fac referiri la cromatograf ia de lichide bazata pe repartitia unor analiti intre
oua faze. Se admite ca trebuie sa se analizeze un amestec de analiti (diferiti), care 1 I I T
~ebuie sa fie separati (aceasta fiind scopul principal al cromatografiei); indiferent de
shnica aleasa, metodele au cateva aspecte comune:
- anali}ii din amestec se repartizeaza intre faza stationara si faza mobila, care sunt
nemiscibile (sau foarte pufin solubile una in alta); intre cantitatile de analiti
repartizati in cele dona faze exista un echilibru ce depinde de insusjrile fiecarui
analit faja de cele douS faze. (a)

- adaugand continuu faza mobila ,,noua sau proaspata" are loc deplasarea echili-
brului de repartitie, antrenand migrarea analitilor de-a-lungul fazei stationare, cu
viteze diferite.
- separarea consta in eluarea continua a analitilor care migrand cu viteza caracte-
ristica fiecaruia, parasesc succesiv coloana. detector
to t3 t4
Pentru a intelege mecanismul separarii in cromatografia de lichide (LC) de
epartitie se admite ca se analizeaza o proba continand doi analiti A si B; se admite de B/
isemenea ca se utilizeaza o coloana pregatita in prealabil prin fixarea pe particulele de A
(b)
uport inert, a unui film (pelicula) de lichid faza stationara, potrivita (compatibila cu
inalitii). Apoi se introduce un volum de proba (in metodele inalt performante se introduc
le la cativa la cateva zeci de U.L de solutie foarte diluata de proba); se adauga apoi faza
nobila putin cate pufin cand se produce developarea, adica migrarea de sus in jos a to ti
mali|ilor, cu viteze diferite; continuand adaugarea fazei mobile se produce elutia, adica
ixtractia din coloana a fiecarui analit, pana la iesirea din coloana; in aparatele actuale
le cromatograf ie, ef luentul se conduce direct la detector in care se face detectia analitilor
Figura 1.8 Separarea componentilor A(.) si B (..) dintr-un amestec
;eparati. In figura 1.8 sunt reprezentate aceste etape ale separarii cromatografice.
a) Schema separarii succesive ; b) Seinnalul de iesire al detectorului pentru cei doi
Din cele expuse se observa ca procesul de separare se produce treptat, intre faza component!, in functie de timpii de elutie
;tationara si faza mobila existand un echilibru, dcterminat de concentratiile fiecarui
malit in faza stationara si faza mobila, al caror raport reprezinta coeficientul de
repartitie sau de distributie:
[A]s _ CAS Puterea de separare a unei coloane depinde de mai multi factori, dar in principal
(1.1)
[A]m CAIH depinde de vitezele relative de elutie care sunt determinate chiar de coeficienjii de
repartitie ai celor doi analiti intre cele dona faze, stationara si mobila. Ideal ar fi caacesti
coeficienji de repartitie sa fie independent! de concentratia analitilor, ceea ce inseamna
CAs = concentratia lui A in faza stationara ca intotdeauna Cs sa fie proportional cu Cm.
CAm = concentratia lui A in faza mobila
 CAPITOLUL 1 CROWIATOGRAFIA. APLICATII iN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR CAPITOLUL 1 CROWIATOGRAFIA. APLICATII iN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR 29

Prin reprezentarea grafica a concentratiei analiti lor A §i B separati, concentrate
ire este egala cu aria de sub pic, in funcfie de timpul de elutie (retentie) sail volumul de
iujie (retentie) se obtine cromatograma celor doi analiti asa cum se poate observa din
isura 1.9.
In context se defineste timpul de retentie maxim al unui analit tR, ca fiind timpul
care se scurge de la injectia (introducerea) probei de analit in coloana si aparitia (iesirea)
picurilor analitului la detector.
Pe de alta parte viteza liniara medie de deplasare a analitului in coloana, vm = L/tR,
este egala cu raportul dintre lungimea L a coloanei si timpul de retentie. lar viteza liniara
medie ,,u" a moleculelor fazei mobile este data de raportul dintre lungimeacoioanei si timpul
mort, u = L/t,,,; timpul mort tM este timpul necesar ca o specie neretinuta sau faza mobila
(solventul) sa traverseze coloana pana la iesire; evident ca este vorba de lungimea coloanei
de faza stationara numita si lungime utila, si nu de lungimea tubului de sticla, silice sau
metalic in care se af la faza stationara. Trebuie precizat ca volumul total al coloanei VT este
ocupat de faza stationara Vs si de volumul fazei mobile VM, deci:

VT = VS + VM (1.5)

A In legatura cu faza stationara trebuie sa se faca unele precizari:

distanta parcursa 1. ea este formata din particule fine solide, sferice (sau aproape sferice) pe
suprafata carora se produc interactiile cu analiti (ex. In cromatografia de
adsorbjie);
Flgura 1.9 Cromatograma amestecului substantelor A si B, respectiv
profilele concentrapor picurilor In doua momente ale 2. ea este formata din particule fine solide, care sunt suportul pe care se fixeaza
migrarii lor, adica la timpii ti si tz faza stationara lichida ca in cromatografia de repartitie;
3. particulele de suport solid pot avea grefate sau adsorbite pe suprafata lor
Din f igurile 1.8 si 1.9 se constata ca substanta B este mai puternic retinuta pe faza substante sau grupari chimice cum sunt C8, CIS etc, si care participa la
stationara decat substanta A, de aceea B se deplaseaza cu viteza mai mica; desigur ca procesele cromatografice;
unbele substance parcurg aceeasi distanta d, egala cu lungimea fazei stationare, dar cu 4. in coloanele capilare utilizate in cromatografia de gaze, faza stationara este
k'iteze diferite. fixata in stare omogena. sub forma unui film (pelicula) pe peretii interior! ai
vA=^ • (1-3) acestora;
5. particulele de faza stationara se caracterizeaza prin cativa parametri intre care
diametrul lor mediu (dp), omogenitatea marimii lor si suprafata specifics
(1.4) (SSp), dar si prin diametrul porilor unora dintre particule, asa cum se poate
vedea din tabelul I . I Suprafata specifics a porilor creste odata cu numarul lor
L = lungimea coloanei de faza stationara in cm (sau mm) si scade odata cu cresterea marimii lor.
Se mai constata de asemenea ca pe masura ce creste distanta dintre cele doua Tabelul 1.1. Caracteristici ale particulelor de SiO2 in LC si Chromosorb In GC
picuri, A si B, deci odata cu apropierea de baza coloanei, se produce o largire a celor
Caracteristici SiOzTnLC Chromosorb in GC
doua picuri, mai vizibila la baza picurilor, ceea ce micsoreaza eficienta separarii lor.
Trebuie precizat ca prin alegerca (stabilirea) unor conditii judicioase est posibil ca accasta Diametvul mediu al particulelor, dp in |ini 1 50-180 Jim
3-lOjim
(80- 100 mesh)
largire a picurilor sa se produca mai meet (lent) decat separarea, ceea ce inseamna o
rezolutic mai buna; aceasta implica o lungime mai potrivila (mai mare) a coloanei; Diametrul mediu al porilor, nm 6-lOnm 300-4000 nm
puterea de separare a unei coloane cromatografice se poate imbunatati prin controlul Suprafata specifics SSp in m /g 400-lOOOm 2 /Q 1 00-500 in2/"
unor parametri cum sunt (vezi si rezolutia, f igura 1.26): Porozitatea tolala, et - suport poros: 0,80
-
- cresterea vitezei de separare a picurilor; - suport ueporos: 0,35-0,40
- micsorarea vitezei de largire a picurilor. Perrneabilitatea, K°=dp2/O (cm2) I0" 9 cm 2 10' 7 cm 2
JO CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATH IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR 31

Volumul dintre particulele (granulele) de faza stationara, numit si volum inter-
;titial sau intergranular, este ocupat de faza mobila, se noteaza cu V M si se numeste volum
nort; el a fost definit mai sus. Volumul mort este egal cu suma volumului porilor, care
;e umple cu faza mobila si se numeste volum intragranular Vp si volumul intragranular
\n (Figura 1.10):
Diferentele dintre marimile date in tabelul 1.1 permit cunoasterea permeabilitatii
specifice a coloanei, K°, care caracterizeaza usurinta cu care faza mobila poate traversa
coloanacromatograf ica si sa se evalueze calitatea umplerii coloanei care are dimensiunea
unei suprafete si care se poate calcula cu ajutorul relatiei (Kozeny-Carman):
(1.11)

Volum intragranular, V p sau

Ku = - (1.12)
Volum intergranular, V]
Calitatea umplerii este caracterizata de permeabilitatea K°, care creste cu patratul
Figura 1.10 Volumul intra si intergranular diametrului particulelor dp. In relajia (12) 3> este factorul de rezistenta la curgere,
exprimat printr-un numar (fara dimensiuni) care depinde de forma granulelor, de
porozitatea lor, de textura lor si de calitatea umplerii coloanei si pe exprima' prin relatia:
VM = Vp + Vi (1.6) ISO^l-Ef)
,3 (1.13)
Volumul coloanei goale (a tubului de sticia sau silice) Vcol, cu lungimea L si
diametral interior d.i. sau (dcol) se poate calcula astfel: Valoarea numerica a factorului de rezistenfa este egala cu <t>=500 pentru granulele
poroase cu forma regulata, sferica si cu 0=1^00 pentru granulele poroase cu forma
neregulata.
De altfel curgerea unui lichid sau fluid - faza mobila se poate datora gravitatii sau
Porozitatea totala a coloanei, respectiv a tuturor granulelor de faza stationara, et
unei presiuni care se exercita asupra fazei mobile cu ajutorul unei pompe Tn cromatogra-
se poate calcula fScand raportul dintre volumul mort si volumul coloanei, deci: fia de lichide si cu fluide supercritice, sau de catre un gazsub presume in cromatografia
VM in faza gazoasa.
et = (1.8) \
Vcol
Pe de alta parte, faza mobila, dar mai ales coloana, adica faza stationara, provoaca
Aceastl porozitate este suma porozitatii intragranulare £p si a celei intergranulare, o rezistenta la curgere; curgere care se caracterizeaza prin viteza ei liniara meclie, vm,
care se exprima in m/sec, si prin relatia:

(1.9) vm=L/tm (1.14)

Et = Ei + £p
L = lungimea coloanei
Vi .
£i — T ~ ; r iar £ Hn — " . (1.10) t m = timpul necesar fazei mobile pentru a parcurge distan{a L
Vcol Vcol

Viteza liniara medie vm depinde de temperatura, de presiunea impusa fazei mobile

In cazul particulelor solide neporoase Vp = 0. ep = 0, iar volumul mort este egal cu si de natura coloanei (adica a fazei stationare); iar la temperatura constants aceasta viteza
Vm = Vi volumul intergranular; evident ca si porozitatea totala este egala cu volumul se exprima prin rela|ia urmatoare (Darcy):
intergranular, el = Vi, fiind cuprinsa in intervalul 0,35 - 0,45, ceea ce Inseamna ca peste
APK 0
60% din volumul coloanei este ocupat de granule neporoase ale fazei stationare. In cazul (1.15)
particulelor poroase et = 0,85, coloana este ocupata de granule poroase in proportie de
peste 80-90%. vm = viteza liniara medie de curgere, in m/s
32 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATH IN ANALIZA §l CONTROLUL MEDICAMENTELOR
K° = constanta de permeabilitate a coloanei, exprimata in m fiind dependents de
diametral particuleior dp pentru o coloanS umpluta
L = lungimea coloanei, in m
il = vascozitatea fazei mobile in pascal-s, Pa-s (IPa-secunda = 10 poises)
AP = pierderea de sarcina (greutate) in pascali (1 Pa = 10"5 bar = 9,8 10"6atm)
Pierderea AP reprezinta diferenta dint re presiunea impusa fazei mobile la intrarea
in coloana (Pe) si presiunea observata la iesirea din coloana (Ps):
AP = Pe - Ps (1.16)
Desigur cS pentru a realiza o separare buna a analifilor trebuie sa se stabileasca o
viteza liniara optima de curgere a fazei mobile, ceea ce implica o alegere judicioasa a
presiunii impose Pe; de asemenea trebuie sa se Jina seama ca pierderea AP (de care
depinde calitatea separarii) depinde de vascozitatea fazei mobile si de permeabilitatea
coloanei K° dependents la randul ei de lungimea sa, L. Pierderea AP se poate deduce din
relatia (1.15) :
AP = ^ (1.17)
K°
Pierderea AP se poate exprima si in func{ie de diametru! particuleior, dp si de
factorul de rezistenja O astfel:
Vm Lr|<t>
AP = (1.18)
di
Avand in vedere ca vascozitatea lichidelor este de cca. 100 de ori mai mare decat
aceea a gazelor, presiunile necesare in cromatografia de lichide (HPLC) trebuie sa fie
de cca. 100 de ori mai mari decat in cromatografia in faza gazoasa (de ex. vascozitatea
apei la 20° este egala cu Pa-s =10"J Pa-s iar presiunea heliului - gaz purtator in GC, este
egala cu t| = 1,94-10° Pa-s).
Considerand o coloana HPLC de 20 cm lungime si cu particulele de 10 tun, pentru
a obtine o viteza liniara medie de 10"2 m/s trebuie sa se utilizeze o presume de intrare Pe
de cateva sute de bari, deci de cateva sute de atmosfere. Deoarece lichidele nu sunt
compresibile (pana la cca 600 bari) viteza fazei mobile este practic constanta, in schimb
in gazcromatografie, gazele fiind compresibile, viteza fazei mobile nu mai este liniara
si nici constanta, ea creste cu lungimea coloanei, deci a distantei parcurse.
Performantele analitice ale coloanelor cromatografice sunt determinate de carac-
teristicile acestora, respectiv de natura fazei stationare si in acest context se impun unele
lamuriri privind factorii sau parametrii cromatografici.
CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATH IN ANALIZA §l CONTROLUL MEDICAMENTELOR 33
Pentru a infelcge fenomenele implicate in separarea cromatografica este necesar
sa se cunoasca structura discret discontinua a transferului de masa (de analifi) prin
coloana, imaginandu-se ca o coloana este alcatuita dintr-un numar foarte mare de ,,ctaje
minuscule" numite ,,platouri teoretice", masade analiti transferandu-se de pe un platou pe
altul, conform unei succesiuni continue de echilibre de transfer (conceptul este oarecum
asemanator distilarii lichidelor intr-o coloana de distilare). Trebuie subliniat faptul ca teoria
platourilor teoretice are neajunsul ca ea considers cromatografia ca o suits discontinua de
operatiuni, deci de echilibre si ca f iecare echilibru se realizeaza separat si integral, netinandu-
se seama de fenomenul de difuzie si de curgerea continuS a fazei mobile, care micsoreaza
schimburile (transferurile de masa). De aceea an aparut si alte teorii In aceasta privinta, intre
care teoria cinetica, In care se ia in considerare aspectul dinamic al fazei mobile si inf luenta
temperaturii si a presiunii asupra curgerii si implicit asupra separarii cromatografice.
In acest context este necesar sa se discute distribufia/repartifia anali|ilor intre doua
faze, curgerea fazei mobile (care provoaca separarea anali^ilor) si elutia succesiva a
analitilor si detectia lor.
Distrlbiitia termodinamM a analitilor intre faza stationara si cea mobila cand
concentratiile lor nu sunt mari, respectiv cand faza stationara nu este saturata in analiti,
se admite ca este regulata si independents de concentra^iile (cantitatile) altor substante
prezente. Tn acest caz intre concentratiile unui analit in faza stationara, Cs, si in faza
mobila CM, exista o relatie liniara, exprimata pjin relatia:
Cs = (1.19)
Kpj = este coef icientul de distribute al unei substante
intre substante intre cele douafaze.
Trebuie subliniat ca in cazul cromatografie gaz-lichid (GL) nu se utilizeaza
coef icientul de distributie ci coef icientul de repartitie, in cromatografia de adsorbtie se
utilizeaza coeficientul de adsorbtie, iar in cromatografia pe gel este valabila constanta
de difuzie.
Marimea KD se numeste ,,coeficientul termodinamic de distributie", putandu-se
exprima in functie de ,,entalpia libera standard de distribute", AG s/i corespunde diferentei
entalpiilor libere, rezultate din transferul unui analit standard cu dilutie infinita din faza
mobila, catre faza stationara:
AG° = - RT InKo (1.20)
Coeficientul termodinamic de distributie se poate exprima si prin utilizarea
,potenjiale!or chimice" standard, |i , ale analitului in fiecare din cele doua faze:
(1.21)
RT RT
34 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA $l CONTROLUL MEDICAMENTELOR CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII TN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR 35

De aceea, potentialul chimic standard, care are dimensiunile unei energii/mol, In procesul cromatografic o importanta deosebita o are ,,curgerea separativa a
trebuie sa fie Tnlocuit cu potentialul chimic (0, care rezulta din interacfiuni specifice, fazei mobile" care implica deplasarile separative si profilul elufiei.
ion ice sail moleculare, la care este supus analitul din partea fazei stationare si a fazei
Curgerea fazei mobile perturba echilibrele de distributie a analitului intre cele
mobile. Potentialul chimic este mult influentat de temperatura si de polaritatea compu- doua faze, stationara si mobila, ceea ce determina deplasarea succesiva a echilibrului Tn
silor, dec! de activitatea a = fC, f fiind coeficientul de activitate (totdeauna subunitar; coloana, astfel ca pe masura ce au loc aceste deplasari se creeaza echilibre noi cu faza
cand f=l, a=C ), iar C este concentrajia:
stationara. Deplasarile analifilor de-a lungul coloanei sunt determinate de doua procese
(j. = (J° + RT In a (1.22) mai importante si anume:
« de ,,fenomenul de transport" prin antrenare si prin difuziune Tn faza mobila, care nu
La echilibru cele doua potentiate chimice sunt egale: este selectiv dar care este guvernat de viteza de curgere a fazei mobile.
« de ,,procesul de reteinle selectM" a analitilor, retentie care se datoreaza afinitatii
U.s = Mm, respectiv: In as H-RTlnam (1.23) fiecarui analit fafa dc fazele stationara si mobila, afinitati care se exprima la randui
lor prin coeficienjii de distributie (Figura 1.11).
iar
(is -Hm = RT In am - RT In as (1.24) De subliniat ca ,,transportul Tn
faza mobila" (care se face Tn sensul
curgerii), prin antrenare sau translatie
A
are loc datoritagravitatiei sau datorita
rn^ (1.25)
RT as presiunii impuse unui fluid cu o
Prin urmare: pompa (ca Tn cromatografia de lichide
., i 3m as sau cu fluide supercritice) sau prin B
In KD = - In — = In — = In (1.26)
3s am detenta unui gaz aflat sub presiune (ca
in cromatografia Tn faza gazoasa).
In sfarsit, daca se considers ca in solutie diluata coeficientul de activitate al
Curgerea unui fluid depinde si
analitiilui are valori foarte apropiate si foarte mici:
este deci influenjata si de rezistenta Figura 1.11 Profilul Gaussian al celor doi analiti
C C la curgere datorata vascozitSfii fazei separati prin migrarea (deplasarea) lor
In KD = In -^— iar KD = TT~ (1.27)
Cm Cm mobile, de permeabilitatea coloanei
si de pierderea de sarcina. despre care s-a vorbit anterior.
Coeficientul termodinamic de distributie KQ este prin urmare o caracteristica a
unui analit dat, in conditii bine determinate; iar in conditii identice analitii care au naturi Transportul se face, asa cum s-a mai aratat, si prin difuziune, Tn cazurile Tn care
diferite au evident coeficienti de distributie diferiti, ceea ce permite separarea lor concentratiile unei substante Tn diferite puncte ale acestuia, sunt diferite. In astfel de
cromatografica. cazuri datorita tendintei de omogenizare a concentratiilor se produc o miscare a
moleculelor de substanta dinspre zona mai concentrata spre aceea mai diluata. Aceasta
Trebuie Tnsa precizat ca bazele teoretice ale variafiei potenfialului chimic standard,
miscare se numeste difuziune si se poate evalua prin legea lui Pick, care coreleaza
A|_i sunt mai complicate, dar scarile de polaritate stabilite mai mult empiric sunt utilizate difuziunea, deci miscareasubstanj;ei, respectiv intensitateafluxului J cu traversarea unei
pentru exprimarea unor interactiuni si anume: suprafete S, cu coeficientul de difuzie D si cu diferenta de concentratie ,,dc" existenta
- seria eluotropa (a lui Snyder), care descrie energia deadsorb(ie EQ a moleculelor fazei Tntre doua puncte ale mediului, Tntre care exista distanta dx:
mobile pe unitatea de suprafafa de adsorbant, ceea ce exprima forta eluanla a fazei (1.28)
mobile; dx
- polaritatea (P') a solventilor calculata dupa Rohrschneider plecand de la datele expe- Coeficientul de difuziune D este o marime caracteristica a unei substante, fiind
rimentale efectuate in cromatografia de gaze; legata de marimca ei Tn conditii date de temperatura, vascozitatea mediului si tinand
- parametrii de solubilitate, 5 (a lui Hildebrand) care reprezinta energia necesara seama si de natura ei; D se exprima Tn m /s. Pentru determinarea experimentala a
pentru a transforma un mol de solvent din stare lichida in stare gazoasa in conditii coeficientului de difuziune, in cazul unor molecule mici dizolvate Tn apa, se poate utiliza
normale, se bazeaza pe masuratori entalpice; relatia:
36 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA §l CONTROLUL MEDICAMENTELOR CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR 37

(1.29) este de tip Gaussian, deci poate fi asemuit cu o curba Gauss. Aceasta Tnseamna ca la un
moment dat al migrarii cromatografice, substanta este localizata pe un platou (imaginat
Tn care / este coeficientul de frecare, exprimabil prin relafia: ca o suprafata orizontala extrem de tngusta) al coloanei si se distribuie simetric Tn jurul
unei valori maxime cu ordonata y0 si abscisa x0.
/ = 6pNrq (1.30)
In figura 1. 13 este prezentat traseul geometric al unei curbe Gauss si ecuatiei unei
Tn care: astfel de curbe, fiecare punct fiind caracterizat prin ordonata lui, y, si prin distanta x Tn
r = raza moleculelor considerate de forma sferica raport cu axa de simetrie a ordonatei yp.
(x-xo)
N = numarul lui Avogadro (notat astfel pentru a-l deosebi de numarul de platouri y =.
yo (1.31)
teoretice N) 2a2

/ = vascozitatea mediului

Trebuie subliniat faptul ca deplasarea prin difuziune este mult mai mica (slaba)
decat aceea prin curgere, coef icientii de difuziune f iind de 1 0 - 103 ori mai mici in lichide
decat Tn gaze. Fenomenele de difuzie sunt mai accentuate si dcci mai importante in
cromatografia de gaze, datorita vascozitatii mai mici a mediului (fata de cromatograf ia
de lichide), intervenind intr-o masura importanta in largirea benzilor (picurilor) mai ales
Tn GC.
0,507 -
Deplasarea unui analit si Tn general a unei substante Tntr-o coloana cromatograf ica,
de ex. in cazul cromatografiei de repartitie, poate fi asemuita cu un transfer de masa a
substanfei, repetat de un numar analit +
faza mobila
foarte mare de ori, conform unui
I
numar tot atat de mare de echilibre
care se stabilesc si se distrug'.
Aceste transferuri se fac de pe niste
,,niveluri" sau ,,etaje" extrem de in- Figura 1.13 Traseul geometric al curbei Gauss, reprezentand profilul concentra|iei
unui analit In cursui procesului de separare cromatografica
guste, pe altele, succesiv, numite
,,platouri teoretice", care sunt in
fond niste niveluri imaginare intr-o A§a cum se observa, curba Gauss este simetrica prezentand un maxim B si doua
faza stafionara reala, asa cum se puncte de inflexiune E si F. Pentru ordonata maximului curbei se atribuie valoarea
poate observa din figura 1.12. yO=l ,000; punctele de inflexiune E 5! F au ordonatele egale, y E = YI: = 0,607, iar distan tele
Transferul de masa, respec- lor Tn raport cu axa de simetrie (BD) sunt egale cu abaterea tip o, prin urmare largimea
tiv deplasarea selectiva a unui picului Tnlre punctele E si F este cgala cu 2a. Pe de alta parte, semi-Tnaltimea picutui este
analit Tn coloana cromatograf ica se egala cu y\/2 = 0,500 iar largimea picului pentru aceasta valoare a ordonatei este egala
face Tn conditii experimentale bine -frits cu 2,34a.
determinate (granulatie, porozi-
Examinand cu atentie curba se observa ca ea se Inscrie intr-un triunghi isoscel,
tate, tip de faza mobila, concen-
AGI, ale carui laturi mai lungi sunt tangente la curba Tn punctele de inflexiune. De
tratie de analit, temperatura etc).
asemenea s-a stabilit tot prin conventie ca inaltimea triunghiului este egala cu ordonata
Pe baza teoriei platourilor teoretice
punctului A, deci yA= 1,200, iar largimea sa la baza este egala cu latura GI = 4o.
se poate aprecia ca dupa un anumit Figura 1.12 Reprezentarea intuitiva a ,,platourilor
parcurs in coloana, profilul con- teoretice" intr-o coloana cromatografica Este important de observal ca abaterea tip, sau mai bine varianja o2 are o distanta
centratiei analitului in faza mobila de migrare egala cu Z si reprezinta dispersia substantei Tn coloana, iar cresterea largimii
38 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICAJII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR
curbei Gauss (deci a picului) se poate exprima prin cresterea varianjei da , dupS o
deplasare egala cu dZ (vezi figura 1.14), deoarece cresterea do2 este proportionals cu
deplasarea dZ; in acest context se poate scrie:
0z (1.32)
Factorul de proportionalitate se noteaza cu H, el fiind o caracteristicS datorata
analitului, naturii fazei stationare, naturii fazei mobile, ca si conditiilor de separare
cromatografica cum sunt debitul fazei mobile si temperatura; factorul de proportionali-
tate este independent de deplasare; pc baza acestor consideratiuni se poate scrie pentru
cresterea variantei egalitatea.
do2 = HdZ (1.33)
In continuarea acestor rationamente se poate considera ca la intrarea in coloana,
largirea prin difuziune 00 este nula (deci Z=0), ea fiind maxima dupa parcurgea de catre
•analit a intregii coloane cu lungimea L. Prin extrapolarea inicii deplasari dZ la intreaga
coloana marimile discutate dz devine L, o^+dz devine OL iar da devine AaL ; prin
urmare se poate scrie:
a 2 -On (1.34)
insS OQ = 0.ceea ce 'face ca
ecuajia (1.34) sS devina:
(1.35)
de unde:
H = -rk ia (1.36)
Se poate spune ca deplasarea analitului in coloana se traduce prin deplasarea curbei
Gauss, care imprima largimea ei (deci a picului) si este determinata de difuziune si de
miscarea de translate (Figura 1.14).
Factorul de proporfionalitate H corespunde, cresterii variantei curbei Gauss pe
unitatea de lungime a migrarii; iar conform teoriei platourilor teoretice coloana croma-
tografica este asemuita unui numar foarte mare de volume elementare, considerandu-se
ca in fiecare dintre acestea se realizeaza un echilibru perfect de distribute a analitului
intre faza mobila si aceea stationara. Notiunea de volum elemental' se poate inlocui cu
notiunea de inaitime, deoarece sectiunea coloanei are o suprafata constants, respectiv
raportul dintre volum §i aceastS suprafata; in acest fel se ajunge la a considera factorul
de proportionalitate H ca fiind inaltimea platoului teoretic pentru coloana utilizata,
inaitime care se exprima in mm (dar H poate avea si alte dimensiuni; a se vedea mai
departe). Cunoscand inaltimea platoului teoretic si lungimea coloanei se poate calcula
numarul de platouri teoretice pentru o anumita coloana.
N= (1.37)
CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR 39
translate
difuzie
difuzie
z+dz
Figura 1.14 Deplasarea analitului ?i largimea curbei Gauss (picului)
O mare importanta in analiza cromatografica o are, ,,elufia analitului", respectiv
,,obtinerea picului cromatograflc". Separarea cromatografica implica in mod necesar migra-
rea completa a analitului prin toata faza stationara pana la iesirea completa din coloana.
Aceasta migrare depinde de afinitatea fazei stafionare fata de analit. de caracteristicile
coloanei (tipul de faza stationara, marimea particulelor, porozitatea, suprafata specifics etc)
si de volumul de faza mobila adaugat, care curge prin coloana.
Pentru o substanta nerejinuta in coloana, deci nesupusa proceselor cromatogra-
fice, este suficient un volum de faza mobila egal cu volumul moil, V M , pentru a culege
substanta la iesirea din coloana; cu alte cuvinte o astfel de substanta se elimina in frontul
fazei mobile.
In realitate substantele de analizat aflate in amestec au o anumita afinitate fa{a de
faza stationara, determinata de structure lor chimica §i de marimea moleculelor lor. De
aceea, cand frontul fazei ajunge la iesirea din coloana, analijii sunt cu atat mai putin
deplasati in coloana cu cat afinitatea lor pentru faza stationara este mai mare. Iar pentru
eluarea analitilor trebuie sa se adauge un volum de faza stationara cu atat mai mare cu
cat ei sunt mai retinufi in coloana, respectiv pe faza stationara.
Pentru un amestec de analiti este posibil sa se utilizeze un detector, plasat cat mai
aproape de iesirea ef luentului din coloana, si sa se inregistreze continuu semnalul analitic
care este proportional cu variatiile concentratiilor analitilor separati si eluati si care
evident traverseaza coloana, obtinandu-se cromatograma corespunzatoare, inregistrata
de un Tnregistrator (recorder) care face par.te din ansamblul componentelor instrumen-
tului de analiza cromatografica.
Prin urmare pentru fiecare analit, intensitatea semnalului detectorului, transmis
catre inregistrator, este proportionals cu cantitatea de analit din proba analizata; f iecarui
analit ii corespunde in consecinta un pic pe cromatograma, care se inregistreaza intr-un
sistem de coordonate drepte; traseul unei astfel de cromatograme este dat in figura 1.15,
pe care sunt inscrise si cateva marimi fundamentale.
40 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR 41

to sau VM De regula eluentul iesit din coloana este detectat printr-un semnal sau pic al
detectorului (primul pic in figura 1.15) si Tncepand din acest moment sc
d R sau tR sau V R
masoara timpul de retentie al analitului, timp care se noteaza cut R si se numeste
,,timp de retentie corectat", el calculanciu-se astfel:
t'r = t R - t M (1.38)
• volumul de retentie, se noteaza cu VR (volumul de retentie brut) si el reprezinta
linia volumul de faza mobila necesar pentru a aduce analitul cu concentrafia sa
de baza
maxima in detector; volumul de retentie se poale deduce din timpul de retentie
b d (cm) sau tR si in acest caz trebuie sa se fina seama de volumul mort de faza mobila,
t(min) sau respectiv de volumul mort al coloanei, care trebuie sa se scada din volumul brut
V (mL) de retentie obtinandu-se astfel, volumul de retentie corectat (sau redus; volumul
mort se poate nota cu VQ iar cu timpul mort to).
Figura 1.15 Traseul unei cromatograme si picul componentului separat
V'r = V R - V M (1.39)
dR = distanta de la inceputul procesului cromatografic la maximul picului
raportul de retentie, notat cu RR, se exprima prin raportul dintre viteza medie de
b = largimea picului la baza, egala cu baza triunghiului in care se Tnscrie cea mai mare deplasare a analitului VA si viteza medie de deplasare a fazei mobile (sau a
parte a curbei Gauss substanfelor neretinute) VM:
h = inaltimea picului cromatografic
s = suprafata de sub pic, cuprinsa intre abscisele G si I si curba Gauss V (1.40)
to = timpul mort M
V M = volmnul mort; V R = volumul de retentie; t R = timpul de reten^ie. sau daca se inlocuiesc VA ?i VM, cu expresiile lor in care se introduc lungimea
coloanei L si timpul de retentie tR, respectiv timpul mort IM, se obtine pentru
Pentru intclegerea corecta a proceselor cromatograf ice si pentru utilizarea corecta raportul de retentie expresia:
si eficienta a metodelor cromatografice de analiza trebuie sa se cunoasca o serie de "- L
' - L
-! - L
(1.41)
parametri sau marimi, care definesc si explica procesele cromatografice de separare. tM

L
(A) Mlrimi de retentie, care caracterizeaza retinerea analifilor in coloana cromato- /tR _ tM
graf ica, respectiv pe faza stationara, marimi exprimate in timp, voluin, distanta si (1.42)
factor de retentie (numit si raport de retentie). Toate aceste marimi sunt legate de
coef icientul de distribute al analitului KD, intre fazele stajionara si mobila (distanta este posibil de asemenea sa se inlocuiasca raportul tM/tR cu raportul volumelor
de retentie notata cu da se poate Tnlocui cu timpul de retenlie tR sau cu volumul de corespunzatoare VM/VR sau cu
retentie VR cu care este proportionals).
C!M VM
- timpul de retenfie este egal cu timpul scurs de la intvoducerea probei de analit in KR — ~; — "7^ (1.43)
dA VR
coloana si momentul in care iese maximul picului din coloana (deci concentrajia
maxima). d^ = distanfa parcursa de volumul mort de faza mobila (VM)
De notat cS viteza de tnregistrare a picului este constants, iar masurarea distantei dR d A = distanta pana la maximul picului analitului A; ambele aceste doua marimi
permite sS sc cunoasca timpul de retentie 1R. EluentuI (faza mobila) neretimit de se pot masura pe cromatograma
coloana iese mull mai repede din aceasta, iar timpul necesar ca faza mobila sa ajungil
la detector se noteaza cu t 0 sau t M si se numeste timp mort. Acest timp se datoreaza
parcursului obligatoriu al fazei mobile prin spa|iile mterstifiale (dintre particulele de Raporlul de retentie are o valoare subunitara iar valoarea sa maxima poate fi egala cu
faza stationary) ca si volumelor moarte ale diferitelor parti componente ale aparatu- unitatea atunci c:ind o substanfi nu este refinuta pe coloana, caz in care substanta se
lui. deplascaza cu aceeasi viteza ca si faza mobila.
 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII [N ANALIZA 51 CONTROLUL MEDICAMENTELOR 43

• factorul de retenfie sau de capacitate, notat cu k' se exprima prin raportul dintre - Pentru exprimarea volumului de retemie si a timpuhu de retemic in funcfie de
cantitatea de analit care se gaseste in faza stationara, Qs, si cantitatea de analit factorul de retentie, k' se pleaca de la expresia volumului Vs in funcfie de
care se gaseste in faza mobila, QM; uneori se utilizeaza pentru factorul de factorul de retentie (vezi relafia 1.44):
capacitate simbolul K, dar este preferat k' care arata mai bine ca acest raport nu
are o valoare constants, decat in conditii bine stabilite: k
' = ^? d e u n d e V s = ^f (1.49)
Qs CsVs KpVs
k' = (1.44) Prin inlocuirea Vs cu valoarea sa din relatia (1.48) se obtin:
QM VM
Exprimarea ,,factor de retentie" este de preferat in locul aceleia de ,,factor de VR = VM + KDVS = VM - = VM + k'VM
capacitate" pentru a se evita confundarea acestuia cu ,,capacitatea coloanei" referi- deci:
tor la cantitatea maxima de subslanja care poate fi fixata pe coloana. Trebuie
subliniat ca marimile de retenfie depind de substantele implicate in procesul (1.50)
cromatograf ic sj de coloane, respectiv de faza stationara, de aceea ele se pot exprima
unele prin altele. Ecuatia (1.50) se poate scrie sj sub forma urmatoare:
Astfel, volumul de retentie VR se poate exprima in funcfie de coeficientul de VR
= 1 -k' (1.51)
distribute KD si fracfia molara a analitului in faza mobila. Analilul se deplaseaza VM
prin coloana numai atunci cand el se gaseste in faza mobila, de aceea cantitatea
lui in faza mobilS se poate exprima prin fracfia sa molara in aceasta faza, care Tinand seama ca acest raport este egal cu raportul de retentie, conform ecuajiei
este egala cu raportul analitului in faza mobila, QM si cantitatea totala de analit (1 .43), ca si de faptul ca raportul de retentie este egal cu raportul tM/tR (conform
introdusa in coloana, QT. Aceasta din urma este egala cu suma QM si Qs, deci ecuatiei 1 .5 1) se deduce o ecuatie referitoare la timp, deci:
Ql = QM + Qs, astfel ca raportul de retentie se poate exprima astfel:
D VM MVi 1
RR = TT~ (1.52)
RR =
OM QM (1.45) VR =.T~
' tR = 1 + k'
= tM(l+k') (1.53)
cum Qs = iar QM = CM VM, raportul de retentie devine:
iar daca se inlocuie$te tM cu valoarea sa IM = L/VM se obtine o relatie care aratS
RR = (1.46)
C M V M + CSVS importanja deosebita a vitezei fazei mobile asupra timpului de retenjie:
L
" k') (1.54)
Pe de alta parte Cs , astfel ca raportul de retentie primeste o alt3
expresie:
R _ M ~_ M VM - In acest contextse potvalorifica ecuatiile 1.52si 1.53 pentru calculareafactorului
~ de retentie k', plecand de la timpii de retentie masurati pe o cromatograma:
tR ~ VR ~ CMVM + K D C M + KDVS

k' = t R - t M (1.55)
tM

de unde se poate deduce volumul de retentie astfel: sau daca se tine seama ca tR - IM = tR (timpul de retentie corectat) se objine:
(1.48)
k' = ^ (1.56) '
Aceasta este una din relafiile fundamentale ale cromatografiei, pentru un anumit tM
analit si evident pentru condi(ii experimentale bine definite, intre care in primul rand Valoarea factorului de capacitate cre?te odata cu timpul t^ cu care este proportional.
timpul, temperatura, prcsiunea etc. Relatia (1.48) leagi volumul de retentie cu coe- Timpul mort t M este constant pentru o coloana data, pentru o substanfa neretinuta,
ficientul de distribute KD 51 cu volumele de fazS stationara $i mobila. t R = t M iar k'=0;
 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATM IN ANALIZA 51 CONTROLUL MEDICAMENTELOR 45
ICAJII IN ANALIZA §l CONTROLUL MEDICAMENTELOR
44 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLi

In aceasta abordare numarul de platouri teoretice devine egal cu:

In temeiul celor discutate se poate aprecia ca optimizarea proceselor cromato-
grafice in faza lichida necesita cautarea unui compromis intre valorile k' cerute pentru (1.63)
o separarc buna a analitilor si timpul de analiza care trebuie sa fie cat mai scurt posibil.

Iar daca se exprima a in raport de largimea bazei picului b, stiind ca o = b/4, se

1.2.2. Eficacitatea coloanei cromatografice obtine:
16dR 16VR 16tR
Eficienta coloanei cromatografice care se traduce prin eficacitatea separarii N (1.64)
cromatografice depinde in primul rand de numarul de platouri teoretice, fiind cu atat
mai mare cu cat acest numar este mai mare (este o situatie similara si in cazul extractiei,
Evident ca din relaj:ia (1.64) se poate deduce ecuatia care da largimea bazei picului
mai ales in faza solida). Prin urmare un analist isi poate da seama de eficienta unei
coloane cromatografice, pe care o utilizeaza, prin determinarea numarului de platouri (b):
_ 4dR = 4Vg _ 4tR
teoretice al coloanei (data de relatia 1.57) care caracterizeaza functionarea coloanei. (1.65)
~N umarul de platouri teoretice depinde de geometria si natura chimica a fazelor stajionara VN" "
si mobila, dar s.i de toti ceilalti factor! care influenteaza repartitia analitului in faza
stationara si mobila. Din toate cele expuse rezulta ca numarul de platouri teoretice N se poate calcula
N=^- (1.57) in functie de distanta d R a picului (adica din momentul injectarii pana la maximul
n picului), de volumul de retentie VR, de timpul de retenfie tR si de largimea bazei picului
b sau chiar 5 = 1/2 h = 2,354a. Prin urmare se pot face pe cromatograma masuratori de
De aceea, a§a cum s-a aratat anterior, valoarea inaltimii platoului teoretic (sau
dR, de b si de largime a picului la semimaltimea acestuia, 8, ceea ce usureaza calcularea
talerului teoretic) depinde nu numai de lungimea coloanei ci si de varianta picului
numarului de platouri teoretice astfel:
cromatografic in cauza, OL ; prin urmare: 16tR 5,54tR (1.66)
°£ (1.58)

Adesea se prefers masurarea largimii 5 a picului la semiinaltimea acestuia (h/2).

'
Tnlocuind valoarea lui H in relatia lui N se objine: deoarece aceasta parte a picului este adesea mai simetrica decat intreg picul (care include
(1.59) largimea b). Odata cunoscut numarul de platouri teoretice si lungimea coloanei croma-
tografice se poate calcula inaltimea talerului teoretic, H = L/N, pentru respectiva
coloana.
De retinut ca abaterea tip o£ (varianta) a curbei Gauss este implicata in largimea Din cele expuse, se poate trage concluzia ca eficacitatea unei coloane cromato-
grafice este cu atat mai mare cu cat numarul de platouri teoretice este mai mare, respectiv
picului cromatografic, deoarece largimea bazei picului este identica bazei triunghiului
cu cat sunt mai mici baza picului b (sau 5) si abaterea tip OL a coloanei. Cu alte cuvinte
AGI si este egala cu 4oL, asa cum se poate observa din figura 1.13. Marimea H nu are
,,eficacitatea coloanei exprima insiisirea ei, capadtatea ei de a da picuri cat rnai sinietrke,
dimensiunile unei inaltimi, asa cum prevede teoria platourilor (conform careia se
mai stramte $i cu baze mai rnici, condifii in care se ob^in cele mat bunc separari ale analitilor"
exprima in mm). H putandu-se exprima in func^e de volumul de reten^ie VR, timpul de
retentie tR sau de distanta pana la maximul picului, dR, conform relajiilor urmatoare: (vezi si rezolu|ia).
Este important de retinut faptul ca pentru o aceeasi coloana, deci pentru o aceeasi
VR (1.60)
Hv faza stationara, distributiile analitilor intre faza stationara si aceea mobila sunt diferite
" N (analitii avand concentratii diferite), de aceea se obtin picuri cromatografice de forma
tR (1.61) similara dar cu inaltimi diferite (desigur in condifii identice) si cu largimi diferite, iar
numarul platourilor teoretice difera de la analit la analit.
dR (1.62)
46 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATM JN ANALIZA $l CONTROLUL MEDICAMENTELOR 47

Inaltimeatalerului teoretic H si implicit eficacitatea coloanei este influentata de mai - difuzia longitudinals B, exprima influenfa difuziunii moleculelor Tn directia de
multi factori. Teoria platourilor teoretice, desi a pevmis sS se traga unele concluzii curgere a fazei mobile asa cum se poate observa din figura 1.17.
experimentale verificate, nu tine seama de faptul ca procesul cromatografic este con-
tinuu s.i ca el consta dintr-un continuu schimb Tntre fazele mobila s.i stajionara. Pe de alia,
procesele de separare cromatografica sunt influentate de condifiile in care se face
trecerea fazei mobile prin f aza stationara, mai ales daca se modif ica debitul fazei mobile,
ceea ce determina largirea sau ingustarea picurilor, iar de astfel de probleme teoria Stif
platourilor teoretice nu poate sa fina seama. In schimb teoria cinetica (a lui Giddings)
referitoare la Tnaljimea talerului teoretic, coreleaza acest parametru H cu numarul
talerelor teoretice al coloanei, cu viteza de curgere a fazei mobile, cu temperature si cu
aparatura. In continuare sunt discutaji cativa factori care inf luenteaza Tnaltimea platou-
lui teoretic si deci ef icacitatea acestuia: Figura 1.17 Reprezentarea schematica a difuziunii longitudinals, B
- viteza liniarS de curgere a fazei mobile este guvernata pentru cromatografia in
faza gazoasa de ecuatia lui van Deineter: Difuziunea longitudinals este un proces general valabil pentru toate particulele
care se gasesc intr-un fluid (lichid, gaz, fluicle supercritice) care se deplaseaza, acest
H = A + — + cvm (1.67)
Vm proces fiind cu atat mai accentual cu cat viteza de curgere a fluidului este mai mica, asa
cum rezulta din expresia termenului B/vm din ecuatia (1 .67). Valoarea difuziei longitu-
A = difuzia turbulenta detenninata de curgerea neregulatfi a fazei mobile prin dinals se poate calcula folosind relafia:
coloana/faza stationara
B = 2yDM (1.68)
B = difuzia longitudinals
C = coeficientul de rezistenta la transferul de inasa in care:
yeste un factor de intortochere care exprima influenta coloanei adica influenta
difuzia turbulenta este data de particule solide mici, acoperite sau nu cu un film granulelor (granulometria) si uniformita|ii umplerii coloanei, fiind cu atat mai
subtire de lichid, cu forma si traiecte diferite de deplasare. Viteza de curgere mica cu cat inaintarea moleculelor de analiti si a fazei mobile este mai uniforma;
este cu atat mai regulata si mai apropiata de profilul teoretic cu cat particulele
DM este coeficientul de difuziune moleculara a analitului considerat Tn faza eluata
de faza stationara sunt mai omogene si cu cat coloana este umpluta mai regulat
(efluent), care Tn cazul fazelor mobile lichide este foarte mic (neglijabil), dar
mai uniform. inaintarea neregulata a analijilor ce trebuie sa fie separati Tn cazul gazelor este de 104-106 ori mai mare, si creste cu cre?terea temperaturii,
cromatografic, produce turbulence care determina largirea zonei, in care se afla scazand insa cu presiunea.
f iecare analit, prin difuziune turbulenta. Difuzia turbulenta A, depinde in afara
de debitul fazei stationare sj de caracteristicile particulelor, crescand cu - coeficientul de rezistentS la transferul de inasa C, reprezinta inegalitafile de pasaj
(trecere) a moleculelor dintr-o faza Tn alta; astfel de procese se produc si la
diametrul lor (vezi figura 1.16).
fixarea analifilor pe particulele de faza stajionara si Tn timpul elutiei, deci tot
tiinpul proceselor cromatograf ice; se pot distinge trei situatii asa cum rezulta din
figura 1.18.
I

Figura 1.16 Reprezentarea schematica a difuziei turbulente A

Figura 1.18 Reprezentarea schematica a rezistentei la transferurile de masa
48 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA §l CONTROLUL MEDICAMENTELOR 49

(a) nu toate moleculele din faza mobilS sunt antrenate cu aceeasi viteza, consta- - inaltimea redusa: H . H
tandu-se ca cele din mijlocul fluxului se deplaseaza cu o viteza mai mare decat h = -7- si h=— (1.69b)
dp dc
cele dinspre exterior (dinsprc perejii coloanei), de aceea conclitiile de reparti-
tie sunt diferite (vezi f igura 1.18 a) Aceasta marime reprezinta pentru o coloana uinpluta, inaltimea coloanei de faza
(b) contactul dintre fazele mobila si stationara nu este identic peste tot, deoarece stationara, sau de suport, ocupatS de un ,,volum de particule" care corespund
traiectul de la suprafata este diferit de eel dintre sinuozitatile din interiorul echilibrului analit-faza mobila-faza stationara. Inaltimea redusa are. in vecinatatea
suportului (vezi f igura 1.18 b) conditiilor optime, valori intre 2 si 4. Rezulta ca dona coloane (sau mai multe)
umplute cu particule cu diametre diferite, pot sa aiba aceeasi Tnaltime redusa si deci
(c) cand faza stationara este lichida, deci cand particulele de suport solid sunt
acoperite cu o pelicula de lichid, moleculele fixate pe faza stationara se gasesc aceeasi eficacitate, in functie de conditiile de lucru experimental.
la distante diferite fata de faza mobila; de aici rezulta ca elujia nu se face cu
aceeasi viteza pentru toate moleculele, timpul de sedere a acestora Tn faza • viteza redusa este data de relatia urraatoare:
stationara este functie de drumul ce trebuie parcurs (vezi f igura 1.18 c). Vmdp
1 (1.70)
~ DM
Toate accstc situatii si procese de care trebuie sa se Jina seama, determina
Tn care:
intarzieri la stabilirea echilibrelor cu atat mai accentuate cu cat debitul fazei mobile este
mai mare (deci viteza de curgere a fazei mobile este mai mare). De aceea trebuie sa fie vm este viteza liniara medie a fazei mobile
atenuati acesti factor! prin micsorarea distantelor ce trebuie parcurse in fiecare faza, dp este diametrul particulelor
reducand diametrul particulelor, grosimea fazei stationare si utilizand coloana cu um- DM este coeficientul de difuziune moleculara a analitului in eluat
plutura regulata si bine tasata pentru a nu include goluri (tasarea nu trebuie sa fie
Viteza redusa arc evident dimensiunile unei viteze si ea intervine si in ecuafia
exagerata).
lui Knox de calculare a valorii Tnal{imii reduse h, a platoului teoretic:
Se poate dovedi matematic si graf ic, pe baza ecuatiei lui Deemter ca prin cresterea
debitului fazei mobile se produce o crestere a inaltimii talerului teoretic H, ceea ce are — + CV (1.71)
ca urmare scurtarea timpului de contact a fazei mobile cu cea stationara, astfel ca Tn care:
echilibrele n-au timpul necesar pentru a se stabili complet. Daca viteza fazei mobile este
A este difuzia turbulentS
mai mica decat viteza optima v0 = VB/C , devin preponderente fenomenele de difuziune
B este difuzia longitudinala
longitudinala, ceea ce contribuie de asemenea la cresterea lui H. C este coeficientul de rezistenta la transferurile de masa.
Marimi reduse. Aceste marimi se utilizeaza pentru a se putea compara mai bine
intre ele, metodele cromatografice Tn faza gazoasa, lichida si supercritica, scop pentru inaltiinea redusa a platoului teoretic h r este alcatuita din trei componenta si
care se si produc coloane diferite care opereaza Tn condi|ii diferite. Marimilc reduse sunt anume: h = h - difuziune turbulenta + h-difuziune longitudinala + h-transfer de
marimi fundamental definite anterior, dar exprimate Tn functie de marimea particu- masa Tn care:
lelor, aclica de diametrul lor ,,dp" pentru coloane umplute, sau pentru coloane capilare - h - difuziune turbulenta = Av'{3 si reprezinta anizotropia curgerii si
neumplute, care an diametrul interior ,,dc". Se definesc Tn aceasta idee urmatoarele marimi dependentei de granulatie sau granulometrie, ca si de buna umplere a
reduse: coloanei; A trebuie sa fie cuprins Tntre 0,5 si 2, iar valori mai mari decat
- lungimea redusa: i i acestea arata o umplere necorespunzatoare si o granulafic neregulata.
l=i- ?i l=i- (1.69a)
dn dc
- h - difuziune longitudinala = — , exprima influenta difuziunii longituclinale
La traversarea unei coloane de catre un analit se tine seama ca traversarea este YI-
a analitului in fazele extra si intragranulara; valoarea lui B este de cca 2.
functie pe de o parte de lungimea coloanei, iar pe de alta parte de numarul de
particule cu diametrul dp, intalnite in cale. Doua coloane pot avea aceeasi
lungime redusa I = L/dp, daca acest raport ramane constant. In aceasta conceptie - h - transfer de masa = Cv v si exprima influenta transferului de masa a
rezulta ca o coloana mica poate avea aceeasi lungime redusa ca si o coloana mai analitului Tntre cele doua faze, stationara si mobila.
lunga, daca ea se umple cu particule care an un diainetru mai mic, iar analitii
care traverseaza astfel de coloane intalnesc acelasi numar de particule.
50 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAF1A. APLICAJII IN ANALI2A ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICAJII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAWIENTELOR 51

Din cele expuse rezulta ca exists o diferenta intre circulatia (deplasarea) fazelor
mobile extra si intragranulara de aceea repartitia analitului intre cele doua faze este
diferita, iar factorial de rezistenta, C, la transferurile de masa se poate exprima prin
relatia:
C = Cs + CM (1.72)
- Cg = rezistenta la transferul de mas3 dinspre faza stationary catre faza mobila
- CM = rezistenta la transferul de masa dinspre faza mobila spre stationara
Factorul de rezistenta C poate fi considerat ca fiind panta dreptei h = /(vr) iar
valorile lui trebuie sa fie cuprinse intre 0,01 si 0,02, dar pot fi si mai mari in cazul
analitilor voluminosi (proteine sau faze stationare polimerice).
Datele si constatarile mentionate mai sus sunt valabile si pentru cromatograf ia de
gaze, cazuri in care este implicata si variatia temperaturii, astfel ca inaltimea talerului
teoretic poate fi corelata si cu temperature, prin ecuajia (1.73):
Prin urmare, relatia (1.74) arata ca intre migrare si concentratie exist! o relafie
care are unele implicatii si consecinfe practice importante in efectuarea separarii cro-
matografice, deoarece depunerea unei substante pe o coloana cromatografica nu este
riguros uniforma ci neregulata s.i de acest fapt trebuie sa se tina seama, avand in vedere
ca:
atunci cand distribufia este liniara se poate scrie:
8x/5t 1_
(1.75)
5v/8t ~ P + KD
deoarece /'(Cs) = K, deci o Constanta. In astfel de cazuri concentratia nu
intervine in viteza de deplasare a substantei, iar aceasta este aceeasi in toate
punctele coloanei. Evident ca in aceste cazuri picul este simetric de tip Gaussian

(1.73)

1.2.3. Simetria picurilor si modificarea formei lor

Atunci cand un pic de elutie are o forma Gaussiana se poate considera ca
distribujiaanalitului intre faza stafionara si cea mobila se face intr-un mod regulat, adica
Figura 1.19 Izoterma liniara de distributie, pic Gaussian
ea mi depinde de concentratie. fiind aplicata relatia (1.19):
Cs = KD€M
asa cum apare in Figura 1.19 al izotermei liniare.
Totusj, distributia termodinamica a analitului nu este intotdeauna perfect regulata,
in cazurile in care intervin fenomcne de adsorbtie, izotermele de distributie nu
datorita f enomenelor de adsorbtie care pot interveni sau cand este vorba de cantitati mari
mai sunt liniare, variind in functie de concentratie, conform legii lui Freundlich:
de substante care trebuie sa fie separate cromatografic. In astfel de cazuri picurile nu
mai an forma simetrica datorita modif icarii repartitiei s.i migrarii cromatograf ice, ceea Cs = KC& (1.76)
ce inseamna ca viteza de migrare a unei substance in raport cu viteza fazei mobile este
a = o constanta care depinde de substanfj, de adsorbant si de faza mobila.
legata de concentratie printr-o ecuatie diferentiala.
6x/5t 1 Pentru cazuri de acest fel pot exista dou3 situatii practice:
(1.74)
5v/5t P+f(Cs) (a) izotermele de distributie pot fi concave in raport cu abscisa, cand a < 1, deci
cu cat substanta este mai concentrata, CM este mai mare si cu atat derivata
- 8x/ 8t reprezinta viteza de deplasare a substantei, exprimata in distanta 8x parcursa de
f(Cs) devine mai mica, ceea ce duce la cresterea raportului in relatia (1.74);
substanta in coloana in timpul 8t;
migratia devine mai mare, iar punctele cromatogramei in care concentratia
- Sv/ 8t reprezinta viteza de deplasare a fazei mobile, adica volumul Sv de faza mobila este mai mare, migreaza mai rapid decat cele in care concentratia este mai
care traverseazS coloana in timpul St mica; de aceea zona de elutie se deformeaza, nemaif iind regulata; consecinta
- P = un factor care depinde de caracteristicile coloanei este cS in cromatograf ia prin developare cromatograma prezinta o ,,coada",
iar in cromatograf ia de elutie picurile prezinta o ramura ascendenta mai intinsa
= dC<; /dC]yi este derivata concentratici substantei in faza stafionara in raport care corespunde fractiunilor mai sarace care migreaza mai incet, figura 1.20.
cu concentratia in faza mobila.
52 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR
Figura 1.20 Izoterma de distributie concava nesimetrica
(deformata, nemaifiind Gaussiana)
(b) izotermele de distributie pot fi convexe in raport cu abscisa, caz in care <x>l,
iar vitezele de migrate sunt invers proportionate cu concentratiile. Si in aceste
cazuri, mai putin frecvente, picurile nu sunt Gaussiene (Figura 1.21).
C's
Figura 1.21 Izoterma de distributie convexS, nesimetrica, deformata,
ne-Gaussiana)
In cazurile picurilor asimetrice se poate exprima asimetria prin compararea
largimii unui pic la 1/2 din inalfimea lui (deci semilargimea) pe perpendiculara ce
coboara din maximu! picului pe abscisa. Intrucat exists dificultati inevitabile de deter-
minare a largimii unui pic la baza sa, se fac masuratori pe o paralela la abscisa la 1/10
sau 1/20 din inaltimea picului, asa cum se observa in figura 1.22.
Se poate utiliza ,,factorul de asimetrie" pentru exprimareaacesteia, factor care este
egal cu raportul dintre semilargimile la 1/10 din inaltimea picului OB'/OA' sau ,,factorul de
simelrie" care se refera la 1/20 din inaltimea picului, dat de raportul b0i05/2A sau b0>05/AB
si A=OA.
CAPIVOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR 53
100-
5Q-\
53
<S
10-
timp
Figura 1.22 Reprezentarea asimetriei unui pic cromatografic si masurarea
largimii lui la 1/10 sau 1/20 din Tnal{imea sa
1.2.4. Largirea picurilor si dilutia cromatografica
Plecand de la constatarea ca deplasarea unui analit in lungul coloanci cromato-
grafice este Tnsotita de cre§terea volumului solutiei in care se gase§te analitul (prin
adaugarea fazei mobile), fata de volumul probei lui introdus in cromatograf, sc produce
o largire a picului, concomitent cu micsorarea inaltimii sale clatorita diluarii analitului
in faza mobila, asa cum se poate observa in figura 1.23.
timp
Figura 1.23 Reprezentarea largimii unui pic cu timpul deplasarii analitului in
coloana odata cu faza mobila
Fenomenul de largire a picurilor cromatografice depinde de eficacitatea coloanei
exprimata prin inaltimea talerului teoretic H sau prin inallimea lui redusa h, tinandu-se
seama de:
- natura fazei stafionare, de diametrul particulelor, de calitatea umplerii coloanei;
- de fenomenele ce insotesc curgerea fazei mobile, care depind de temperatura si
presiune;
- de natura analitului.