Capitolul 5

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus
Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu Universitatea din Bucureti, Facultatea de Biologie Splaiul Independenei 91-95, 76201 Bucureti Bacteriile aparinnd genurilor Bacillus i Streptomyces sunt cunoscute ca fiind productori ai unor game largi de compui biologic activi, dintre care unii au aplicaii n agricultur i industria farmaceutic. Dac n cazul bacililor cunotinele sunt mai avansate, iar aplicaiile practice concentrate mai ales asupra enzimelor, la streptomicete cele mai multe cunotine au fost dobndite n urma studiilor asupra producerii de antibiotice. Scopul acestei lucrri este de a sintetiza datele referitoare la biosinteza de enzime i de compui cu efect inhibitor, utili pentru diferite procese biotehnologice. De asemenea, sunt prezentate unele date referitoare la genele ce codific biosinteza unor substane importante din punct de vedere biotehnologic. Actinomicetele reprezint un grup de microorganisme procariote cu numeroase asemnri cu fungii microscopici, alturi de care constituie un exemplu clasic de evoluie convergent. Relevante n acest sens sunt: morfologia i organizarea micelial a coloniilor lor ca i sistemul lor de reproducere. Se poate specula c aceste asemnri rezult dintr-o adaptare comun n sensul desfurrii tuturor funciilor metabolice n condiiile absenei apei n imediata lor vecintate. Ciclul de viaa al streptomicetelor, cel mai important gen din cadrul grupului actinomicetelor, crescute pe mediu solid implic formarea (diferenierea) a dou tipuri diferite de miceliu: miceliul de substrat care crete n si pe mediul de cultur solid; miceliul aerian care crete pe primul i pe care se formeaz sporii (Figura 1). In timpul creterii miceliului de substrat se remarc o cretere simultan a greutii uscate care ns ncetinete semnificativ odat cu formarea miceliului aerian.
Figura 1. Reprezentarea schematic a celor dou tipuri de miceliu (dup Zarnea, 1982). 123
Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu
Un aspect interesant este acela c, la multe dintre speciile de streptomicete, ncetinirea ratei de cretere este nsoit de producerea de substane antibiotice sau cu alte funcii (metabolii secundari), astfel c n timpul formrii miceliului aerian se remarc o foarte intens activitate antibiotic. Acest fapt vine n sprijinul ipotezei asupra rolului antibioticelor produse de streptomicete i anume acela de a proteja miceliul de substrat care se lizeaz mpotriva altor bacterii existente n sol care l-ar putea folosi ca surs de carbon i azot, pstrndu-l astfel pentru creterea miceliului aerian (Chater i Merrick, 1979). Diferenierea celular evideniat la streptomicete pare a fi un proces controlat de unele substane autoreglatoare cum sunt factorii A i B al cror mecanism de aciune, cel puin n cazul unor specii de streptomicete care au fost studiate mai intens, este asemntor mecanismului de aciune al hormonilor de la eucariote, implicnd prezena unor receptori specifici (Beppu, 1986). Acest tip de reglaj mpreun cu observaiile legate de asemnrile structurale ale factorului B cu AMPc de la eucariote sugereaz ideea c anumite substane evideniate la streptomicete ar putea fi semnale universale sau mesageri pentru funcii celulare nu numai la procariote ci i la eucariote. Ca rezultat al activitii lor metabolice, att streptomicetele ct i bacilii, formeaz mai multe categorii de compui care includ, pe lng constituenii structurali ai celulei, enzime intrai extracelulare, produi finali de metabolism precum i o serie de produi cu importan practic deosebit incluznd metaboliii primari i pe cei secundari. Metaboliii primari sunt compui cu greutate molecular n general mic, reprezentnd produi intermediari sau finali ai metabolismului intermediar necesari microorganismului productor i care includ : aminoacizi, acizi organici, nucleotide, vitamine, enzime etc (Zarnea, 1984). Aceti compui sunt sintetizai n cursul trofofazei (perioadei de multiplicare rapid i acumulare de biomas celular), n medii bogate n substane nutritive i condiii fizice corespunztoare. Dup aceast etap urmeaz idiofaza n cursul creia creterea i multiplicarea nceteaz dar celulele rmn metabolic active sintetiznd o categorie special de substane cu structur chimic variat, denumite metabolii secundari. Numrul metaboliilor secundari este foarte mare iar efectele lor sunt de asemenea foarte variate. Diversitatea neobinuit a efectelor farmacodinamice i a structurii lor chimice este ilustrat de numeroasele clase de compui organici la care pot aparine i care includ: glucide aminate, chinone, cumarine, epoxizi, alcaloizi, glicozide, derivai indolici, lactione, macrolide, naftalene, nucleozide, terpenoizi i tetracicline (Berdy, 1974). Sinteza metaboliilor secundari se face printr-o mai mare varietate de ci dect aceea a metaboliilor primari, pe seama compuilor cu greutate molecular mic folosii n timpul creterii exponeniale pentru sinteza constituenilor celulari normali i este rezultatul acumulrii n mediu a unor substane cu rol de inductor. De asemenea, declanarea sintezei metaboliilor secundari se poate datora i epuizrii unor substane cu funcie de represor (Vining, 1990). In contrast cu diversitatea cilor de biosintez i a produilor finali, cei mai muli dintre metaboliii secundari sunt asamblai pornind de la civa metabolii cheie. In plus, spre deosebire de metabolismul primar n care procesele de biosintez se desfoar ntotdeauna cu mare specificitate (se utilizeaz un singur substrat i rezult un singur produs), n metabolismul secundar proporia fiecrui component depinde de factori genetici i de mediu, probabil datorit specificitii sczute a enzimelor implicate n desfurarea sa. Majoritatea metaboliilor secundari au aciuni antibiotice dar exist i compui cu aciuni diferite. In general ei au mrime redus chiar dac nu sunt monomeri ci oligomeri; ei sunt de obicei excretai n mediul extern fie sub form solubil n ap fie ca produi insolubili care formeaz agregate amorfe sau cristaline asociate cu celulele productoare (Vining, 1990).
124
1. Functiile
metabolitilor secundari produi de bacili i streptomicete
1.1. Activitatea antibiotic a metaboliilor secundari Printre bacterii, actinomicetele i n special cele din genul Streptomyces sunt cunoscute ca fiind principalii productori de antibiotice, sintetiznd 3/4 dintre toi produii cunoscui de acest tip. Antibioticele produse de streptomicete au structur chimic variat putnd fi clasificate n diferite tipuri n timp ce compuii cu funcii similare elaborai de bacteriile din genul Bacillus sau din alte grupe (bacterii lactice, enterobacterii, Pseudomonas sp.) sunt n majoritate peptide sau peptide modificate. Membrii genului Bacillus (Figura 2) sunt capabili s produc antibiotice ca metabolii secundari n faza de cretere logaritmic trzie sau la nceputul fazei staionare. Au fost semnalai mai mult de 169 de astfel de metabolii. De exemplu, B subtilis poate produce 68 tipuri de antibiotice, n timp ce la B.brevis au fost identificate numai 23 asemenea tipuri de substane.(Katz i Demain 1987).
Figura 2. Aspect electronomicroscopic al celulelor de Bacillus subtilis (dup Zarnea, 1984).
Multe dintre antibioticele produse de bacili sunt active mpotriva bacteriilor Gram pozitive, dar exist i excepii. Aa cum s-a menionat deja, majoritatea antibioticelor produse de bacili sunt peptide, dar unele aparin altor clase de compui chimici (de exemplu, leutirosin este o amiloglicozid, iar protacin este o trien fosforic). Exist o controvers n ceea ce privete funcia acestor antibiotice la bacteriile din genul Bacillus. Ele apar, de obicei, n timpul sporutrii, de aceea se crede c antibioticele respective constituie un factor important ce apare la tranziia de la starea vegetativ la spori (Katz i Demain,1987). Multe dintre tulpinile de bacili productoare de compui cu aciune antimicrobian au fost supuse unor analize speciale de cartare molecular, de identificare i clonare a genelor codificate. Datele obinute pn n prezent sunt prezentate n Tabelul 1. Metaboliii secundari datoreaz activitatea antibiotic capacitii lor de a inhiba procesele metabolice primare. Cei mai muli acioneaz ca antimetabolii deoarece asemnarea lor funcional cu metaboliii normali le permite legarea la situsuri int i s interfere cu activitatea normal. Produii generai de o anumit cale metabolic inhib de obicei o alt cale metabolic, activitatea lor depinznd n ntregime de configuraia antibioticului i de distribuia gruprilor funcionale la nivelul lor.
125
Tabelul 1. Substane antibiotice produse de bacteriile genului Bacillus Specie Antibiotic Aciune inhibitoare Harta genetic Subtilin Bacterii Gram + + B.subtilis Surfactin + Bacilysin Bacterii Gram + + Difficidin Spectru larg de aciune Oxydificidin Spectru larg de aciune Bacillomycin F Antifungic Mycobacillin Antifungic Iturin Antifungic Gramicidin S Bacterii Gram + + B. brevis Tyrocidin Bacterii Gram + + B. licheniformis Bacitracin Bacterii Gram + + Proticin Pumilin Bacterii Gram + B. pumilus Tetain Bacterii Gram + Esperin Bacterii Gram + B. mesentericus Polymyxin Bacterii Gram B. polymyxa Colistin Bacterii Gram Octopytin Bacterii Gram + B.tyaminoliticus Baciphelecin Bacterii Gram + Circulin Bacterii Gram B. circulans Butirosin Bacterii Gram + Laterospuramine Bacterii Gram + B.laterosporus Laterosporin Biorin Bacterii Gram + B. cereus Cerexin
Gene clonate + + + + -
Deoarece nu exist o corelaie strict ntre intele antibioticului i cile metabolice n care el este format, este riscant s se spun c toi metaboliii secundari manifest o anumit activitate biologic, mai ales dac inem cont de faptul c de multe ori aceti compui au semnificaie numai pentru om i mai puin pentru organismul productor. Dei cercetrile asupra utilitii medicale a antibioticelor s-au referit n special la activitatea antibacterian, n prezent sunt studiate aciunile unor asemenea substane i asupra unor alte tipuri de celule, eucariote. Un exemplu n acest sens l constituie monensinul, identificat iniial n culturi de Streptomyces cinnamonensis i care n prezent este utilizat pe scar larg ca i coccidiostatic sau ca stimulator al creterii animalelor (Vining, 1990). O problem care se pune n cazul producerii de substane antibiotice este aceea a modalitilor n care bacteriile productoare rezist la aciunea acestor substane care de obicei inhib creterea sau alte procese biochimice eseniale. Pentru a elimina efectul de inhibare a creterii, bacteriile productoare pot prezenta mai multe mecanisme de rezisten: modificarea situsului int al antibioticului, modificarea permeabilitii membranare sau inactivarea metabolitului toxic (Cundliffe, 1989). Deoarece antibioticele sunt rapid eliminate n exteriorul celulei pe msur ce el este produs, inactivarea celular nu afecteaz eficiena produsului extracelular. Un studiu efectuat asupra rezistenei la antibiotice a tulpinilor bacteriene sensibile ("int") a evideniat faptul c antibioticele excretate n mediu i care acioneaz n vecintatea organismului productor au semnificaia unor factori implicai n competiia pentru resurse.
126
Rezistena la antibioticele obinute a fost observat la multe tulpini bacteriene de colecie, izolate nainte de introducerea acestor antibiotice n practica medical ceea ce sugereaz ideea c populatiile bacteriene vin n contact cu asemenea compui n mediul lor natural de via. De asemenea, unii metabolii toxici chiar dac nu au o valoare antibiotic mare, ei pot potena activitatea altor antibiotice fa de care s-a instalat rezistena la numeroase tulpini bacteriene. Acesta este cazul acidului clavulanic produs de tulpini de S.clavuligerus care are o slab activitate antibiotic dar care determin o sporire a aciunii unor antibiotice -lactamice cum este cefamicinul prin inhibarea -lactamazelor pro-duse de tulpina bacterian int. Antibioticele descoperite pn n prezent i utilizate mai mult sau mai puin intens n practica medical pot fi clasificate innd cont de diferite criterii: modul de aciune, natura chimic, spectru de aciune etc. O abordare recent a structurii unor antibiotice consider c acestea, alturi de un numr mare de metabolii sintetizai att de ctre bacterii ct i de fungi sau plante, pot fi grupate ntr-o familie de compui denumii poliketide (Hopwood i Sherman 1990). Toi aceti compui au n comun prezena unor grupri keto la nivelul unor atomi de carbon foarte variai ca poziie n molecula respectiv. Printre compuii inclui n aceast familie menionm: tetraciclinele, antraciclinele, eritromicina, rifamicinele, granaticinul, avermectinul (toate sintetizate de ctre streptomicete), aurantininul (sintetizat de Bacillus sp.) mupirocin (elaborat de Pseudomonas sp.) precum i ale substane elaborate de celule eucariote: micotoxine, flavonoizi, fitoalexine etc. 1.1.1. Antibiotice care inhib sinteza peretelui celular Dup descoperirea penicilinei de ctre Fleming n 1929, un numr mare de antibiotice nrudite cu aceasta au fost izolate, ele avnd n comun structura chimic (sunt -lactami) i modul de aciune (inhibarea sintezei peretelui celular bacterian). Dei penicilinele au fost descoperite ca fiind produse de ctre fungi, s-a dovedit c asemenea antibiotice pot fi sintetizate i de ctre unele specii de streptomicete cum ar fi: S.clavuligerus, S.lipmanii, S.lactamgens, S.cattleya (Martin i Liras, 1989; Matsushima i Baltz, 1989; Srinivasan i colab.,1991). Pe lng antibioticele -lactamice au mai fost izolai i caracterizai i ali compui care afecteaz funciile membranei plasmatice. Un exemplu l constituie nistatinul, antifungic produs de unele specii ale genului Streptomyces. Un alt grup este reprezentat de polimixine, bacitracine i gramicidine, antibiotice polipeptidice produse de bacterii aparinnd genului Bacillus (B.polymixa, B.licheniformis, B.brevis). Aceti compui determin creterea permeabilitii membranei plasmatice ceea ce are drept consecin ieirea masiv a unor aminoacizi sau a unor derivai purinici i pirimidinici din bacterie, conducnd n final la moartea celulei. De asemenea, bacitracina acioneaz asupra sintezei peretelui celular, determinnd inhibarea biosintezei peptidoglicanului unor bacterii Gram negative. 1.1.2. Antibiotice care inhib sinteza proteinelor Dintre antibioticele care afecteaz sinteza proteinelor, un loc important este ocupat de aminoglicozide, tetracicline i cloramfenicol, toate cele trei grupe fiind sintetizate de specii ale genului Streptomyces.. Aminoglicozidele reprezint un grup foarte important de antibiotice care au drept component principal unele glucide aminate. Primul antibiotic din acest grup care a fost descoperit n 1944 este streptomicina produs de S.griseus, dup care au fost izolate numeroase alte aminoglicozide de la bacterii aparinnd n principal genurilor Streptomyces i Micromonospora: gentamicina produs de specii de Micromonospora, neomicina produs de S.fradiae, ribostamicina produs de S.ribosidificus, kanamicina sintetizat de tulpini de S.kanamyceticus, butirozina produs de B.circulans etc.(Okuda i Ito, 1982).
127
Aminoglicozidele sunt antibiotice cu spectru larg de aciune utilizate de obicei pentru tratarea unor infecii produse de tulpini de E.coli, Klebsiella sp., Proteus sp., Enterobacter sp. Mecanismul prin care aceste antibiotice omoar celulele sensibile nu este pe deplin elucidat. Exist numeroase date experimentale care evideniaz c situsul primar de aciune al acestor antibiotice ar fi ribosomii, ceea ce determin afectarea sintezei proteinelor. Efectele pleiotropice ale aminoglicozidelor asupra bacteriilor sunt considerate a fi consecina interaciunii lor cu ribosomii. Alturi de interferena cu sinteza proteic, aminoglicozidele induc distrugeri ale membranei plasmatice, afecteaz respiraia celular, acumularea de ARN i determin n final moartea celulelor. In ceea ce privete mecanismul rezistenei bacteriilor productoare la aciunea acestor antibiotice s-a evideniat faptul c acestea prezint strategii diferite cum ar fi producerea unor enzime ce inactiveaz antibioticul sau modificarea situsului de aciune al acestuia (Cundliffe, 1989). Spre exemplu, bacteriile productoare de aminoglicozide sintetizeaz n acelai timp i enzime ce modific antibioticele respective: aminoglicozid-fosfotransferaza (APH) i acetiltransferaza (AAC). De asemenea, bacteriile respective (S..kanamyceticus, S.tenebrarius) pot produce simultan i enzime ce modific unele situsuri de aciune ale antibioticului (de exemplu, situsurile ribosomale) prin metilarea ARNr. Tetraciclinele reprezint un grup destul de heterogen de antibiotice produse n special de bacterii din genul Streptomyces ele avnd n comun o structur chimic de baz dar variind n funcie de gruprile chimice care se leag de aceast structur: oxitetraciclina (produs de S.rimosus), tetraciclina (produs de S. viridofaciens), clortetraciclina (sintetizat de S.aureofaciens). Tetraciclinele prezint un spectru destul de larg de aciune fiind bacteriostatice pentru diferite bacterii Gram pozitive i Gram negative (cu excepia tulpinilor de Salmonella, Proteus i Pseudomonas) i bactericide n concentraii mari. Tinta principal de aciune a acestor antibiotice este sinteza proteic, ele neavnd efecte evidente asupra ADN, ARN sau asupra sintezei peretelui celular. Modalitatea exact a legrii tetraciclinelor la ribosomi nu este nc pe deplin cunoscut. Se pare c ele se leag puternic de subunitatea 70S a ribosomilor ceea ce determin efectul inhibitor al antibioticelor. De asemenea, tetraciclina se leag slab de subunitatea 30S ceea ce are drept consecin blocarea legrii aminoacil-ARNt la aceast subunitate i deci a alungirii lanurilor polipeptidice. Autorezistena bacteriilor productoare poate include modificarea situsurilor int normale, inactivarea intracelular a antibioticului sau eliminarea sa rapid din celul (Cundliffe, 1989). Cloramfenicolul este un antibiotic cu spectru destul de larg de aciune, el fiind izolat n 1947 din filtrat de cultur de S.venezuelae. Aciunea cloramfenicolului const n mpiedicarea ARNm s se lege la ribosomi ceea ce se concretizeaz prin inhibarea sintezei proteice (a formrii legturilor peptidice) (Pongs, 1979). 1.1.3. Antibiotice care inhib replicarea i transcrierea informaiei genetice Dintre antibioticele care mpiedic replicarea ADN i sinteza ARNm menionm novobiocina, coumermicina i rifamicinele. Novobiocina este un antibiotic cu o structur complex produs de S.sphaeroides cu efect, de obicei, bacteriostatic asupra bacteriilor, mai ales n mediu acid. Similar ca aciune este coumermicina A, un antibiotic izolat din culturi de S.rishinensis i S.hazeliensis. La concentraii mai mici de novobiocin i cumermicin A este afectat doar replicarea ADN din celulele sensibile, nu i procesul de transcriere. Cele dou antibiotice pot afecta aciunea ADN girazei, enzim ce determin suprarsuciri ale moleculei de ADN, ceea ce explic inhibarea replicrii i transcrierii informaiei genetice (Ryan, 1979). Rezistena la novobiocin a bacteriei productoare S.sphaeroides este determinat de gena gyrB al crei produs, ADN giraza B este rezistent la aciunea acestui antibiotic (Cundliffe, 1989). Rifamicinele, avnd ca reprezentat tipic rifampicina reprezint un grup de antibiotice macrociclice care acioneaz, n special, asupra micobacteriilor i bacteriilor Gram pozitive.
128
Mecanismul lor de aciune se refer la inhibarea procesului de transcriere a informaiei genetice prin blocarea aciunii enzimei ARN-polimeraza. Un alt antibiotic cu aciune inhibitoare asupra acizilor nucleici este granaticinul, antibiotic de tip quinonic, izolat din culturi de S.olivaceus i S.violaceoruber. Aciunea sa in vitro se manifest, att la procariote ct i la eucariote, asupra sintezei de ADN, ARN, dar i de proteine. De aceea, granaticinul are efect antitumoral, mpotriva leucemiei P388 i efect citotoxic pentru celulele KB (Ogilvie i Kersten, 1979). 1.2. Aciuni asupra celulelor animale Numeroase substane antibiotice nu au fost utilizate n practica medical datorit aciunii lor toxice asupra celulelor animale. Acest efect toxic rezult din aciunea direct asupra uneia dintre cile metabolismului primar, ci care sunt universale, de obicei, asupra producerii de energie sau exprimrii genelor. Totui, toxicitatea asupra celulelor animale nu rezult ntotdeauna din inhibarea aceleiai reacii care este int la microorganisme. Spre exemplu, amfomicina care interfer cu transportul membranar al intermediarilor mureinei la bacterii, la celulele eucariote determin o blocare a glicozilrii. Unele antibiotice care au evideniat o activitate de inhibare a creterii mai multor tipuri de organisme au nceput s fie utilizate ca substane antitumorale datorit toxicitii lor asupra celulelor ce prolifereaz rapid. Printre aceste substane, un loc important l ocup antraciclinele i bleomicina substane care sunt produse de specii ale genului Streptomyces (Tsukagoshi i colab.,1986). Descoperite iniial ca ageni antibacterieni, s-a dovedit ulterior c cele dou familii de substane se leag specific, prin intercalare, la moleculele de ADN iar bleomicina, n plus, poate determina scindarea catenelor de ADN. Citotoxicitatea selectiv a bleomicinei rezult din scderea activitii unei enzime de inactivare din celulele tumorale. Un alt tip de produi antimicrobieni sau inhibitori enzimatici cu activitate antitumoral este reprezentat de proteine de dimensiuni mici, cum ar fi: macromicinul, actinoxantinul, forfenicin sau bestatin, ce conin o grupare prostetic cromofor ce se intercaleaz n macromoleculele de ADN, modificndu-le structura(Aoyagi i colab.,1978). Unii metabolii secundari manifest aciune farmacologic specificp asupra animalelor; n acest caz ei nu prezint o citotoxicitate general, dar aciunea lor farmacologic i poate face uneori extrem de toxici. Un exemplu l constituie aciunea vasodilatatoare a unui compus (WS 1228A, B) izolat de la S. aureofaciens care ns nu este nsoit i de toxicitate sau activitate antibiotic. Un alt compus, MY-336a, izolat din culturi de S. gabonae exercit aciune antagonic cu receptorii -adrenergici, avnd deci o aciune farmacologic selectiv, netoxic (Kase, 1986). In cazul amicourmamicinei A izolate de la B. pumilis s-a evideniat iniial o aciune antibiotic, dup care s-a dovedit a avea i o activitate antiinflamatorie asupra animalelor testate (Itoh i colab., 1981). De asemenea, printre substanele izolate iniial n experimentele de screening pentru activitatea antibiotic au fost descoperite unele care au aciune de modulare a rspunsului imun. Spre exemplu, substana IC201 izolat de la S.cirratus i S fimbriatus ca agent antitumoral, s-a dovedit a avea aciune activatoare i asupra macrofagelor. Un alt compus, macrolidul FK 506 izolat de la S.tsukubaensis n cursul unor experimente de selecie a unor substane care s inhibe producerea de interleukin-2 s-a dovedit a avea aciune imunosupresoare. 1.2.1. Activitate insecticid S-a evideniat c numeroi metabolii secundari produi de streptomicete n special au aciune insecticid. Unii dintre ei, cum ar fi unele antibiotice macrolidice polienice, blocheaz respiraia celular sau inhib sinteza proteic la eucariote, fiind astfel ageni nespecifici. Ali metabolii secundari, de tipul nikamicinei au aciune specific inhibnd chitin-sintetaza i deci
129
acioneaz asupra peretelui celular chitinos al insectelor. Un alt antibiotic, mibelmicina produs de S. hygroscopicus subsp. aureolacrimosus, nu are efect antibacterian dar acioneaz selectiv asupra insectelor avnd n plus i efect antihelmintic i acaricid. Intr-un studiu recent, Fabre i colab.(1988) au izolat n urma unui complex proces de selecie realizat asupra a 6280 de culturi de actinomicete, o nou substan cu aciune insecticid. O important aciune insecticid este datorat biosintezei de ctre unele tulpini bacteriene a chitinazei care acioneaz direct asupra nveliurilor insectelor patogene. 1.3. Activitate asupra celulelor vegetale Unii metabolii secundari produi de bacteriile din genul Streptomyces au aciune fitotoxic i uneori antifungic. Spre exemplu, herbicidinele produse de S.sagonensis sunt nucleozide cu aciune fitotoxic pentru plantele dicotiledonate. Ele inhib, de asemenea, i dezvoltarea fungilor. Alte substane, cum ar fi herbimicinele produse de S.hygroscopicus au o foarte slab activitate antibiotic, n schimb sunt toxice pentru celulele vegetale. In plus, herbimicina A inhib dezvoltarea virusului mozaicului tutunului i are aciune antitumoral pentru celulele animale (Yamashita i colab., 1989). O alt substan, homoalanozina, produs de S. galileus este un antimetabolit al acidului aspartic i acidului glutamic, ea exercitnd aciune insecticid i herbicid (Fushimi i altii,1989). De asemenea, numeroi cercettori (Backman 1995, Baker 1985, Bachow 1995) au publicat date referitoare la capacitatea unor specii aparinnd genului Bacillus de a inhiba dezvoltarea unor ciuperci fitopatogene (Tabelul 1). In majoritatea cazurilor combaterea biologic a fungilor fitopatogeni implic folosirea factorilor biotici existeni n mediul plantelor. Studiile efectuate pn n prezent au evideniat capacitatea unor tulpini de Bacillus subtilis de a combate diferite ciuperci fitopatogene, cum ar fi : Macrophomina phaseolina patogen la mazre (Siddiqui 1995), Rhizoctomia solani - patogen la mazre (Bochow 1994), fasole i semine de gru (Lazzareti 1994), Fusarium oxysporum i Phytyum ultinacere patogeni la tomate (Sadders 1996). Cele mai frecvente specii ale genului Bacillus care au prezentat capacitatea de a preveni i combate evoluia unor boli determinate de ciuperci fitopatogene sunt: Bacillus subtilis (Figura 3), Bacillus licheniformis, Bacillus polymyxa, Bacillus cereus.
Figura 3. Aciunea inhibitoare a tulpinii B.subtilis B2 asupra fitopatogenului Sclerotinia sclerotiorum.
Studiile privind oportunitatea utilizrii acestor specii bacteriene n combaterea biologic s-au bazat pe proprietatea de a produce spori cu nalt rezisten i longevitate n condiii naturale de mediu, acesta determinnd posibilitatea obinerii i comercializrii lor ntr-o manier similar cu fungicidele chimice. In lupta pentru nutrieni microorganismele au la dispoziie un ntreg arsenal de compui chimici care inhib organismele competitive. Muli din aceti compui au origine
130
peptidic i pot fi sintetizai ribozomal sau neribozomal. Multe dintre tulpinile de Bacillus subtilis produc o serie de substane de natur lipooligopeptidic din gama iturinului, care au activitate antifungic, hemolitic precum i proprieti antibiotice. Structura chimic a acestor substane a fost determinat prin diverse metode (spectrometrie de mas (MS), gel cromatografie, cromatografie n strat subire (TLC), lichid cromatografie (HPLC)). Componenta proteic a acestor substane este reprezentat de oligopeptide alctuite din apte aminoacizi, iar componenta lipidic conine acizi grai cu catena carbonic lung (C14-C16). Astfel, iturin AL conine o heptapeptid (2 D-Asp, 1 L-Asp, 1 L-Glu, 1 L-Pro, 1 LSer, 1 D-Tir) i un amestec de -amino acizi grai cu caten lung C14-C16. Iturin D i iturin E conin o heptapeptid (3 Asp, 1 Glu, 1 Pro, 1 Ser, 1 Tyr) i un amestec de -amino acizi grai cu caten C14-C16, diferind de iturin A prin prezena unei grupri carboxil la iturin D i o grupare carboximetil la iturin E. Mycosubtilin, o substan din gama iturinului, conine o heptapeptid ciclic (Asn, Tyr, Asn, Gln, Pro, Ser, Asn) legat de un -amino acid gras. Tot din gama iturinului fac parte surfactinul i fengycinul care conin un -hidroxiacid gras i bacillomycinul care conine un -amino acid gras. Studii mai intense au fost efectuate cu o substan produs de mai multe specii de Streptomyces (S. hygroscopicus, S. viridochromogenes) i care a primit denumirea de bialafos (fosfinotricin-alanil-alanina). Aceasta substan a fost iniial selectat pentru activitatea sa antibiotic dup care s-a observat c ea are, de fapt, o aciune mult mai complex. Componentul activ al bialafosului este fosfinotricinul care inhib glutamin-sintetaza din celulele vegetale, ceea ce i confer bialafosului o puternic aciune herbicid (Lea i colab., 1984). Muli dintre metaboliii secundari produi de diverse microorganisme au fost testai pentru eventuala lor aciune asupra unor enzime. Atunci cnd sistemul test a inclus enzime cheie n procesele farmacologice de la animale, numeroi metabolii secundari au fost detectai ca avnd activiti fiziologice "in vivo". Muli dintre aceti compui au fost descoperii a fi inhibitori proteazici, acionnd asupra pepsinei, papainei, tripsinei, chimiotripsinei, catepsinei, elastazelor, aminopeptidazei B i leucin-aminopeptidazei (Umezawa, 1982). Printre inhibitorii proteazici izolai de la actinomicete unii acioneaz asupra reninei sau asupra unei zinc-exopeptidaze care convertete angiotensina I n angiotensin II. Cercetrile efectuate asupra culturilor microbiene au permis izolarea unor inhibitori i ai altor enzime. Acesta este cazul inhibitorilor pentru glucozidaze (Muller, 1986), pentru cAMP (reticulol), pentru kinaze etc. 2. Determinismul
genetic al biosintezei unor antibiotice si a altor metaboliti secundari
In urma experimentelor de cartare a genelor implicate n metabolismul secundar la procariote s-a evideniat faptul c acestea sunt grupate formnd "clusteri". Localizarea acestor gene este, n majoritatea cazurilor, cromosomal dar, exist cazuri cnd acestea sunt localizate pe plasmide (Hopwood, 1978; Kinashi i colab.,1987). Spre exemplu, genele implicate n sinteza oxitetraciclinei de ctre S.rimosus sunt grupate n doi "clusteri" cromosomali (Binnie i colab., 1989). La fel i genele care determin sinteza actinorhodinului i undecilprodigiozinului de ctre tulpini de S. coelicolor (Rudd i Hopwood, 1979), a eritromicinei de ctre Saccharopolyspora erythraea (Weber i altii, 1985) sau avermectinei de ctre Streptromyces avermectilis (Ikeda i colab., 1987). In plus, evidenierea faptului c aceste grupuri de gene includ i elemente reglatoare ca i determinani genetici de rezisten la produsul antibiotic respectiv sugereaz existena unui sistem foarte bine organizat, cu funcionare complex. Nu este ns stabilit cu exactitate dac aceast organizare a genelor exist i n cazul altor metabolii secundari, fr
131
activitate antibiotic, cum ar fi unii pigmeni, alcaloizi, reglatori ai celulei vegetale etc. (Martin i Liras, 1989). In ceea ce privete localizarea plasmidial a unor gene implicate n biosinteza unor antibiotice, datele referitoare la acest aspect sunt mai puine. Un exemplu l constituie genele pentru biosinteza metilenomicinei care se gsesc plasate pe plasmida SCP1 de la S. coelicolor (Wright i Hopwood, 1978; Chater i Bruton, 1985). De asemenea, de la bacteriile din genul Streptomyces au fost izolate o serie de plasmide lineare cu dimensiuni variate, ntre 5,4-17 Kb pn la 350-520 Kb (Chardon-Loriaux, 1985; Kinashi i colab., 1987). Evidenierea plasmidelor lineare uriae la ase tulpini de Streptomyces productoare de antibiotice i examinarea corelaiei dintre prezena lor i sinteza de antibiotice a dus la concluzia c, cel puin n cazul metilenomicinei, genele implicate n sinteza sa sunt plasate pe aceste plasmide care reprezint aproximativ 5 % din cantitatea total de ADN celular. Sunt ns necesare studii suplimentare pentru a stabili dac i n alte cazuri genele care determin sinteza unor antibiotice sunt localizate pe plasmide similare. 2.1. Organizarea i exprimarea genelor pentru unii metabolii secundari sintetiza i de specii de Bacillus Cea mai mare parte a metaboliilor secundari produi de bacteriile din genul Bacillus sunt homo- sau heteropeptide. Spre exemplu, gramicidina S este un decapeptid ciclic format din dou uniti de D-Phe-L-Pro-L-Val-L-Orn-L-Leu, fiind produs de tulpini de B. brevis, ca de altfel i tirocidinele. Familia bacitracinelor cuprinde peptide alctuite din 12 aminoacizi, produse de tulpini de B. licheniformis. Studiile cu extracte celulare au evideniat c aminoacizii constitueni ai acestor compui sunt activai i legai n subunitile respective de ctre mai multe tipuri de peptid-sintetaze (Kleinkauf i Van Dohren, 1987). Experimentele de clonare n E. coli a genelor pentru sinteza gramicidinei i tirocidinei au evideniat faptul c n cazul tirocidinei sunt implicate trei enzime multifuncionale, n timp ce la producerea gramicidinei S particip cel puin 2 sintetaze (GS1 i GS2) codificate de dou gene diferite grsA i grsB. 2.2. Organizarea i exprimarea genelor pentru unele antibiotice sintetizate de bacteriile din genul Streptomyces In cazul streptomicetelor au fost evideniai numeroi metabolii secundari, dar numai puini au o structur peptidic. Unul dintre acetia, bialafosul prezint importan practic deosebit, deoarece manifest activitate herbicid. Recent, Nakajima i colaboratorii (1991) au izolat de la S.hygroscopicus un nou compus cu activitate herbicid, care a primit denumirea de hidantocidin. Bialafosul, care a fost mai intens studiat, este sintetizat pornind de la piruvat sau fosfoenolpiruvat, printr-o cale metabolic care cuprinde cel puin 13 etape (Thompson i Anzai, 1987). Experimentele de clonare cu genele implicate n sinteza acestui compus au evideniat faptul c n acest proces sunt implicate mai multe gene (cel puin 7) grupate, alturi de care se afl i gena pentru rezistena la bialafos (bar). Astfel, au fost obinute dou grupe de clone derivate de la mutante neproductoare i care au fost transformate cu plasmida pIJ61 recombinant (coninea diferite gene de la S.hygroscopicus). Un grup de asemenea plasmide recombinante restabilete productivitatea mutantelor care prezint modificri ale etapelor 5, 6, 12 i 13 ale cii metabolice, n timp ce un alt grup restabilea producerea de bialafos de ctre mutantele blocate la nivelul etapelor 1, 3 i 4. In plus, a fost realizat transferul unui segment de 16 Kb, care restabilea productivitatea tuturor celor 7 tipuri de mutante. Acest segment de ADN coninea i gena bar care, de altfel, a permis i identificarea clonelor transformate. Totui, acest fragment nu determin o producie semnificativ de bialafos la mutantele neproductoare, ceea
132
ce sugereaz existena unor gene suplimentare aflate n afara segmentului de 16 Kb, necesare exprimrii complete a operonului pentru sinteza bialafosului. De asemenea, n urma experimentelor de clonare a genelor bar (de rezisten la bialafos) n diferite celule gazd, inclusiv n celulele vegetale s-a evideniat faptul c pentru funcionarea normal a genelor pentru biosinteza bialafosului sunt necesare nc trei gene diferite care determin adenilarea la diferite etape ale biosintezei. Aceste noi date conduc la presupunerea c genele implicate n biosinteza acestui compus se gsesc localizate la nivelul unui fragment de ADN de peste 34 Kb. Experimentele lui Anzai si ale colaboratorilor (1987) au evideniat faptul c prin clonarea unui fragment de ADN de 5,9 Kb, care conine gena brpA are loc activarea transcrierii att a genei bar ct i a cel puin altor 6 gene structurale bap. De asemenea, aceti autori au artat c att la S.viridochromogenes, ct i la S. hygroscopicus organizarea genetic a genelor implicate n sinteza bialafosului este identic. Un alt grup de metabolii secundari peptidici, actinomicinele (cromopeptide) este sintetizat n urma aciunii unei enzime, fenoxazinon-sintetaza (PHS). Prin clonarea genei pentru PHS de la S. antibioticus n S. lividans (Jones i Hopwood, 1984) s-au obinut mai multe tipuri de clone: unele care conineau gena structural pentru PHS, iar altele care prezentau activitate PHS, dar care a rezultat n urma activrii unei gene "tcute" (silent gene) endogene de ctre fragmentul de ADN exogen transformant. Fenomenul este frecvent ntlnit n cazul streptomicetelor, el fiind semnalat i n cazul tulpinilor productoare de ali metabolii secundari. Un exemplu l constituie clonarea genelor pentru producerea cefamicinei de la S.cattleya la S.lividans, clonele productoare rezultnd n urma activrii unor gene endogene silenioase (Martin i Liras, 1989). Muli dintre metaboliii secundari produi de streptomicete au o structur de tip macrolidic n care inelul macrociclic derivat de la poliketide este nchis printr-o legtur lactonic. La acest inel macrociclic sunt, de obicei, ataate glucide bazice sau neutre. Spre exemplu, eritromicina produs de Saccharopolyspora erythraea (Streptomyces erythraeus) conine un inel lactonic (eritronolid) i 2 glucide specifice, dezozamina i cladinoza, sinteza sa realizndu-se n aproximativ 30 etape enzimatice Prin clonarea n S.lividans a unor fragmente de ADN cromosomal izolate de la tulpini de S.erythraea productoare de eritromicin s-a stabilit c trei dintre genele implicate n biosinteza antibioticului, eryA, eryB i eryC sunt grupate i localizate ntr-o unic regiune a cromosomului bacteriei productoare. Utiliznd un vector de clonare integrativ (care se poate integra n cromosomul gazdei) s-a stabilit c alturi de genele care determin sinteza antibioticului se afl i gena pentru rezistena la eritromicin, ermE (gen care determin sinteza unei metilaze pentru ARNr) (Stanzak i colab., 1986). De asemenea, Mc Alpine i colab. (1987) au comunicat obinerea unui antibiotic hibrid care a primit denumirea de 2-noreritromicin, n urma clonrii ntr-o mutant de S.erythraea, care avea blocat ultima etap a sintezei eritromicinei a unui fragment de ADN de 30-35 Kb izolat de la S.antibioticus productor de oleandomicin. Un alt antibiotic, tilozina produs de tulpini de S.fradiae prezint o structur chimic asemntoare eritromicinei, avnd un inel macrociclic, tilanolid i trei glucide mai puin rspndite: micaminoza, micaroza i micinoza. Studiile referitoare la organizarea genelor implicate n sinteza acestui antibiotic au evideniat faptul c genele tyl (aproximativ 9 gene) sunt grupate, alturi de ele aflndu-se i gena de rezisten (tlrB), precum i o secven de ADN amplificabil flancat de 2 secvene repetate direct (Baltz i Seno, 1988). De asemenea, s-a stabilit c pentru exprimarea genei tylF, care codific enzima ce controleaz ultima etap a cii metabolice de sintez a antibioticului este necesar o protein reglatoare (efector pozitiv) produs de gena tylG. O situaie asemntoare prezint i genele care codific sinteza carbomicinei i rezistena la acest antibiotic (Martin i Liras, 1989).
133
Un alt grup de antibiotice derivate de la poliketide este reprezentat de tetracicline i antracicline, antibiotice intens studiate datorit importanei lor practice deosebite. In urma examinrii mai multor tipuri de mutante incapabile de a sintetiza oxitetraciclina s-a dovedit c genele care codific producerea acestui antibiotic se afl localizate n dou grupe plasate opus pe cromosomul bacterian. Prin clonarea n S.griseus a unor fragmente de ADN izolate de la S.rimosus s-a reuit identificarea a dou gene responsabile de rezistena la tetraciclin (Ohnuki i colab., 1985): gena tetA care codific un polipeptid care interfer cu sinteza proteinelor la nivel ribosomal i gena tetB care determin o acumulare intracelular redus a antibioticului n celulele productoare. Nu este, ns, clar dac aceste gene se afl localizate la nivelul celor dou grupuri de gene sau au o alt dispunere. Au mai fost clonate i alte gene de rezisten la tetraciclin, otcRI i otcRII, dar nu s-a stabilit nc dac aceste gene sunt sau nu identice cu cele anterioare. Recent, Butler i colab. (1989) i Binnie i colab. (1989), au realizat o serie de clonri a unor gene implicate n sinteza i rezistena la acest antibiotic i au sugerat faptul c cel puin o parte, dac nu chiar toate genele structurale care codific sinteza oxitetraciclinei sunt linkate cu genele de rezisten otcRI i otcRII, formnd, astfel, un singur "cluster". O grupare asemntoare prezint i genele implicate n biosinteza/rezistena tetracenomicinei C, un antibiotic antraciclinic produs de S.glaucescens. Aminoglicozidele reprezint un alt grup de antibiotice intens studiat datorit importanei practice deosebite. Din acest grup streptomicinei i s-a acordat cea mai mare atenie. Astfel, la S.griseus, cel mai cunoscut productor al acestui antibiotic, cel puin 13 gene sunt implicate n biosinteza i rezistena la streptomicin, ele fiind localizate ntr-un singur "cluster" cromosomal (Mansouri i altii, 1989) (Figura 4).
Figura 4. Reprezentarea schematic a genelor implicate n biosinteza streptomicinei la dou specii de streptomicete: S.griseus i S.glaucescens.
Ohnuki i colaboratorii (1985) au artat c la S.griseus grupul de gene str este format din cel puin 4 gene: strR, strA, strB i strC. Gena strA codific enzima streptomicin-6'fosfotransferaza care asigur rezistena la acest antibiotic; strB complementeaz o mutaie la o tulpin care prezenta deficien n legarea streptidin-6-fosfatului de dihidrostreptoz; strR este o gen reglatoare care codific un efector pozitiv necesar exprimrii complete a genelor strA i strB. Rezultate similare au obinut Distler i colab.(1987), care au evideniat c la S.griseus genele necesare sintezei streptomicinei sunt linkate cu gena aphD care codific pentru enzima streptomicin 6-fosfotransferaza, gen similar genei sph pentru enzima hidroxi-streptomicin134
fosfotransferaza de la S.glaucescens. Analizele de restricie i studiile de hibridizare a fragmentelor de ADN de la S.griseus i S.glaucescens au relevat existena, n ciuda unei omologii de aproximativ 75 % a genelor implicate n biosinteza streptomicinei, a unor diferene majore, ceea ce sugereaz faptul c, n cursul evoluiei a avut loc o separare a genelor de biosintez n dou seturi distincte repartizate doar la speciile de Streptomyces (Martin i Liras, 1989). 2.3. Organizarea i exprimarea genelor de biosintez a unor pigmeni de ctre streptomicete Streptomicetele pot sintetiza pe lng diferite antibiotice i ali metabolii secundari, cum ar fi pigmenii, unii dintre acetia manifestnd i o uoar activitate antibiotic. Dintre acetia cel mai mult studiat este actinorhodinul, un pigment de tip izocromanequinonic, produs de S.coelicolor printr-o cale poliketidic tipic (Floss, 1981). Pigmentul respectiv produs de bacteriile cultivate pe mediul R2YE este rou i nedifuzibil la pH neutru dar, dup expunere la vapori de amoniac devine albastru i difuzibil. In urma cercetrilor efectuate pe diferite tulpini mutante de S.coelicolor s-a realizat o grupare a acestora n mai multe clase (7) n funcie de variaiile de exprimare a genelor care alctuiesc "clusterul" act. Rezultatele obinute au permis elaborarea unei ipoteze referitoare la sinteza unor metabolii secundari de tip poliketidic, innd cont de marea varietate de asemenea metabolii (macrolide, poliene, polieteri, tetracicline, antracicline, ansamicine, isocromaquinone etc). Se pare c la toi metaboliii secundari de tip poliketidic, esterii acil-CoA i -cetoacizii condenseaz mpreun printr-un mecanism de polimerizare de tip cap-coad, ceea ce conduce la obinerea unor lanuri alifatice de diferite dimensiuni. Aceste lanuri sufer, ulterior, modificri suplimentare, care le asigur specificitatea (Hopwood i Sherman, 1990). Dac reacia de condensare realizat prin intervenia unei enzime de tip -ceto-acil-tioester-sintetaza ("enzima de condensare") este comun tuturor metaboliilor secundari poliketidici, atunci ar nsemna c ntre secvenele care codific poliketid-sintetazele la diferite organisme productoare exist o mare omologie care este conservat. Pornind de la o asemenea ipotez, Malpardita i colab.(1987) au utilizat genele act de la mutantele din clasele I i III ca probe de ADN n experimentele de hibridizare i au observat c ntre acestea i ADN de la 14 dintre cei 18 productori de poliketide se produce hibridizare cu intensitate variat, deci exist omologie. Probele nu au hibridizat cu ADN izolat de la tulpinile care produc tetraciclin, eritromicin, candicidin i curamicin. Aceste rezultate demonstreaz o corelaie, incomplet, ntre producerea de poliketide i prezena de secvene de ADN care sunt parial omoloage cu actinorhodin poliketid-sintetaza. Aceast strategie de hibridizare poate fi extins prin utilizarea unor probe de ADN a unor secvene care codific diferite sintetaze izolate de la tulpini bacteriene variate, ceea ce ar permite recunoaterea unor productori criptici ai unor clase de metabolii secundari particulari. Prin alterarea specificitii de substrat a unor sintetaze specifice utiliznd mutageneza direct sau recombinarea"in vitro" a genelor care codific pentru aceste enzime pot fi obinute noi antibiotice cu proprieti speciale. Alte dou tipuri de pigmeni, metilenomicin produs de tulpini de S.coelicolor i S.violaceoruber sau undecilprodigiozin produs de S.coelicolor A3(2) au fost studiate cu o intensitate mai sczut, rezultatele obinute sugernd i n aceste cazuri o grupare a genelor implicate n biosinteza produilor respectivi (Malpardita i colab., 1990). Gruparea n "clusteri a genelor care codific ci ale metabolismului secundar reprezint un fenomen comun pentru numeroase tipuri de substane. In cazul "clusterilor" pentru sinteza tetra-cenomicinei i actinorhodinului s-a evideniat o subgrupare special a genelor componente care controleaz momentul apariiei fiecrei enzime n calea metabolic respectiv, astfel nct intermediarii apar n anumite etape ale reaciilor biochimice. Formarea secvenial a enzimelor este binecunoscut n cile de biosintez a metaboliilor secundari la fungi i streptomicete
135
(Martin i Liras, 1989). Cuplarea strns a proceselor de transcriere/traducere la streptomicete i la alte procariote, precum i faptul c genele structurale sunt grupate i ordonate permite ca enzima obinut n urma acestor fenomene s acioneze asupra produsului enzimei anterioare (Motamedi i Hutchinson, 1987). O aciune mai eficient a enzimelor poate rezulta n urma gruprii enzimelor n complexe enzimatice, fenomen ntlnit n cazul biosintezei gramicidinei,tirocidinei i bacitracinei. Poliketidele i metaboliii secundari polienici sunt formai prin aciunea unor complexe enzimatice care cuprind sintetaze specifice. 2.4. Coordonarea exprimrii genelor de biosintez i rezisten Deoarece genele implicate n biosinteza i rezistena la antibiotice sunt grupate este foarte probabil s existe o coordonare a exprimrii genelor pentru a nu produce disfuncii. Dac un metabolit secundar este activ fa de tulpina productoare, mecanismele de protecie (inactivarea antibioticului sau sporirea eliminrii lui) trebuie s fie induse naintea acumulrii metabolitului respectiv. Exist numeroase exemple referitoare la inducerea exprimrii genelor de rezisten la antibiotice la bacteriile din genul Streptomyces. Astfel, exprimarea genelor de rezisten la tetraciclin, tetA i tetB de la S.rimosus i S.griseus a fost indus de adugarea de tetraciclin n mediul de cultur (Ohnuki i colab., 1985). Nivelul rezistenei a crescut de 2 ori atunci cnd s-a mrit cantitatea de tetraciclin adugat (de la 5 la 50g/ml). Aceasta sugereaz faptul c inducerea genelor de rezisten protejeaz tulpinile productoare fa de creterea nivelului antibioticului n timpul cultivrii. Gena de rezisten la streptomicin (strA sau aphD) de la S.griseus se afl plasat alturi de genele pentru biosinteza antibioticului i se gsete sub un control dublu, pozitiv i negativ. Ea este indus de streptomicin, dar nu i de streptavidin. Exprimarea genei strA se afl sub un control negativ exercitat de o protein represor de 40 KDa codificat de o secven (ORF) plasat n apropierea acestei gene. De asemenea, ea este stimulat de produsul genei strR care activeaz n acelai timp i gena strB (gen structural care codific o amidinotransferaz) (Ohnuki i colab., 1985) (Figura 5).
Figura 5. Model ipotetic al transcrierii genelor implicate n sinteza i rezistena la streptomicin (dup Piepersberg i colab., 1988).
In mod similar, gena de rezisten la kanamicin clonat de la bacteria productoare S.kanamyceticus se exprim dup inducere n noile gazde (S.lividans, S.lavendulae sau S.parvulus) (Nakana i colab., 1984). S-a dovedit c multe dintre tulpinile de Streptomyces productoare de antibiotice prezint dou sau mai multe mecanisme de rezisten la antibioticele pe care le produc, probabil ca o modalitate de protecie fa de antibiotice nrudite. Spre exemplu, n cazul tulpinilor de
136
S.kanamyceticus exist dou mecanisme de rezisten la kanamicin: una este modificarea ribozomilor, iar cealalt presupune inactivarea antibioticului de ctre o enzim specific (6'-Nacetiltransferaza) (Nakano i colab., 1988). La S.fradiae, la o tulpin industrial au fost identificate cel puin trei gene diferite care asigur rezistena la tilozin, gene care sunt linkate la genele de biosintez. In unele situaii, enzima codificat de gena de rezisten poate ndeplini i alte funcii catalitice n cadrul cii metabolice de biosintez a antibioticului respectiv. Acesta este cazul genelor de rezisten la puromicin sau bialafos, care se pare c sunt implicate i n unele dintre etapele intermediare ale sintezei metabolitului respectiv, ceea ce nseamn c exprimarea genelor de biosintez i rezisten se afl sub acelai mecanism de reglare. 2.5. Reglarea exprimrii genelor implicate n metabolismul secundar
Metabolismul secundar este o form de difereniere biochimic a microorganismelor. Reglarea desfurrii sale este realizat prin diferite mecanisme. Astfel, factorul A este o protein reglatoare cu efecte pleiotropice care stimuleaz att biosinteza i rezistena la streptomicin, ct i sporularea la S.griseus i S.bikinensis. Au fost identificate, astfel, mai multe gene ai cror produi de transcriere controleaz diferite procese. Un exemplu este reprezentat de gena afsA ("A factor synthesis"), care a fost izolat de la S.bikinensis, i apoi clonat n diferite gazde. O alt gen, afsB a fost izolat de la S.coelicolor i s-a dovedit c ea codific o protein reglatoare care stimuleaz att producerea de factor A, ct i a unor pigmeni cum ar fi actinorhodinul i undecilprodigiozinul. O situaie interesant o prezint gena saf ("secondary metabolism-acting factor") izolat de la S.griseus, gen care este implicat ntr-un mecanism de control comun pentru diferenierea celular, pentru producerea a cel puin patru enzime extracelulare i pentru formarea de pigment (Martin i Liras, 1989). Secvena aminoacizilor pe care i conine produsul genei saf indic faptul c acesta interacioneaz cu ADN, secvena respectiv coninnd un domeniu tipic de legare la ADN. Aceasta nseamn fie c polipeptidele de legare la ADN interacioneaz specific cu secvene reglatorii ale genelor implicate n metabolismul secundar, fie c ele controleaz exprimarea genelor care determin formarea factorului A sau a altor efectori pleiotropici, influennd, astfel, exprimarea grupurilor de gene care codific enzimele metabolismului secundar. Genele implicate n biosinteza metabolismului secundar nu sunt exprimate, de obicei, n culturile cu o rat mare de cretere. Astfel, numeroase sintetaze aparinnd metabolismului secundar sunt fie inhibate fie represate de nivelul surselor de carbon, fosfor, sau azot n timpul fazei de cretere a productorilor (Martin, 1989). Un alt mecanism de coordonare a exprimrii genelor, evideniat iniial la B.subtilis, E.coli, dar i la alte bacterii, este producerea unor factori sigma sau a altor proteine care modific specificitatea ARN polimerazei, conducnd la o exprimare selectiv a unor seturi speciale de gene. Si n cazul streptomicetelor a fost evideniat o heterogenitate a ARN polimerazelor (Westpheling i col.ab, 1985). Spre exemplu, dou holoenzime de ARN polimeraz (E 35 i E 49) de la S.coelicolor recunosc doi promotori bine definii de la B.subtilis. Promotorii de la streptomicete sunt destul de variai: unii care prezint conservate regiunile -10 i -35 par a fi similari celor de la E.coli, n timp ce alii sunt complet diferii (Jansen i colab, 1985). Distana dintre cele dou regiuni conservate, -10 i -35, este un factor important al determinrii triei promotorului. Astfel, o distan de aproximativ 17 perechi de baze este corelat cu o activitate optim a promotorului, n timp ce o distan mai mic de 15pb sau mai mare de 20pb este asociat cu o scdere a activitii sale. Date recente (Buttner i colab., 1988) indic faptul c gena pentru agaraz (dagA) de la S.coelicolor care conine patru promotori diferii este transcris de cel puin trei forme diferite
137
(holoenzime) de ARN polimeraz. Similar, genele galE i galK de la S.lividans sunt transcrise de dou ARN polimeraze de la nivelul a doi promotori, galP1 i galP2. Dei existena mai multor factori sigma este bine cunoscut, semnificaia fiziologic a diferitelor holoenzime de ARN polimeraz rmne nc neclar. La streptomicete multe dintre secvenele aflate naintea regiunii start a transcrierii unor gene conin doi sau mai muli promotori dar nu este clar dac toi promotorii funcioneaz "in vivo" (Tomich, 1988). Recunoaterea difereniat a promotorilor aranjai n tandem de ctre diferite ARN polimeraze poate explica exprimarea selectiv a anumitor seturi de gene n timpul creterii i diferenierii morfologice i a altor gene n timpul desfurrii metabolismului secundar. Aranjarea genelor implicate n biosinteza antibioticelor n grupuri ("clusteri") este deci de mare interes n legtur cu exprimarea difereniat a genelor. 2.6. Seminificaia biologic a metaboliilor secundari Semnificaia biologic a metaboliilor secundari produi de diferite microorganisme nu este nc foarte clar. Sinteza lor ar reprezenta rezultatul unor "erori de metabolism" fr importan pentru fiziologia microorganismului productor. In legtur cu rolul metaboliilor secundari au fost avansate numeroase propuneri pornind de la studiul n laborator al activitii acestor compui. Vining (1990) consider c funciile metaboliilor secundari pot fi grupate n dou categorii: unele care privesc direct productorul (funcii intrinseci) i altele care asigur anumite beneficii productorului prin aciunea n exterior, n mediu (funcii extrinseci). In cadrul funciilor intrinseci, unii metabolii secundari pot fi precursori ai unor componente structurale cum ar fi de exemplu streptomicina care, se sugereaz c ar fi un constituent al nveliului mureinic (Szabo i colab., 1989). De asemenea, ali metabolii secundari joac un rol important n sporulare i n germinarea sporilor la actinomicete i la bacili ca i n diferenierea celular (Chater, 1989; Maplestone i colab.,1992). Atunci cnd activitatea metaboliilor secundari este direcionat asupra altor organisme din mediul nconjurtor, aceste substane pot fi considerate ca "ageni ecologici" asigurnd productorilor supravieuirea n cadrul competiiei cu alte organisme ce populeaz aceeai ni ecologic. De asemenea, datele obinute pn n prezent n urma analizei secvenei de nucleotide sprijin conceptul c metabolismul secundar a rezultat n urma modificrilor cilor existente ale metabolismului primar. Dei secvena de aminoacizi identificat deductiv din secvena de nucleotide a genelor corespunztoare este suficient pentru a indica o origine comun, pentru ca datele s fie mai concludente ar fi necesar o comparare a genelor de la specii diferite dect de la aceeai specie. Informaiile obinute n acest fel sugereaz c transferul natural de gene ntre diferite organisme a reprezentat un important factor n evoluia metaboliilor secundari. Multe dintre cile metabolismului secundar pot avea o origine foarte veche, modificrile care apar la nivelul lor putnd rezulta n urma achiziiilor mai recente de material genetic exogen la nivelul unor microorganisme productoare. Pe baza cunotinelor acumulate n domeniu, Vining (1992) stabilete o serie de caracteristici clare ale metabolismului secundar: 1. metaboliii secundari nu sunt eseniali pentru cretere i tind s fie specifici de tulpin; 2. aceti compui au o mare varietate de structuri chimice i activiti biologice; 3. metaboliii secundari deriv din intermediari ai metabolismului primar prin ci de biosintez unice. Aceste ci sunt deseori lungi i complexe; reaciile biochimice sunt catalizate de enzime cu specificitate de substrat diferit de cea a enzimelor echivalente ale metabolismului primar; 4. formarea metaboliilor secundari este determinat de seturi de gene asociate supuse unui mecanism de reglare care se refer att la nivelul exprimrii genelor ct i la momentul declanrii acesteia;
138
5. mecanismele de control este bine integrat cu fiziologia organismului productor. Relativ recent, Davies (1990) a propus ideea c metaboliii secundari sunt substane cu origine foarte veche i c muli dintre ei exercit activiti biologice cunoscute (cum sunt antibioticele) datorit interaciunii cu anumite situsuri vechi, conservate ale diferitelor macromolecule. Aceasta nseamn c metaboliii secundari au jucat un rol important n evoluia reaciilor biochimice, nainte ca enzimele s fie disponibile. Spre exemplu, reaciile de biosintez erau catalizate sau modulate de molecule cu greutate molecular mic care erau prezente n atmosfera Pmntului sau erau produse n "supa primordial". Odat ce sistemul de traducere a evoluat iar proteinele au nceput s fie produse i s exercite diferite funcii, rolul produilor cu greutate molecular mic a fost nlocuit de mecanisme mai complexe n care sunt implicate polipeptidele, dar acetia i-au meninut capacitatea de a interaciona cu anumite situsuri receptoare din macromolecule (acizi nucleici sau proteine). Conceptul rolului cheie primordial al moleculelor cu greutate molecular mic ca efectori (stimulatori) ai biosintezelor sugereaz o nou abordare a modalitilor de screening pentru diferite activiti farmacologice. In locul urmririi exclusive a efectelor inhibitorii este necesar s se studieze activitatea stimulatoare fie a unor celule ntregi fie a unor extracte celulare (Murakama i colab.,1989). Numeroase organisme (poate chiar toate) produc compui cu greutate molecular mic cu activitate antibiotic, cum ar fi de exemplu defensinele (Gabai i colab., 1989). In acest sens, microorganisme de tipul streptomicetelor sunt neobinuite n sens evolutiv deoarece ele i-au dezvoltat i meninut cile necesare pentru a produce o gam foarte larg de compui cu greutate molecular mic atunci cnd sunt cultivate n mod corespunztor. Aciunea acestor compui este foarte variat, ei inhibnd de obicei desfurarea unor procese biochimice diferite. Studii mai amnunite asupra activitii acestor substane antibiotice a evideniat ns c multe dintre ele au efect stimulator asupra transferului de gene (aminoglicozidele, penicilinele, tetraciclinele), asupra transpoziiei (tetraciclina), transcrierii (eritromicina, tiostreptonul), creterii celulare (kanamicina, streptomicina, eritromicina) sau mutagenezei (streptomicina). Pornind de la aceste observaii, Davies (1990) propune c efectorii cu greutate molecular mic i situsurile lor de aciune dateaz dinaintea stabilirii rolului proteinelor, dei aciunea lor este mai puin eficient i are o specificitate sczut. Odat ce organismele devin din punct de vedere genetic i biochimic mai evoluate, rolul efectorilor cu greutate molecular mic este preluat de proteine care asigur o eficien i specificitate de aciune ridicat.
3. Enzime produse de bacteriile din genurile Bacillus si Streptomyces

Dei streptomicetele produc mai mult de 60% dintre antibioticele cunoscute, exist relativ puine date referitoare la echipamentul enzimatic al acestor bacterii. Tinnd cont de faptul c streptomicetele sunt microorganisme din sol unde exist o mare varietate de posibile substraturi nutritive, este logic de presupus c aceste bacterii prezint o mare varietate de ci metabolice putnd sintetiza unii intermediari prin ci diferite. Cile metabolice alternative fac posibil utilizarea eficient a celor mai multe substrate disponibile (Behal, 1986). In ultimii ani bacteriile din genul Streptomyces constituie un serios subiect de studiu din punctul de vedere al enzimelor pe care le produc, multe dintre ele fiind de importan biotehnologic (proteaze, amilaze, glucoz-izomeraze, celulaze, hemicelulaze, endonucleaze, chitinaze etc. Mai mult, s-a dovedit c cel puin unele dintre aceste enzime sunt produse simultan cu unele antibiotice (tabelul 2) (Pokorny i Vitale, 1980). Unele dintre enzimele sintetizate de ctre streptomicete sunt sau pot fi folosite n practica medical fie n stabilirea unor diagnostice fie n terapie. Acesta este cazul colesterol-oxidazei produs de unele specii de Streptomyces i Nocardia care este utilizat pentru dozrile de
139
colesterol din ser, sau al urat-oxidazei produs de S.cyanogenus care poate fi utilizat pe scar larg pentru detectarea enzimatic a acidului uric (Srinivasan i colab., 1991). Producerea enzimelor hidrolitice de ctre streptomicete depinde n mare msur de substratul pe care acestea sunt cultivate astfel c datele prezentate n Tabelul 2 pot fi completate i cu alte tipuri de enzime. Uneori ns, datorit scopului n care enzimele ar putea fi utilizate (de exemplu n industria alimentar) se prefer utilizarea unor tulpini bacteriene productoare care ns s nu sintetizeze substane toxice sau potenial toxice (cum sunt de altfel antibioticele) Tabelul 2. Enzime entracelulare produse de unele bacterii productoare de antibiotice
Specia bacterian S.griseus S.rimosus S.aureofaciens S.fradiae S.antibioticus S.venezuelae B.licheniformis B.subtilis Antibioticul streptomicina oxitetraciclin tetraciclina neomicina oleandomicina cloramfenicol Bacitracina Bacitracina Enzimele detectate proteaze, elastaze, amilaze, peptidaze proteaze, elastaze, proteaze, amilaze proteaze, elastaze, keratinaze proteaze, amilaze Proteaze Proteaze Proteaze
De asemenea, studii recente au demonstrat posibilitatea utilizrii bacteriilor din genul Streptomyces pentru clonarea unor gene cu origine diferit i pentru producerea proteinelor corespunztoare (Erpicum i colab., 1990). In plus, metaboliii secundari ai acestor bacterii ofer avantajul exprimrii (sintezei) prelungite a unui produs i dup faza iniial de cretere a culturii (Gardner i Cadman, 1990). In cazul enzimelor produse de bacteriile din genul Bacillus, aplicaiile practice sunt bine cunoscute, ele fiind prezentate pe scurt n Tabelul 3. Tabelul 3. Tipuri de enzime hidrolitice produse de bacili i principalele aplicaii ale acestora
Enzima Proteaze alcaline Tipul enzimei Extracelulare Specia productoare B. subtilis B. pumillus B. amylosacchariticus B. licheniformis B.subtilis B. amyloliquefaciens B. thermoproteolyticus B. amylosacchariticus B. stearothermophilus B. cereus B. subtilis B.licheniformis B.coagulans B. stearothermophilus B. cereus var.mycoides B. polymyxa B.circulans B. megatherium B. cereus var.mycoides B.subtilis B.polymyxa B. licheniformis B. cereus
140
Utilizri detergeni industria alimentar industria pielriei Industria berii Industria alimentar
Proteaze neutre
Extracelulare
-amilaze
Extracelulare
Industria alimentar degradarea amidonului
-amilaz
Extracelulare
industria alimentar degradarea amidonului Industria alimentar Industria textil Industria celulozei i hrtiei Zootehnie Tratarea deeurilor agricole
Celulaze
Extracelulare
Datorit acestor considerente o trecere n revist a principalelor tipuri de enzime (cu posibil valoare biotehnologic) este nu numai interesant ci i necesar. 3.1. Proteaze Proteazele microbiene constituie un grup complex de enzime hidrolitice, care difer prin specificitatea de substrat, mecanism de reacie, dependena activitii enzimatice i stabilitii n funcie de pH i temperatur. Aciunea lor poate fi blocat, activat, sau inhibat ntr-o anumit proporie de ageni fizici, chimici sau biologici. Producia i caracteristicile enzimelor microbiene pot fi influenate prin selecia tulpinii productoare i alegerea condiiilor de cultivare ale acesteia. Enzimele din categoria proteazelor hidrolizeaz majoritatea proteinelor comune cum ar fi: caseina, hemoglobina, gelatina, albumina de ou, glutenul, proteina din soia i alte proteine vegetale i animale. Condiiile de hidroliz precum i randamentul operaiei n sine depind ns de natura, caracteristicile i gradul de puritate al preparatului proteolitic utilizat. Numeroasele utilizri ale enzimelor proteolitice, n cele mai diferite domenii de activitate (industria alimentar, farmaceutic, agricultur, industria detergenilor, medicin) au determinat demararea cercetrilor n vederea obinerii acestora pe cale biotehnologic innd seama n acelai timp de avantajele pe care le ofer utilizarea microorganismelor ca surs biologic, precum i de proprietile enzimelor microbiene. Proteazele reprezint un grup de enzime hidrolitice, de obicei extracelulare, care scindeaz molecula proteic n fragmente polipeptidice formate din civa aminoacizi unii prin legturi peptidice. Aceste polipeptide pot fi n continuare degradate de ctre peptidaze pn la aminoacizii componeni. Peptidazele, n funcie de modul lor de aciune sunt de dou tipuri: endopeptidaze i exopeptidaze. La rndul lor exopeptidazele pot fi: aminopeptidaze care i ncep aciunea de la nivelul extremitii NH2 libere a polipeptidului, activitatea lor depinznd de prezena unor ioni metalici; carboxipeptidaze care i ncep atacul de la captul COOH liber al peptidului (Scriban, 1988). Clasificarea enzimelor proteolitice se face, conform recomandrilor International Unit of Biochemistry n ase familii, diferenele dintre ele datorndu-se secvenelor de aminoacizi care alctuiesc situsul activ (Tabelul 4) (Neurath, 1989). Tabelul 4. Familii de enzime proteolitice (dup Neurath, 1989) Familia Proteaze reprezentative Resturi caractiristice de aminoacizi ale situsului activ Serin proteaze I Chimiotripsina, tripsina, elastaza, Asp102Ser195His57 kalikreina,pancreatina Serin proteaze II Subtilizina Asp32Ser221His64 Cistein proteaze Papaina, actinidin, catepsina B i H de Cys25His159Asp158 la obolan Aspartic proteaze Penicilopepsin, renina, proteaze acide Asp33Asp213 de la Rhizopus sp. Metaloproteaze I Carboxipeptidaza A bovin Zn, Glu270 Try248 Metaloproteaze II Termolizina Zn Glu143His231 Membrii fiecrei familii se crede c au rezultat dintr-o form ancestral comun, n urma unui proces evolutiv divergent. Din datele prezentate n tabelul 2 se remarc faptul c serin proteazele includ dou familii distincte: serin-proteazele de la mamifere i cele de origine bacterian. Dei prezint un mecanism enzimatic comun, cele dou familii de serinproteaze difer ca secven de aminoacizi i ca structur tridimensional.
141
In mod similar, metalopreoteazele includ i ele tot dou familii n funcie de originea lor i de structura chimic: de la mamifere i de la bacterii. Exist i alte enzime proteolitice identificate la diferite grupe de organisme care nu pot fi ncadrate nc n nici una dintre grupele de mai sus deoarece mecanismul lor de aciune i situsul activ nu este cunoscut cu exactitate. Acesta este cazul colagenazelor i aminopeptidazelor. Proteazele bacteriene produse de tulpini de Bacillus subtilis sunt amestecuri de proteaze alcaline (subsubclasa 3.4.21, proteaze serinice) i proteaze neutre (subsubclasa 3.4.24, metaloproteaze). Proteazele serinice au n centrul lor activ serina i histidina. Acest grup a fost divizat de Morihara n alte 4 subgrupe: proteaze similare tripsinei; proteaze alcaline; proteaze Myxobacter -litice; proteaze stafilococice. Proteazele similare tripsinei cuprind, n afar de tripsin i chimotripsin, enzime produse de specii de Streptomyces, care hidrolizeaz legturile Arg22 Gly23 i Lys29 Ala30 din lanul -insulinic, aceast specificitate de substrat fiind trstura distinctiv. Aceste enzime acioneaz la pH 8,0, au temperatura optim de cataliz 50C, sunt inhibate de diizopropilfluorfosfat (DIFP), pcloromercurilbenzoic (PCMB), tosyl-L-lizinclorometilceton (TLCK), tripsin-inhibitorul din soia. Activitatea lor nu este influenat de etilendiaminotetraacetat (EDTA) i acid iod-acetic (IAA), n plus prezint i activitate esterazic i amidazic. A doua grup de proteaze serinice sunt proteazele alcaline; acestea pot fi produse de bacterii, drojdii i fungi fiind prezente i n esuturile animale. n aceast grup se ncadreaz i proteazele alcaline produse de unele tulpini de B.subtilis i cele fungice din Aspergillus oryzae. Aceste proteaze au aciune specific fa de resturile de aminoacizi aromatici sau hidrofobi care particip cu gruparea carboxil la legtura care se scindeaz; valoarea optim a pH este cuprins ntre pH 9 i pH 11, dar enzimele rmn active n domeniul de pH 59; aceste proteaze sunt inhibate de DIFP, de PMSF fiind ns rezistente a aciunea EDTA sau ortofenantrolinei. Din acest grup fac parte proteazele cunoscute sub denumirea de subtilizine sau subtilopeptidaze. S-a constatat c aceste proteaze nu sunt exclusiv produse de B.subtilis ci n general de bacterii ale genului Bacillus astfel nct s-a propus numele generic de bacilopeptidaze. Respectivele enzime pot fi clasificate n dou grupe: Bacilopeptidaze A care cuprind subtilizina Carlsberg (proteaza alcalin produs de tulpini de B.licheniformis) i proteaza alcalin produs de B.pumilis; Bacilopeptidaze B care includ subtilizina NOVO (proteaz alcalin sintetizat de B.subtilis NRRL B3411) i subtilizina BNP (Bacterial Protease Nagarse), proteaz alcalin din B. subtilis var. amylosacchariticus. Metodele de examinare a amestecurilor de enzime produse de diferii bacili au artat c bacteriile productoare de bacilopeptidaze A nu sintetizeaz proteaze neutre sau amilaz, n timp ce bacteriile productoare de bacilopeptidaze B sintetizeaz n acelai timp i proteaze neutre i amilaz n acelai timp. Metaloproteazele sunt proteaze activate de ionii metalici legai de centrul activ al enzimei (Ca2+, Zn2+, Mg2+, Fe2+). Ele pot fi metaloproteaze neutre i metaloproteaze alcaline. Proteazele neutre conin de obicei Zn i prezint specificitate fa de aminoacizii hidrofobi implicai cu gruparea amino n legtura peptidic. Ele au un pH optim de aciune cuprins ntre pH 7 i pH 8, sunt inhibate complet de EDTA (care complexeaz atomul de Zn din structur)
142
fiind sensibile la concentraii de EDTA sub 10-3M, orto-fenantrolin, nefiind afectate de DIFP i PCMB. Metaloproteazele alcaline conin, de asemenea, un ion metalic implicat n mecanismul de reacie catalitic. Ele i manifest activitatea optim n domeniul de pH 79, fiind mai puin inhibate de EDTA dect proteazele neutre, necesitnd concentraii mai ridicate de 10-2 M pentru inactivare. Proteazele neutre produse de Bacillus subtilis var. amylosacchariticus sunt diferite de proteazele neutre produse de Bacillus subtilis NRRL B3441 i din acest motiv este necesar specificarea exact a provenienei proteazei neutre respective. Producerea lor este supus represiei exercitate de prezena n mediul de incubare a unor aminoacizi n cantitate mai mare (Bawden i colab.,1987). Aceste enzime sunt folosite n prezent la fabricarea detergenilor la tratarea pieilor n industria pielriei, frgezirea crnii, eliminarea depozitelor proteice din buturile fermentate (Sasson, 1988). La aceste bacterii s-au realizat i numeroase studii referitoare la determinismul genetic i controlul producerii i excreiei acestor enzime n scopul obinerii prin clonare a unor tulpini superproductoare (Mc Connell i colab., 1986). S-a dovedit faptul c producerea de proteaze este supus unor mecanisme reglatoare complexe, ntre care un rol cheie este jucat de sistemul DegS-DegU precum i de factorii de reglare DegR and DegQ (Nagami and Tanaka, 1986; Tanaka et al., 1987; Ogura et al., 1994). Aceti factori reglatori se pare c sunt implicai n superproducia de proteaze cel puin n cazul unor tulpini de B.subtilis. De asemenea, relativ recent, Ogura et al (1994) au caracterizat alte dou gene: proB (ce codific sinteza -glutamil kinazei) i proA (codific sinteza glutamil--semialdehid dehidrogenaza) ale cror produi par a fi implicai n sporirea capacitii de biosintez a exoproteazelor la o tulpin de B.subtilis. Astfel, cele dou gene au fost clonate ntr-un vector e clonare (pLC1) i apoi introduse, mpreun cu un alt vector (pNC61) ce conine gena reglatoare prtR (degR) ntr-o tulpin de B.subtilis. Transformanii obinui au prezentat o activitate proteolitic mai mare dect a tulpinii parentale. Date fiind aplicaiile practice ale acestor enzime extracelulare, preocuprile cercettorilor vizeaz sporirea nivelului de biosintez ca i mrirea stabilitii enzimelor n diferite condiii experimentale. Aceste deziderate se pot realiza pe mai multe ci, printre care cele ce utilizeaz metodele clasice de ameliorare a microoganismelor (prin tratament cu ageni mutageni) i cele moderne, de inginerie genetic (fuziunea de protoplati i tehnologia ADN recombinant). Conform datelor de literatur, mutagenii cei mai eficieni sunt nitrosometiluree, nitrosoguanidina, dietilsulfatul, precum i ageni fizici de tipul radiaiilor X sau a radiaiilor . Astfel, prin mutagenez s-a reuit ridicarea nivelului de biosintez a tulpinilor de B.subtilis de aproximativ 8-10 ori. n cel de-al doilea caz, majoritatea tulpinilor superproductoare de proteaze care prezint anumite caracteristici s-au obinut prin inginerie genetic. Astfel, sunt foarte cunoscute rezultatele obinute de cercettorii japonezi care, pornind de la tulpini slbatice de B.thermoproteolyticus i B.stearothermophilus au reuit obinerea de tulpini productoare de termolizin, o proteaz foarte diferit de celelalte proteaze neutre n ceea ce privete termostabilitatea i mecanismul de aciune. n prezent, cunoscndu-se structura termolizinei precum i genele rspunztoare de caracteristicile sale deosebite, se ncearc obinerea de tulpini de B.subtilis, B.stearothermophilus modificate genetic, capabile s produc proteaze termostabile sau stabile la valori diferite ale pH sau la aciunea unor ageni inhibitori. In cazul bacteriilor din genul Streptomyces examinarea lichidelor de cultur a unor tulpini productoare de antibiotice a dus la evidenierea prezenei unui amestec de enzime dintre care, un loc important din punct de vedere cantitativ l ocup proteazele (neutre i alcaline) i peptidazele (aminopeptidaze) (Pokorny i Vitale, 1980).
143
Vitale i colab.(1980) au reuit izolarea din filtrat de cultur de S.rimosus a unei serin proteaze care a prezentat un pH optim de aciune cuprins ntre 7 i 9 i al crei substrat de aciune este reprezentat de proteine sau de peptide mari, hidroliznd n general esterii terminali simpli. Recent, Renko i colab.(1989) au prezentat particularitile unei proteaze de tip tripsinic ("trypsin-like proteinase") izolat tot din filtrat de cultur de S.rimosus evideniind faptul c aceasta este o proteaz alcalin, sensibil la aciunea inhibitorului proteazic PMSF (specific pentru serin-proteaze) ca i la cea a -antitripsinei. Aceste enzime au activitate arginilaminopeptidazic att asupra proteinelor ct i asupra peptidelor mai mici. Enzime similare au fost izolate i caracterizate i de la alte specii de Streptomyces: S.fradiae, S.paromomycinus, S.moderatus, S.hygroscopicus etc. O situaie oarecum special o prezint S.griseus care produce un amestec de proteaze neutre i alcaline, produsul obinut fiind denumit pronaz, el fiind studiat mai intens n scopul elucidrii mecanismului de aciune i a omologiei sale cu tripsinele vertebratelor (Read i colab.,1984). Aceste studii au importan att teoretic prin contribuiile aduse la nelegerea unor aspecte evolutive, a taxonomiei serin-proteazelor dar i practic, aceste enzime putnd nlocui tripsina n anumite reacii biochimice. S-a dovedit de asemenea c unele specii de streptomicete, cum ar fi de pild S.rimosus, pot produce i o alt categorie de proteaze: metaloproteaze (Vitale i colab.,1987). Aceste enzime sunt fie bazice fie neutre, fiind activate de ionii de calciu, mangan sau zinc, stabilizate de ionii de calciu i inhibate de EDTA. Metaloproteazele alcaline acioneaz doar asupra proteinelor, nu i asupra peptidelor n timp ce metaloproteazele neutre degradeaz n egal msur proteinele i peptidele. In cazul acestora din urm aciunea enzimatic se manifest la extremitatea COOH, ceea ce permite ncadrarea lor printre dipeptidil-carboxipeptidaze. De asemenea, s-a reuit izolarea de la mai multe specii de Streptomyces (S.rimosus, S.fradiae, S.peptidofaciens, S.griseus) a unor peptidaze care, pe baza proprietilor specifice (specificitatea de substrat, inhibarea de ctre EDTA, activare de ctre ionii de calciu, magneziu, prezena leucinei la captul NH2 terminal) au fost identificate ca fiind leucin-amino-peptidaze (Vitale i colab.,1986). Tinnd cont c n ultima vreme streptomicetele au nceput s fie utilizate drept gazde pentru clonarea de material genetic heterolog, este interesant de tiut dac tulpinile utilizate de obicei drept acceptori elaboreaz sau nu proteaze. Producerea unor asemenea enzime la aceste tulpini constituie un serios impediment n obinerea produsului dorit. Pornind de la aceast idee, Aretz i colab.(1989) au studiat prezena enzimelor proteolitice la tulpina S.lividans TK24, tulpin recombinat obinut pentru prelucrarea i secretarea unei proteine de fuziune (ntre inhibitorul -amilazei de la S.tendae i proinsulina de la maimua Macacca fascicularis). Dup purificarea prin cromatografie pe schimbtori de ion au fost separate mai multe tipuri de enzime proteolitice: alanin-aminopeptidaze, leucin-aminopeptidaze, proteaze de tip tripsinic i proteaze de tip chimiotripsinic. Dintre acestea, proteazele de tip chimiotripsinic ("chemo-trypsin-like") sunt cele care degradeaz proteina de fuziune dar aceast aciune poate fi inhibat prin adugarea n mediul de cultura unor sruri de zinc sau nichel. Dac n cazul bacililor au fost izolate i clonate genele ce codific sinteza a dou subtilizine i a unei proteaze neutre (Mc Connell i colab.,1986), n cazul bacteriilor din genul Streptomyces studiile referitoare la determinismul genetic al producerii de proteaze sunt mult mai puine. Astfel, Duez i colab.(1987) au reuit izolarea, clonarea i secvenierea genei pentru o peptidaz extracelular de la Streptomyces sp.R61 la S.lividans, iar Henderson i colab.(1987) au caracterizat genele pentru proteazele A i B de la S.griseus. In cazul unor tulpini de streptomicete au fost evideniate unele enzime proteolitice care degradeaz preferenial colagenul ("collagenase-like")(Mukhopadhyay i Chandra, 1987). Dei nu au fost izolate i purificate (s-au utilizat filtrate de cultur) enzimele de tip colagenaze de la Streptomyces au evideniat o activitate specific pe colagen din tendon bovin i piele de viel, la
144
280 C i pH 7,2-7,5, fiind inhibate de EDTA i azid de sodiu. Dei neobinuit, producerea unor asemenea enzime de ctre streptomicete nu este surprinztoare dac ne gndim la multitudinea de substrate nutritive pe care aceste bacterii le pot gsi n sol. 3.2. -Amilazele -Amilazele (1,4--D-glucan-glucanhidrolaza, EC 3.2.1.1.) sunt larg rspndite n rndul microorganismelor, att la fungi ct i la bacterii, mai ales la specii ale genurilor Bacillus i Streptomyces, aciunea lor constnd n hidroliza legturilor -1,4-glicozidice de la nivelul amidonului, elibernd maltoza. Cel mai mult studiate i utilizate n practic sunt -amilazele produse de speciile de Bacillus (B.amilolyquefaciens, B.licheniformis, B.stearothermophilus, B.subtilis etc). Aceste bacterii produc dou tipuri de -amilaze: de lichefiere a amidonului (degradarea amidonului pn la maltodextrine) i de zaharificare (convertesc maltoza la glucoz). -Amilazele produse de tulpinile de B.licheniformis prezint un interes special datorit rezistenei lor la temperaturi ridicate (85-1150C). In general, enzimele respective sunt utilizate n practic n lichefierea amidonului n industria distilatelor ca i n industria textil (Zarnea i colab.,1980). O serie de studii genetice realizate prin experimente de mutagenez sau prin clonri de gene au evideniat faptul c gena pentru -amilaz de la B.subtilis se afl sub un control genetic complex care este ns puin cunoscut la nivel molecular (Mc Connell i colab.,1986). Se pare ns c exist mai multe gene reglatoare cu efecte pleiotropice (sacU, sacQ, prtR) care intervin n exprimarea genei pentru -amilaz, levansucraz, serin proteaz, proteaze neutre i -glucanaz (Priest, 1987). In cazul streptomicetelor au fost izolate i caracterizate -amilaze de la mai multe specii, acest tip de enzime prnd a fi sintetizat practic de majoritatea bacteriilor aparinnd acestui grup. O atenie special a fost acordat -amilazei produs de S.hygroscopicus (Hoshiko i colab.,1987), S.limosus (Virolle i Bibb, 1988) i S.venezuelae (Virolle i colab.,1988) la aceste specii fiind studiat i genele ce codific sinteza i reglarea sintezei acestor enzime. De asemenea, s-au efectuat experimente de clonare a genelor respective n diferite gazde (E.coli, S.lividans) n scopul obinerii unor tulpini superproductoare de interes industrial. Pe lng aspectul practic al cercetrilor de acest tip, ele mai pot oferi o serie de informaii referitoare la modul de exprimare i reglare a funciilor genelor de la streptomicete (n particular a genelor pentru -amilaz). Mai mult, rezultatele obinute au permis o comparare a enzimelor de tip -amilaz produse de streptomicete cu cele produse de alte organisme, n special cu cele produse de eucarioate (Mac Gregor, 1988). S-a dovedit c S.hygrosopicus produce o -amilaz care degradeaz amidonul pn la maltoz, aciunea sa fiind de tip endoglucanolitic (taie legturile -1,4 glicozidice din interiorul lanului polizaharidic). Compararea secvenei de aminoacizi pe care aceast enzim o conine cu cele ale altor enzime de acest tip, fie de la procariote (de la bacili) fie de la eucariote (de la Aspergillus oryzae, A.nidulans, Hordeum vulgare, Drosophila melanosgaster etc) a evideniat faptul c exist trei regiuni care sunt conservate la toate aceste enzime, indiferent de origine (Ihara i colab.,1985). Cu toate acestea, -amilaza de la S.hygroscopicus este unic deoarece conine triptofan la nivelul celei de-a treia regiuni conservate (Mac Gregor, 1988). Experimentele de clonare a genei amy de la S.hygroscopicus n alte gazde cum ar fi E.coli i S.lividans au evideniat faptul c, dei transferul genei s-a realizat eficient, exprimarea sa variaz n funcie de gazd i de numrul de copii ale genei respective (efectul de dozare a genei). Hoshika i colab. (1987) utiliznd cartarea cu o nucleaz specific ("mung bean nuclease") au determinat faptul c gena amy de la S.hygroscopicus prezint trei situsuri de iniiere a transcrierii (trei promotori): amyP1, amyP2 i amyP3, care au asemnri mai mult sau mai puin extinse cu promotorii altor gene de la Streptomyces (endoH, ermP1, aphP1).
145
Studii similare au fost fcute i cu gena pentru -amilaz (aml) de la S.limosus i S.venezuelae. In cazul tulpinilor de S.venezuelae analizate s-a observat c exprimarea genei aml este represat puternic de glucoz n timp ce asupra exprimrii genei similare de la S.limosus glucoza nu are efect. Exprimarea acestei gene este ns influenat (represat) puternic de manitol (Virolle i colab.,1988). Interesant este c prin clonarea genei aml de la S.limosus n S.lividans exprimarea genei este puternic represat de glucoz n noua gazd (Virolle i Bibb 1988). Acesta nseamn c rezistena la aciunea glucozei evideniat la tulpinile de S.limosus analizate este mai degrab o particularitate a bacteriei dect a genei pentru -amilaz. De asemenea, n urma comparrii secvenei de aminoacizi a acestei proteine cu proteine similare de la eucariote s-a observat o omologie ridicat cu -amilaza produs de Drosophila melanogaster (>40%), Mus musculus (36,8%), Aspergillus nidulans (36,1%) i mai mic cu enzimele similare de la B.subtilis (22,6%) i B.amylolyquefaciens (16,1%)(Long i colab.,1987). 3.3. Glucoz-izomeraza In ultimii ani, de mare interes n Japonia, SUA i Frana este obinerea siropurilor cu coninut ridicat de fructoz din hidrolizate de amidon n urma aciunii glucoz-izomerazei (xilozoizomeraza, EC 5.3.1.5.). Printre productorii recunoscui de asemenea enzime se numr i unele specii de streptomicete: S.violaceoniger i S.olivochromogenes. Suekane i Iizuka (1982), n cadrul unor cercetri legate de producerea de glucoz-izomeraz de ctre streptomicete au evideniat faptul c abilitatea de a converti glucoza la fructoz este larg rspndit ntre bacteriile acestui gen. Localizarea acestei enzime este att intracelular (cea mai mare parte) dar i extracelular. Experimentele lui Szentirmai i colab.(1986) au evideniat faptul c, cel puin n cazul S.matensis, glucoz-izomeraza intracelular difer de cea extracelular din punctul de vedere al greutii moleculare. De asemenea, s-a observat c utilizarea ca surs de azot a unei combinaii de glicocol i sulfat de amoniu i adugarea xilozei i a ionilor de cobalt (de magneziu sau mangan n cazul altor specii bacteriene) duce la stimularea producerii de enzim la S.olivochromogenes, S.flavogriseus sau S.violaceoniger (Chen i colab.,1979; Sicard i colab., 1990). Park i Toma (1974) au observat c la unele tulpini de streptomicete exist o interrelaie ntre producerea de glucoz-izomeraz i cea de xilanaz, n funcie de sursa de carbon utilizat pentru cultivarea bacteriilor respective. Utilizarea unui mediu de cultur ce conine fie xilan fie glucoz ca surs de carbon determin producerea de glucoz-izomeraz n timp ce xilanaza este produs doar de bacteriile crescute pe mediu cu xilan, nu i pe cel ce conine glucoz. Datorit importanei practice deosebite a acestei enzime, n ultimii ani au fost realizate studii referitoare la determinismul genetic al sintezei glucoz-izomerazei ca i la controlul acestei sinteze, scopul fiind acela al obinerii prin tehnici de inginerie genetic a unor tulpini capabile de a sintetiza noi tipuri de glucoz-izomeraze cu proprieti modificate, cu aciunea mai eficient. Utilizarea D-xilozei ca surs de carbon de ctre bacterii se realizeaz pe o cale metabolic ce presupune transportul prin membrana plasmatic, izomerizarea la D-xiluloz i apoi fosforilarea acesteia cu ajutorul xiluloz-kinazei cu formarea de D-xiluloz-5-fosfat. Intermediarul fosforilat este apoi metabolizat fie pe calea pentozo-fosfailor fie pe calea Embden-Meyerhoff. Pornind de la aceste date s-a determinat faptul c operonul xyl de la streptomicete (de la S.violaceoniger n particular) este alctuit din cel puin trei gene: xylA care codific pentru sinteza xiloz-izomerazei, xylB care codific xiluloz-kinaza i xylX care determin sinteza unei proteine reglatoare. In cazul acestor bacterii s-a evideniat o situaie interesant: genele xylA i xylB plasate apropiat una de cealalt pe cromosomul bacterian prezint o orientare diferit, exprimarea lor datorndu-se unor promotori divergeni plasai n regiunea dintre cele dou gene
146
(Tiraby i colab.,1989). Produsul genei xylX pare a fi o protein reglatoare care controleaz att exprimarea celor dou gene cu orientare opus ct i propria sa sintez. Experimentele de clonare care se realizeaz n diferite laboratoare ncearc, pe de o parte stabilirea cu precizie a genelor ce alctuiesc operonul xyl la streptomicete i modul de reglare a exprimrii lor att n tulpina de origine ct i n diferite tulpini gazd n care genele respective au fost clonate, i, pe de alt parte s se construiasc "in vitro" tulpini recombinate genetic capabile de a sintetiza glucoz-izomeraz cu proprieti ameliorate (de exemplu termostabil) (Sicard i colab, 1990). Rezultatele obiute pn n prezent sunt promitoare, cercetrile fiind continuate pe direciile menionate mai sus. 3.4. Celulazele Biomasa vegetal reprezint sursa major de carbon n ecosistemele terestre astfel c este fireasc presupunerea c multe dintre microorganismele care populeaz aceste ecosisteme s fie capabile s degradeze aceste substrate, deci s sintetizeze enzime de timpul celulazelor i hemicelulazelor. Actinomicetele i n mod special bacteriile din genul Streptomyces constituie un grup important care intr n alctuirea populaiilor microbiene respective (Mc Carthy i Williams, 1992). Celuloza este un polimer neramificat de glucoz compus din uniti de anhidro Dglucoz unite prin legturi 1,4--D-glucozidice. Aceste legturi pot fi hidrolizate de ctre enzimele celulozolitice. De obicei celuloza este foarte rezistent la hidroliz datorit gradului ridicat de cristalinitate, rezultatul unei conformai lineare (paralele) care permite realizarea unor puternice legturi de hidrogen ntre gruprile OH ale lanurilor paralele vecine. In fibrele de celuloz regiunile cu structur nalt cristalin coexist cu regiunile cu structur amorf iar cele cu un raport favorabil zonelor cristaline prezint o rezisten crescut la aciunea enzimatic. Celuloza, aa cum se gsete n natur este un homopolimer cu greutate molecular mare, insolubil i adesea n asociere intim cu lignina, hemiceluloza la nivelul peretelui celular vegetal fapt ce o face puin accesibil degradrii enzimatice (Robson i Chambliss, 1989). Toate organismele care degradeaz celuloza cristalin secret sisteme enzimatice mai mult sau mai puin complexe care sunt alctuite din enzime cu diferite modaliti de aciune, specificitate de substrat i care acioneaz de obicei sinergic pentru a hidroliza celuloza. Cel mai bine studiat sistem celulazic este cel de la fungi (de la Trichoderma reesei), enzimele care l alctuiesc fiind grupate n trei categorii: - exo--1,4-glucanaze sau celobiohidrolaze (EC 3.2.1.91.) - endo--1,4-glucanaze sau endocelulaze (endoglucanaze)(EC 3.2.1.4.) - -glucozidaza sau celobiaza (EC 3.2.1.21.) Aceste trei grupe de enzime acioneaz sinergic ducnd la hidroliza celulozei cristaline. Endoglucanazele determin ruperea legturilor interne ale lanului de celuloz, atacul fcndu-se la ntmplare i ducnd la formarea de oligozaharide. Efectul direct al acestui tip de enzime este fragmentarea lanului de celuloz cuplat cu o cretere slab a cantitii de zaharuri reductoare eliberate. De obicei, n complexele celulozolitice sunt cuprinse mai multe endoglucanaze care pot prezenta afiniti diferite pentru celo-oligozaharide cu lungimi variate. Spre deosebire de aceste, exoglucanazele (celobiohidrolazele) acioneaz la nivelul extremitilor nereductoare ale lanului de celuloz, elibernd glucoz sau celobioz (zaharuri reductoare) n cantitate crescut, lungimea lanului celulozic nefiind modificat semnificativ. Acionnd individual, att endoglucanazele ct i celobiohidrolazele pot degrada regiuni restrnse ale lanului celulozic (cele cu structur amorf). Pentru a determina hidroliza regiunilor cu structur cristalin este necesar ca n amestecul enzimatic s fie prezente ambele tipuri de enzime.
147
In ceea ce privete -glucozidazele, acestea determin hidroliza celobiozei n dou uniti de glucoz. Dei aceste enzime nu sunt propriu-zis celulaze, ele particip la mbuntirea randamentului degradrii celulozei prin eliminarea inhibrii prin feedback a celulazelor realizat de obicei de celobioz (Robson i Chambliss, 1989). Utilizarea a numeroase substrate i diverse tehnici de evideniere a activitii celulazice a dus la o comparare dificil a sistemelor celulozolitice de la diferite organisme. Mai mult, deoarece celulazele aflate n extracte brute prezint o suprapunere parial a specificitii de substrat, un studiu corect trebuie realizat n condiiile purificrii acestor enzime. In ultima vreme au fost obinute o serie de substrate celulozice care ar putea fi folosite ca substrate mai mult sau mai puin specifice pentru fiecare dintre componentele sistemului celulazic (Wood i Bhat, 1988). Cel mai utilizat procedeu de determinare a activitii enzimatice este msurarea cantitii de zaharuri reductoare eliberate n urma aciunii enzimelor asupra substratului. Astfel, substratele celulozice cu structur amorf sau cele modificate chimic cum sunt celuloza-azur, carboximetilceluloza(CMC), celuloza tratat cu acizi ("acid-swollen cellulose") sau trinitrofenil-carboximetilceluloza (TNP-CMC) sunt degradate n mod semnificativ i specific de ctre endoglucanaze dar, n unele situaii i celobiohidrolazele le pot hidroliza de i cu o eficien mai mic. In cazul utilizrii drept substrat a celulozei cu structur cristalin de tipul Avicelului (celuloz microcristalin), bumbacului sau hrtiei de filtru, pentru degradarea lor eficient este necesar un sistem celulazic complet, care s conin att endoglucanaz ct i celobiohidrolaz. De obidei, pentru a determina prezena ntr-un preparat enzimatic brut a ambelor tipuri de enzime se determin eliberarea de zaharuri reductoare n funcie de substrat. Astfel, endoglucanazele cauzeaz o cretere rapid a fluiditii (reducerea vscozitii) carboximetilcelulozei dar o eliberare sczut de zaharuri reductoare. In contrast, celobiohidrolazele nu modific fluiditatea substratului dar conduce la eliberarea unei cantiti mai mari de zaharuri reductoare. Cu toate acestea este dificil de precizat dac o celulaz este sau nu celobiohidrolaz deoarece nu exist un substrat specific pentru aceasta. Deshpande i colab., (1988) au artat ns c hidroliza unor compui cum ar fi metil-umbeliferil-celobiozid (MUC) sau p-nitrofenil--D-celobiozid (pNPC) ar fi un indiciu al activitii exo--1,4-glucanazice. Exist n prezent numeroase date referitoare la bacterii celulozolitice dar muli autori consider c bacteriile produc doar endoglucanaze i nu un sistem celulazic complet. Dei cea mai acceptat teorie referitoare la modul de degradare a celulozei este cea bazat pe rezultatele cercetrilor efectuate asupra fungilor i care presupune c hidroliza eficient a substratelor celulozice se realizeaz n urma aciunii sinergice a endo- i exoglucanazelor, ea nu este aplicat bacteriilor. La acestea, modelul de degradare sugerat presupune c endoglucanazele care au ca substrat specific celo-oligozaharidele cu lungimi variate pot determina hidroliza celulozei cristaline dac ele se afl n concentraie mare sau dac se leag de fibrele de celuloz sau sunt grupate n imediata vecintate a acestora ("celulosomi") (Robson i Chambliss, 1989). Reuita unor laboratoare din lume de a izola i caracteriza celobiohidrolaze de la bacterii vine s contrazic n cazul speciilor respective teoria enunat mai sus (Creuzet i colab.,1983; Mac Kenzie i colab.,1984; Gardner i colab., 1987; Beguin, 1990; Ruttersmith i Daniel, 1991). Printre bacteriile considerate a avea sisteme celulazice complexe, tipice se numr genurile Clostridium, Cellulomonas, Bacillus, Thermomonospora, Ruminococcus, Bacteroides, Erwinia i Acetobacter. De asemenea, tulpini celulozilitice au fost identi-ficate i n cadrul altor genuri de bacterii: Streptomyces, Rhizobium, Cellvibrio, Pseudomonas, Microbispora etc. In studiul de fa ne vom referi doar la sistemele celulazice de la dou genuri de bacterii Gram pozitive, Bacillus i Streptomyces. La bacteriile din genul Bacillus s-a evideniat faptul c ele produc doar endoglucanaza i nu snt capabile de o degradare eficient a celulozei cristaline. Studiile referitoare la celulazele de la Bacillus au fost sprijinite i de faptul c aceste bacterii pot fi uor manipulate genetic (genomurile de la mai multe specii fiind destul de bine caracterizate) i de caracterul extracelular
148
al acestor enzime. Printre speciile care produc celulaze se numr B.subtilis, B.polymyxa, B.licheniformis, B.cereus etc. Studiile referitoare la celulazele de la Bacillus se refer att la caracterizarea biochimic a enzimelor ct i la identificarea i secvenierea genelor implicate n producerea acestor enzime ca i n clonarea i exprimarea lor n diferite gazde. In prezent se cunoate secvena de nucleotide a mai multor endoglucanaze de la Bacillus (tabelul 5) i deci secvena de aminoacizi a proteinelor corespunztoare, realizndu-se astfel comparaii ntre enzimele secretate de diferite specii de bacili. Tabelul 5. Genele pentru celulazele de la Bacillus Tulpina Gena Mrimea proteinei produse (aminoacizi) 378 B.circulans 499 B.subtilis DLG 463 B.subtilis N-24 499 B.subtilis PAP 115 celB 536 B.lautus celA 384 Bacillus N-4 465 celB >800 celC 365 B.polymyxa celF 770 Bacillus 1139 912 Bacillus sp.KSM 635 S-a stabilit astfel c enzimele produse de diferite tulpini de Bacillus prezint un grad nalt de omologie, poriunile cu omologie ridicat fiind localizate, n general, n regiunea aminoterminal, ceea ce sugereaz c situsul catalitic activ al enzimelor se afl plasat n aceast zon. Aceast supoziie este sprijinit de observaiile c poriunea de la captul carboxiterminal al endoglucanazei respective nu este necesar pentru activitatea celulozolitic, regiunea respectiv putnd fi deletat experimental fr pierderea actibvitii (Nakamura i colab. 1991). Recent, Henrissat i colab.(1989) analiznd gruprile ("clusterii") hidrofobe ale diferitelor enzime au clasificat celulazele, inclusiv pe cele de la Bacillus, n ase familii. Din acest punct de vedere, endoglucanazele de la B.subtilis i B.ciculans sunt incluse n familia A, subfamiliile A2 i A4 (Beguin, 1990; Gilkes i colab.,1991). De asemenea, rezultatele de pn acum referitoare la genele pentru enduglucanazele de la Bacillus sugereaz ideea c ele ar deriva dintr-o gen ancestral comun. In ceea ce privete particularitile biochimice ale endoglucanazelor de la bacteriile din genul Bacillus acestea au o greutate molecular ce variaz, de obicei, ntre 35 i 46 kDa, dar poate atinge, la unele tulpini alcalofile, pn la 92 kDa (Fukumori i colab., 1986), sunt n general termostabile, activitatea optim realizndu-se la 50-60oC. Reglarea producerii de endoglucanaze de ctre bacteriile din genul Bacillus variaz nu numai de la specie la specie ci chiar i de la tulpin la tulpin. Spre exemplu, tulpini de B.cereus, Bacillus sp.N-4, B.subtilis AU1, B.licheniformis sintetizeaz enzima n mod constitutiv n timp ce la alte tulpini, B.polymyxa, B.subtilis DLG, Bacillus sp.1139, aceasta pare a fi inductibil. De asemenea, nivelul glucozei i al celobiozei influeneaz diferit producerea englucanazei de ctre tulpinile bacteriene studiate. Dac n cazul tulpinii B.subtilis AU1 att glucoza ct i celobioza inhib sinteza enzimatic la concentraii mai mari de 2%, n cazul tulpinii alcalofile Bacillus sp.1139 glucoza inhib, iar celobioza stimuleaz producerea de enzim. La alte tulpini de
149
Bacillus, B.subtilis DGL, B.cereus, B.licheniformis, ambele zaharuri reductoare stimuleaz sinteza endoglucanazei. In urma experimentelor de clonare a genelor pentru endoglucanaz n diferite gazde (fie tulpini auxotrofe de E.coli fie alte tulpini de B.subtilis) au fost obinute informaii interesante referitoare la exprimarea genelor respective n gazde heterologe ca i la reglarea exprimrii acestora. De obicei, celulazele ale cror gene au fost clonate n E.coli sunt sintetizate iniial sub forma unor compui de dimensiuni mari, activi din punct de vedere enzimatic, cu localizare intracelular. Aceti compui sufer o "prelucrare" n urma creia dimensiunea enzimei se micoreaz, sub aceast form ea fiind exportat n spaiul periplasmic (Cantwell i Mc Connel, 1983; Robson i Chambliss, 1989). In cazul utilizrii drept gazda pentru clonare a unor tulpini mutante de Bacillus s-a observat un fenomen similar de "procesare intracelular" a precursorului enzimatic n urma cruia dimensiunia enzimei se apropie de cea a enzimei produs de tulpina de origine (Robson i Chambliss, 1989). De asemenea, Nakamura i colab.(1991) au observat c utilizarea drept gazd a unei tulpini mutante de B.subtillis care nu produce proteaze a condus la obinerea unei cantiti superioare de enzim de la tulpina recombinat. Aceast cretere poate fi de cel puin 9 ori dac n noua gazd este clonat suplimentar i gena sacQ. Dei cele mai multe informaii referitoare la degradarea substratelor celulozice de ctre actinomicete sunt legate de bacteriile din genul Thermomonospora (T.fusca, T.curvata)(Wilson, 1992), n ultimii ani au fost realizate i studii referitoare la sistemul celulazic al bacteriilor din genul Streptomyces. Tulpinile de streptomicete capabile de a degrada celuloza aparin la mai multe specii cum ar fi: S.antibioticus (Enger i Mc Coy, 1965), S.thermodiastaticus (Crawford i Mc Coy, 1972), S.flavogriseus (Ishaque i Kluepfel, 1980), S.olivochromogenes (Mac Kenzie i colab.,1987), S.reticuli (Wachinger i colab., 1989), S.lividans (Theberge i colab., 1992), S.flavovirens SfG3 (Cornea i colab., 1993), dar lista poate continua dac inem cont de tulpinile de Streptomyces care nu au fost ncadrate pn acum ntr-o specie anume. Primele lucrri referitoare la sistemul celulazic de la streptomicete au evideniat faptul c acesta este complex, enzimele componente fiind capabile de a degrada substrate foarte variate: CMC, hrtie de filtru, bumbac, celuloz microcristalin, celobioz dar i paie, tre sau alte deeuri celulozice. Studiind complexul celulazic de la S.flavogriseus, Ishaque i Kluepfel (1980) au stabilit c aceste bacterii produc enzime extracelulare capabile de a degrada, cu o rat diferit, carboximetilceluloza, hrtia de filtru i fibrele de bumbac. De asemenea, tulpina respectiv produce i -glucozidaz dar aceast enzim rmne n cea mai mare parte localizat intracelular. Cercetrile ulterioare realizate asupra unor tulpini aparinnd aceleiai specii (S.flavogriseus) au condus la precizarea c aceste bacterii produc att endoglucanaze ct i exoglucanaze (celobio-hibrolaze)(Mac Kenzie i colab.,1984). Rezultate asemntoare au fost comunicate i de ali autori n cazul unor specii diferite de Streptomyces: S.reticuli (Wachinger i colab., 1989) sau Streptomyces sp.SD16 (Cornea i colab.,1992) (Figura 6). In ceea ce privete stabilirea condiiilor optime de aciune a acestor enzime, exist o oarecare variaie n funcie de tulpina bacterian studiat i de autor. Astfel, n cazul tulpinilor de S.flavogriseus analizate, testarea aciunii enzimelor pe CMC se realizeaz la 500C, n tampon fosfat 50mM pH 6 (Mac Kenzie i colab.,1984) sau n tampon citrat-fosfat 50mM pH 7 (Ishaque i Kluepfel, 1980), n timp ce activitatea enzimatic pe hrtie de filtru sau pe celuloz microcristalin (Avicel) se realizeaz la 400C fie n tampon fosfat 50mM pH 6 (Mac Kenzie i colab.,1984) fie n tampon citrat 50mM pH 5,6 (Ishaque i Kluepfel, 1980). La o alt specie, S.reticuli, testarea activitii celulazelor s-a realizat la 450C n tampon Tris HCl pH 7,5 (Wachinger i colab., 1989). Ali autori (Godden i colab., 1989) testeaz activitatea endoglucanazic a filtratului de cultur de la o tulpin de Streptomyces n tampon fosfat de potasiu 100mM, pH 8 la 500C. Recent, Theberge i colab.(1992) au caracterizat o endoglucanaz de la S.lividans 66 care prezenta o activitate optim la p 5,5 la 500C. O situaie particular a fost
150
evideniat la o tulpin alcalofil de Streptomyces tulpin capabil de a sintetiza trei endoglucanaze diferite, cu pH optim de aciune ce variaz ntre 6 i 8,5 (Nakai i colab.,1988).
Figura 6. Selecia unor noi tulpini de Streptomyces sp. productoare de celulaze.
In cadrul unor exprimente realizate cu o tulpin de Streptomyces sp.SD16 izolat n Institutul de Biologie Bucureti, Cornea i colab. (1992) au nregistrat o activitate endoglucanazic maxim la pH 6,4 la 500C n tampon fosfat de potasiu 50mM. In cazul utilizrii drept substrat a hrtiei de filtru au fost obinute valori maxime de degradare (eliberare de zaharuri reductoare) la 400C n tampon fosfat de potasiu 50mM la pH 5,8 i pH 8 (Figura 7).
Figura 7. Activitatea enzimatic a unor tulpini de streptomicete izolate din sol (dup Cornea i colab., 1992).
Streptomicetele, ca multe alte bacterii, sitetizeaz celobiaz (-glucozidaz) dar n mod normal nu o excret n mediul de cultur ci ea rmne localizat intracelular. Studii mai amnunite asupra acestui tip de enzime au fost realizate la tulpini de S.granaticolor (Jiresova i colab.,1987) la care s-a ncercat izolarea i caracterizarea enzimei, ca i la S.thermodiastaticus (Ozaki i Yamada, 1991). La aceast ultim specie a fost obinut o tulpin care produce o glucozidaz a crei sintez nu este afectat de glucoz, enzima fiind purificat i caracterizat. Alturi de aceast enzim rezistent la aciunea glucozei, de la aceeai tulpin bacterian au mai
151
fost izolate nc dou enzime de acelai tip (-glucozidaze) dar a cror sintez este supus inhibrii de ctre glucoz. Un aspect interesant al cercetrilor referitoare la celulazele produse de bacteriile din genul Streptomyces este izolarea i purificarea componentelor acestui sistem. Spre deosebire de bacteriile din genul Thermomonospora la care au fost bine caracterizate cinci endoglucanaze diferite (E1-E5) dintre care E3 prezint sinergism att cu alte endoglucanaze ct i cu o celobiohidrolaz izolat de la Trichoderma reesei (Wilson, 1992), la streptomicete asemenea rezultate sunt mai puine. Nakai i colab.(1987) au purificat i caracterizat de la o tulpin alcalofil de Streptomyces (Streptomyces sp.KSM9) trei celulaze diferite care degradeaz preferenial CMC i care au fost notate CMC-aza I, CMC-aza II i CMC-aza III. Greutile moleculare ale acestor enzime variaz ntre 32 kDa (CMC-aza I), 32,5 kDa (CMC-aza II) i 92 kDa (CMC-aza III). Purificarea i separarea celor trei enzime s-a realizat prin cromatografie pe schimbtori de ioni, prin trecerea pe o coloan de DEAE-Toyopearl 650M a unui preparat celulazic brut, rezultat prin precipitarea cu sulfat de amoniu (70%) a proteinelor din filtratul de cultur i eluarea lor cu un gradient linear de NaCl (0,05-0,4M). Ali autori (Wachinger i colab.,1989) au fracionat celulazele de la S.reticuli prin gel filtrare pe Superose 12 i au obinut cel puin dou CMC-aze precum i mai multe proteine cu activitate pe celuloza microcristalin. CMC-azele, notate CMC-aza 1 de 40 kDa i CMC-aza 2 de 48 kDa prezint un pH optim de aciune ce variaz ntre 5,5 i 7,5 la o temperatur de 45-500C. De asemenea ele nu sunt inhibate de tamponul fosfat i nu sunt stimulate de adugarea de ioni de calciu n amestecul de reacie. Spre deosebire de acestea, preparatul enzimatic ce prezint activitate specific pe Avicel, supus electroforezei n gel de poliacrilamid n condiii de denaturare a evideniat prezena a mai multor benzi cu greuti moleculare ce au variat ntre 42 i 120 kDa (42, 56, 70, 120). Preparatul enzimatic obinut prin gel filtrare a avut o temperatur optim de aciune la 45-500C la un pH optim 7. Activitatea celulazic pe substrat de Avicel este redus semnificativ n tampon fosfat, dar este stimulat de adugarea de CaCl2 40mM i de asemenea ea este pierdut rapid, n decursul a ctorva zile prin pstrare la 40C, n timp ce CMC-azele sunt mult mai stabile. Proprietile avicelazei de la S.reticuli sunt foarte asemntoare celor descrise pentru exoglucanaza de la Ruminococcus albus care a fost izolat sub forma unui complex de 230 kDa, alctuitdin monomeri de 118 kDa (Gardner i colab., 1987). Recent, Theberge i colab.(1992) au purificat i caracterizat o endoglucanaz de la S.lividans 66 dup cultivarea bacteriilor pe mediu cu xiloz ca surs de carbon. Aceasta este o glicoprotein cu greutatea molecular de 46 kDa, cu pI la 3,3 i cu o activitate maxim asupra CMC la 500C la pH 5,5. Interesant este c prin cultivarea bacteriilor n mediu cu Avicel sau celobioz ca surs principal de carbon s-a obinut un preparat enzimatic alctuit din mai multe proteine de dimensiuni variate, dar active pe oligozaharide i care au interacionat pozitiv cu anticorpii anti-endoglucanaz. Fenomenul respectiv a fost observat la celulazele de la Trichoderma reesei i de la Clostridium thermocellum, el datorndu-se n cazul fungilor fie unui grad diferit de glicozilare a proteinelor fie unor modificri proteolitice. In cazul bacteriilor fenomenul s-ar putea explica prin formarea unor complexe enzimatice specifice, celulosomi, doar n prezena substratelor microscristaline. Autorii presupun ns c apariia fragmentelor endoglucanazice la S.lividans 66 s-ar datora mai degrab unei serii de fenomene proteolitice dect unei glicozilri difereniate sau formrii celulosomilor. In orice caz, activitatea specific a endoglucanazei de S.lividans comunicat de autori a fost de 539 IU/mg protein, ceea ce reprezint una dintre cele mai mari valori raportate n literatur (Theberge i colab.,1992). Rezultate interesante au fost obinute i de Mac Kenzie i colab.(1984) care au reuit, printre puinii cercettori de altfel, izolarea i caracterizarea unei exoglucanaze de la o tulpin de S.flavogriseus. Aceasta s-a realizat prin cromatografie pe DEAE Bio-Gel A a unui preparat brut obinut prin concentrarea de 100 ori a filtratului de cultur (prin ultrafiltrare). Eluarea enzimelor
152
s-a fcut cu un gradient linear de NaCl (0-0,2M) obindu-se mai multe "peak-uri" cu activitate celulazic. Cinci dintre acestea au prezentat activitate CMC-azic iar unul a evideniat o activitate enzimatic complex (avicelazic, CMC-azic, xilanazic i proteazic). Fraciile care au prezentat cea mai mare activitate avicelazic au fost supuse gel filtrrii pe Bio-Gel P60 reuindu-se separarea avicelazei de CMC-az. Fraciile active au fost apoi trecute pe o coloan de Concanavalin A-Sefaroz 4B, fiind recuperat o protein de 46 kDa care nu a prezentat afinitate pentru coloana respectiv (pentru lectina imobilizat). Aceast protein prezint pI la 4,15, determin n special hidroliza celulozei tratate cu acizi ("acid-swollen cellulose"), produii de hidroliz fiind celobioza i celotrioza (n cea mai mare parte). Datele obinute la streptomicete, n special de la tulpinile de S.flavogriseus evideniaz faptul c mecanismul de aciune al celulazelor de la aceste bacterii este mai degrab asemntor celui descris la fungi la care degradarea substratelor celulozice se datoreaz aciunii sinergice a endoglucanazelor, exoglucanazelor i -glucozidazei. De asemenea, glicozilarea unora dintre componentele sistemului celulazic de la streptomicete (a endoglucanazelor, de exemplu), fenomen care este destul de puin rspndit la bacterii dar frecvent la fungi poate sugera un comportament asemntor al celulazelor de la streptomicete cu cel al unor fungi. In ceea ce privete semnificaia glicozilrii, dei unii autori atribuie glucidului un rol n funcionarea enzimei, ea rmne nc neclar (Knowles i colab.,1987). Cu toate acestea explicarea mecanismului de aciune a celulazelor de la streptomicete este complicat de faptul c la unele tulpini bacteriene, la S.reticuli de pild, au fost identificate celulaze legate de miceliu ("mycelium buond cellulase") care amintesc de formarea celulosomilor de la Clostridium thermocellum (Lamed i Bayer, 1988; Wachinger i colab.,1989). O organizare a celulazelor n celulosomi similar celei evideniate la clostridii a fost descris i la Thermomonospora curvata dei studiile au fost n special de microscopie electronic (Figura 8).
Figura 8. Aspect electronomicroscopic al suprafeei celulelor de T.curvata cultivate pe fibre de celuloz (dup Bond i Stutzberger, 1989).
Modificarea aspectului suprafeei celulelor de streptomicete cultivate n mediu de cultur ce conine celuloz drept unic surs de carbon a fost observat la tulpinile Streptomyces sp.SD16 i Streptomyces sp.P216 (Figura 9) (Cornea, 1996). Aceste rezultate sugereaz c fenomenul complexrii sistemului celulazic este comun mai multor tipuri de bacterii iar mecanismul de degradare a celulozei este mai complicat dect s-a presupus iniial (Ljungdahl 1989).
153
Figura 9. Aspect electronomicroscopic al celulelor Streptomyces sp.SD16 cultivate n mediu minimal ce conine celuloz.
In ceea ce privete determinismul genetic al producerii enzimelor celulozolitice, datele referitoare la streptomicete sunt destul de puine i incomplete. In general, clonarea i secvenierea unei gene structurale pentru o enzim este util nu numai pentru determinarea secvenei de aminoacizi pe care proteina i conine ci i pentru a obine proteina n cantitate mai mare ca i pentru studii de mutagenez care s determine rolul anumitor secvene de aminoacizi n funcionarea enzimei. Clonarea prezint interes mai ales pentru celulaze deoarece prezena mai multor gene care codific aceste enzime la majoritatea microorganismelor celulozolitice face dificil att obinerea de mutante ct i studiul rolului fiecrui component n parte. Pn n prezent s-a reuit izolarea, secvenierea i clonarea n diferite tulpini mutante de S.lividans (care nu produc celulaze) sau n E.coli a trei gene implicate n sinteza celulazelor la streptomicete: gena casA ce codific CMC-aza I de la o tulpin alcalofil de Streptomyces sp. (Nakai i colab.,1988), gena celA ce codific o endoglucanaz de la S.lividans 66 (Theberge i colab.,1992) i gena celA1 ce codific o endoglucanaz de la S.halstedii (Fernandezabalos i colab.,1992). De asemenea, Shareck i colab.(1987) au realizat clonarea ntr-o tulpin mutant de S.lividans (care nu producea celulaze) a unei secvene de ADN care a determinat nu numai restabilirea capacitii de a degrada celuloza ci i o sporire de peste 800 ori a activitii enzimatice comparativ cu tulpina slbatic. Interpretarea rezultatelor n acest caz rmne dificil deoarece genele clonate nu au fost analizate astfel c nu se poate preciza dac secvenele de ADN clonate conin gene ce codific celulaze (endoglucanaze) sau proteine reglatoare. Secvenierea genelor casA i celA a relevat prezena unei secvene de 14 pb repetate inversat, plasat naintea regiunii ce codific proteinele respective, secven identificat i la nivelul genelor celE2, celE4 i celE5 de la Thermomonospora fusca (Wilson, 1992; Theberge i colab., 1992). De asemenea, din examinarea secvenelor de aminoacizi deduse din examinarea secvenelor de nucleotide ale genelor casA i celA i compararea lor cu secvenele de aminoacizi ale altor celulaze au fost evideniate elementele structurale ale celulazelor respective, aa cum au fost ele propuse de Gilkes i colab.(1991): domeniile catalitice, domeniile de legare la celuloz, linkerii ce unesc asemenea domenii i secvenele repetate de aminoacizi. Spre exemplu, endoglucanaza produs de S.lividans 66 (codificat de gena celA) este alctuit din dou domenii (domeniul catalitic i domeniul de legare la celuloz) conectate de un linker scurt, extremitatea amino-terminal evideniind un grad nalt de omologie cu domeniul de legare la celuloz ("cellulose-binding domain") al endoglucanazei CenA de la Cellulomonas fimi, iar regiunea din
154
mijlocul proteinei prezint omologie extins cu celulaza E5 de la T.fusca i alte endoglucanaze de Bacillus (Theberge i colab., 1992). Conform propunerilor lui Henrissat i colab.(1989) i Gilkes i colab.(1991) de grupare a celulazelor n familii pe baza secvenelor de aminoacizi de la nivelul domeniilor catalitice conservate la mai multe microorganisme i a analizei regiunilor ("clusteri") hidrofobe, endoglucanazele ale cror gene au fost clonate i secvenializate (casA i celA) pot fi ncadrate n familia A (celA), alturi de endoglucanaze de la Clostridium thermocellum, B.subtilis, Bacillus sp., Erwinia chrosanthemi, Ruminococcus albus, Clostridium cellulolyticum etc, i n familia B (casA) alturi de endoglucanaze de la Cellulomonas fimi, Microbispora bispora i o celobiohidrolaz de la Trichoderma reesei. Reglarea activitii celulazelor reprezint un alt aspect al cercetrilor cu aceste enzime, n scopul stabilirii condiiilor optime de producere i aciune a acestora. La fel ca i n cazul mecanismului de degradare a substratelor celulozice, mecanismul de reglare a sintezei i activitii celulazelor este destul de neclar. O ipotez general susine c microorganismele celulozolitice produc celulazele la un nivel bazal care este ns suficient pentru a asigura hidroliza celulozei insolubile, rezultnd produi de degradare care pot funciona ca inductori determinnd sinteza unor cantiti crescute de celulaze (Robson i Chambliss, 1989). Ca i alte enzime hidrolitice extracelulare i celulazele se sintetizeaz ca rspuns la prezena inductorului, ele fiind represate de obicei de produii finali de degradare. In cazul actinomicetelor exist mai multe date referitoare la reglarea celulazelor la bacteriile din genul Thermomonospora. Astfel, sinteza celulazelor de ctre T.fusca este reglat att prin inducere ct i prin represie (Liu i Wilson, 1987). Wilson (1992) a artat c tulpina T.fusca YX cultivat pe celuloz a evideniat o activitate celulazic de 100 ori mai mare dect cea obinut prin cultivarea n mediu cu glucoz ca surs unic de carbon. Ali autori (Fennington i colab.,1984) au obinut o tulpin mutant de T.curvata capabil de a rezista la aciunea inhibitoare a glucozei. Liu i Wilson (1988) au reuit izolarea unei tulpini mutante de T.fusca YX care sintetiza n mod constitutiv celulaze, dar sinteza lor era supus n continuare represiei produse de glucoz. Spre deosebire de bacteriile din genul Thermomonospora, la streptomicete exist foarte puine date referitoare la reglarea sintezei celulazelor iar cele care exist sunt oarecum contradictorii. Astfel, Mac Kenzie i colab.(1984) au artat c activitatea celulazelor de la S.flavogriseus este inhibat de concentraii mai mari de glucoz i celobioz, n timp ce Ball i Mc Carthy (1988) susin c n cazul unor tulpini de Streptomyces izolate de ei glucoza i xiloza nu exercit efect inhibitor asupra enzimelor implicate n degradarea deeurilor celulozice de tipul paielor. In orice caz, cultivarea bacteriilor pe mediu ce conine celuloz pulbere sau CMC are drept consecin inducerea sintezei doar a enzimelor celulazice n timp ce prin cultivarea bacteriilor pe medii mai complexe (cu paie, xilan sau tre de gru) are loc inducerea unei game mai largi de enzime hidrolitice: att celulaze ct mai ales hemicelulaze (Mac Kenzie i col., 1987, Godden i colab., 1989). Spre exemplu, Godden i colab. (1989) utiliznd pentru testri o tulpin de Streptomyces sp. a evideniat faptul c endoglucanazele i -glucozidazele sunt induse specific prin cultivarea pe mediu cu CMC ca surs de carbon. Celobioza a evideniat o slab aciune de inducere a sintezei endoglucanazelor, dar induce -glucozidaza n timp ce celotrioza i celotetraoza induc slab endoglucanazele. Obinerea unei activiti celulazice specifice ridicate n filtratele de cultur rezultate prin cultivarea bacteriilor pe substratele celulozice naturale (de exemplu paie) se datoreaz probabil unei cooperri dintre diferiii inductori rezultai din aciunea componentelor complexului lignocelulozic. Mai mult, inducerea sintezei celulazelor este inhibat de adugarea a 50 g/ml cloramfenicol ceea ce ar sugera c , cel puin n cazul tulpinii analizate, inducerea enzimelor este mai degrab o sintez "de novo" (Godden i colab. 1989).
155
3.5. Hemicelulazele Alturi de celuloz i lignin, hemicelulozele reprezint componente de baz ale peretelui celular vegetal, degradarea lor n natur realizndu-se destul de greoi, prin cooperarea unor sisteme enzimatice de origini foarte diferite. Intre microorganismele productoare de hemicelulaze un loc important este ocupat de streptomicete datorit sintezei unei game foarte variate de asemenea enzime. Hemicelulozele sunt polizaharide care conin diferite tipuri de resturi de zaharuri (xiloz, manoz, galactoz, arabinoz sau glucoz) ce alctuiesc polimeri lineari sau ramificai. Clasificarea acestor substane se face n funcie de coninutul n zaharuri. Dintre acestea, -1,4D-xilanii reprezint grupul major de hemiceluloze fiind alctuii din resturi de D-xilopiranozil unite prin legturi de tip -1,4. In muli xilani resturile de D-xilopiranozil sunt ntocmite de arabinozil, glucuronozil sau diferite grupri acetil, n funcie de planta de origine. Un alt grup de hemiceluloze, mananii snt constituii din resturi de D-manopiranozil unite tot prin legturi de tip -1,4. Si n cazul acestor polimeri unitile specifice de D-manopiranozil pot fi nlocuite de Dgalactozil sau grupri acetat (Zimmermann, 1989). Hemicelulozele reprezint un important component al peretelui celular vegetal, ele putnd fi linkate la compui fenolici sau pot prezenta legturi cu lignina. Sistemul enzimatic pentru degradarea hemicelulozelor const n enzime care cliveaz legturile din interiorul macromoleculei (endoenzime) i n exoenzime care taie resturile de zaharuri de la extremitile nereductoare ale polimerului. Prezena unor substitueni variai influeneaz puternic hidroliza enzimatic. De aceea, pentru hidroliza complet a hemicelulozelor sunt necesare enzime care s taie n diferite puncte de ramificaie. In sistemul xilanolitic, aceste enzime acioneaz n cooperare cu xilanazele pentru hidroliza complet a xilanilor (Biely, 1985). Tinnd cont de habitatul natural al streptomicetelor i de prezena n acesta a unei mari cantiti de materiale celulozice i lignocelulozice, bacteriile respective pot fi considerate ca o surs potenial de enzime hemicelulozolitice (Zimmermann i colab., 1992). Sistemul enzimatic de degradare a xilanului de la diferite tulpini de Streptomyces a fost studiat n detaliu. La aceste bacterii au fost identificate mai multe tipuri de hemicelulaze: xilanaze, -xilozidaze, -L-arabinofuranozidaze, -4-O-metil-glucuronidaze, acetil-xilan esteraze, ferulic i cumaric esteraze, enzime ce degradeaz mananii (mananaze). Dintre acestea, 1,4--D-xilanazele (EC 3.2.1.8.) au fost mai mult studiate, ele fiind detectate la numeroase tulpini de Streptomyces (Ball i Mc Carthy, 1988). De asemenea, s-a evideniat faptul c aceeai tulpin poate produce mai multe xilanaze distincte. Spre exemplu, S.ostreogriseus i S.exfoliatus produc cte 5 asemenea enzime n timp ce S.lividans produce o singur asemenea xilanaz (Sreenath i Joseph, 1982; Morosoli i colab.,1986). Recent, Lumba i Penninchx (1992) au caracterizat mai multe forme de -xilanaz izolate de la o tulpin de Streptomyces cultivat pe lignoceluloz. Interesant ns c n cazul acestei tulpini, formele de -xilanaz evideniate nu acioneaz sinergic pentru hidrolizarea substratului ceea ce ar constitui o redundan a crei semnificaie nu este clar. Pentru purificarea i caracterizarea xilanazelor de la diferite streptomicete (Tabelul 6) sau utilizat filtrate de cultur din care enzimele au fost precipitate cu sulfat de amoniu i apoi supuse unor tratamente speciale: ultrafiltrare, cromatrografie pe schimbtori de ioni, gel filtrare i focusare izoelectric ("isoelectric focusing")(Sreenath i Joseph, 1982; Morosoli i colab., 1986; Mac Kenzie i colab., 1987; Yasui i colab., 1988). Cele mai multe dintre aceste enzime au pH ntre 5 i 6,5 iar punctul lor izoelectric variaz ntre 5,2 i 10,3 (Zimmermann, 1989). Xilanazele determin hidroliza xilanilor prin ruperea legturilor interne -1,4, determinnd eliberarea de xilotrioz, xilobioz sau xiloz (Yasui i colab., 1988). Un alt tip de hemicelulaze produse de streptomicete, exo--1,4-xilozidazele (1,4156
-D xylan xylohydrolase, EC 3.2.1.37) hidrolizeaz xilanii prin atac la extremitile nereduc toare ale lanului de polimer. Tabelul 6. Proprietile unor xilanaze izolate din diferite tulpini de streptomicete. Tulpina S.xylophagus S.flavogriseus CD45-2 S.exfoliatus Streptomyces sp. KT23 S.lividans Streptomyces sp.E86 pH optim 6,5 6,5 5,5 5,5 5,5-6,5 5,5-6,2 t0 optim 55-60 50 50 55 55-65 55-60 pI 6,9 5,2 7,3 greutate molecular (kDa) 43 40
Eliberarea de resturi -L-arabinoz din arabinoxilani, arabinani i arabinogalactani se datoreaz aciunii specifice a -L-arabinofuranozidazelor, enzime evideniate la unele specii de Streptomyces (S.rubiginosus, S.purpurascens, S.massasporus) (Zimmermann, 1989). Alte enzime, -4-O-metilglucironidaze, evideniate la S.flavogriseus i S.olivochromogenes (Mac Kenzie i colab., 1987) determin clivarea legturilor -1,2 dintre acidul glucuronic i resturile de xiloz, acionnd sinergic cu xilanazele n procesul de hidroliz a xilanilor. Pe lng aceste tipuri de hemicelulaze, unele tulpini de Streptomyces mai pot sintetiza i alte enzime care hidrolizeaz alte specii de xilani. Acetil-xilan esterazele produse de S.olivochromogenes i S.rubiginosus particip alturi de xilanaze la hidroliza acetil-xilanilor n timp ce alte tulpini de Streptomyces (S.viridosporus) pot produce ferulic esteraze care elibereaz acid ferulic din arabinixilanii aflai n cantiti mai mari n peretele celular al gramineelor (Mac Kenzie i colab., 1987; Deobald i Crawford, 1987). O categorie mai puin studiat de hemicelulaze produse de streptomicete (innd cont de literatura de specialitate) este reprezentat de mananaze (1,4--D-manan mananohidrolaza, EC 3.2.1.78.) evideniate la unele tulpini de S.olivochromogenes sau la alte specii. Utilizarea tehnicilor de biologie molecular i implicit a celor de inginerie genetic n studiul hemicelulazelor de la streptomicete a permis izolarea i caracterizarea genelor implicate n producerea unor asemenea enzime. Astfel, Mondou i colab.,(1986) au raportat clonarea unei gene pentru endoxilanaz de la S.lividans ntr-o tulpin mutant neproductoare. Clonele ce conineau un fragment de ADN de 2kb au evideniat o cretere de peste 60 ori a producerii de xilanaz comparativ cu tulpina slbatic . De asemenea, Iwasaki i colab.(1986) au realizat transferul genei pentru xilanaz izolat de la o tulpin de Streptomyces n alte dou tulpini de streptomicete - S. lividans i S. kasugaensis - la care s-a observat o cretere a nivelului de sintez a enzimei respective prin achiziionarea unui fragment de ADN de 1,04kb. Alturi de clonrile de gene, fuziunile de protoplati constituie o metod relativ simpl dar eficient de a obine tulpini recombinate genetic, capabile de o mai bun degradare a substratelor complexe. Astfel, Pettey i Crwford (1984) au obinut o mbuntire a capacitii de degradare a hemicelulozelor i ligninei de ctre o tulpin recombinat obinut prin fuziunea interspecific de protoplati de la S.viridospurus T7A i S.setonii 75 Vi2. Rezultate asemntoare au for prezentate de Cornea i colab.(1992) care, n urma fuziunii protoplatilor de S.flavovirens SfG3 cu protoplati izolai de la Streptomyces sp.SD16 au obinut mai multe tulpini recombinate genetic care prezentau o capacitate crescut de degradare a substratelor celulozice i hemicelulozice comparativ cu tulpinile parentale (Figura 10).
157
Uneori, enzimele produse de diferite tulpini de streptomicete (preparate brute sau enzime purificate) au fost studiate n privina aciunii lor asupra peretelui celulei vegetale sau al unor fungi. Astfel, Cornea i colab.(1992) au evideniat faptul c prin utilizarea unui filtrat de cultur de Streptomyces sp.SD16 s-au putut obine n condiii experimentale specifice protoplati vegetali de Nicotiana tabacum. Acest rezultat sugereaz faptul c filtratul de cultur conine o mare varietate de enzime asemntoare celulazelor, hemicelulazelor dar i alte enzime care coopereaz n degradarea peretelui celular vegetal.
Figura 10. Comparaie ntre activitatea enzimatic (celulozolitic) a unor tulpini de streptomicete de tip slbatic (P216, SD16 i SFG3) i a unor recombinani obinui prin fuziune triparental de protoplati.
In ceea ce privete aciunea pe peretele celular fungic, s-a dovedit c printre enzimele sintetizate de unele tulpini de Streptomyces se numr i chitinazele, enzimele ce degradeaz componenta chitinic (dominant) a peretelui celular fungic ducnd la formarea protoplatilor (Tagawa i Okazaki, 1991). Okazaki i Tagawa (1991) au izolat i caracterizat o chitinaz produs de S.cinereoruber dup cultivarea pe un mediu ce coninea ca surs de carbon perei celulari de Aspergillus niger. Enzima respectiv are o greutate molecular de 19 kDa i un pI 8,6 iar pH optim se situeaz n domeniul acid (4,0-5,0) la 500C. Beyer i Diekeman (1984) au caracterizat enzime de tip laminarinaz de la Streptomyces sp.ATCC11238 ca i un complex de enzime ce degradeaz eficient chitina i laminarina, fiind active asupra a peste 50 specii de ascomicete. Fracionarea chitinazei prin gel filtrare i cromatografie pe schimbtori de ioni a condus la evidenierea unei exo-chitinaze i a unei -Nacetil-glucozoaminidaze ce elibereaz N-acetil glucozamina din crusta chitinoas de crab (Beyer i Diekman, 1985). In mod asemntor, Billich i colab.(1988) au obinut protoplati de Fusarium scirpi prin utilizarea unui preparat enzimatic de S.tsushimaensis. Datele prezentate n aceast lucrare reflect particularitile deosebite ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus i importana pe care acestea o au att din punct de vedere teoretic ct i practic, fie pentru obinerea unor compui cu aplicaii in medicin, industria alimentar, a detergenilor etc. fie n natur, ca verigi importante ale mecanismelor de degradare i reciclare a unor resturi organice existente de obicei n sol. Cunoaterea echipamentului lor enzimatic, al potenialului lor de biosintez ca i al determinismului genetic al acestuia corelat cu tehnicile moderne de biologie molecular i cu cele de fuziuni celulare asigur, pe de o parte, o mai bun studiere a caracteristicilor acestor bacterii, inclusiv a taxonomiei grupului iar, pe de alt parte, poate conduce la obinerea unor tulpini recombinate genetic capabile de a sintetiza sau degrada cu o eficien crescut anumii compui cu importan practic deosebit.
158
Bibliografie selectiv
1. Aretz, W., Koller, K. P., Riess, G., 1989, Proteolytic enzymes from recombinant Streptomyces lividans TK24, FEMS Microbiol. Letts., 65, p.31-36. 2. Ball, A. S., Mc Carthy, A. J., 1988, Saccharification of straw by actinomycetes enzymes, J. Gen. Microbiol., 134, p.2139-2147. 3. Baltz, R. H., Seno, E. T., 1988, Genetics of Streptomyces fradiae and tylosin biosynthesis, Ann. Rev. Microbiol., 42, p. 547-574. 4. Bayer, E. A., Setter, E., Lamed, R., 1985, Organization and distribution of the cellulosome in Clostridium thermocellum, J. Bact., 163, p.552-559. 5. Beguin, P., 1990, Molecular biology of cellulose degradation, Ann. Rev. Microbiol., 44, p. 219-248. 6. Beyer, M., Diekman, H., 1985, The chitinase system of Streptomyces sp. ATCC 11238, Appl. Microbiol. Biotechnol., 23, p. 140-146 7. Billich, A., Keller, U., Kleinkauf, H., Zocher, K., 1988, Production of protoplasts from Fusarium scirpi by lytic enzymes from Streptomyces tsusimaensis, Appl. Microbiol. Biotechnol., 28, p.442-444 8. Binnie, C., Warren, M., Butler, M. J., 1989, Cloning and heterologous expression in S.lividans of S.rimosus genes involved in oxytetracycline biosynthesis, J. Bact., 171, p. 887895 9. Bond, K., Stutzenberger, F., 1989, A note on the localization of cellulosome formation in Thermomonospora curvata, J. Appl. Bacteriol., 67, p. 605-609. 10. Bonner, M. A., Stutzenberger, F., 1988, Cell surface changes in Thermomonospora curvata during cellulase induction and repression, Letts. Appl. Microbiol., 6, p.59-63. 11. Buttner, M. J., Smith, A. M., Bibb, M. J., 1988, At least three different RNA polymerase holoenzymes direct transcription of the agarase gene (dagA) of S.coelicolor A3(2), Cell, 52, p. 599-607. 12. Chardon-Loriaux, I., Charpentier, M., Percheron, F., 1986, Isolation and characterization of a linear plasmid from Streptomyces rimosus, FEMS Microbiol.Letts., 35, p.151-155. 13. Chater,K., Bruton,C.J., 1985, Resistance, regulatory and production genes for the antibiotic methylenomycin are clustered, EMBO.J., 4, p.1893-1900. 14. Cornea, 1996, Obinerea unor bacterii cu importan biotehnologic prin fuziunea i transformarea genetic a protoplatilor, Tez de doctorat, Universitatea Bucureti. 15. Cornea, C. P., Coglniceanu, G., Brezeanu, A., Vatafu, I., Savu, L., Popescu, I., Pop, A., 1992, Obinerea protoplatilor de tutun prin utilizarea unui preparat enzimatic brut de Streptomyces sp. SD16, St. Cercet. Biol., 44, p. 85-88. 16. Cornea, C. P., Vatafu, I., Pop, A., Brezeanu, A., Savu, L., Dobrot, S., 1993, Interspecific protoplast fusion in Streptomyces, Rev. Roum. Biol., 38, p. 49-53. 17. Cornea, C. P., Vatafu, I., Savu, L., 1994, Plasmid transfer by protoplast fusion, Microbiol. Ind. Biotehnol., 8, p. 145-148. 18. Coughlan, B. P., 1988, Staining techniques for the detection of the individual components of cellulolytic enzyme system, Methods in Enzymology, 160, p. 135-145. 19. Cundliff, E., 1989, How antibiotic-producing organims avoid suicide, Ann. Rev. Microbiol., 43, p. 207-233. 20. Damude, H. G., Gilkes, N. R., Kilburn, D. G., Miller, R. C., Warren, R. A., 1993, Endoglucanase Cas A from alkalophilic Streptomyces strain KSM-9 is a tipical member of family B of -1,4-endoglucanase, Gene, 123, p. 105-107. 21. Davies, J., 1990, What are antibiotics? Archaic functions for modern activities, Molec. Microbiol. , 4 (8), p. 1227-1232.
159
22. Deobald, L. A., Crawford, D. L., 1987, Activities of cellulase and other extracellular enzymes during lignin solubilization by Streptomyces viridosporus, Appl. Microbiol. Biotechnol., 28, p. 158-163. 23. Dimcev, A., 1988, Protoplast from antibiotic-producing actinomycetes. Application in the biotechnology, Biotechnol. Bioeng., 4, p. 12-19. 24. Doyle, R. J., 1994, Introduction to lectins and their interactions with microorganisms, in Lectin-Microorganism Interaction, Eds. R.J.Doyle si M.Slifkin, Marcel Dekker Inc., p. 1-65. 25. Duitman, E., Hamoen, L., Rembold, M., Vater, L., 1999, The mycosubtilin synthetase of Bacillus subtilis ATCC6633: A multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an amino transferase, and a fatty acid synthase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 96 (23), 1329413299. 26. Felix, C. R., Ljungdahl, L. G., 1993, The cellulosome: the exocellular organelle of Clostridium, Ann. Rev. Microbiol., 47, p. 791-819. 27. Fernandez-Abalos, J. M., Sanchez, P., Coll, P. M., Villanueva, J. R., Perez, P., Santamaria, R. I., 1992, Cloning and nucleotide sequence of celA1, an endo--1,4-glucanase-encoding gene from Streptomyces halstedii JM8, J. Bacteriol., 174, p. 6338-6376. 28. Ghangas, G. S., Wilson, D. B., 1988, Cloning of the Thermomonospora fusca endoglucanase E2 gene in Streptomyceslividans: affinity purification and functional domains of the cloned gene product, Appl. Envir. Microbiol., 54, p. 2521-2526. 29. Gilbert, H. J., Hazlewood, G. P., 1993, Bacterial cellulases and xylanases, J. Gen. Microbiol., 139, p. 187-194. 30. Godden, B., Legon, T., Helvenstein, P., Penninckx, M., 1989, Regulation and production of hemicellulolytic and cellulolytic enzymes by a Streptomyces sp. growing on lignocellulose, J. Gen. Microbiol., 135, p. 285-292. 31. Gokhale, D. V., Deobagkar, D. N., 1989, Differential expression of xylanase and endoglucanase in the hybrid derived from intergeneric protoplast fusion between Cellulomonas sp. and Bacillus subtilis, Appl. Envir. Microbiol., 55, p. 2675-2680. 32. Gormley, E. P., Cantwell, B. A., Barker, P. J., Mc Connell, D. J., 1988, Secretion and processing of the Bacillus subtilis endo--1,3-14-glucanase in Escherichia coli, Molec. Microbiol, 2, p. 813-819. 33. Horikoshi, K., Nakao, M., Kurono, Y., Sashihara, N., 1984, Cellulases of an alkalophilic Bacillus strain isolated from soil, Can. J. Microbiol., 30, p. 774-779. 34. Imanaka, T., 1986, Application of recombinant DNA technology to the production of useful biomaterials, Adv. Biochem. Eng., 33, p. 1-27. 35. Ishaque, M., Kluepfel, D., 1980, Cellulase complex of a mesophilic Streptomyces strain, Can. J. Microbiol., 26, p. 183 189. 36. Kakoniova, D., Labudova, I, Liskova, D., 1987, Callus culture as substrate for the production of specific cell wall degradind enzymes for derived protoplast isolation, Biotechnol. Letts., 9, p. 721-724. 37. Kinashi, H., 1988, Giant linear plasmids in Streptomyces and antibiotic production, in Biology of Actinomycetes '88, Japan Scientific Societies Press, p. 117-122. 38. Kinashi, H., 1989, Giant linear plasmids in various methylenomycin-producing strains of Streptomyces species, in Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, Ed. C. L. Hershberger, S. W. Queener, G. Hegeman, ASM, p. 141-146. 39. Kirby, R., Hopwood, D. A., 1977, Genetic determination of methylenomycin biosynthesis by the SCP1 plasmid of Streptomyces coelicolor A3(2), J. Gen. Microbiol., 98, p. 239-252. 40. Kluepfel, D., Shareck, F., Mondou, F., Morosoli, R., 1986, Characterization of cellulase and xylanase activities of Streptomyces lividans, Appl. Microbiol. Biotechnol., 24, p. 230-234. 41. Lamed, R., Naimark, J., Morgenstern, E., Bayer, E. A., 1987, Specialized cell surface structures in cellulolytic bacteria, J. Bacteriol., 169, p. 3792-3800.
160
42. Mansouri, K., Pissowotzki, K., Distler, J., Ebert, A., Piepersberg, W., 1989, Genetics of streptomycin production, n Genetics and molecular biology of industrial microorganisms, Ed. Hershberger, C. L., Queener, S. W., Hegeman, G., ASM, p. 61-67. 43. Martin, J. F., 1989, Molecular mechanisms for the control by phosphate of the biosynthesis of antibiotics and other secondary metabolites, n Regulation of secondary metabolism in Actinomycetes, Ed. S. Shapiro, Boca Raton, CRC, p. 230-251. 44. Martin, J. F., Liras, P., 1989, Organization and expression of genes involved in the biosynthesis of antibiotics and other secondary metabolites, Ann. Rev. Microbiol., 43, p. 173206. 45. Mc Carthy, A. J., Williams, S. T., 1992, Actinomycetes as agents of biodegradation in the environment - a review, Gene, 115, p. 189-192. 46. Nakano, M. N., Butsuya, I., Ogawara, H., 1989, Expression of the kanamycin resistance gene in a kanamycin-producing strain of S. kanamyceticus, J. Antib., 42, p. 423-430. 47. Nakano, M. N., Mashiko, H., Ogawara, H., 1984, Cloning of the kanamycin resistance gene from a kanamycin producing Streptomyces species, J. Bact., 157, p. 79-83. 48. Okanishi, M., Katagiri, K., Furumai, T., Takeda, K., Kawagichi, K., Saitoh, M., Nabeshima, S., 1983, Basic techniques for DNA cloning and conditions required for streptomycetes as host, J. Antib., 36, p. 99-108. 49. Okuda, T., Ito, Y., 1982, Biosynthesis and mutasynthesis of aminoglycoside antibiotics, n Aminoglycoside antibiotics, Ed. Umezawa, H., Hooper, I. R., Springer Verlag., p. 111-203. 50. Omich, P. K., 1988, Streptomyces cloning: useful recombinant DNA systems and a summation of cloned genes, Antim. Ag. Chemoth., 32, p. 1465-1471. 51. Peberdy, J. F., Illing, G. T., 1985, Genetic manipulation of antibiotic producer strains, in The Scientific Basis of Antimicrobial Chemotherapy, Ed. D. Greenwood, F. O' Grady, p.283-322. 52. Pettey, T. M., Crawford, D. L., 1984, Enhancement of lignin degradation in Streptomyces spp. by protoplast fusion, Appl. Envir. Microbiol., 47, p. 439-440. 53. Pokorny, M., Vitale, L., 1980, Enzymes as by-products during biosynthesis of antibiotics, n Industrial and Clinical Enzymology, Ed. Vitale, L., Simeon, V., Pergamon Press Oxford, p. 13-25. 54. Pongs, O., 1979, Cloramphenicol, n Antibiotics, Ed.Hahn, F. E., Springer Verlag, 5, p. 26-42. 55. Ramachandra, M., Crawford, D. L., Pometta, A. L., 1987, Extracellular enzyme activities during lignocellulose degradation by Streptomyces spp.: a comparative study of wild-type and genetically manipulated strains, Appl. Envir. Microbiol., 53, p. 2754-2760. 56. Robson, J. M., Chambliss, G. H., 1989, Cellulases of bacterial origin, Enzyme Microbiol. Technol., 11, p. 626-644. 57. Schlochtermeier, A., Miemeier, F., Schrempf, H., 1992, Biochemical and electron microscopic studies of the Streptomyces reticuli cellulase (avicelase) in its myceliumassociated and extracellular forms, Appl. Environ. Microbiol., 58, p. 3240-3248. 58. Schlochtermeier, A., Walter, S., Schroder, J., Moorman, M., Schrempf, H., 1992, The gene encoding the cellulase (avicelase) Cel1 from Streptomyces reticuli and analysis of protein domains, Molec. Microbiol., 6, p. 3611-362. 59. Srinivasan, M. C., Laxman, R. S., Deshpande, M. V., 1991, Physiology and nutritional aspects of actinomycetes: an overview, World J. Microbiol. Biotechnol., 7, p. 171-184. 60. Tiraby, G., Bejar, S., Reynes, J. P., Sicard, P. J., Farber, G. K., Ringe, D., Petsko, G. A., 1989, Genetic, enzymatic and crystallographic studies of the glucose isomerase of two Streptomyces species, n Genetics and molecular biology of industrial microorganisms, Ed. Hershberger, C. L., Queener, S. W., Hegeman, G., ASM, p. 119-126. 61. Vining, L. C., 1990, Functions of secondary metabolites, Ann. Rev. Microbiol., 44, p. 395427
161
62. Vining, L. C., 1992, Secondary metabolism, inventive evolution and biochemical diversity: a review, Gene, 115, p. 135-140. 63. Wachinger, G., Bronnenmeier, K., Staudenbauer, W. L., Schrempf, H., 1989, Identification of mycelium-associated cellulase from Streptomyces reticuli, Appl. Environ. Microbiol., 55, p. 2653-2657. 64. Wilson, D. B., 1992, Biochemistry and genetics of actinomycete cellulase, Crit.Rev. Biotechnol., 12, p. 45-63. 65. Winkelmann G., Allgaier H., Lupp R., Jung G., Iturin AL- a new long chain iturin a possessing an unusual high content of C16--amino acids, J Antibiot (Tokyo) 1987 Apr., 40(4): 437-42. 66. Wood, T. M., Bhat, K. M., 1988, Methods for measuring cellulase activities, Methods Enzymol., 160, p. 87-112. 67. Zarnea, G., 1984, Tratat de microbiologie general, 1, Ed. Academiei. 68. Zimmermann, W., 1989, Hemicellulolytic enzyme systems from actinomycetes, n Enzyme systems for lignocellulose degradation, Ed. Coughlan, M. P., Elsevier Applied Science, p. 167-181. 69. Zimmermann, W., Davis, B., Winter, B., Shou,W., 1992, Actinomycetes and their enzymes for applications in the pulp and paper industry, n Biotechnology in Pulp and Paper Industry, Ed. Kuwahara, M., Shimada, M., Uni Publishers, Co. LdT, p. 145-150.
162

Capitolul 5

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Capitolul 5

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

metabolitilor secundari produi de bacili i streptomicete

Figura 2. Aspect electronomicroscopic al celulelor de Bacillus subtilis (dup Zarnea, 1984).

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Figura 3. Aciunea inhibitoare a tulpinii B.subtilis B2 asupra fitopatogenului Sclerotinia sclerotiorum.

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

genetic al biosintezei unor antibiotice si a altor metaboliti secundari

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

3. Enzime produse de bacteriile din genurile Bacillus si Streptomyces

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Industria alimentar degradarea amidonului

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Figura 6. Selecia unor noi tulpini de Streptomyces sp. productoare de celulaze.

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

Aplicaii biotehnologice ale bacteriilor din genurile Streptomyces i Bacillus

Rodica Mateescu, Clina Petrua Cornea, Irina Grebenian, Gh. Cmpeanu

S-ar putea să vă placă și