Lp 7: Cultivarea virusurilor, rickettsiilor si chlamydiilor

Obiective:
1. Definirea virusurilor - particularităţile de cultivare a acestora.
2. Prezentarea regulilor de prelevare a produselor patologice.
3. Izolarea virusurilor în culturi de celule, pe ouă embrionate sau pe animale de laborator
(etape, urmărirea replicării/prezentei virusurilor, cuantificarea încărcăturii virale)
4. Cultivarea rickettsiilor
5. Cultivarea chlamydiilor

1. Virusuri = particule infecţioase acelulare, formate dintr-un singur tip de acid nucleic
(ARN/ADN), metabolic inerte, lipsite de orice mecanisme necesare producerii şi stocării
de energie.

Parazite intracelulare absolute

nu cresc
nu se divid
=
Cultivă numai în celule receptive capabile să le replice

2. Reguli de prelevare a produselor patologice

- Alegerea produsului patologic → în funcţie de sindromul investigat putem examina:

• aspirate (exsudate, secreţii, excrete)
• lichid de spălătura nazală sau/şi faringiană
• materii fecale
• secreţii prelevate cu tamponul de pe mucoase şi din leziuni cutanate
• fragmente de ţesuturi
• sânge
• LCR, etc

- Alegerea metodei de recoltare şi a momentului prelevării

→ probele pentru diagnosticul virusologic direct trebuie examinate cât mai precoce,
în faza acută a bolii (primele 2-3 zile de boală) Explicaţie: depistarea virusului la
poarta de intrare

- Asigurarea condiţiilor optime de transport şi conservare:

→ menţinerea viabilităţii virusurilor
→ împiedicarea dezvoltării altor microorganisme

Necesitatea mediilor de transport (la care se adaugă antibiotice şi antifungice)

Refrigerarea probelor (cu unele excepţii)

3. IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA VIRUSURILOR

Sisteme de diagnostic:

1
 - culturi de organ sau culturi de celule;
- cultivarea pe embrioni, în dezvoltare;
- izolarea pe animale de laborator susceptibile;

I. Izolarea virusurilor în culturi de celule

Tipuri de culturi de celule:

obţinute din ţesuturi adulte
Culturi primare → supravieţuiesc 5-6 cicluri de subcultivare

obţinute din ţesuturi embrionare

Linii de celule diploide → au morfologie şi cariotip normal
pot fi subcultivate 40-50 de generaţii

Linii permanente → provin din tumori canceroase sau din celule normale transformate malign
au morfologie alterată
pot fi subcultivate indefinit
Etape:

Pregătirea suspensiei virale

Inocularea filmului celular

Incubarea

Depistarea şi cuantificarea virusului replicat:

a. efectul citopatic – rotunjirea şi desprinderea celulelor de pe suport, apariţia de sinciţii,

etc
→ cuantificarea virusurilor prin metoda plajelor Ö unităţi formatoare de plaje

b. apariţia în supernatant a unor proteine codificate de virus (e.g., hemaglutinine)

c. adsorbţia eritrocitelor pe membrana modificată a celulelor care au replicat virus

d. incluziuni virale = acumulări de virioni sau componente virale în aria celulară de

replicare şi asamblare a unor virusuri (citoplasmă, nucleu) ; ex.: formaţiuni rotunde sau
ovalare, bazofile sau acidofile, IC sau/şi IN.

e. interferenţa virală = replicarea virusurilor care cultivă fără efect citopatic este
depistată indirect prin incapacitatea celulelor infectate de a replica un virus cunoscut
citopatogen.

2
 f. Depistarea antigenelor prin IF (reactii antigen-anticorp car efolosesc marcajul cu
fluoresceină)

g. transformarea celulelor normale în celule canceroase printr-un virus oncogen.

II. Izolarea pe ouă embrionate în dezvoltare

Indicată pentru izolarea virusurilor gripale, paragripale, herpetice, poxvirusurilor.
Etape:
În cavitatea amniotică (adaptare)
Inocularea embrionilor
Pe membrana corioalantoidă
(în vârstă de 6-14 zile)
În cavitatea alantoidă (LA –produs final pentru indentificare)
– pasaje repetate

Incubare la 35 ºC, 3-5 zile

Depistarea virusului replicat:

♦ moartea embrionului (viabilitatea embrionilor a fost verificată anterior la ovoscop)
♦ apariţia de pustule pe membrana corioalantoidă (MCA) - poxvirusuri
♦ acumularea de virus (hemaglutinine) în lichidul amniotic / alantoidian – RH
(evidenţiere şi titrare de antigen hemaglutinant) – virusuri gripale, unele
paramyxovirusuri

Cuantificarea virusului replicat:

- titrarea antigenului viral (H) în lichidul alantoidian (prin RH)
- numărul de pustule formate pe MCA

Identificarea virusului = prin reacţia de inhibare a hemaglutinării (RIH) sau, in cazul unei
tulpini noi: vizualizarea prin ME (ex. SARS – un nou coronavirus)

III. Izolarea pe animale de laborator de mici dimensiuni (şoarece alb, hamsteri, etc sau
gazde unice: maimuţe, cimpanzei); rar utilizate (vezi dezavantaje)

Produsul patologic recoltat in funcţie de sindromul clinic, prelucrat, se inoculează utilizând

diferite căi de inoculare (de regulă, la fel ca poarta naturală de intrare): ic, sc, im, etc
Urmărirea replicării virusului:
• Moartea animalului
• Reproducerea bolii la animal (ex.: paralizii, tremor determinat de enterovirusuri)
• Evidenţierea de leziuni histopatologice caracteristice la nivelul organelor ţintă; in
lichidele sau pp recoltate de la animal se evidenţiază prezenţa virusului prin reacţii Ag-Ac,
ME (pentru virusurile nou izolate, cercetare, etc)

Cuantificarea virusului replicat → măsurarea dozei infectante sau letale 50% pentru animale
(DI50 / DL50)= reciproca diluţiei de suspensie virală care determină efectul urmărit
(infecţie/moarte) la 50% din animalele inoculate.

3
Identificarea = prin reacţii Ag-Ac (RN, RIH, RFC)
Dezavantaje:
- Costuri ridicate (infrastructură specială, personal, hrană, etc)
- Timp îndelungat pentru rezultatul final
- Infecţii virale latente cu propriile virusuri
- Reactivităţi diferite
- Producerea de Ac care împiedică expresia clinică

4. Cultivarea rickettsiilor
o sunt bacterii pleomorfe (bacili, cocobacili) cu perete de tip gram-negativ, care se
înmulţesc prin diviziune, obligat intracelular, la vertebrate sau artropode;
o cultivă numai în gazde vii: animale de laborator, sacul vitelin al embrionului de găină,
culturi de celule;
o temperatura optimă de cultivare în sacul vitelin este de 32 C;
o odată cu creşterea temperaturii, rata multiplicării scade;
o gazdele mai sensibile pentru izolare sunt, în funcţie de specie, cobaiul şi şoarecele.
Diagnostic:
- microscopie: coloraţii speciale (pe amprente sau secţiuni histologice
din probe bioptice sau necroptice, rickettsiile apar ca fini bacili sau
cocobacili, intracelulari, albaştri-purpurii în coloraţia Giemsa sau roşii
(pe fondul albastru al citoplasmei) în coloraţia Macchiavello.
- IF - biopsia tegumentară sau valve cardiace la decedaţi
Izolarea şi identificarea:
- inocularea intraperitoneală, la animalele receptive, a prelevatelor
necontaminate;
- inocularea se face la patul bolnavului;
- dacă intervalul de timp se prelungeşte peste o oră, se congelează proba
la - 25° C.
- probele contaminate (spută, urină, lapte, suspensii de placentă) se
inoculează după tratarea cu penicilină;

Concluzie: datorită dificultăţilor diagnosticului direct şi al infecţiozităţii crescute, se preferă

diagnosticul serologic (indirect)

5. Cultivarea chlamydiilor
o bacterii cocoide, imobile, adaptate la parazitismul intracelular, au devenit total
dependente energetic de gazdă;
o sunt paraziţi energetici;
o ciclul reproductiv particular (vezi curs)
o cultivă numai în sacul vitelin al embrionului de găină sau în culturi de celule;
o cele mai multe chlamydii cultivă în culturi de celule numai în condiţii speciale, care
facilitează iniţierea infecţiei şi înmulţirea:

Chlamydia trachomatis
i. diagnosticul este în special direct: microscopic, izolare pe culturi de
celule, metode moleculare;
Chlamydophila pneumoniae
ii. diagnosticul direct presupune recoltarea ca PP a exsudatului faringian.

4
 iii. izolare în sacul vitelin (OE) sau pe CC (HeLa, culturi de celule de
maimuţă -cultiva dificil); dupa incubare 3 zile la 35˚C se identifica prin
IF (cu Ac monoclonali specific de grup sau specie).
iv. Micro – IF – mai sensibilă
v. diagnosticul, în principal indirect

Chlamydophila psittaci
• PP: spută (de regulă după stimulare), exsudat nasofaringian, sânge, ţesut pulmonar
(deces).
• Transportul probelor se face în mediu protector adiţionat cu antibiotice şi antifungice
• Microscopia directa si cultivarea: dificile.
• Identificare: ELISA cu sensibilitate relative redusă, 70-80%; specificitate foarte bună.
• PCR: foarte utilă.
. – diagnosticul serologic (indirect) mai util