1.

Fitohormonii - generaliti
1.1. Definiie Fitohormonii (regulatorii de cretere sau substanele de cretere) sunt compui organici care, n concentraii mici sau foarte mici, influeneaz procesele de cretere i de morfogenez (le stimuleaz sau le inhib), respectiv regleaz procesele fiziologice din diferitele esuturi i organe ale plantelor. Fitohormonii sunt un set unic de compui, cu metabolism i proprieti specifice. Singurele caracteristici universale sunt faptul c reprezint compui naturali din plante cu o abilitate de a afecta procesele fiziologice la concentraii mult mai mici dect cele la care nutrienii sau vitaminele afecteaz aceste procese. (Davies, 2004). 1.2. Etimologie Termenul hormon a fost pentru prima dat folosit n medicin n urm cu aproximativ 100 de ani, nsemnnd un factor stimulator, dei a ajuns s nsemne un mesaj chimic transportat. Cuvntul provine din limba greac unde nseamn a stimula sau a pune n micare. Prin urmare, nsi originea cuvntului nu presupune noiunea de transport, iar definiia de mai sus a unui fitohormon este mult mai aproape de nelesul cuvntului grecesc dect de semnificaia actual a hormonilor folosit n contextul fiziologiei animale. Went i Thimann (1937), n cartea lor Phytohormones, au definit hormonii ca substane ce sunt transportate dintr-o parte a organismului n alta. Utilizarea lor original n fiziologia vegetal a derivat din conceptul mamalian al hormonilor. Acesta implic identificarea unui loc de sintez, transportul prin fluxul sanguin la un esut int i controlul rspunsurilor fiziologice n esutul int n funcie de concentraia hormonului. (Davies, 2004). 1.3. Scurt istoric (Cachi, 1987) Darwin (1880) a intuit existena fitohormonilor, dar abia n secolul XX s-a putut dovedi experimental rolul lor fiziologic, respectiv modul de aciune, precum s-a putut realiza izolarea, purificarea sau sintetizarea acestora.

Went (1928) a pus n eviden prezena, n coleoptilul de Avena, a unei substane de cretere, cu rol n curbarea fototropic a poriunii apicale a acestuia. Kgl i Haagen-Smit (1931) au obinut o substan activ, auxina A, izolat din urina uman. Apoi Kgl i colab. (1934) au comunicat izolarea, tot din urin, a unei substane mai complexe, pe care au denumit-o heteroauxin (auxina A i B), compus care, ulterior, s-a dovedit a fi acidul 3-indolilacetic (acidul -indolilacetic, abreviat AIA). Aceast substan a fost sintetizat nc din anul 1904 de ctre Ellinger, dar pn n anii 1937 - 1939 nu s-au cunoscut proprietile sale biologice. n 1934, Kgl i Kostermans au izolar AIA din drojdii, iar Thimann, n 1935, a extras AIA din Rhizopus. n anii 1938 - 1939, prin experimente independente (i aproape simultane), efectuate de ctre Gautheret i Nobecourt cu culturi de esuturi in vitro, s-a pus n eviden aciunea fitohormonal (de excepie) exercitat de ctre auxin. n laboratoarele lui Skoog, n anul 1956, s-a izolat o alt substan activ, chinetina (6furfurilaminopurina), preparat din sperm de heringi. Tot n 1956, s-a remarcat, n laboratoarele lui Steward, aciunea particular a laptelui din nuc de cocos, a crui prezen n mediul de cultur inducea formarea a numeroase plantule, din celulele cultivate in vitro. Laptele din nuc de cocos este un produs natural, bogat n citochinine native. Giberelinele, acidul abscisic i etilena au fost descoperite cam n aceeai perioad a anilor 30. Efectele acestora n culturile de esuturi sunt mai puin spectaculoase n raport cu cele obinute n practica agricol. 1.4. Structura, sinteza i transportul Sub aspect chimic, fitohormonii sunt substane micromoleculare foarte heterogene ce se aseamn cu vitaminele i cu unii hormoni animali. Conin n molecul inele ciclice (indolic, gibanic, purinic, iononic etc.), legturi etenice i diferite grupri funcionale. Sunt substane larg rspndite n natur, ce se gsesc n diferite esuturi i organe ale plantelor superioare, n ciuperci, drojdii, alge, flagelate, n numeroase microorganisme, att n stare liber, ct i asociate cu proteinele. Pe lng fitohormoni (regulatori de cretere de natur endogen) se cunoate i o foarte extins gam de substane organice cu aciune fiziologic asemntoare cu cea a fitohormonilor, compui de sintez ce aparin familiilor de substane fitohormonale native, avnd un nucleu apropiat sau prezint o structur diferit. Dei sunt compui variai ca

structur chimic, ei au comun faptul c exercit aciuni asemntoare fitohormonilor (mimnd efectul lor), influennd procesele de cretere la diluii foarte mari. Fitohormonii naturali sunt metabolizai intracelular i, ca atare, au durat limitat de aciune asupra celulelor. Spre deosebire de acetia, regulatorii de cretere sintetici (omologi ca aciune fiziologic cu fitohormonii) sunt metabolizai mai lent. Astfel, durata lor de influen este prelungit, efectul lor fiind mai puternic. Regulatorii de cretere sunt sintetizai de citoplasma celulelor tinere i se acumuleaz mai ales n zonele de cretere ale tulpinilor i rdcinilor, n muguri, semine, polen, n ovare, n esuturi tinere etc. (Burnea, 1977). Fitohormonii sunt, de regul, transportai i acioneaz de la distan, dar pot aciona i n esutul n care au fost sintetizai. De exemplu, citochininele sunt transportate de la rdcin la frunze, unde intervin n prevenirea senescenei, n timp ce etilena acioneaz n acelai esut n care a fost sintetizat. (Vntu, 2005). Biogeneza fitohormonilor este localizat, de regul, n alte organe dect n organele int. Din locurile de sintez, ei sunt translocai (sub form activ sau inactiv) spre esuturile apte de a recepiona semnalele i de a reaciona la stimulii primii (concentraiile active sunt, adesea, mai mici de 1 M). (Cachi, 1987). Translocai la locul de reacie ei determin producerea unor rspunsuri specifice biochimice, fiziologice i/sau morfologice. n funcie de natura lor, sinteza fitohormonilor este localizat n diferite zone ale plantelor. Ei pot fi pstrai un timp la locul de origine (sub form activ sau inactiv) ori pot migra n diferitele organe ale plantelor, acumulndu-se n anumite celule i esuturi. Faptul c semnalul purtat de ctre fitohormoni marcheaz un rspuns imediat sau ntrziat depinde de starea fiziologic a celulelor, esuturilor sau organelor receptori, de stadiul lor de dezvoltare, de natura i nivelul semnalului, de interaciile cu ali fitohormoni i de condiiile de mediu. Celulele responsabile de biogeneza fitohormonilor, ca de altfel i cele care decodific mesajul lor, trebuie s dein un sistem enzimatic adecvat sintezei sau deblocrii cilor metabolice, responsabile de asigurarea manifestrii integrale a activitii fiecrui compartiment biomolecular, implicat n procesele de cretere i dezvoltare. Amplitudinea reaciei este dependent nu numai de ntrunirea condiiilor endogene receptoare a impulsurilor fitohormonale i a condiiilor de mediu, ci i de disponibilitile celulare n a rspunde mesajelor primite, cu referire deosebit la rezervele energetice i constructive ale celulelor, cu att mai mult cu ct ne adresm proceselor de multiplicare i de cretere celular. (Cachi, 1987). 3

1.5. Rolul fiziologic Fitohormonii ocup poziii cheie n procesele de multiplicare celular i n creterea acestora, n general, i n morfogeneza plantelor cormofite, n special. Fitohormonii determin creterea plantelor prin intensificarea diviziunii celulare i prin alungirea celulelor existente. Mecanismul prin care se realizeaz creterea plantelor depinde de natura fitohormonilor. Fitohormonii joac un rol important n controlarea modului n care planta crete i se dezvolt. n timp ce metabolismul furnizeaz energia i crmizile necesare pentru viaa plantei, hormonii sunt cei care regleaz viteza de cretere a prilor individuale i integrarea acestora pentru a produce forma pe care noi o recunoatem ca fiind plant. Prin urmare, ei joac un rol important n procesele de reproducere. (Davies, 2004). 1.6. Clasificare Clasificarea fitohormonilor se face, de obicei, n trei grupe (Vntu, 2005): Stimulatoare; Retardante; Inhibitoare.

Aceste trei grupe de substane se intercondiioneaz reciproc, astfel c reaciile plantelor, n toate fazele de cretere i dezvoltare, reprezint rezultatul unui echilibru ntre produii stimulatori i cei inhibitori. n categoria substanelor stimulatoare se ncadreaz: auxinele, citochininele, giberelinele i etilena. Pe baza aciunilor de stimulare i inhibare a proceselor de cretere s-au sintetizat i substane cu proprieti biologice caracteristice, implicate n ntrzierea proceselor de cretere, motiv pentru care au fost numite retardani. ntre acestea amintim: beta-hidroxietilen hidrazida, clorura de trimetilamoniu etc. Dintre inhibitorii naturali menionm acidul abscisic, florizinul, cumarina, scopoletina, acidul maleic, acidul citric, acidul cafeic, unii alcaloizi (chinina, cafeina) etc. Dintre inhibitorii sintetici menionm hidrazida maleic, actinomicina D un puternic inhibitor al metabolismului nucleoproteic, oprind creterea plantelor.

Alte substane regulatoare de cretere i maturare: brasinosteroizii: brasinolidul (izolat din uleiul de rapi) i castasteronul cu rol stimulator n creterea esuturilor vegetale, stimularea produciei de etilen i creterea rezistenei la nghe, boli, stres hidric; poliaminele alifatice care sunt implicate n dezvoltarea fructelor i au aciune antagonic fa de etilen; acidul jasmonic care are efect asemntor cu etilena i actiuni similare acidului abscisic; acidul salicilic care este implicat n biosinteza proteinelor cu mas molecular mic ce confer rezisten plantelor la aciunea agenilor patogeni.

2. Auxinele
Auxinele sunt compui naturali, fiziologic polivaleni, care (n doze extrem de reduse) pot influena att creterea, ct i dezvoltarea plantelor, respectiv formarea organelor vegetative i generative. (Vntu, 2005). Auxinele au fost primul grup de substane fitohormonale descoperite. n aceast categorie sunt grupate i alte substane organice, de regul acizi organici, care n principal au capacitatea de a produce curbarea coleoptilului de Avena (la concentraii <0,001 M), promovnd creterea n lungime a celulelor. (Cachi, 1987). Acidul 3-indolilacetic este primul fitohormon cert care a fost descoperit i care se mai numete i heteroauxin (Kgl 1934). Acest fitohormon are o larg rspndire n natur, fiind prezent n toate plantele superioare i inferioare. Se acumuleaz de obicei n endosperm, coleoptil, ovare i n gruncioarele de polen. Se formeaz n cantitate mai mare n vrful rdcinii i tulpinii, n tuburile polenice, n seminele tinere i n general n esuturile meristematice, dar este sintetizat i de unele ciuperci parazite i simbiote. Principalele auxine sunt: cu nucleu indolic acidul 3-indolilacetic (auxina nativ, AIA), acidul indolilbutiric (AIB), acidul indolilpropionic (AIP); cu nucleu naftalic acidul alfa naftilacetic (ANA), acidul beta naftoxiacetic (ANOA);

cu nucleu clorfenoxiacetic acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4-D), acidul 2,4,5triclorfenoxiacetic (2,4,5-T), acidul 2-metil-4-clorfenoxiacetic; cu nucleu benzoic acizi 2,4,6- sau 2,3,6-triclorbenzoici, acidul 2-metoxi-3,6diclorbenzoic (dicamba); cu nucleu picolinic acidul 4-amino-3,5,6-tricloropicolinic (PIC / picloram) etc. n numeroase plante s-au identificat derivai ai acidului 3-indolilacetic sau substane

nrudite cu acesta, care au aciune fitohormonal, dintre acestea, mai importante fiind aldehida 3-indolilacetic, acidul indolilpiruvic, esterul etilic al acidului indolilacetic, acidul indolilacetonitrilic, acidul indolilpiruvic etc. Paralel cu extragerea i separarea auxinelor naturale au fost sintetizate numeroase substane chimice cu structur asemntoare cu a compuilor endogeni, avnd o puternic influen asupra metabolismului plantelor i multiple aplicaii n practica agricol i horticol. Aceste substane sunt: acidul 2,4-diclorfenoxiacetic (2,4-D), acidul indolilbutiric, acidul indolilpropionic, acidul naftilacetic (ANA). Aceste substane sunt derivai ai indolului i naftalenului. (Vntu, 2005). Extragerea, purificarea i identificarea chimic a auxinelor au pus n eviden prezena lor, n stare natural, n concentraii extrem de reduse, n diferite organe ale plantelor, precum i faptul c se acumuleaz preferenial n organele cu cretere activ muguri i frunze tinere, vrfuri de tulpini i rdcini, antere i granule de polen, cotiledoane, semine imature etc. Cantiti infime de auxine se gsesc n cambiu i n esuturile parenchimatice. (Vntu, 2005). Sinteza primar a auxinei presupune existena unui precursor care se transform prin oxidare: triptofanul trece treptat n triptamin, apoi n acid -indolilpiruvic. Acidul indolilpiruvic reprezint punctul de plecare a reaciilor metabolice din procesul sintezei auxinelor, reacii ce au la baz anumite procese enzimatice ce necesit pentru fiecare etap o enzim specific. Auxinele se sintetizeaz n frunzele tinere, de unde migreaz spre celelalte organe tinere, aflate n procese intense de cretere, sub form de precursori inactivi, legai de proteine. n vrfurile vegetative (meristemele apicale), auxinele inactive se desprind de proteine sub aciunea unor enzime proteolitice i devin libere i active. Sub aceast form (activ) circul descendent, prin vasele liberiene i, mai rar, prin esuturile parenchimatice adiacente vaselor conductoare. (Vntu, 2005). Circulaia auxinelor nu se face prin difuziune, ci pe principiul polaritii, datorit diferenei de potenial electric dintre vrful plantei (cu sarcin electric negativ) i baza

plantei (cu sarcin electric pozitiv). Astfel, auxina (ncrcat cu sarcin electric negativ) circul bazipetal, polarizat, spre celulele tinere, dar auxinele pot circula i transversal, n cazul organelor aezate orizontal (lstari laterali) sau iluminate lateral, ceea ce explic geotropismul rdcinilor i fototropismul tulpinilor. n prezena luminii pe care o capteaz unii fotoreceptori (riboflavin, beta-caroten), are loc degradarea auxinelor, ca un proces de oxidare i trecere ntr-o form oxidat i inactiv, numit hemiauxin-lacton sau hemiauxin. Datorit proceselor concomitente de biosintez i degradare oxidativ, stocul auxinic dintr-un organ va fi alctuit din precursori auxinici, auxine active i auxine degradate. (Vntu, 2005). Acidul 3-indolilacetic se gsete n plante n stare liber i asociat cu proteinele. Acidul 3-indolilacetic asociat cu proteinele este inactiv i reprezint o rezerv nsemnat pentru plante. n funcie de necesiti, acidul 3-indolilacetic se desprinde pe cale enzimatic de proteina inhibitoare i devine astfel activ. n celule, auxina nativ (AIA) este degradat de ctre AIA-oxidaz. n meninerea sau decarboxilarea AIA intervin i peroxidazele, iar n procesele fiziologice legate de auxin se interpun i ali fitohormoni care amplific sau nu efectele auxinei. Viteza de degradare, ca i capacitatea de a aciona, ntr-un anumit sens este dependent de natura esutului supus influenei unei anumite auxine, rdcinile fiind mai receptive la administrarea unor concentraii mici, iar tulpinile reacionnd la concentraii ceva mai ridicate. ntre organele aceleiai plante, reacia este diferit, n funcie de natura, concentraia i combinaiile dintre variate auxine i, eventual, dintre auxine i ali regulatori de cretere (de exemplu, n stimularea nrdcinrii butailor, uneori se folosesc i amestecuri de auxine). Acest fapt este i mai evident la explantele cultivate in vitro. Diferena de reacie exist i n ceea ce privete receptivitatea selectiv a plantelor fa de dozele de auxine, ntre dicotiledonate i monocotiledonate, fapt care a permis combaterea buruienilor n lanuri prin aplicarea unor doze ridicate de auxine, ca erbicide. (Cachi, 1987). n general, decarboxilarea enzimatic a AIA este mai puternic n esuturile btrne dect n cele tinere. Dintre auxine, ANA i 2,4-D sunt mai stabile i mai puin supuse degradrii endocelulare, pe cnd AIA nativ sau exogen este fotooxidabil i este degradat de ctre radiaiile ionizante, de razele UV, de peroxizi etc. Auxinele intervin n numeroase procese fiziologice, interacioneaz cu alte substane endogene i, firete, cu ali fitohormoni, n special cu citochininele, giberelinele i cu etilena. Auxinele naturale i cele obinute prin sintez au o larg utilizare n agricultur i horticultur. Ele pot fi utilizate ca stimulatori pentru nrdcinarea butailor, pentru accelerarea coacerii 7

fructelor, obinerea fructelor fr semine, inhibarea mugurilor, pentru prevenirea cderii premature a fructelor etc. n concentraii mai mari sunt utilizate ca ierbicide n combaterea buruienilor. (Burnea, 1977). Auxinele naturale i sintetice exercit diferite aciuni fiziologice, care declaneaz reacii particulare de cretere, dezvoltare i metabolism. Tratamentul cu auxine intensific creterea prin modificarea volumului celular, alungirea plasmalemei i ngroarea ei, prin depunerea de noi substane formative. Totodat sunt modificate proprietile fizice ale membranelor (elasticitate, plasticitate, permeabilitate pentru ap i pentru anumii ioni), proprietile structurale (orientarea microfibrilelor de celuloz) i proprietile chimice (natura proteinelor plasmatice, compoziia pectinelor). Influeneaz metabolismul, ndeosebi sinteza proteic, prin exercitarea unei influene asupra sintezei de ARN ribosomal. Auxinele, n concentraii sczute, stimuleaz diviziunea celular, iar n concentraie ridicat stimuleaz elongaia celular. Influeneaz sinteza de etilen, iar etilena la rndul ei acioneaz n stabilirea nivelului de auxin i n transportarea acesteia prin corpul plantelor. Exercit o aciune n micrile de cretere tropisme i sunt implicate n corelaiile interorgane i, mai ales, n fenomenul de dominan apical, caulinar, exercitat de ctre mugurele terminal. Unghiul de curbur al plantelor (coleoptilului) este proporional cu cantitatea substanei de cretere. Ca unitate de msur se ia unitatea de ovz, prin care se nelege cantitatea de auxin care, aplicat pe un coleoptil de ovz, produce o curbur de 10 la o temperatur de 22 C i la o umiditate relativ a aerului de 92 %. (Burnea, 1977). Stimuleaz germinarea seminelor, tratamentele cu AIA, 2,4-D i ANA mrind capacitatea i energia germinativ a seminelor. Unele auxine sintetice (AIA, ANA, 2,4-D) stimuleaz formarea rdcinilor la plante care, n mod normal, se nrdcineaz greu prin butai (Rosa, Clematis, Magnolia). Prin urmare, pentru reuita butirii i a marcotajului, se recomand folosirea acestor substane. n doze mari, auxinele menin n stare de laten mugurii pomilor fructiferi sau pe cei ai tuberculilor de cartof. n declanarea nfloririi, un rol activ l au auxinele endogene existente n ovar, la baza inflorescenei i n pedunculul florii. Polenul conine, de asemenea, auxine implicate n creterea tubului polenic. (Vntu, 2005). n timpul polenizrii i fecundrii are loc biosinteza auxinelor naturale. Creterea fructului este stimulat de auxinele sintetizate n semine, de unde difuzeaz n pulpa fructului i declaneaz extensia celulelor. Pe baza administrrii auxinelor exogene este posibil 8

formarea fructelor fr polenizare, obinerea fructelor partenocarpice (fr semine), la tomate, struguri, mr, pr, citrice etc. (Vntu, 2005). ntrzierea mbtrnirii esuturilor se poate realiza prin tratamente cu auxine, ceea ce poate fi asociat cu meninerea unui anumite nivel al proteinelor i acizilor nucleici. De asemenea, auxinele inhib formarea embrionilor n suspensiile de celule.

3. Citochininele
Citochininele constituie un grup de substane derivate de la adenin, cu efect n inducerea diviziunilor celulare. Au fost izolate din laptele de Cocos nucifera i din diferite extracte de flori i fructe. Au fost identificate n numeroase plante superioare i inferioare, avnd o larg rspndire n natur. La nceput a fost izolat chinetina (6-furfurilaminopurina) i a fost experimentat pe explante din mduv de tutun, cultivate pe medii aseptice. n lipsa acestei substane celulele nu se divid. n prezena chinetinei sau a unei substane de tip citochininic (i mai ales i n prezena unei auxine), se obine o multiplicare celular i neoformarea de mugurai i de tulpinie. (Cachi, 1987). Spre deosebire de auxine, citochininele reprezint un grup de substane mai omogen, din punctul de vedere al constituiei chimice. n general, citochininele sunt adenine substituite i posed un nucleu purinic. Prin nlocuirea gruprii furfurilice a chinetinei cu alte grupe (fenil-naftil-ciclohexil etc.) se pot obine substane cu activitate asemntoare chinetinei. n general, citochininele suport bine autoclavarea, fiind termostabile. Prima extragere i purificare a citochininelor naturale a fost realizat de ctre L. S. Letham (1963), care a izolat, din boabe imature de porumb, un compus numit zeatin. n ultimii ani au fost sintetizai peste 50 de compui chimici care manifest proprieti similare cu cele ale citochininelor naturale (benziladenina, 6-benzilaminopurina, gama-azochinetina). Citochininele endogene deriv din degradarea acizilor nucleici, trecnd prin faza de nucleotide. (Vntu, 2005). Metabolismul citochininelor este strns legat de metabolismul acizilor nucleici, n special de cel al ARN-ului. La doar trei luni de la sintetizarea chinetinei, s-a sintetizat i benziladenina (benzilaminopurina, abreviat BAP sau BA). Din marele numr de derivai activi cu nucleu purinic, n culturile de esuturi i de celule, se folosesc mai frecvent urmtorii

patru: 2-izopentiladenina (2iP) i zeatina (Z) ca citochinine naturale i chinetina (K) i benziladenina (BAP) ca citochinine de sintez. (Cachi, 1987). Citochininele includ substane care determin efecte fiziologice legate de reglarea diviziunii celulare, creterea celulei prin extensie, diferenierea i organogeneza. Prezena citochininelor n vasele de xilem arat c sinteza acestei substane se face n rdcini, de unde migreaz ctre vrful plantei i se acumuleaz n fructe, frunze i muguri. Migraia se realizeaz concomitent cu curentul care asigur transpiraia. Totui, ele nu circul polarizat n plant, n cursul migraiei fiind legate de un glucid sau mbrcnd o form inactiv. La culturile in vitro citochininele servesc n meninerea viabilitii celulelor, susinnd capacitatea de supravieuire a esuturilor inoculate, favoriznd dediferenierea i stimulnd multiplicarea celular. Procesele de morfogenez n prezena citochininelor constau n caulogenez, ele impulsionnd formarea de mugurai i tulpinie. Citochininele stimuleaz diviziunea celulelor mature, nemeristematice. Ele stimuleaz creterea plantelor, procesele de morfogenez, biosinteza substanelor proteice (s-au descoperit citochinine legate de ARN de transfer), formarea mugurilor i sunt antagoniste rizogenezei. Protejeaz metaboliii de aciunea enzimelor hidrolizante, ceea ce confer citochininelor un rol important n prevenirea senescenei. Ele exercit un efect antagonic auxinelor, anihilnd dominana apical a mugurelui terminal (mugurii axilari tratai cu citochinine intr n cretere activ, n competiie cu mugurele terminal, dar, odat cu nlturarea citochininei, creterea acestor se micoreaz i se oprete, ei reintrnd sub incidena aciunii mugurelui apical). Acest fapt are ca efect o puternic ramificare a tulpinii (cazuri frecvent ntlnite la specii de Centaurea, Crepis). Stimuleaz de asemenea germinarea seminelor plantulelor parazite, ntrerup repausul seminelor, stimuleaz formarea i creterea frunzelor prin alungirea limbului. Reduc efectul toxic al unor virusuri i anuleaz efectul unor inhibitori ai germinaiei (cumarina, xantina etc.). Stimuleaz dezvoltarea mugurilor, a organelor florale, dezvoltarea ovarelor, induce formarea fructelor partenocarpice, intensific transportul asimilatelor i mrete rezistena plantelor la temperaturi sczute sau ridicate, la infecii cu ciuperci. Prin capacitatea de a stimula sinteza proteinelor, a pigmenilor clorofilieni i a acizilor nucleici, ca i prin polarizarea circulaiei metaboliilor din esuturile adiacente spre cele tratate, citochininele au rol esenial n ntrzierea mbtrnirii plantelor. Citochininele acioneaz asupra diviziunii celulei vegetale, eficiena lor fiind asigurat de prezena auxinei, ntruct auxina favorizeaz duplicarea ADN, iar chinetina separarea cromozomilor. Stimularea diviziunii celulare este datorat unor modificri eseniale n ciclul 10

mitotic, reducnd durata fazei presintetice (G1) din ciclul mitotic, intensificarea procesului de sintetizare (S) a ADN-ului i prelungirea perioadelor post-sintetice (G2). (Vntu, 2005). Deosebit de important este efectul fiziologic combinat al auxinelor i citochininelor, alctuind ceea ce, n tehnica culturilor de esuturi i celule vegetale, poart denumirea de balan hormonal. n 1957, Skoog i Miller au fondat experimental conceptul de control hormonal al organogenezei. n lucrarea lor, devenit clasic, ei au demonstrat c diferenierea de rdcini i de tulpini, n cultura de mduv de tutun, a fost dependent de raportul dintre auxin/citochinin, prezent n substratul de cultur. Organogeneza a putut fi reglat prin schimbarea concentraiei acestor doi hormoni n mediul de cultur. Astfel, o concentraie crescut de auxin a promovat rizogeneza, n timp ce mrirea coninutului de citochinin a stimulat formarea de tulpinie. O concentraie egal a celor doi hormoni a impulsionat creterea calusului. Acest experiment st la baza cercetrilor ulterioare, efectuate cu explante cultivate in vitro i a servit la dirijarea proceselor de morfogenez la multe alte tipuri de culturi de esuturi i celule. (Cachi, 1987).

4. Giberelinele
Giberelinele sunt fitohormoni care deriv de la hidrocarbura tetraciclic numit giban. Giberelina, principalul reprezentant al acestei clase de compui, a fost descoperit n mediile de cultur ale ciupercii Gibberella fujikuroi i izolat de ctre cercettorii japonezi T. Yabuta i T. Hayashi (1935). Giberelinele au fost identificate ulterior n numeroase plante superioare, ciuperci, bacterii, alge, muchi, ferigi etc. Ulterior au fost descoperite peste 50 de gibereline. Dintre acestea, acidul giberelic (GA) este cea mai activ substan de acest tip i cea mai frecvent utilizat n practic, precum i n tehnicile de culturi in vitro. (Cachi, 1987). Din punct de vedere chimic, giberelinele sunt diterpenoide tetraciclice care conin n molecul grupri etilenice, hidroxilice i carboxilice. Giberelinele au o structur molecular asemntoare acidului giberelinic, care are cea mai mare activitate fitohormonal din acest grup. (Burnea, 1977). Sunt termolabile i se sterilizeaz numai prin filtrare. S-a reuit detectarea prezenei giberelinelor naturale n aproximativ 130 de specii de plante superioare (100 de specii de dicotiledonate i 30 de specii de monocotiledonate). Locul de sintez a giberelinei este n embrionii seminelor n curs de germinare, n frunzele tinere,

11

mugurii apicali. Se cunosc 52 de gibereline, care au fost identificate prin metode moderne de separare i analiz (electroforez, cromatografie). (Vntu, 2005). Ele circul n plant prin vasele liberiene. La culturile in vitro giberelinele se folosesc n mai mic msur, dar exist, totui, recomandri exprese de utilizare a lor n anumite situaii. De exemplu, ele exercit o anumit aciune specific asupra alungirii meristemelor apicale care, n absena GA, prezint o cretere globular. Adaosul de giberelin face ca miniinternodurile meristemelor caulinare s se alungeasc (de exemplu, la cultura in vitro a meristemului de cartof) i servesc la nlturarea fenomenelor de nanism. Pe de alt parte, trebuie avut n vedere faptul c giberelinele inhib dediferenierea celulelor, de aceea ele se folosesc n mediile de cultur numai n cazul n care explantul posed meristeme n structura sa (de exemplu, la cultura de apex sau de dom meristematic). (Cachi, 1987). Giberelinele au n general o aciune sinergic cu a auxinelor, iar n unele esuturi efectul lor este identic. Giberelinele nu acioneaz asupra rdcinilor i au efect mic asupra coleoptilelor, dar stimuleaz creterea tulpinilor i a frunzelor. Ele acioneaz n special asupra sistemelor enzimatice implicate n procesul de cretere i mai puin asupra membranelor celulare. Joac un rol important n reglarea nivelului endogen de auxin, fie prin intervenii directe n procesul de biosintez al acesteia, fie inhibnd aciunea AIA-oxidazei. Exercit un rol complex n suprimarea latenei instalate n semine, muguri sau n organele de rezerv. Tratamentul cu gibereline poate determina substituirea aciunii frigului i a fotoperioadelor, formarea fructelor partenocarpice, formarea florilor mascule sau femele etc.

5. Etilena i acidul 2-cloroetilfosfonic

Etilena a fost recunoscut ca fitohormon n anii 80, dei nc din anul 1901 Neljubov a descris la plante efectele fiziologice stimulatoare ale acestei substane. ntre anii 1917 1937 se ntlnesc referiri bibliografice cu privire la rolul etilenei n coacerea fructelor, dar abia n anul 1959 a crescut interesul specialitilor pentru studierea acestui fitohormon. Fiind o hidrocarbur nesaturat gazoas, a fost greu de identificat i de cuantificat, cu att mai mult cu ct la plante etilena se produce n cantitate foarte mic (numai fructele n curs de coacere eman cantiti mai mari de etilen). (Cachi, 1987).

12

n culturile de esuturi i celule, etilena a fost mai puin folosit, datorit dificultilor inerente de administrare a ei n concentraii strict controlabile. Fiind n stare gazoas, difuzeaz uor din recipientele de cultur i este imposibil de sterilizat prin autoclavare. Efectele fiziologice ale etilenei sunt multiple, cile metabolice i aciunea fiziologic ale acesteia intersectndu-se cu multe alte procese. Astfel, etilena exercit un control asupra creterii permeabilitii membranelor, stimuleaz cderea frunzelor i a fructelor, deschiderea florilor, induce senescena esuturilor i este implicat n transportul auxinei. Celulele rnite produc etilen n cantitate mai mare dect celulele netraumatizate. A fost semnalat o cretere substanial a biosintezei i a eliberrii de etilen sub influena AIA i a chinetinei prezente n mediul de cultur. Acumularea unei cantiti maxime de etilen s-a nregistrat n faza de intens diviziune a celulelor aflate n cultur. Dup atingerea pragului maxim de multiplicare celular, se instala un fenomen rapid de reprimare a producerii de etilen. Street (1976) meniona c ntr-o suspensie fin celular de Spinacea oleracea, producia de etilen a fost antagonist cu nverzirea culturii. Tisserat i Murashige (1977) i Dunwell (1979) au raportat producerea unei inhibri a embriogenezei somatice (la morcov, tutun i citrice) sub influena etilenei. (Cachi, 1987). Acidul 2-cloroetilfosfonic (ACEP) este un regulator de cretere deosebit de valoros, cu aplicaii practice extinse att n horticultur (cultura de legume, n floricultur, pomicultur i viticultur), ct i n cultura cerealelor, plantelor tehnice, cartofului, tutunului etc. El are efecte diverse asupra creterii plantelor, n funcie de doza i momentul aplicrii acestuia. Introdus n mediul de cultur folosit pentru creterea in vitro a ovulelor de bumbac excizate din capsule imature, a inhibat creterea normal a ovulelor, dar a indus o stimulare a formrii de calus n lipsa altor hormoni n mediu. A fost raportat, totui, stimularea creterii explantelor tisulare la Citrus pe medii cu acid 2-cloroetilfosfonic. Mattoo i Lieberman (1977) au sugerat c sinteza de etilen este localizat n complexul constituit de membrana celular i protoplasm. Ei au observat c protoplatii de mr izolai produc foarte puin etilen, n comparaie cu celulele cultivate n suspensie. Capacitatea de a sintetiza etilen a fost redobndit n momentul n care protoplatii au nceput regenerarea peretelui celular. (Cachi, 1987). Kevers i Gaspar (1985) precizau c la plantele vitrificate s-a observat un efect al etilenei n lignificarea vaselor i n rigidizarea pereilor celulelor parenchimatice. Ei au experimentat cu explante constnd din noduri de Dianthus caryophyllus cultivate pe medii lichide i solide. (Cachi, 1987). 13

Se presupune c etilena joac un rol major n rndul hormonilor vegetali, avnd o important contribuie n controlarea proceselor regenerative, n embriogeneza somatic i n morfogenez. Experimentele utiliznd explante din solzi de bulbi de Lilium speciosum au evideniat faptul c adugarea de etilen ntr-o faz timpurie de cultur a stimulat neoformarea de plantule n prezena ANA. Temperatura ridicat sau rnirea esuturilor (care urmau a fi inoculate) a provocat un efect similar, considerat ca fiind datorat mririi sintezei de etilen, biogenez care pare a avea un rol crucial n primele faze ale proceselor de regenerare, la nivelul explantelor de acest tip. Experimentele realizate pe o suspensie celular de morcov au semnalat faptul c putresceina i arginina blocheaz biosinteza de etilen n celule. S-a observat c formarea de xilem (xilogeneza) n explantul medular de salat (Lactuca sativa) a crescut pe msura adugrii la mediile de cultur a precursorilor etilenei (acidul 1-aminociclopropan-1-carboxilic sau ACC) sau a L-metioninei sau chiar a ACEP, generator de etilen, substane ce au ridicat producia de etilen n recipientele de cultur. Introducerea n mediu a unor inhibitori ai etilenei a condus la o inhibare a formrii de xilem i la o inhibare a producerii de etilen de ctre esuturile aflate n cultur. Nici L-metionina, nici ACC i nici etilena nu sunt eficiente n inducerea xilogenezei n absena unei auxine i a unei citochinine. (Cachi, 1987). n general, ACEP stimuleaz puternic organogeneza la diferite tipuri de inoculi. Natura proceselor de morfogenez (rizogenez sau caulogenez) i amploarea lor depind mult de concentraia ACEP i de specie. La garoafe, ACEP provoac generarea dintr-un unic meristem a nenumrai mugurai i tulpinie, dar rizogeneza este slab reprezentat. Dei caulogeneza a fost puternic stimulat de prezena ACEP n substratul de cultivare al inoculilor meristematici de garoafe, tulpiniele neoformate au avut frunzuliele vitrificate. Att la crizanteme, ct i la protocormul de Cymbidium, ACEP a provocat o stimulare deosebit a proceselor de rizogenz, concomitent cu o optimizare a creterii tulpinilor. La minibutaii de crizanteme, prezena AIA n mediul de cultur a stimulat rizogeneza (cu formare de rdcini groase i lungi), dar s-a nregistrat o brunificare a mediului i a rdcinilor, probabil din cauza oxidrii AIA. La propagulele de gerbera, prezena ACEP n mediul de cultur a indus o foarte bun cretere a coloniei de plantule, fiind stimulat att rizogeneza, ct i caulogeneza. (Cachi, 1987). n cazul minibutailor de cartof, constnd din minidiscuri dimensionate din minituberculi, generai in vitro, s-a constatat c a fost stimulat att caulogeneza, ct i rizogeneza n prezena ACEP. Experiene ntreprinse cu explante constnd din minibutai de Saintpaulia (frunzulie pedunculate, detaate din colonii de propagule generate in vitro) pe 14

medii cu ACEP nu au condus la nregistrarea vreunui efect deosebit al ACEP asupra proceselor de morfogenez.

6. Acidul abscisic i ali inhibitori

Acidul abscisic este un fitohormon ce poate lua natere din unele carotenoide sau din precursori inferiori. Se gsete predominant n fructele necoapte i are o aciune complex asupra plantelor. El inhib n general creterea plantelor i grbete formarea florilor. Se pare c acidul abscisic se gsete n raport invers proporional cu coninutul giberelinelor. Acidul abscisic a fost descoperit de P. F. Wareing (1964) n mugurii dorminzi de paltin de munte (Acer pseudoplatanus). Se consider c acidul abscisic este prezent n indivizii tuturor speciilor vegetale, cu variaii sezoniere n funcie de starea fiziologic a esuturilor. Transportul acidului abscisic din zona de sintez se face prin floem, de unde se extinde n seva xilemului. Circulaia are loc dup o polaritate distinct, fiind mult mai intens n sensul descendent dect n cel ascendent. (Vntu, 2005). Dei acidul abscisic (AAB) este un fitohormon cu rol important n viaa plantelor cormofite, fiind implicat n procesele de laten, n culturile de esuturi i de celule se folosete n mic msur. Este totui utilizat n culturile de embrioni somatici, pentru inducerea intrrii acestora n repaus i n procedeele de conservare in vitro. (Cachi, 1987). Acidul abscisic prezint aciune antigiberelinic, antiauxinic, menine starea de repaus a plantelor, fiind prezent n esuturile meristematice (meristeme apicale, cambiu), n oosfere nefecundate, embrioni, regleaz creterea mugurilor i nflorirea, favorizeaz procesele de desprindere i cdere a fructelor i frunzelor i grbete mbtrnirea esuturilor i descompunerea clorofilei. (Vntu, 2005). Substanele inhibitoare sunt substanele care exercit o aciune specific de inhibare a diferitelor procese vitale, anihilnd aciunea auxinelor naturale. n majoritatea cazurilor, inhibitorii endogeni sunt lactone nesaturate, compui fenolici simpli sau compleci, acizi organici, flavonoide, prezeni n diferite organe ale plantelor (semine, bulbi, muguri). Inhibitorii au capacitatea de a reduce sau anula aciunea substanelor stimulatoare i de a provoca o inhibare a creterii plantelor cu intensiti diferite. (Vntu, 2005). Aciunea fitohormonilor poate fi inhibat de unele substane numite antiauxine, cum sunt acidul gamafenilbutiric, florizinul, hidrazida maleic, cumarina, xantina, scopoletina, acidul maleic, acidul citric, acidul cafeic, unii alcaloizi (chinina, cafeina) etc.

15

Compuii fenolici acioneaz antagonic substanelor de cretere, inhibnd unele reacii metabolice, oprind creterea i chiar provocnd necrozarea celulelor. Aceti compui pot interveni i ei n fenomenele de laten. La explantele cultivate in vitro compuii fenolici sunt desorbii n mediul de cultur de ctre celulele traumatizate sau chiar de ctre celulele din profunzimea esuturilor inoculate. Treptat, fenolii se oxideaz, se brunific, iar acest fapt are ca o prim consecin o brunificare a mediului de cultur. Fenolii oxidai sunt toxici pentru celulele aflate n cultur, iar acestea se necrozeaz rapid i inoculul moare. Pentru prevenirea aciunii profund nocive a fenolilor (n special a formelor oxidate), se indic operarea unor subculturi repetate, practicate n cascad (2 3 la numr) la intervale de zile sau sptmni, n funcie de specie, pentru a feri esuturile de efectul inhibitor al acestor substane toxice. Eventual, la fiecare subcultivare, se recomand nlturarea unei mici poriuni din zona bazal a explantelor. (Cachi, 1987). n general, eliberarea de fenoli n substratul de cultur constituie un fenomen frecvent ntlnit la explantele prelevate de la plante lemnoase, dar nu numai la acestea. Dac brunificarea mediului persist la fiecare subcultur, se recomand adugarea n mediu a unor substane cu proprieti antioxidante (cisteina HCl, acidul ascorbic, acidul citric, ditiotritol (DTT) etc.) sau a unor compui ce au proprietatea de a adsorbi produii fenolici, cum ar fi polivinilpirolidona (Policar AT sau PVP) sau crbunele activ. Uneori pstrarea explantelor inoculate o perioad de timp la ntuneric a condus la o micorare a proceselor de oxidare a fenolilor i la o mai slab brunificare a mediului, prentmpinndu-se efectul nociv al fenolilor oxidai asupra inoculilor. (Cachi, 1987). Florizinul este un inhibitor natural din grupa flavonoizilor, descoperit de L. P. Sarapun (1960, 1965). Este un compus rezultat din glicozidarea i condensarea polifenolilor i se sintetizeaz uneori n frunze, n condiii de zi scurt. Dup sinteza sa n frunze, florizinul se degradeaz i trece n floretin, un compus cu proprieti stimulatoare asupra nfloririi i creterii embrionare. Floretinul migreaz n muguri, unde sufer o nou glicozidare i trece la florizin, care exercit o aciune de inhibare n perioadele de repaus mugural din timpul iernii. Se consider c din raportul cantitativ i calitativ al acestor compui cu proprieti fiziologice diferite ar rezulta ritmul proceselor de cretere a plantelor n diferite sezoane i faze de vegetaie. (Vntu, 2005).

16

7. Alte substane cu efect n reglarea creterii, a multiplicrii i a morfogenezei la explantele cultivate in vitro
Procaina HCl (clorhidrat de procain / p-aminobenzoat de dietilaminoetanol) face parte din categoria biostimulatorilor cu gam larg de aciune. Ea a fost aplicat n culturile de celule de drojdie de bere i s-a constatat un efect stimulator al acesteia asupra respiraiei celulelor, asupra multiplicrii drojdiilor, asupra creterii algelor, iar la plantele superioare s-a dovedit aciunea sa stimulatoare asupra germinaiei i a creterii lor. La monocotiledonate se recomand utilizarea unor doze mai ridicate, iar la dicotiledonate, concentraii mai mici. Tratamentele se aplic la nivelul seminelor (prin mbibarea acestora) sau al plantelor prin stropiri repetate n decursul ciclului de vegetaie. Se obine o cretere a masei vegetative, o precocitate n nflorire i n coacere, o sporire a cantitii de fructe i de semine etc. S-a constatat c adaosul de procain n mediul de cultur al inoculilor cultivai in vitro a determinat o stimulare a multiplicrii protocormilor de Cymbidium i o cretere n greutate a acestora. (Cachi, 1987). La nivelul explantelor constnd din fragmente de rdcini de morcov (cu cambiul n poziie median) procaina a indus instalarea unui net proces proliferativ i de stimulare a creterii n lungime a celulelor nou formate i a determinat o sporire a greutii uscate a inoculilor. Calusul de Arabidopsis cultivat pe medii cu procain a prezentat o sporire a creterii n volum i a greutii proaspete i uscate. Procaina a indus nu numai o stimulare a multiplicrii celulare, ci i o cretere a coninutului n pigmeni asimilatori, a activitii peroxidazice, a consumului de oxigen etc. (Cachi, 1987). Floroglucinolul este indicat a fi folosit n culturile de explante prelevate de la pomii fructiferi, mai ales la speciile din familia Rosaceae. Acest compus fenolic, izolat din seva brut a merilor, asigur o mai bogat multiplicare a tulpinilor i o mai corespunztoare nrdcinare a plantulelor neoformate in vitro. n afara regulatorilor de cretere, n unele reete de medii de cultur se practic adugarea unor substane ca picloramul, insatinul, unele carburi cancerigene (antracen, metilcolantren, acid traumatic), unii ageni chelatizani (acidul 1,3-diamino-2-hidroxipropanN, N, N, tetraacetic), erbicide (benazolinul), antibiotice etc. n scopul intensificrii proceselor de morfogenez este indicat adugarea n mediul de cultur a sulfatului de adenin. Difenilureea este, de asemenea, o substan cu efect citochininic.

17

Anexe

Foto 1. Apariia lstarilor la nivel de calus cu originea peiol la kiwi

Foto 2. Apariia lstarilor la nivel de calus cu originea limb foliar la kiwi

Foto 3. Formarea calusului din explantul peiol kiwi

Foto 4. Formarea exogen a primordiilor foliare la kiwi

Foto 5. Formarea rdcinilor pe mediul B5 la kiwi

18

Foto 6. Rspunsul speciei Piper solmsianum, explantul fiind un peiol, dup 30 de zile de cultivare. A: control; B: 2 mg/l BA i 2mg/l IAA; C: 2 mg/l BA i 0,2 mg/l 2,4 D; D: 2mg/l IAA; E: 2 mg/l BA i 0,2 mg/l NAA; F: 0,2 mg/l BA i 0,2 mg/l 2,4 D. c, r, s formarea calusului, rdcinii i respectiv tulpinii; e explant.

Foto 7. Rizogeneza lstarilor derivai din frunze la P. pyrifolia Senbuzhi pe mediul MS suplimentat cu 25 mg/l IBA i 30 g/l sucroz cu (a) sau fr (b) crbune activ i plantul binedezvoltat (c). (Tang, 2008)

Foto 8. Influena giberelinei (Ziauka, 2006)

19

Bibliografie
1. Burnea I., Popescu Ionela, Neamu G., Stancu Elena, Lazr t., 1977 Chimie i biochimie vegetal, Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti. 2. Cachi-Cosma Dorina, 1987 Metode in vitro la plantele de cultur, Editura Ceres, Bucureti. 3. Davies Peter J., 2004 PLANT HORMONES. Biosynthesis, Signal Transduction, Action, Kluwer Academic Publusher, pag. 1 2. 4. Derendovski Antonina, Tcaciuc Olga, Moroan Elizaveta, 2008 Activitatea procesului de rizogenez la butaii de vi de vie i metodele de reglare a ei, tiina agricol, nr. 2, Republica Moldova. 5. Maria Graziela Zagatto Krug, Liliane Cristina Librio Stipp, Adriana Pinheiro Martinelli Rodriguez, Beatriz Madalena Januzzi Mendes, 2005 In vitro organogenesis in watermelon cotyledons, Pesq. agropec. bras., Braslia, v.40, n.9, p.861-865. 6. Meneses A., Flores Dora, Muoz M., Arrieta Griselda, Espinoza Ana M., 2005 Effect of 2,4-D, hydric stress and light on indica rice (Oryza sativa) somatic embryogenesis, Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 53 (3-4): 361-368, September-December. 7. Omid Karami, Gona Karimi Kordestani, 2007 Proliferation, shoot organogenesis and somatic embryogenesis in embryogenic callus of carnation, Journal of Fruit and Ornamental Plant Research Vol. 15: 167-175. 8. Tang H., Luo Y., Liu C., 2008 Plant regeneration from in vitro leaves of four commercial Pyrus species, Plant Soil Environ., 54, (4): 140148, China. 9. Vntu Smaranda, 2005 Culturi de celule i esuturi vegetale n biotehnologii, Editura Univ. Al. I. Cuza, Iai. 10. Xiaofei Lin, Wenbo Zhang, Hiroyoshi Takano, Susumu Takio, Kanji Ono, 2004 Efficient plant regeneration and micropropagation from callus derived from mature zigotic embryo of Larix gmelinii, Plant biotechnology, 21 (2), 159 163. 11. Jonas Ziauka, Sigute Kuusiene, 2006 Gibberellin in vitro research for vegetative propagation of aspen.

20