Sunteți pe pagina 1din 20

1. Fitohormonii - generalităţi

1.1. Definiţie

Fitohormonii (regulatorii de creştere sau substanţele de creştere) sunt compuşi organici care, în concentraţii mici sau foarte mici, influenţează procesele de creştere şi de morfogeneză (le stimulează sau le inhibă), respectiv reglează procesele fiziologice din diferitele ţesuturi şi organe ale plantelor. Fitohormonii sunt un set unic de compuşi, cu metabolism şi proprietăţi specifice. Singurele caracteristici universale sunt faptul că reprezintă compuşi naturali din plante cu o abilitate de a afecta procesele fiziologice la concentraţii mult mai mici decât cele la care nutrienţii sau vitaminele afectează aceste procese. (Davies, 2004).

1.2. Etimologie

Termenul “hormon” a fost pentru prima dată folosit în medicină în urmă cu aproximativ 100 de ani, însemnând un factor stimulator, deşi a ajuns să însemne un mesaj chimic transportat. Cuvântul provine din limba greacă unde înseamnă “a stimula” sau “a pune în mişcare”. Prin urmare, însăşi originea cuvântului nu presupune noţiunea de transport, iar definiţia de mai sus a unui fitohormon este mult mai aproape de înţelesul cuvântului grecesc decât de semnificaţia actuală a hormonilor folosită în contextul fiziologiei animale. Went şi Thimann (1937), în cartea lor Phytohormones, au definit hormonii ca substanţe ce sunt transportate dintr-o parte a organismului în alta. Utilizarea lor originală în fiziologia vegetală a derivat din conceptul mamalian al hormonilor. Acesta implică identificarea unui loc de sinteză, transportul prin fluxul sanguin la un ţesut ţintă şi controlul răspunsurilor fiziologice în ţesutul ţintă în funcţie de concentraţia hormonului. (Davies, 2004).

1.3. Scurt istoric (Cachiţă, 1987)

Darwin (1880) a intuit existenţa fitohormonilor, dar abia în secolul XX s-a putut dovedi experimental rolul lor fiziologic, respectiv modul de acţiune, precum s-a putut realiza izolarea, purificarea sau sintetizarea acestora.

1

Went (1928) a pus în evidenţă prezenţa, în coleoptilul de Avena, a unei substanţe de creştere, cu rol în curbarea fototropică a porţiunii apicale a acestuia. Kögl şi Haagen-Smit (1931) au obţinut o substanţă activă, „auxina A”, izolată din urina umană. Apoi Kögl şi colab. (1934) au comunicat izolarea, tot din urină, a unei substanţe mai complexe, pe care au denumit-o „heteroauxină” („auxina A şi B”), compus care, ulterior, s-a dovedit a fi acidul 3-indolilacetic (acidul β-indolilacetic, abreviat AIA). Această substanţă a fost sintetizată încă din anul 1904 de către Ellinger, dar până în anii 1937 - 1939 nu s-au cunoscut proprietăţile sale biologice. În 1934, Kögl şi Kostermans au izolar AIA din drojdii, iar Thimann, în 1935, a extras AIA din Rhizopus. În anii 1938 - 1939, prin experimente independente (şi aproape simultane), efectuate de către Gautheret şi Nobecourt cu culturi de ţesuturi in vitro, s-a pus în evidenţă acţiunea fitohormonală (de excepţie) exercitată de către auxină. În laboratoarele lui Skoog, în anul 1956, s-a izolat o altă substanţă activă, chinetina (6- furfurilaminopurina), preparată din spermă de heringi. Tot în 1956, s-a remarcat, în laboratoarele lui Steward, acţiunea particulară a laptelui din nucă de cocos, a cărui prezenţă în mediul de cultură inducea formarea a numeroase plantule, din celulele cultivate in vitro. Laptele din nucă de cocos este un produs natural, bogat în citochinine native. Giberelinele, acidul abscisic şi etilena au fost descoperite cam în aceeaşi perioadă a anilor ’30. Efectele acestora în culturile de ţesuturi sunt mai puţin spectaculoase în raport cu cele obţinute în practica agricolă.

1.4. Structura, sinteza şi transportul

Sub aspect chimic, fitohormonii sunt substanţe micromoleculare foarte heterogene ce se aseamănă cu vitaminele şi cu unii hormoni animali. Conţin în moleculă inele ciclice (indolic, gibanic, purinic, iononic etc.), legături etenice şi diferite grupări funcţionale. Sunt substanţe larg răspândite în natură, ce se găsesc în diferite ţesuturi şi organe ale plantelor superioare, în ciuperci, drojdii, alge, flagelate, în numeroase microorganisme, atât în stare liberă, cât şi asociate cu proteinele. Pe lângă fitohormoni (regulatori de creştere de natură endogenă) se cunoaşte şi o foarte extinsă gamă de substanţe organice cu acţiune fiziologică asemănătoare cu cea a fitohormonilor, compuşi de sinteză ce aparţin familiilor de substanţe fitohormonale native, având un nucleu apropiat sau prezintă o structură diferită. Deşi sunt compuşi variaţi ca

2

structură chimică, ei au comun faptul că exercită acţiuni asemănătoare fitohormonilor (mimând efectul lor), influenţând procesele de creştere la diluţii foarte mari. Fitohormonii naturali sunt metabolizaţi intracelular şi, ca atare, au durată limitată de acţiune asupra celulelor. Spre deosebire de aceştia, regulatorii de creştere sintetici (omologi ca acţiune fiziologică cu fitohormonii) sunt metabolizaţi mai lent. Astfel, durata lor de influenţă este prelungită, efectul lor fiind mai puternic. Regulatorii de creştere sunt sintetizaţi de citoplasma celulelor tinere şi se acumulează mai ales în zonele de creştere ale tulpinilor şi rădăcinilor, în muguri, seminţe, polen, în ovare, în ţesuturi tinere etc. (Burnea, 1977). Fitohormonii sunt, de regulă, transportaţi şi acţionează de la distanţă, dar pot acţiona şi în ţesutul în care au fost sintetizaţi. De exemplu, citochininele sunt transportate de la rădăcină la frunze, unde intervin în prevenirea senescenţei, în timp ce etilena acţionează în acelaşi ţesut în care a fost sintetizată. (Vântu, 2005). Biogeneza fitohormonilor este localizată, de regulă, în alte organe decât în organele ţintă. Din locurile de sinteză, ei sunt translocaţi (sub formă activă sau inactivă) spre ţesuturile apte de a recepţiona semnalele şi de a reacţiona la stimulii primiţi (concentraţiile active sunt, adesea, mai mici de 1 µM). (Cachiţă, 1987). Translocaţi la locul de reacţie ei determină producerea unor răspunsuri specifice biochimice, fiziologice şi/sau morfologice. În funcţie de natura lor, sinteza fitohormonilor este localizată în diferite zone ale plantelor. Ei pot fi păstraţi un timp la locul de origine (sub formă activă sau inactivă) ori pot migra în diferitele organe ale plantelor, acumulându-se în anumite celule şi ţesuturi. Faptul că „semnalul” purtat de către fitohormoni marchează un răspuns imediat sau întârziat depinde de starea fiziologică a celulelor, ţesuturilor sau organelor receptori, de stadiul lor de dezvoltare, de natura şi nivelul semnalului, de interacţiile cu alţi fitohormoni şi de condiţiile de mediu. Celulele responsabile de biogeneza fitohormonilor, ca de altfel şi cele care decodifică mesajul lor, trebuie să deţină un sistem enzimatic adecvat sintezei sau deblocării căilor metabolice, responsabile de asigurarea manifestării integrale a activităţii fiecărui compartiment biomolecular, implicat în procesele de creştere şi dezvoltare. Amplitudinea reacţiei este dependentă nu numai de întrunirea condiţiilor endogene receptoare a impulsurilor fitohormonale şi a condiţiilor de mediu, ci şi de disponibilităţile celulare în a răspunde mesajelor primite, cu referire deosebită la rezervele energetice şi constructive ale celulelor, cu atât mai mult cu cât ne adresăm proceselor de multiplicare şi de creştere celulară. (Cachiţă,

1987).

3

1.5. Rolul fiziologic

Fitohormonii ocupă poziţii cheie în procesele de multiplicare celulară şi în creşterea acestora, în general, şi în morfogeneza plantelor cormofite, în special. Fitohormonii determină creşterea plantelor prin intensificarea diviziunii celulare şi prin alungirea celulelor existente. Mecanismul prin care se realizează creşterea plantelor depinde de natura fitohormonilor. Fitohormonii joacă un rol important în controlarea modului în care planta creşte şi se dezvoltă. În timp ce metabolismul furnizează energia şi “cărămizile” necesare pentru viaţa plantei, hormonii sunt cei care reglează viteza de creştere a părţilor individuale şi integrarea acestora pentru a produce forma pe care noi o recunoaştem ca fiind plantă. Prin urmare, ei joacă un rol important în procesele de reproducere. (Davies, 2004).

1.6. Clasificare

Clasificarea fitohormonilor se face, de obicei, în trei grupe (Vântu, 2005):

Stimulatoare;

Retardante;

Inhibitoare.

Aceste trei grupe de substanţe se intercondiţionează reciproc, astfel că reacţiile plantelor, în toate fazele de creştere şi dezvoltare, reprezintă rezultatul unui echilibru între produşii stimulatori şi cei inhibitori. În categoria substanţelor stimulatoare se încadrează: auxinele, citochininele, giberelinele şi etilena. Pe baza acţiunilor de stimulare şi inhibare a proceselor de creştere s-au sintetizat şi substanţe cu proprietăţi biologice caracteristice, implicate în întârzierea proceselor de creştere, motiv pentru care au fost numite „retardanţi”. Între acestea amintim: beta-hidroxietilen hidrazida, clorura de trimetilamoniu etc. Dintre inhibitorii naturali menţionăm acidul abscisic, florizinul, cumarina, scopoletina, acidul maleic, acidul citric, acidul cafeic, unii alcaloizi (chinina, cafeina) etc. Dintre inhibitorii sintetici menţionăm hidrazida maleică, actinomicina D – un puternic inhibitor al metabolismului nucleoproteic, oprind creşterea plantelor.

4

Alte substanţe regulatoare de creştere şi maturare:

brasinosteroizii: brasinolidul (izolat din uleiul de rapiţă) şi castasteronul cu rol stimulator în creşterea ţesuturilor vegetale, stimularea producţiei de etilenă şi creşterea rezistenţei la îngheţ, boli, stres hidric;

poliaminele alifatice care sunt implicate în dezvoltarea fructelor şi au acţiune antagonică faţă de etilenă;

acidul jasmonic care are efect asemănător cu etilena şi actiuni similare acidului abscisic;

acidul salicilic care este implicat în biosinteza proteinelor cu masă moleculară mică ce conferă rezistenţă plantelor la acţiunea agenţilor patogeni.

2. Auxinele

Auxinele sunt compuşi naturali, fiziologic polivalenţi, care (în doze extrem de reduse) pot influenţa atât creşterea, cât şi dezvoltarea plantelor, respectiv formarea organelor vegetative şi generative. (Vântu, 2005). Auxinele au fost primul grup de substanţe fitohormonale descoperite. În această categorie sunt grupate şi alte substanţe organice, de regulă acizi organici, care în principal au capacitatea de a produce curbarea coleoptilului de Avena (la concentraţii <0,001 M), promovând creşterea în lungime a celulelor. (Cachiţă, 1987). Acidul 3-indolilacetic este primul fitohormon cert care a fost descoperit şi care se mai numeşte şi heteroauxină (Kögl 1934). Acest fitohormon are o largă răspândire în natură, fiind prezent în toate plantele superioare şi inferioare. Se acumulează de obicei în endosperm, coleoptil, ovare şi în grăuncioarele de polen. Se formează în cantitate mai mare în vârful rădăcinii şi tulpinii, în tuburile polenice, în seminţele tinere şi în general în ţesuturile meristematice, dar este sintetizat şi de unele ciuperci parazite şi simbiote. Principalele auxine sunt:

cu nucleu indolic → acidul 3-indolilacetic (auxina nativă, AIA), acidul indolilbutiric (AIB), acidul indolilpropionic (AIP);

cu nucleu naftalic → acidul alfa naftilacetic (ANA), acidul beta naftoxiacetic (ANOA);

5

cu nucleu clorfenoxiacetic → acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4-D), acidul 2,4,5- triclorfenoxiacetic (2,4,5-T), acidul 2-metil-4-clorfenoxiacetic;

cu nucleu benzoic → acizi 2,4,6- sau 2,3,6-triclorbenzoici, acidul 2-metoxi-3,6- diclorbenzoic (dicamba);

cu nucleu picolinic → acidul 4-amino-3,5,6-tricloropicolinic (PIC / picloram) etc.

În numeroase plante s-au identificat derivaţi ai acidului 3-indolilacetic sau substanţe înrudite cu acesta, care au acţiune fitohormonală, dintre acestea, mai importante fiind aldehida 3-indolilacetică, acidul indolilpiruvic, esterul etilic al acidului indolilacetic, acidul indolilacetonitrilic, acidul indolilpiruvic etc. Paralel cu extragerea şi separarea auxinelor naturale au fost sintetizate numeroase substanţe chimice cu structură asemănătoare cu a compuşilor endogeni, având o puternică influenţă asupra metabolismului plantelor şi multiple aplicaţii în practica agricolă şi horticolă. Aceste substanţe sunt: acidul 2,4-diclorfenoxiacetic (2,4-D), acidul indolilbutiric, acidul indolilpropionic, acidul naftilacetic (ANA). Aceste substanţe sunt derivaţi ai indolului şi naftalenului. (Vântu, 2005). Extragerea, purificarea şi identificarea chimică a auxinelor au pus în evidenţă prezenţa lor, în stare naturală, în concentraţii extrem de reduse, în diferite organe ale plantelor, precum şi faptul că se acumulează preferenţial în organele cu creştere activă – muguri şi frunze tinere, vârfuri de tulpini şi rădăcini, antere şi granule de polen, cotiledoane, seminţe imature etc. Cantităţi infime de auxine se găsesc în cambiu şi în ţesuturile parenchimatice. (Vântu, 2005). Sinteza primară a auxinei presupune existenţa unui precursor care se transformă prin oxidare: triptofanul trece treptat în triptamină, apoi în acid β-indolilpiruvic. Acidul β- indolilpiruvic reprezintă punctul de plecare a reacţiilor metabolice din procesul sintezei auxinelor, reacţii ce au la bază anumite procese enzimatice ce necesită pentru fiecare etapă o enzimă specifică. Auxinele se sintetizează în frunzele tinere, de unde migrează spre celelalte organe tinere, aflate în procese intense de creştere, sub formă de precursori inactivi, legaţi de proteine. În vârfurile vegetative (meristemele apicale), auxinele inactive se desprind de proteine sub acţiunea unor enzime proteolitice şi devin libere şi active. Sub această formă (activă) circulă descendent, prin vasele liberiene şi, mai rar, prin ţesuturile parenchimatice adiacente vaselor conducătoare. (Vântu, 2005). Circulaţia auxinelor nu se face prin difuziune, ci pe principiul polarităţii, datorită diferenţei de potenţial electric dintre vârful plantei (cu sarcină electrică negativă) şi baza

6

plantei (cu sarcină electrică pozitivă). Astfel, auxina (încărcată cu sarcină electrică negativă) circulă bazipetal, polarizat, spre celulele tinere, dar auxinele pot circula şi transversal, în cazul organelor aşezate orizontal (lăstari laterali) sau iluminate lateral, ceea ce explică geotropismul rădăcinilor şi fototropismul tulpinilor. În prezenţa luminii pe care o captează unii fotoreceptori (riboflavină, beta-caroten), are loc degradarea auxinelor, ca un proces de oxidare şi trecere într-o formă oxidată şi inactivă, numită hemiauxin-lactonă sau hemiauxină. Datorită proceselor concomitente de biosinteză şi degradare oxidativă, stocul auxinic dintr-un organ va fi alcătuit din precursori auxinici, auxine active şi auxine degradate. (Vântu, 2005). Acidul 3-indolilacetic se găseşte în plante în stare liberă şi asociat cu proteinele. Acidul 3-indolilacetic asociat cu proteinele este inactiv şi reprezintă o rezervă însemnată pentru plante. În funcţie de necesităţi, acidul 3-indolilacetic se desprinde pe cale enzimatică de proteina inhibitoare şi devine astfel activ. În celule, auxina nativă (AIA) este degradată de către AIA-oxidază. În menţinerea sau decarboxilarea AIA intervin şi peroxidazele, iar în procesele fiziologice legate de auxină se interpun şi alţi fitohormoni care amplifică sau nu efectele auxinei. Viteza de degradare, ca şi capacitatea de a acţiona, într-un anumit sens este dependentă de natura ţesutului supus influenţei unei anumite auxine, rădăcinile fiind mai receptive la administrarea unor concentraţii mici, iar tulpinile reacţionând la concentraţii ceva mai ridicate. Între organele aceleiaşi plante, reacţia este diferită, în funcţie de natura, concentraţia şi combinaţiile dintre variate auxine şi, eventual, dintre auxine şi alţi regulatori de creştere (de exemplu, în stimularea înrădăcinării butaşilor, uneori se folosesc şi amestecuri de auxine). Acest fapt este şi mai evident la explantele cultivate in vitro. Diferenţa de reacţie există şi în ceea ce priveşte receptivitatea selectivă a plantelor faţă de dozele de auxine, între dicotiledonate şi monocotiledonate, fapt care a permis combaterea buruienilor în lanuri prin aplicarea unor doze ridicate de auxine, ca erbicide. (Cachiţă, 1987). În general, decarboxilarea enzimatică a AIA este mai puternică în ţesuturile bătrâne decât în cele tinere. Dintre auxine, ANA şi 2,4-D sunt mai stabile şi mai puţin supuse degradării endocelulare, pe când AIA nativ sau exogen este fotooxidabil şi este degradat de către radiaţiile ionizante, de razele UV, de peroxizi etc. Auxinele intervin în numeroase procese fiziologice, interacţionează cu alte substanţe endogene şi, fireşte, cu alţi fitohormoni, în special cu citochininele, giberelinele şi cu etilena. Auxinele naturale şi cele obţinute prin sinteză au o largă utilizare în agricultură şi horticultură. Ele pot fi utilizate ca stimulatori pentru înrădăcinarea butaşilor, pentru accelerarea coacerii

7

fructelor, obţinerea fructelor fără seminţe, inhibarea mugurilor, pentru prevenirea căderii premature a fructelor etc. În concentraţii mai mari sunt utilizate ca ierbicide în combaterea buruienilor. (Burnea, 1977). Auxinele naturale şi sintetice exercită diferite acţiuni fiziologice, care declanşează reacţii particulare de creştere, dezvoltare şi metabolism. Tratamentul cu auxine intensifică creşterea prin modificarea volumului celular, alungirea plasmalemei şi îngroşarea ei, prin depunerea de noi substanţe formative. Totodată sunt modificate proprietăţile fizice ale membranelor (elasticitate, plasticitate, permeabilitate pentru apă şi pentru anumiţi ioni), proprietăţile structurale (orientarea microfibrilelor de celuloză) şi proprietăţile chimice (natura proteinelor plasmatice, compoziţia pectinelor). Influenţează metabolismul, îndeosebi sinteza proteică, prin exercitarea unei influenţe asupra sintezei de ARN ribosomal. Auxinele, în concentraţii scăzute, stimulează diviziunea celulară, iar în concentraţie ridicată stimulează elongaţia celulară. Influenţează sinteza de etilenă, iar etilena la rândul ei acţionează în stabilirea nivelului de auxină şi în transportarea acesteia prin corpul plantelor. Exercită o acţiune în mişcările de creştere – tropisme şi sunt implicate în corelaţiile inter- organe şi, mai ales, în fenomenul de dominanţă apicală, caulinară, exercitat de către mugurele terminal. Unghiul de curbură al plantelor (coleoptilului) este proporţional cu cantitatea substanţei de creştere. Ca unitate de măsură se ia „unitatea de ovăz”, prin care se înţelege cantitatea de auxină care, aplicată pe un coleoptil de ovăz, produce o curbură de 10º la o temperatură de 22º C şi la o umiditate relativă a aerului de 92 %. (Burnea, 1977). Stimulează germinarea seminţelor, tratamentele cu AIA, 2,4-D şi ANA mărind capacitatea şi energia germinativă a seminţelor. Unele auxine sintetice (AIA, ANA, 2,4-D) stimulează formarea rădăcinilor la plante care, în mod normal, se înrădăcinează greu prin butaşi (Rosa, Clematis, Magnolia). Prin urmare, pentru reuşita butăşirii şi a marcotajului, se recomandă folosirea acestor substanţe. În doze mari, auxinele menţin în stare de latenţă mugurii pomilor fructiferi sau pe cei ai tuberculilor de cartof. În declanşarea înfloririi, un rol activ îl au auxinele endogene existente în ovar, la baza inflorescenţei şi în pedunculul florii. Polenul conţine, de asemenea, auxine implicate în creşterea tubului polenic. (Vântu, 2005). În timpul polenizării şi fecundării are loc biosinteza auxinelor naturale. Creşterea fructului este stimulată de auxinele sintetizate în seminţe, de unde difuzează în pulpa fructului şi declanşează extensia celulelor. Pe baza administrării auxinelor exogene este posibilă

8

formarea fructelor fără polenizare, obţinerea fructelor partenocarpice (fără seminţe), la tomate, struguri, măr, păr, citrice etc. (Vântu, 2005). Întârzierea îmbătrânirii ţesuturilor se poate realiza prin tratamente cu auxine, ceea ce poate fi asociat cu menţinerea unui anumite nivel al proteinelor şi acizilor nucleici. De asemenea, auxinele inhibă formarea embrionilor în suspensiile de celule.

3. Citochininele

Citochininele constituie un grup de substanţe derivate de la adenină, cu efect în inducerea diviziunilor celulare. Au fost izolate din laptele de Cocos nucifera şi din diferite extracte de flori şi fructe. Au fost identificate în numeroase plante superioare şi inferioare, având o largă răspândire în natură. La început a fost izolată chinetina (6-furfurilaminopurina) şi a fost experimentată pe explante din măduvă de tutun, cultivate pe medii aseptice. În lipsa acestei substanţe celulele nu se divid. În prezenţa chinetinei sau a unei substanţe de tip citochininic (şi mai ales şi în prezenţa unei auxine), se obţine o multiplicare celulară şi neoformarea de muguraşi şi de tulpiniţe. (Cachiţă, 1987). Spre deosebire de auxine, citochininele reprezintă un grup de substanţe mai omogen, din punctul de vedere al constituţiei chimice. În general, citochininele sunt adenine substituite şi posedă un nucleu purinic. Prin înlocuirea grupării furfurilice a chinetinei cu alte grupe (fenil-naftil-ciclohexil etc.) se pot obţine substanţe cu activitate asemănătoare chinetinei. În general, citochininele suportă bine autoclavarea, fiind termostabile. Prima extragere şi purificare a citochininelor naturale a fost realizată de către L. S. Letham (1963), care a izolat, din boabe imature de porumb, un compus numit zeatină. În ultimii ani au fost sintetizaţi peste 50 de compuşi chimici care manifestă proprietăţi similare cu cele ale citochininelor naturale (benziladenina, 6-benzilaminopurina, gama-azochinetina). Citochininele endogene derivă din degradarea acizilor nucleici, trecând prin faza de nucleotide. (Vântu, 2005). Metabolismul citochininelor este strâns legat de metabolismul acizilor nucleici, în special de cel al ARN-ului. La doar trei luni de la sintetizarea chinetinei, s-a sintetizat şi benziladenina (benzilaminopurina, abreviat BAP sau BA). Din marele număr de derivaţi activi cu nucleu purinic, în culturile de ţesuturi şi de celule, se folosesc mai frecvent următorii

9

patru: 2-izopentiladenina (2iP) şi zeatina (Z) ca citochinine naturale şi chinetina (K) şi benziladenina (BAP) ca citochinine de sinteză. (Cachiţă, 1987). Citochininele includ substanţe care determină efecte fiziologice legate de reglarea diviziunii celulare, creşterea celulei prin extensie, diferenţierea şi organogeneza. Prezenţa citochininelor în vasele de xilem arată că sinteza acestei substanţe se face în rădăcini, de unde migrează către vârful plantei şi se acumulează în fructe, frunze şi muguri. Migraţia se realizează concomitent cu curentul care asigură transpiraţia. Totuşi, ele nu circulă polarizat în plantă, în cursul migraţiei fiind legate de un glucid sau îmbrăcând o formă inactivă. La culturile in vitro citochininele servesc în menţinerea viabilităţii celulelor, susţinând capacitatea de supravieţuire a ţesuturilor inoculate, favorizând dediferenţierea şi stimulând multiplicarea celulară. Procesele de morfogeneză în prezenţa citochininelor constau în caulogeneză, ele impulsionând formarea de muguraşi şi tulpiniţe. Citochininele stimulează diviziunea celulelor mature, nemeristematice. Ele stimulează creşterea plantelor, procesele de morfogeneză, biosinteza substanţelor proteice (s-au descoperit citochinine legate de ARN de transfer), formarea mugurilor şi sunt antagoniste rizogenezei. Protejează metaboliţii de acţiunea enzimelor hidrolizante, ceea ce conferă citochininelor un rol important în prevenirea senescenţei. Ele exercită un efect antagonic auxinelor, anihilând dominanţa apicală a mugurelui terminal (mugurii axilari trataţi cu citochinine intră în creştere activă, în competiţie cu mugurele terminal, dar, odată cu înlăturarea citochininei, creşterea acestor se micşorează şi se opreşte, ei reintrând sub incidenţa acţiunii mugurelui apical). Acest fapt are ca efect o puternică ramificare a tulpinii (cazuri frecvent întâlnite la specii de Centaurea, Crepis). Stimulează de asemenea germinarea seminţelor plantulelor parazite, întrerup repausul seminţelor, stimulează formarea şi creşterea frunzelor prin alungirea limbului. Reduc efectul toxic al unor virusuri şi anulează efectul unor inhibitori ai germinaţiei (cumarina, xantina etc.). Stimulează dezvoltarea mugurilor, a organelor florale, dezvoltarea ovarelor, induce formarea fructelor partenocarpice, intensifică transportul asimilatelor şi măreşte rezistenţa plantelor la temperaturi scăzute sau ridicate, la infecţii cu ciuperci. Prin capacitatea de a stimula sinteza proteinelor, a pigmenţilor clorofilieni şi a acizilor nucleici, ca şi prin polarizarea circulaţiei metaboliţilor din ţesuturile adiacente spre cele tratate, citochininele au rol esenţial în întârzierea îmbătrânirii plantelor. Citochininele acţionează asupra diviziunii celulei vegetale, eficienţa lor fiind asigurată de prezenţa auxinei, întrucât auxina favorizează duplicarea ADN, iar chinetina separarea cromozomilor. Stimularea diviziunii celulare este datorată unor modificări esenţiale în ciclul

10

mitotic, reducând durata fazei presintetice (G1) din ciclul mitotic, intensificarea procesului de sintetizare (S) a ADN-ului şi prelungirea perioadelor post-sintetice (G2). (Vântu, 2005). Deosebit de important este efectul fiziologic combinat al auxinelor şi citochininelor, alcătuind ceea ce, în tehnica culturilor de ţesuturi şi celule vegetale, poartă denumirea de balanţă hormonală. În 1957, Skoog şi Miller au fondat experimental conceptul de control hormonal al organogenezei. În lucrarea lor, devenită clasică, ei au demonstrat că diferenţierea de rădăcini şi de tulpini, în cultura de măduvă de tutun, a fost dependentă de raportul dintre auxină/citochinină, prezent în substratul de cultură. Organogeneza a putut fi reglată prin schimbarea concentraţiei acestor doi hormoni în mediul de cultură. Astfel, o concentraţie crescută de auxină a promovat rizogeneza, în timp ce mărirea conţinutului de citochinină a stimulat formarea de tulpiniţe. O concentraţie egală a celor doi hormoni a impulsionat creşterea calusului. Acest experiment stă la baza cercetărilor ulterioare, efectuate cu explante cultivate in vitro şi a servit la dirijarea proceselor de morfogeneză la multe alte tipuri de culturi de ţesuturi şi celule. (Cachiţă, 1987).

4. Giberelinele

Giberelinele sunt fitohormoni care derivă de la hidrocarbura tetraciclică numită giban. Giberelina, principalul reprezentant al acestei clase de compuşi, a fost descoperită în mediile de cultură ale ciupercii Gibberella fujikuroi şi izolată de către cercetătorii japonezi T. Yabuta şi T. Hayashi (1935). Giberelinele au fost identificate ulterior în numeroase plante superioare, ciuperci, bacterii, alge, muşchi, ferigi etc. Ulterior au fost descoperite peste 50 de gibereline. Dintre acestea, acidul giberelic (GA) este cea mai activă substanţă de acest tip şi cea mai frecvent utilizată în practică, precum şi în tehnicile de culturi in vitro. (Cachiţă, 1987). Din punct de vedere chimic, giberelinele sunt diterpenoide tetraciclice care conţin în moleculă grupări etilenice, hidroxilice şi carboxilice. Giberelinele au o structură moleculară asemănătoare acidului giberelinic, care are cea mai mare activitate fitohormonală din acest grup. (Burnea, 1977). Sunt termolabile şi se sterilizează numai prin filtrare. S-a reuşit detectarea prezenţei giberelinelor naturale în aproximativ 130 de specii de plante superioare (100 de specii de dicotiledonate şi 30 de specii de monocotiledonate). Locul de sinteză a giberelinei este în embrionii seminţelor în curs de germinare, în frunzele tinere,

11

mugurii apicali. Se cunosc 52 de gibereline, care au fost identificate prin metode moderne de separare şi analiză (electroforeză, cromatografie). (Vântu, 2005). Ele circulă în plantă prin vasele liberiene. La culturile in vitro giberelinele se folosesc în mai mică măsură, dar există, totuşi,

recomandări exprese de utilizare a lor în anumite situaţii. De exemplu, ele exercită o anumită acţiune specifică asupra alungirii meristemelor apicale care, în absenţa GA, prezintă o creştere globulară. Adaosul de giberelină face ca miniinternodurile meristemelor caulinare să se alungească (de exemplu, la cultura in vitro a meristemului de cartof) şi servesc la înlăturarea fenomenelor de nanism. Pe de altă parte, trebuie avut în vedere faptul că giberelinele inhibă dediferenţierea celulelor, de aceea ele se folosesc în mediile de cultură numai în cazul în care explantul posedă meristeme în structura sa (de exemplu, la cultura de apex sau de dom meristematic). (Cachiţă, 1987). Giberelinele au în general o acţiune sinergică cu a auxinelor, iar în unele ţesuturi efectul lor este identic. Giberelinele nu acţionează asupra rădăcinilor şi au efect mic asupra coleoptilelor, dar stimulează creşterea tulpinilor şi a frunzelor. Ele acţionează în special asupra sistemelor enzimatice implicate în procesul de creştere şi mai puţin asupra membranelor celulare. Joacă un rol important în reglarea nivelului endogen de auxină, fie prin intervenţii directe în procesul de biosinteză al acesteia, fie inhibând acţiunea AIA-oxidazei. Exercită un rol complex în suprimarea latenţei instalate în seminţe, muguri sau în organele de rezervă. Tratamentul cu gibereline poate determina substituirea acţiunii frigului şi

a fotoperioadelor, formarea fructelor partenocarpice, formarea florilor mascule sau femele etc.

5. Etilena şi acidul 2-cloroetilfosfonic

Etilena a fost recunoscută ca fitohormon în anii ’80, deşi încă din anul 1901 Neljubov

a descris la plante efectele fiziologice stimulatoare ale acestei substanţe. Între anii 1917 –

1937 se întâlnesc referiri bibliografice cu privire la rolul etilenei în coacerea fructelor, dar abia în anul 1959 a crescut interesul specialiştilor pentru studierea acestui fitohormon. Fiind o hidrocarbură nesaturată gazoasă, a fost greu de identificat şi de cuantificat, cu atât mai mult cu

cât la plante etilena se produce în cantitate foarte mică (numai fructele în curs de coacere emană cantităţi mai mari de etilenă). (Cachiţă, 1987).

12

În culturile de ţesuturi şi celule, etilena a fost mai puţin folosită, datorită dificultăţilor

inerente de administrare a ei în concentraţii strict controlabile. Fiind în stare gazoasă, difuzează uşor din recipientele de cultură şi este imposibil de sterilizat prin autoclavare. Efectele fiziologice ale etilenei sunt multiple, căile metabolice şi acţiunea fiziologică ale acesteia intersectându-se cu multe alte procese. Astfel, etilena exercită un control asupra creşterii permeabilităţii membranelor, stimulează căderea frunzelor şi a fructelor, deschiderea

florilor, induce senescenţa ţesuturilor şi este implicată în transportul auxinei. Celulele rănite produc etilenă în cantitate mai mare decât celulele netraumatizate.

A fost semnalată o creştere substanţială a biosintezei şi a eliberării de etilenă sub

influenţa AIA şi a chinetinei prezente în mediul de cultură. Acumularea unei cantităţi maxime de etilenă s-a înregistrat în faza de intensă diviziune a celulelor aflate în cultură. După atingerea pragului maxim de multiplicare celulară, se instala un fenomen rapid de reprimare a producerii de etilenă. Street (1976) menţiona că într-o suspensie fină celulară de Spinacea oleracea, producţia de etilenă a fost antagonistă cu înverzirea culturii. Tisserat şi Murashige (1977) şi Dunwell (1979) au raportat producerea unei inhibări a embriogenezei somatice (la morcov, tutun şi citrice) sub influenţa etilenei. (Cachiţă, 1987). Acidul 2-cloroetilfosfonic (ACEP) este un regulator de creştere deosebit de valoros, cu aplicaţii practice extinse atât în horticultură (cultura de legume, în floricultură, pomicultură şi viticultură), cât şi în cultura cerealelor, plantelor tehnice, cartofului, tutunului etc. El are efecte diverse asupra creşterii plantelor, în funcţie de doza şi momentul aplicării acestuia. Introdus în mediul de cultură folosit pentru creşterea in vitro a ovulelor de bumbac excizate din capsule imature, a inhibat creşterea normală a ovulelor, dar a indus o stimulare a formării de calus în lipsa altor hormoni în mediu. A fost raportată, totuşi, stimularea creşterii explantelor tisulare la Citrus pe medii cu acid 2-cloroetilfosfonic. Mattoo şi Lieberman (1977) au sugerat că sinteza de etilenă este localizată în complexul constituit de membrana celulară şi protoplasmă. Ei au observat că protoplaştii de măr izolaţi produc foarte puţină etilenă, în comparaţie cu celulele cultivate în suspensie. Capacitatea de a sintetiza etilenă a fost redobândită în momentul în care protoplaştii au început regenerarea peretelui celular. (Cachiţă, 1987). Kevers şi Gaspar (1985) precizau că la plantele vitrificate s-a observat un efect al etilenei în lignificarea vaselor şi în rigidizarea pereţilor celulelor parenchimatice. Ei au experimentat cu explante constând din noduri de Dianthus caryophyllus cultivate pe medii lichide şi solide. (Cachiţă, 1987).

13

Se presupune că etilena joacă un rol major în rândul hormonilor vegetali, având o importantă contribuţie în controlarea proceselor regenerative, în embriogeneza somatică şi în morfogeneză. Experimentele utilizând explante din solzi de bulbi de Lilium speciosum au evidenţiat faptul că adăugarea de etilenă într-o fază timpurie de cultură a stimulat neoformarea de plantule în prezenţa ANA. Temperatura ridicată sau rănirea ţesuturilor (care urmau a fi inoculate) a provocat un efect similar, considerat ca fiind datorat măririi sintezei de etilenă, biogeneză care pare a avea un rol crucial în primele faze ale proceselor de regenerare, la nivelul explantelor de acest tip. Experimentele realizate pe o suspensie celulară de morcov au semnalat faptul că putresceina şi arginina blochează biosinteza de etilenă în celule. S-a observat că formarea de xilem (xilogeneza) în explantul medular de salată (Lactuca sativa) a crescut pe măsura adăugării la mediile de cultură a precursorilor etilenei (acidul 1-aminociclopropan-1-carboxilic sau ACC) sau a L-metioninei sau chiar a ACEP, generator de etilenă, substanţe ce au ridicat producţia de etilenă în recipientele de cultură. Introducerea în mediu a unor inhibitori ai etilenei a condus la o inhibare a formării de xilem şi la o inhibare a producerii de etilenă de către ţesuturile aflate în cultură. Nici L-metionina, nici ACC şi nici etilena nu sunt eficiente în inducerea xilogenezei în absenţa unei auxine şi a unei citochinine. (Cachiţă, 1987). În general, ACEP stimulează puternic organogeneza la diferite tipuri de inoculi. Natura proceselor de morfogeneză (rizogeneză sau caulogeneză) şi amploarea lor depind mult de concentraţia ACEP şi de specie. La garoafe, ACEP provoacă generarea dintr-un unic meristem a nenumăraţi muguraşi şi tulpiniţe, dar rizogeneza este slab reprezentată. Deşi caulogeneza a fost puternic stimulată de prezenţa ACEP în substratul de cultivare al inoculilor meristematici de garoafe, tulpiniţele neoformate au avut frunzuliţele vitrificate. Atât la crizanteme, cât şi la protocormul de Cymbidium, ACEP a provocat o stimulare deosebită a proceselor de rizogenză, concomitent cu o optimizare a creşterii tulpinilor. La minibutaşii de crizanteme, prezenţa AIA în mediul de cultură a stimulat rizogeneza (cu formare de rădăcini groase şi lungi), dar s-a înregistrat o brunificare a mediului şi a rădăcinilor, probabil din cauza oxidării AIA. La propagulele de gerbera, prezenţa ACEP în mediul de cultură a indus o foarte bună creştere a coloniei de plantule, fiind stimulată atât rizogeneza, cât şi caulogeneza. (Cachiţă, 1987). În cazul minibutaşilor de cartof, constând din minidiscuri dimensionate din minituberculi, generaţi in vitro, s-a constatat că a fost stimulată atât caulogeneza, cât şi rizogeneza în prezenţa ACEP. Experienţe întreprinse cu explante constând din minibutaşi de Saintpaulia (frunzuliţe pedunculate, detaşate din colonii de propagule generate in vitro) pe

14

medii cu ACEP nu au condus la înregistrarea vreunui efect deosebit al ACEP asupra proceselor de morfogeneză.

6. Acidul abscisic şi alţi inhibitori

Acidul abscisic este un fitohormon ce poate lua naştere din unele carotenoide sau din precursori inferiori. Se găseşte predominant în fructele necoapte şi are o acţiune complexă asupra plantelor. El inhibă în general creşterea plantelor şi grăbeşte formarea florilor. Se pare că acidul abscisic se găseşte în raport invers proporţional cu conţinutul giberelinelor. Acidul abscisic a fost descoperit de P. F. Wareing (1964) în mugurii dorminzi de paltin de munte (Acer pseudoplatanus). Se consideră că acidul abscisic este prezent în indivizii tuturor speciilor vegetale, cu variaţii sezoniere în funcţie de starea fiziologică a ţesuturilor. Transportul acidului abscisic din zona de sinteză se face prin floem, de unde se extinde în seva xilemului. Circulaţia are loc după o polaritate distinctă, fiind mult mai intensă în sensul descendent decât în cel ascendent. (Vântu, 2005). Deşi acidul abscisic (AAB) este un fitohormon cu rol important în viaţa plantelor cormofite, fiind implicat în procesele de latenţă, în culturile de ţesuturi şi de celule se foloseşte în mică măsură. Este totuşi utilizat în culturile de embrioni somatici, pentru inducerea intrării acestora în repaus şi în procedeele de conservare in vitro. (Cachiţă, 1987). Acidul abscisic prezintă acţiune antigiberelinică, antiauxinică, menţine starea de repaus a plantelor, fiind prezent în ţesuturile meristematice (meristeme apicale, cambiu), în oosfere nefecundate, embrioni, reglează creşterea mugurilor şi înflorirea, favorizează procesele de „desprindere şi cădere” a fructelor şi frunzelor şi grăbeşte îmbătrânirea ţesuturilor şi descompunerea clorofilei. (Vântu, 2005). Substanţele inhibitoare sunt substanţele care exercită o acţiune specifică de inhibare a diferitelor procese vitale, anihilând acţiunea auxinelor naturale. În majoritatea cazurilor, inhibitorii endogeni sunt lactone nesaturate, compuşi fenolici simpli sau complecşi, acizi organici, flavonoide, prezenţi în diferite organe ale plantelor (seminţe, bulbi, muguri). Inhibitorii au capacitatea de a reduce sau anula acţiunea substanţelor stimulatoare şi de a provoca o inhibare a creşterii plantelor cu intensităţi diferite. (Vântu, 2005). Acţiunea fitohormonilor poate fi inhibată de unele substanţe numite antiauxine, cum sunt acidul gamafenilbutiric, florizinul, hidrazida maleică, cumarina, xantina, scopoletina, acidul maleic, acidul citric, acidul cafeic, unii alcaloizi (chinina, cafeina) etc.

15

Compuşii fenolici acţionează antagonic substanţelor de creştere, inhibând unele reacţii metabolice, oprind creşterea şi chiar provocând necrozarea celulelor. Aceşti compuşi pot interveni şi ei în fenomenele de latenţă. La explantele cultivate in vitro compuşii fenolici sunt desorbiţi în mediul de cultură de către celulele traumatizate sau chiar de către celulele din profunzimea ţesuturilor inoculate. Treptat, fenolii se oxidează, se brunifică, iar acest fapt are ca o primă consecinţă o brunificare a mediului de cultură. Fenolii oxidaţi sunt toxici pentru celulele aflate în cultură, iar acestea se necrozează rapid şi inoculul moare. Pentru prevenirea acţiunii profund nocive a fenolilor (în special a formelor oxidate), se indică operarea unor subculturi repetate, practicate în cascadă (2 – 3 la număr) la intervale de zile sau săptămâni, în funcţie de specie, pentru a feri ţesuturile de efectul inhibitor al acestor substanţe toxice. Eventual, la fiecare subcultivare, se recomandă înlăturarea unei mici porţiuni din zona bazală a explantelor. (Cachiţă, 1987). În general, eliberarea de fenoli în substratul de cultură constituie un fenomen frecvent întâlnit la explantele prelevate de la plante lemnoase, dar nu numai la acestea. Dacă brunificarea mediului persistă la fiecare subcultură, se recomandă adăugarea în mediu a unor substanţe cu proprietăţi antioxidante (cisteina HCl, acidul ascorbic, acidul citric, ditiotritol (DTT) etc.) sau a unor compuşi ce au proprietatea de a adsorbi produşii fenolici, cum ar fi polivinilpirolidona (Policar AT sau PVP) sau cărbunele activ. Uneori păstrarea explantelor inoculate o perioadă de timp la întuneric a condus la o micşorare a proceselor de oxidare a fenolilor şi la o mai slabă brunificare a mediului, preîntâmpinându-se efectul nociv al fenolilor oxidaţi asupra inoculilor. (Cachiţă, 1987). Florizinul este un inhibitor natural din grupa flavonoizilor, descoperit de L. P. Sarapun (1960, 1965). Este un compus rezultat din glicozidarea şi condensarea polifenolilor şi se sintetizează uneori în frunze, în condiţii de zi scurtă. După sinteza sa în frunze, florizinul se degradează şi trece în floretin, un compus cu proprietăţi stimulatoare asupra înfloririi şi creşterii embrionare. Floretinul migrează în muguri, unde suferă o nouă glicozidare şi trece la florizin, care exercită o acţiune de inhibare în perioadele de repaus mugural din timpul iernii. Se consideră că din raportul cantitativ şi calitativ al acestor compuşi cu proprietăţi fiziologice diferite ar rezulta ritmul proceselor de creştere a plantelor în diferite sezoane şi faze de vegetaţie. (Vântu, 2005).

16

7. Alte substanţe cu efect în reglarea creşterii, a multiplicării şi a morfogenezei la explantele cultivate in vitro

Procaina HCl (clorhidrat de procaină / p-aminobenzoat de dietilaminoetanol) face parte din categoria biostimulatorilor cu gamă largă de acţiune. Ea a fost aplicată în culturile de celule de drojdie de bere şi s-a constatat un efect stimulator al acesteia asupra respiraţiei celulelor, asupra multiplicării drojdiilor, asupra creşterii algelor, iar la plantele superioare s-a dovedit acţiunea sa stimulatoare asupra germinaţiei şi a creşterii lor. La monocotiledonate se recomandă utilizarea unor doze mai ridicate, iar la dicotiledonate, concentraţii mai mici. Tratamentele se aplică la nivelul seminţelor (prin îmbibarea acestora) sau al plantelor prin stropiri repetate în decursul ciclului de vegetaţie. Se obţine o creştere a masei vegetative, o precocitate în înflorire şi în coacere, o sporire a cantităţii de fructe şi de seminţe etc. S-a constatat că adaosul de procaină în mediul de cultură al inoculilor cultivaţi in vitro a determinat o stimulare a multiplicării protocormilor de Cymbidium şi o creştere în greutate a acestora. (Cachiţă, 1987). La nivelul explantelor constând din fragmente de rădăcini de morcov (cu cambiul în poziţie mediană) procaina a indus instalarea unui net proces proliferativ şi de stimulare a creşterii în lungime a celulelor nou formate şi a determinat o sporire a greutăţii uscate a inoculilor. Calusul de Arabidopsis cultivat pe medii cu procaină a prezentat o sporire a creşterii în volum şi a greutăţii proaspete şi uscate. Procaina a indus nu numai o stimulare a multiplicării celulare, ci şi o creştere a conţinutului în pigmenţi asimilatori, a activităţii peroxidazice, a consumului de oxigen etc. (Cachiţă, 1987). Floroglucinolul este indicat a fi folosit în culturile de explante prelevate de la pomii fructiferi, mai ales la speciile din familia Rosaceae. Acest compus fenolic, izolat din seva brută a merilor, asigură o mai bogată multiplicare a tulpinilor şi o mai corespunzătoare înrădăcinare a plantulelor neoformate in vitro. În afara regulatorilor de creştere, în unele reţete de medii de cultură se practică adăugarea unor substanţe ca picloramul, insatinul, unele carburi cancerigene (antracen, metilcolantren, acid traumatic), unii agenţi chelatizanţi (acidul 1,3-diamino-2-hidroxipropan- N, N, N, tetraacetic), erbicide (benazolinul), antibiotice etc. În scopul intensificării proceselor de morfogeneză este indicată adăugarea în mediul de cultură a sulfatului de adenină. Difenilureea este, de asemenea, o substanţă cu efect citochininic.

17

Anexe

Anexe Foto 1. Apariţia lăstarilor la nivel de calus cu originea peţiol la kiwi Foto 3.

Foto 1. Apariţia lăstarilor la nivel de calus cu originea peţiol la kiwi

lăstarilor la nivel de calus cu originea peţiol la kiwi Foto 3. Formarea calusului din explantul

Foto 3. Formarea calusului din explantul peţiol kiwi

kiwi Foto 3. Formarea calusului din explantul peţiol kiwi Foto 2. Apariţia lăstarilor la nivel de

Foto 2. Apariţia lăstarilor la nivel de calus cu originea limb foliar la kiwi

la nivel de calus cu originea limb foliar la kiwi Foto 4. Formarea exogenă a primordiilor

Foto 4. Formarea exogenă a primordiilor foliare la kiwi

la kiwi Foto 4. Formarea exogenă a primordiilor foliare la kiwi Foto 5. Formarea rădăcinilor pe

Foto 5. Formarea rădăcinilor pe mediul B5 la kiwi

18

Foto 6. Răspunsul speciei Piper solmsianum , explantul fiind un peţiol, după 30 de zile

Foto 6. Răspunsul speciei Piper solmsianum, explantul fiind un peţiol, după 30 de zile de cultivare. A: control; B: 2 mg/l BA şi 2mg/l IAA; C: 2 mg/l BA şi 0,2 mg/l 2,4 D; D: 2mg/l IAA; E: 2 mg/l BA şi 0,2 mg/l NAA; F: 0,2 mg/l BA şi 0,2 mg/l 2,4 D. c, r, s – formarea calusului, rădăcinii şi respectiv tulpinii; e – explant.

rădăcinii şi respectiv tulpinii; e – explant. Foto 7. Rizogeneza lăstarilor derivaţi din frunze la P.

Foto 7. Rizogeneza lăstarilor derivaţi din frunze la P. pyrifolia Senbuzhi pe mediul MS suplimentat cu 25 mg/l IBA şi 30 g/l sucroză cu (a) sau fără (b) cărbune activ şi plantulă bine- dezvoltată (c). (Tang, 2008)

(b) cărbune activ şi plantulă bine- dezvoltată (c). (Tang, 2008) Foto 8. Influenţa giberelinei (Ziauka, 2006)

Foto 8. Influenţa giberelinei (Ziauka, 2006)

19

Bibliografie

1. Burnea I., Popescu Ionela, Neamţu G., Stancu Elena, Lazăr Şt., 1977 Chimie şi biochimie vegetală, Editura Didactică şi Pedagogică, Bucureşti.

2. Cachiţă-Cosma Dorina, 1987 Metode in vitro la plantele de cultură, Editura Ceres, Bucureşti.

3. Davies Peter J., 2004 PLANT HORMONES. Biosynthesis, Signal Transduction, Action, Kluwer Academic Publusher, pag. 1 – 2.

4. Derendovski Antonina, Tcaciuc Olga, Moroşan Elizaveta, 2008 Activitatea procesului de rizogeneză la butaşii de viţă de vie şi metodele de reglare a ei, Ştiinţa agricolă, nr. 2, Republica Moldova.

5. Maria Graziela Zagatto Krug, Liliane Cristina Libório Stipp, Adriana Pinheiro Martinelli Rodriguez, Beatriz Madalena Januzzi Mendes, 2005 In vitro organogenesis in watermelon cotyledons, Pesq. agropec. bras., Brasília, v.40, n.9, p.861-865.

6. Meneses A., Flores Dora, Muñoz M., Arrieta Griselda, Espinoza Ana M., 2005 Effect of 2,4-D, hydric stress and light on indica rice (Oryza sativa) somatic embryogenesis, Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 53 (3-4): 361-368, September-December.

7. Omid Karami, Gona Karimi Kordestani, 2007 Proliferation, shoot organogenesis and somatic embryogenesis in embryogenic callus of carnation, Journal of Fruit and Ornamental Plant Research Vol. 15: 167-175.

8. Tang H., Luo Y., Liu C., 2008 Plant regeneration from in vitro leaves of four

commercial Pyrus species, Plant Soil Environ., 54, (4): 140–148, China.

9. Vântu Smaranda, 2005 Culturi de celule şi ţesuturi vegetale în biotehnologii, Editura Univ. „Al. I. Cuza”, Iaşi.

10. Xiaofei Lin, Wenbo Zhang, Hiroyoshi Takano, Susumu Takio, Kanji Ono, 2004 Efficient plant regeneration and micropropagation from callus derived from mature zigotic embryo of Larix gmelinii, Plant biotechnology, 21 (2), 159 –

163.

11. Jonas Ziauka, Sigute Kuusiene, 2006 Gibberellin in vitro research for vegetative propagation of aspen.

20