PCR – VARIANTE ȘI APLICAȚII

Catenă nou sintetizat ă ADN polimeraza

CUPRINS

1. PCR – principiul metodei

2. PCR – mediul de reacție
3. Etapele PCR
4. Variante PCR
4.1. RFLP
4.2. AFLP
4.3. RAPD
4.4. RT-PCR
4.5. RT-qPCR
4.6. Colony PCR
4.7. Long PCR
4.8. Nested PCR
4.9. Multiplex PCR
 ADN Nuclear și Mitocondrial

ADN NUCLEAR ADN MITOCONDRIAL (mtDNA)

(nDNA)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18

OR

X Y X X
19 20 21 22 23

ADN NUCLEAR vs. ADN MITOCONDRIAL

- 2 copii/celulă - sute de copii/celulă
- moștenit biparental - moștenit pe linie maternă
- au loc procese de recombinare - nu au loc procese de recombinare
- genotipare (DNA fingerprinting) - taxonomie și filogenie moleculară
- identificarea sexelor - filogeografie
2. Izolarea și purificarea ADNt

Wizard Genomic DNA

PCI* = fenol : cloroform : alcool izoamilic (25 : 24 : 1)

MATERIAL ŞI METODE – Izolarea și purificarea ADN

2. Izolarea și purificarea ADNt

+ 600µl + 600µl
tampon liză PCI*
+10µl proteinază K
Prelevare 200mg
Incubare la 37oC, Amestecul lizat - PCI
țesut
timp de 12 ore 8000 rpm, 4 min, RT

ADN ADN
ADN
Resturi
+ 550µl celulare
cloroform
Cloroform Solvent
organic
Transferul fazei 8000 rpm, Transferul fazei
superioare (500µl) Cloroform
4 min, RT superioare (500µl)
Separarea fazelor
după centrifugare
+ 1ml alcool etilic
absolut -20oC
Îndepărtare etanol
Eluție +100µl TE
CUANTIFICARE
ADN ADNt
Precipitare precipitat
8000 rpm,
4 min, RT

PCI* = fenol : cloroform : alcool izoamilic (25 : 24 : 1)

MATERIAL ŞI METODE – Izolarea și purificarea ADN

1. PRINCIPIUL METODEI

ADN polimeraza
5` 3`

5`
3`-OH primer

ADN monocatenar ADN bicatenar

Genă de interes
5`-ACTAGCCTACGATTTACTGTAGATT...TACCATCGATTTACTGACTCAATGATAATTATACGAGAGGATC-3`
Primer direct (F) 3`-ATGACTGAGTTACTA-5`
5`
-AGCCTACGATTTA-3` Primer revers (R)
3`-TGATCGGATGCTAAATGACATCTAA...ATGGTAGCTAAATGACTGAGTTACTATTAATATGCTCTCCTAG-5`

1.300.000.000 copii ADN ale secvenței de interes

PCR – principiul metodei

 2. MEDIUL DE REACȚIE

47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 M

Amplificări
Mix nespecifice
Flexi

PCR buffer ADNt (ADNmt +ADNn)

dNTP mix H2O

Specifici - 20 – 30pb
Taq polimeraza
- 40-60% GC
MgCl2 Primeri - Tm = 2(A+T) + 4(C+G)

Nespecifici - 10pb (RAPD) Electroforeza ampliconilor unei reacții PCR în gradient de

temperatură, pentru identificarea valorii optime a Tm (47-56
ADN polimeraza (Taq) reprezintă temperaturile de aliniere a primerilor pentru fiecare
probă; M=marker de 100pb

3`
5` OH
3` 5` MgCl2
- substratul polimerazei
- Utilizat în optimizarea activității enzimatice
- temperatura optimă de 70 - 75⁰ C,
- polimerizează aproximativ 150 nucleotide/sec

PCR – mediul de reacție

 3. ETAPELE PCR

Prima etapă de amplificare

5` 3`
5` 3`
1. Denaturare
3` 5`
(94 - 95oC) 3` 5`

5` 3` 5` 3`
3`OH- 5`

2. Aliniere 5` -OH 3`
(45 - 60oC) 3` 5` 3` 5`

5` 3` 5` 3`
3`OH- 5` 5`
3`
3. Elongare
3`
(70 - 72oC) 5` -OH 3` 5`
3` 5` 3` 5`

5` 3`
3` 5`
2 catene noi de ADN
5` 3`
3` 5`

Etapele PCR
 A doua etapă de amplificare
5` 3` 5` 3`
3` 5` 5`
3`
1. Denaturare
5` 3`
(94 - 95oC) 5` 3`
3` 5` 3` 5`

5` 3` 5` 3`
3`OH- 5` 3`OH- 5`
-OH 3` 5` -OH 3`
5`
2. Aliniere 5` 3` 5`
3`
(45 - 60oC) 5` 3` 5` 3`

3`OH- 5` 3`OH- 5`
-OH 3` 5` -OH 3`
5`
3` 5` 3` 5`

5` 3` 5` 3`
3`OH- 5` 3` 5`
5` -OH 3` 5` 3`
3. Elongare 3` 5` 3` 5`
(70 - 72oC) 5` 3` 5`
6 catene noi de ADN
3`
3`OH- 5` 3` 5`
5` -OH 3` 3`
5`
3` 5` 3` 5`

Etapele PCR
PCR – COX1

Cantitatea pentru o
Reactiv
probă (µl)
GoTaq Green Master Mix 12,5
Primer Fish F1 0,5
GoTaq® G2
Green Master Primer Fish R1 0,5
Mix (Promega) ADN template <250ng
Apa ultrapură până la 25µl

Nume primer Secvența Tm oC Conținut GC%

Fish F1 5` - TCA ACC AAC CAC AAA GAC ATT GGC AC - 3` 60,2 46,1
Fish R1 5` - TAG ACT TCT GGG TGG CCA AAG AAT CA – 3` 59,8 46,1

35 cicluri de reacție

95oC 95oC
72oC 72oC
2 min 30 sec
55oC 30 sec 7 min M P S P20 P80 S20 S80 P20 P80 S20 S80 P20 P80 S20 S80
NTC
100pb MP MP MC MC MC MC 134z 134z 134z 134z 154z 154z 154z 154z

30 sec

Electroforeză

PCR

MATERIAL ŞI METODE – Analiza viabilității ADN, PCR

 4. VARIANTE PCR
4.1. RFLP (Restriction fragment length polymorphism)

HaeIII
5`-ATGCTTACCTTGGCCGATATG-3`
3`-TACGAATGGAACCGGCTATAC-5`
Enzima nu recunoaște situsul
5`-ATGCTTACCTTGTCCGATATG-3`
3`-TACGAATGGAACAGGCTATAC-5`
Mutație

M
50pb

HaeIII Produși PCR (ampliconi) AluI

50pb
GGCC AGCT
40pb

30pb

20pb 21pb

10pb 13pb

8pb
5pb

Incubarea ampliconilor cu enzima HaeIII Incubarea ampliconilor cu enzima Alu I

Variante PCR
RFLP – metodă utilizată în studiul markerilor moleculari codominanți - permit identificarea unei alele în cazul
indivizilor homozigoți sau a două alele la indivizii heterozigoți

Individ 1 Individ 2 Individ 3

(homozigot) (homozigot) (heterozigot)

Alela 1 1 1 2 1
GENOTIPURI
Alela 2
2 3

1 1

1 2

2 3

Variante PCR
 RFLP – metodă utilizată în tehnologia ADN recombinant care permite clivajul ADN cu enzime de restricție și
crearea de capete („sticky ends”) care ulterior permit includerea unui insert (genă) într-un plasmid sau
genom diferit
EcoRI EcoRI
GENA de interes
5`-ATGCCTTGAATTCGATATGGCCTGAATTCCATGATTAC-3` 5`-ATGCCTTG AATTCCATGATTAC-3`
3`-TACGGAACTTAAGCTATACCGGACTTAAGGTACTAATG-5` 3`-TACGGAACTTAA GGTATAATG-5`

5`- AATTCGATATGGCCTG - 3`
3`- GCTATACCGGACTTAA - 5`
EcoRI sticky ends
GENA de interes

Plasmidă
Plasmidă cu insert
Plasmidă
(gena de interes)

ADN
bacterian

Expresia genei de interes

Cultură Bacterie

Variante PCR
4.2. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

EcoRI EcoRI MseI EcoRI EcoRI MseI

1. Digestia ADNt cu
enzime de restricțiie 5` 3`
3` 5`
R R

2. Atașarea Adaptori EcoRI F Adaptor MseI

F R
adaptorilor specifici R R
situsurilor de legare
F R F
PCR PCR PCR PCR PCR

3. PCR amplificarea
fragmentelor cu
ampliconi
primeri specifici
adaptorilor
2 3 4 1 5
M
50pb

4. Analiza prin
electroforeză 1
2

3
4
5

Variante PCR
4.3. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

RAPD primer (10pb) OPA18 - AGGTGACCGT

Individ 1 Individ 2
OPA18 OPA18 OPA18 OPA18 OPA18 OPA18
5` 3` 5` 3`
3` 5` 3` 5`
OPA18 OPA18 OPA18 OPA18 Lipsa amplificării –
OPA18
distanță prea mare
între primeri

Lipsa amplificării –
distanță prea mare
între primeri

M
Individ 1 Individ 2
50pb

M Ab1 Ab2 Ab3 Ab4 Ab1 Ab2 Ab3 Ab4 Ab1 Ab2 Ab3 Ab4 Ab1 Ab2 Ab3 Ab4 NTC

OPA-18 OPC-02 OPC-06 OPC-19

Analiza RAPD a 4 indivizi aparținând speciei Alysum borzeanum, cu 4 primeri OPA-18,

OPC-02, OPC-06 și OPC-19 (M=marker 100pb, NTC=non template control)

Variante PCR
 4.4. RT-PCR (Revers-Transcription PCR)

PCR buffer
1 2 3 4 5 6 H2O
A
dNTP mix
ARN
Izolare ARN
B ARN Revers
C Transcriptaza
D ARN purificat Primeri oligo-dT
MgCl2
Cultură de celule
RT-PCR
ARNm 5`- AUGCGAAUCCUAAUCCGGCGGACAUUAGAAAAAAAAAAAAAA – 3`

TTTTTTT
3`OH- 5`
Primer oligo-dT

1. Sinteza
ADNc la 37oC,
ARNm 5`- AUGCGAAUCCUAAUCCGGCGGACAUAGAAAAAAAAAAAA – 3`
timp de 1 oră
ADNc 3` - TACGCTTAGGATTAGGCCGCCTGTATCTTTTTTTT - 5`
Primer oligo-dT
Tratament
cu RNA-ză PCR - standarde
2. Digestia
catenai de ARN ADNc 3` - TACGCTTAGGATTAGGCCGCCTGTATCTTTTTTTT - 5`
cu o RNA-ză
ADNc mono-catenar Primer oligo-dT
RT-qPCR

Variante PCR
 4.5. RT-qPCR (Real Time quantitative PCR) 4.3.1. RT-qPCR – principiul metodei
Sondă de hibridare (FRET –
Fluorescence Resonance Energy
SYBR green Sondă de hidroliză Transfer)
Quencer sondă Reporter Donor R2 Acceptor
R1
Q R
ADNc 5` 3` 5` 3` 5` 3`
primer primer

Inhibarea
fluorescenţei Donor R1 R2 Acceptor
5` 3`
1. Alinierea 5` 3` Q R 5` 3`
primerilor

5` 3`
Q Donor R1 R2 Acceptorul emite
R fluorescență
2. Elongare 5` 3`
5` 3`
5` 3`

Q Donor R1 R2 Acceptor
R
5` 3`
3. Denaturare 5` 3`
5` 3`
și aliniere
3` 5` Q R
3` 5`
R Q
5` R2R1
3`
Q R Donor R1 R2 Acceptor
5` 3` 5` 3`
4. Elongare 5` 3`
3` 5`
3` 5` Q 3` 5`
R
R2R1

Variante PCR
4.3.2. RT-qPCR – cuantificare absolută M BCL2 M TP53 M CDKN1A
50pb 53o 54o 55oC NTC 50pb 59o 60o 61oC NTC 50pb NTC

ADNc PCR pentru 100pb -

amplificarea 50pb -
genelor de interes

Analiza gelurilor de electroforeză

10µl STD1 10µl STD1 10µl STD1 10µl STD1 10µl STD1

Amplicon 90μl H2O 90μl H2O 90μl H2O 90μl H2O

purificat ultrapură ultrapură ultrapură ultrapură
Standard 1 Standard 2 Standard 3 Standard 4 Standard 5 Standard 6

Cuantificare Diluțiile seriale vor fi utilizate ca template în

realizarea standardelor

Variante PCR
 Compoziția mediului de reacție
Componenta Volum pentru Concentrația
10µl reacție finală
GoTaq® qPCR Master 5 1x
Mix, 2X
Primer forward 1 50-300nM
Primer reverse 1 50-300nM
GoScript™ RT Mix for 1- 0,2 1X
Step RT-qPCR, 50X
or Nuclease-Free Water Placă cu tuburi de 0,1ml
for NTC control
GoTaq® 1-Step RT-qPCR System
RNA Template (500fg– 2 variabile
100ng) (or Nuclease-free
Water for NTC
Nuclease-Free Water Până la 10µl -

Sistem Rotor-Gene și rotoare

Revers-transcripție

Profilul termic pentru Real-Time PCR

Variante PCR
 STANDARDE

PROBE

Standarde și probe

Curba etalon
Curba de topire / denaturare (HRM)

Variante PCR
4.3.2. RT-qPCR – cuantificare relativă

Curbele pentru analiza comparativă relativă

Expresia relativă a genelor de interes

Variante PCR
 4.6. Colony PCR

Transeferul
Transfer în
Cultură bacteriană Incubare 90oC, timp de 2 min. 14000 rcf supernatantului în
25µl TE PCR
2 min. RT tuburi de 1,5ml

4.7. Long PCR 10kb

5` 3` Taq polimearaza poate induce erori în procesul de polimerizare

Pfu (proof-reading) polimearaza are activitate exonucleazică și

3` 5` corectează erorile induse de Taq

4.8. Nested PCR

5` 3` 5` 3`
PCR 1
3` 5` 3` 5`

5` 3` 5` 3`
PCR 2 3` 5`
3` 5` 5` 3`
3` 5`

Variante PCR