BIOFIZICA

CURS 3
 METODE UTILIZATE IN
BIOFIZICA
• I. METODE GENERALE
• II.METODE SPECIFICE
I.METODE GENERALE
- OBSERVATIA(STIINTIFICA)
- EXPERIMENTUL STIINTIFIC
- Hipocrate -fondatorul scolii medicale din Kos,
perioada de inceput a medicii stiintifice.
- Diagnosticele sale se bazau pe un rationamemt
logic dupa o atenta observatie clinica.
- Supranumit parintele medicinii- Juramantul lui
Hipocrate
- Actualmete- foaia de observatie- cu
elemnetele de observatie clinica continua sa
fie una din cele mai importante componente din
evalauarea medicala a uni pacient.
 - Observatia stiintifica
• Natura raspunde celor care sunt pregatiti!
• metodele stiintifice presupun initial observarea si formarea unor ipoteze.
• Intrebari in legatura cu un fenomen natural:
• Observarea fenomenului
• Initierea unor ipoteze in legatura cu fenomenul
• Predicitii logice, consecinte observabile pe baza ipotezelor
• Testarea predictiilor prin experimente sau studii observationale
• Formularea unor concluzii din datele adunate din experiment. Realizarea unor noi
ipoteze sau revizuirea celor vechi. Repetarea proceselor- reproductibilitatea!
• Scrierea unei descrieri despre metoda, despre observatii si despre rezultate,
generarea unor concluzii. Revizuirea rezultatelor in relatie cu alte rezultate din
cadrul aceluiasi fenomen.

Observations play a role in the second and fifth steps of the scientific method.
Intrebari despre fenomenObservatii clinice in Testarea unor ipoteze Ipoteze si excplicatii.
(manisfestari clinice) (diagnostice partiale), Concluzii ( diagnostic final)
relatie cu
fenomenul (boala) predictii, studii observationale
case Intrebari despre pacient si suferinta sa ( boala)

• Nume : XY, varsta 24, F, data internari

14.10.2017
• Motivele internarii: febra , varsatura,
durere intensa in FID veche de 24 ore.
• Antecedente:
• heredocolaterale- Mama- neoplasm de san
2010, Tata –polipoza colonica operata in 2002
• Personale: student la medicina, nefumator,
fara medicatie la domiciliu
• istoricul bolii:
• durere intensa in FID in urma cu 24 de ore,
aparuta imediat dupa cursul de biofizica, ( :D),
in timpul noptii febra 38⁰C , stare afectata,
varsatura
 Observatii referitoare la satusul clinic al pacientului

Status general influentat: IMC normal (W-55 kg, H-168cm)

Facies: normal colorat, constienta prezanta
Tegumente- elasticitate normala,
Mucoase: normal colorate
Fanere – aspect normal
Tesut subcutanta-normal representat
Ganglioni superficiali: nepalpabili
 Making observations of the phenomenon
Sistem musculo-scheletal: sistem osos integru, muschi
normotoni, normokinetici
Sistem Respirator:
- Torace normal conformat
- Inflatie normala, ascultatie normala
Cardio-vascular system:
- Zgomote cardiace normale (sthethoscope)
- AT- 120/60 mm Hg, VR- 70/minute
- puls periferic prezent bilateral
Sistem digestiv:
- Durere in fosa iliaca dreapta la palparea profunda
- Tranzit materii fecale normal
Liver, Spleen: dimensiuni normale( palpare)
Geniti-urinary System:
- Loje renale nedureroase
- Urina normal colorata, mictiuni fiziologice
- Ciclu menstrual regulat, UM- 1.10.2017
 Testarea ipotezelor prin studiu observational.

Date paraclinice:
- WBC – 16.000/mL
- RBC- 400k /mL
- Hb- 12 g/L
- Creatinine- 1g/mL
- HGC- normal

Ecografie abdominala;
Ficat dimnesiuni si reflectivitate normala, omogen
Colecist: perete subtire, continut lichidian, fara calculi
RD, RS- morfologie si topografie normala, fara dilatatie
pielocaliceala
Vezica urinara – semirepletie, perete regulat
In FID cu SPM:
Formatiune digestva in deget de manusa-
necopresibila, cu diametrul de ~ 8 mm, cu fina lama
de lichid adiacenta.
Ipoteza explicarii fenomenelor

diagnostic : Apendicita acuta!!

Observatia stiintifica
•este metodica
•este intentionala
•poate fi inclusa intr-un algoritm sistematic
•are valoare de cunoastere
• se realizeaza fara interventia observatorului si poate fi :
•directa (bazta pe perceptiile proprii)
•indirecta (intermediata de un instrument)
Experimentul stiintific
• Are aceleasi atribute ca si observatia stiintific dar se face
cu intervetia observatorului
•poate fi :
-in vivo (pe modele animale)
-in vitro (pe celule, culturi etc)
• In mod obisnuit nu se poate realiza pe oameni! (decat in
conditii foarte restrictive si foartre bine cotrolate)
 Cercetare model animal
primara Imagistica multimodala translationala

Modelel animale din

cercetarea primara
presupun inducerea
unei conditii patologice http://bme.ucdavis.edu/cmgi/about-us/image-gallery
asemantoare patologiei
umane

Sunt utilizate pentru:

-Intelegere biologiei acestora
- studii fiziologice si patologice
uman
- dezvoltarea si testatrea unor http://www.pdc.magee.edu/imaging.htm

noi medicamente.

Medicina umana
http://www.healthcare-in-europe.com/en/article/2136-
World
%C2%92s_first_human_brain_images_scanned_with_a_PET
-MRI_hybrid_system.html
18
F FDG PET/MRI prognostic markers in Cardiorenal Syndrome (CRS)
Ipoteza:
Sindromul cardio renal (SCR) este o condiție clinică în care Patologia Renală Cronică (PRC) și
Insuficiența Cardiacă (IC) coexistă, insuficienta unui organ accelerand-o pe a celuilalt organ.
Model de sobolan SCR dual, PRC și IC, prin nefrectomie subtotala renala 5/6 (ceea ce va
induce afectarea restului de parenchim renal restant) precedata de insuficiență cardiacă
indusă prin administrarea de 1mg/kg de doxorubicina de doua ori pe saptamana timp de 6
sapatamani (ceea ce va induce cardiomiopatie dilatativa).
Obiective și activități conexe:
a.Validarea modelulul dual propus de Insuficiența Cardiacă și Renală
b.Statuarea metodei PET/MRI (utilizarea 18FDG) în evaluarea Sindromului Cardio-Rrenal (CRS)
Material:
Cohorta de 40 de sobolani Wistar distribuita în 4 loturi – 8 șobolani în lotul martor; 20 șobolani
în lotul cu insuficiență cardiaca din care 10 vor forma un nou grup, cu intentia de a modela
sindromul cardio-renal în forma acuta prin nefrectomie 5/6 la 6 saptamani dupa inducerea
insuficientei cardiace; lot de 12 șobolani la care se practică nefrectomie 5/6, iar după 12 luni
se induce insuficiența cardiaca, cu scopul de a modela forma cronica a sindromului cardio-
renal.
Metoda:
Evaluarea modelului propus prin 18F FDG-PET va oferi informații în relație cu activitatea
metabolică a inimii, rinichilor sistemul digestiv, splinei - masuratori de tip semicantitativ -
Standar Uptake Value ( SUV), măsuratori care vor fi corelate cu parametrii biochimici specifici
patologiilor menționate. Astfel, prin aceste corelații să asociem un prognostic pe baza analizei
imagistice, cat și a parametrilor biochimici pentru evaluarea stadiilor terminale ale organelor
țintă ( cord si rinichi) din cadrul SCR.
PET/MRI

Image courtesy of Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden

II.Metode specifice
I. Metode in functie de principiul biofizic

II. Metode in functie procedeu

• Metode de separare
• Metode analitice

III. Metode in relatie cu complexitatea sistemelor stuidate

• Atomice,
• Moleculare
• Celulare
• Tisulare
• Organe /sisteme complexe
Metode in functie de principiul biofizic
• 1. Metode electrokinetice
• 2. Cromatografia
• 3. Centrifugarea si ultracentrifugarea
• 4. Liofilizarea
• 5. Metode kinetice
Metode in functie de principiul biofizic

6. Metode optice (utilizeaza lumina):

a) fotocolorimetrie
b) turbidimetrie
c) nefelometrie
d) fluorimetrie
e) polarimetrie
f) refractometrie
g) flamfotometrie
7. Metode electrice : conductometrie-Lucrare practica- Dializa
8. Difractia cu raze X ( a se vedea cursul 2)
Metode in functie de principiul biofizic
9. Microscoape optice:
• Microscopul optic obisnuit
• Microsopul cu imersie
• Microscopul in contrast de faza
• Microscopul fluorescent
• Ultramicroscopul- microscopul pe fond intunecat
• Microscopul polarizant
Metode in functie de principiul biofizic
• 10. Microscopia electronica. Microanaliza
• 11. Metode spectroscopice:
• Spectoscopie gamma
• Spectroscopie raze X
• Spectroscopie in UV/vizibil-
• Spectroscopie in infrarosu si Ramman
• Spectroscopie prin Rezonanta Magnetica Nucleara
Metode in functie de principiul biofizic
• 12. Metode radioizotopice
• 13. Metode pentru studiul bioelectricitatii (metoda Patch-
clamp)
Metode electrokinetice
• Electroforeza
• Immunoelectroforeza
• Izofocalizrea
Electroforeza
• Metoda de separare a unor particule incarcatre electric sub
actiunea campului electric

https://www.mun.ca/biology/scarr/
Hemoglobin_Electrophoresis.html
Electroforeza = migrare diferenţială în câmp electric, deci posibilitate de
separare a:
- AMINOACIZILOR
- PEPTIDELOR
- PROTEINELOR
- ACIZILOR NUCLEICI
Electroforeza proteinelor serice
Electroforegrama normala
separarea proteinelor în 5 fracţiuni
 Sindromul nefrotic -leziuni morfologice din cadrul unor
nefropatii glomerulare (proteinurie mai mare de 3,5 g/24
de ore)
-hipoalbuminemie si cresterea alfa 2 si beta globulinelor.
(compensare sintezelor proteice a ficataului in
contextul pierderi rapide prin urina)

Ciroza hepatica
- scaderea albuminelor serice
- scaderea proteinelor totale din cauza deficitului de
sinteza
- hipergammaglobulinemie importanta (sdr. cronic Agammaglobulinemie- boala genetica X-linkata
inflamator)
alfa1-antitripsină este o proteină sintetizată în
ficat, care inhibă proteaza eliberată de celule
în lichidele biologice ale organismului ca urmare
a apoptozei
- Deficitul de alfa1-antitripsină se asociază cu
emfizem pulmonar (distructie parenchim
pulmonar) şi ciroză hepatică (inlocuirea
hepatocitelor cu celule fibroase) , debutate
la vârste tinere
- nivel scăzut de alfa1-globuline sau prezenţa a
2 benzi in regiunea alfa1
 Electroforegrama urinara- diagnoticare
proteine Bence- Jones

Electroforeza de urină este tehnica de

electie pentru identificarea de
proteinei Bence-Jones, la pacienţii cu
mielom multiplu.
Acesta trebuie să fie întotdeauna
efectuata în comparatie cu
electroforeza serica, astfel încât
rezultatele sa poata fi comparate
direct.
 Immunoelectroforeza
Principiul fizic:
2 etape:
• 1. electroforeza -separarea
electroforetica a unor antigeni-
(Ag)
• 2. imunodifuzia -reactie specifica
Ag+Ac (complex Ag-Ac)

Ag- structura moleculara capabila sa

determine un raspuns imun
Ac- structura moleculara –specifica,secretata
de un sistem imun in prezenta Ag

Grosimea şi poziţia arcurilor de precipitare

Focalizarea izoelectrica
• Focalizarea izoelectrică: electroforeză în gradient de pH, migrarea şi separarea depinde doar de
pI (punctul izoelelctric)
• Principiul fizic:
• Dacă un amestec de proteine este supus unei electroforeze în gradient de pH fiecare proteină va
migra până în locul unde pH-ul mediului corespunde pH-ului său izoelectric (când proteina va
avea sarcină globală nulă).
Metode in functie de principiul biofizic
• 1. Metode electrokinetice
• 2. Cromatografia
• 3. Centrifugarea si ultracentrifugarea
• 4. Liofilizarea
• 5. Metode kinetice
 Cromatografia
Clasificarea metodelor cromatografice

• Cromatografia – este o metoda de Pe baza interactiunii

separaresi preupune doua faze – o In functie de In functie
solvitului cu faza suportul de de starea
faza stationara-fixa si o faza mobila-
ce se deplaseaza intr-o directie stationara separare fizica a
definita.  fazei
• Faza stionara poate fi lichida, sau Partitie Afinitate mobile
2D 3D
solida; faza mobila poate fi lichida sau
gazoasa Lichid
• Separarea se face in functie de gradul Adsorbtie Schimb ionic
In coloana
solubilitate a solvitului urmarit, in cele Gaz
doua faze- parametrul ce
caracterizeaza aceasta metoda se In strat Pe suport
numeste coeficient de partaj: subtire de hartie Fluid
• K = C1/C2 supercritic
• C1- concentratia solvitului in faza solida
• C2 - concentratia solvitului in faza mobila
 In functie de modul in care
solvitul interactioneaza cu
faza stationara

- Cromatografie de adsorbtie
- Interactiuni
Cromatografie de afinitate electorstatice-Sarcini
- Cromatografie prin schimb ionic electrice
- Cromatografie de permeatie
Filtrare prin pori-
dimensiunea particule

Legături covalente sau

necovalente
 Adsorbtia este complet diferita de absorbiti.
Cromatografie de adsorbtie Moleculele sunt doar atrase in straturile superficiale
Faza mobila: lichid sau gaz care este adsorbit ale fazei stationare – ne facand parte efectiv din
pe suprafata solida a fazei stationare componenta acesteia (nu realizeaza legaturi stabile)
Tip de Aplicatii in viata reala De ce ? Cum?
cromatografie
Cromatografia Verificarea gradului de pouluare a probelor de Analiza prezentei ionilor
in Lichid apa metalici sau a unor solviti
organici. In stare lichida pot fi
incorporate atat molecule
hidrofile cat si hidrofobe
Cromatografia Detectarea materialelor explozibile, droguri, Analiza gazelor volatile;
in Gaz alcool, in medicina legala- analiza probelor helium este utilizat de obicei
textile pentru a mobiliza amestecul
gazos prin coloana cu material
adsorbant
Cromatografia Detectarea pesticidelor, insecticidelor in Folosete fie un material
in strat subtire alimente, medicina legala- analiza culorilor adsorbant (hartie de filtru) fie
textile o placa de sticla-verificarea
rapida a puritatii unor compusi
Cromatografia Separarea aminoacizilor. ARN, fingerprinting, Cea mai comuna. Hartia
pe hartie testare antibiotice reprezinta faza stationara in
care prin capilaritate trec
moleculele de solvit
Cromatografie de
afinitate
În cromatografia de afinitate, un ligand care se cuplează specific la o proteină este fixat
covalent de o matrice poroasă (faza staţionară).

Când un amestec de proteine traversează faza

staţionară:
Proteina de separat se cuplează cu ligandul, iar celelalte
proteine din amestec sunt eliminate din coloană fără a fi
reţinute deloc.

Modificând condiţiile de eluţie (pH acid) proteina

reţinută se detaşează de faza staţionară şi este eliminată
(recuperată).

Separarea unui anticorp dintr-un amestec prin

cromatografie de afinitate
Cromatografie prin schimb ionic
Ex! Generatorul de 99m-Tc
Ioni legaţi electrostatic la un suport insolubil şi chimic inert
• Separarea ionilor sau sunt înlocuiţi reversibil de alţi ioni din amestecul de separat:
moleculelor polare pe Suport+A- + Ion-  Suport+Ion- + A-
baza afinitatii fazei
stationare pentru ioni
• Poate fi specifica pentru
anioni sau pentru
cationi
• Utilizata in pocedeele
de purificare a
proteinelor sau de
verificare a calitatii apei
 Cromatografie de permeatie

În cromatografia de permeaţie sau de filtrare în gel,

(cromatografie de excludere sau tamisaj molecular),
proteinele sunt separate după mărimea şi forma lor

Cromatografia de
permeaţie se poate
folosi pentru estimarea
masei moleculare

Frecvent faza staţionară este: dextran (Sephadex), agaroză sau poliacrilamidă

Metode in functie de principiul biofizic
• 1. Metode electrokinetice
• 2. Cromatografia
• 3. Centrifugarea si ultracentrifugarea
• 4. Liofilizarea
• 5. Metode kinetice
 fv;

Gg
v

Greutatea Forta Arhimedica Forta de frecare

G = m g FA = m0 g Ff = -6πηrv
g: acceleratia gravitationala m : masa volumului de lichid v- viteaza de
0
sedimentare
dislocuit
r- raza particulei
η- indice viscozitate
 Centrifugarea
• Centrifugarea se bazeaza pe
principiul sedimentarii,
acceleratia centrifuga va
face ca particule mai dense
sa se deplaseze spre
exterior
Fc = mω2R, ω = 2π R
m: masa particulei = frecventa
r: raza traiectoriei circulare
ω :viteza unghiulara (rad/s)
 Eprubeta cu proba în
rotaţie

Ff

G
Ff Fc
Ff

G Fc
Forţa centrifugă
Eprubeta cu proba in procesul
de sedimenatre

fv;
v
Forta centrifuga
Fc = m
Forta de frecare
ω- viteza unghiulara Forta Arhimedica
Ff = -6πηrv
ω = 2πν, ν-frecventa de rotatie FA = m0 g
R- raza traiectoriei circulare v- viteaza de sedimentare
m0: masa volumului de
r- raza particulei
lichid dislocuit η- indice viscozitate
Forta relativa de Centrifugare
(Factor de eficienta a unei instalatii de centrifugare)
• RCF (I) === =

m: masa particulei v = frecventa de rotatie

R: raza traiectoriei circulare de
rotatie
ω :viteza unghiulara
Microcentrifuga:
- Volum 0,5-1,5 cm3
- pentru determinari uzuale
(concentrarea probelor serice- 10.000 g)
Centrifuga de capacitate ridicata:
- Volum pana la 250 cm3
- 3-7.000 g
Centrifuga cu sistem de racire si viteza de
rotatie ridicata:
- Volum pana la 250 cm3
- 100.000 g-centrifugare diferentiata-
separare nuclee, mitocondrii, precipitate
proteice, oarganele celulare mari
Ultracentrifuga:
-Volum pana la 250 cm3
- 600.000 g- separare mitocondrii, ribozomi
- sitem de racire + sistem de vacumpentru
reducerea frecarii
 Tehnici de centrifugare
Centrifugarea in gradient de densitate

Doua tipuri:
- In functie de gradientul zonal-
gradient de densitate redus-
separare in funcfie de
dimensiuni
- In functie de punctul
isopycnic- gradient de
Theodor Svedberg (1884-1971), densitate inalt- separare in
Chemist Suedez -1926 Nobel prize functie de diferenta de O substanta cu un
1908– a descris prima data tehnica de ultracentrifugredensitatea (isopycnic- aceasi coeficient de
sedimentare de 26
si a adus astfel argumnete folosite in teoria miscariidensitate)
S (26 x 10-3) se va
Browniene
deplasa cu o viteza
- Coeficientul de sedimentare prin centrifugare se
de 26μm/s sub
exprima in Svedberg ; 1 S = 10-3
actiunea a 10 6 g
Tehnici de centrifugare
Centrifugarea diferentiala- izolarea componentelor subcelulare

1. Viteză mică
(1.000gX 10 min):
Homogenization
celule întregi, Tissue
cells
nuclee, citoschelet 1000 g Homogenate
(1000 times the
2. Viteză medie force of gravity)
(20.000gX 20 10 min Differential centrifugation
Supernatant poured
min): mitocondrii into next tube

lizozomi 20,000 g
20 min
3. Viteză mare
(80.000gX 1 h): 80,000 g
microzomi Pellet rich in 60 min
nuclei and
4. Ultracentrifugare cellular debris
150,000 g
(150.000gX 3 h): 3 hr
Pellet rich in
ribozomi mitochondria
(and chloro-
macromolecule. plasts if cells
are from a Pellet rich in
plant) “microsomes”
(pieces of
plasma mem-
branes and Pellet rich in
cells’ internal ribosomes
membranes)