Influenta micotoxinelor asupra produselor alimentare

Coorodonator: Student: Prof.univ.dr. ing. Sonia GUTT

Micotoxinele sunt considerate substane naturale, dar sunt denumite i produse secundare de schimb, care apar n timpul dezvoltrii ciupercilor parazite la plante n cmp sau la materialul depozitat i utilizat apoi n hrana oamenilor i a animalelor. Ele mai pot fi considerate i ca metabolii primari, in alimentatia att pentru oameni, ct i pentru animale. Funciile formrii micotoxinelor n procesul de schimb al substanelor la ciuperci nu sunt pn n prezent cunoscute. Exist n momentul de fa circa 300-400 micotoxine (intervalul este dat de diferii autori, aparinnd la 24 de grupe chimice de toxine care pot aprea n condiii din cele mai diferite n produciile agricole i n diferitele alimente obinute din acestea). n cazul cerealelor i porumbului sunt cunoscute urmtoarele toxine foarte periculoase: Fumonisin b1 (FB1) produs de Fusarium Verticiloides i Fusarium proliferatum (prezente mai ales la porumb, dar i de speciile Fusarium napiforme, Fusarium anthophilum, Fusarium diamini i Fusarium nygami, prezente mai ales n Canada, SUA, Africa de Sud, Nepal, Australia, Tailanda, Filipine, Indonezia, Mexic, Frana, Italia, Polonia i Spania. Deoxynivalenol, produs ndeosebi de Fusarium graminearum i care este foarte prezent n spaiul romnesc, ndeosebi la gru i triticale i foarte rar pe secar i orz. Foarte frecvente i periculos de abundente sunt aceste micotoxine n grul dur (Triticum durum).

Aspergillus

Penicillium

Fusarium

Alternaria

Claviceps

Distributia micotoxinelor n diferite zone ale globului se caracterizeaz prin urmtoarele: n regiunile reci domin aflatoxinele (excepie fac produsele de import provenite din rile calde) dar foarte importante sunt: vomitoxina, zearalenona, ochratoxina, DAS, toxina T-2 i toxina HT-2; n sudul i centrul Europei, unde se cultiv porumb, domin fusariotoxinele (vomitoxina, zearelona, toxina T-2); n nordul Europei pe primul loc se afla ochratoxina A; n regiunile calde i umede mai rspndite sunt aflatoxinele.

Sensibilitatea animalelor la micotoxine

Intoxicrile produse oamenilor i animalelor cu micotoxine sunt denumite micotoxicoze. Ele apar cu o frecven destul de mare i la fel de frecvent nu sunt recunoscute. Declanarea bolii poate aprea sezonal fiind influenat de condiiile de clim care favorizeaz formarea micotoxinelor. n asemenea situaii, crete mult frecvena micotoxinelor. Nu se definete, ntotdeauna, o relaie clar cu sursa de furaj contaminat. Intoxicrile acute sunt date, totui, de concentraiile ridicate de micotoxine n furaje. Intoxicarea chiar i cronic este greu de diagnosticat, pentru c nu exist parametri de msurare a bolii. Cel mai frecvent apar indicii privind reducerea productivitii animalelor fr un motiv anume. Pot aprea diaree sau pneumonii inexplicabile. Nediagnosticarea corect poate conduce la tratamente false i se pot finaliza prin moartea animalului. Speciile de animale au o sensibilitate diferit la diferite categorii de micotoxine. Zearalenonul are o structur estrogenic, aparinnd grupei fitoestrogenilor. Simptomele induse la porc se caracterizeaz prin agitaie, diaree i temperaturi la purceii mici, diaree i nroirea vulvei la scroafe, mortalitate ridicat la purcei. Intoxicarea are loc la o concentraie ntre 50 i 200 g/kg furaj administrat (5-20 ppm). Puii par a fi puin mai rezisteni. La rumegtoarele adulte (vite i oi), datorit tubului digestiv prevzut cu prestomac (rumen), att zearalenonul ct i celelalte micotoxine (Deoxynivalenol, Ochratoxin A), datorit faptului c n stomac se ntlnesc cu microorganisme diverse (bacterii, protozoare), pot fi degradate i fcute inofensive, dac concentraiile nu sunt prea mari.

Limitele micotoxinelor n furaje i alimente

Ochratoxina A
Cereale neprocesate 5 g/kg Cereale neprocesate, destinate direct consumului uman 3 g/kg Cereale procesate pentru copii 0,5 g/kg

Deoxinivalenol
Cereale neprocesate, altele dect gru dur, ovz i porumb 1250 g/kg Gru dur, porumb i ovz neprocesate 1750 g/kg Cereale i produse de mcini destinate direct consumului uman 750 g/kg Paste finoase 750 g/kg Pine, biscuii, snacks 500 g/kg Cereale procesate pentru copii 200 g/kg Produse de la mciniul porumbului cu particule > 500 m 750 g/kg Produse de la mciniul porumbului cu particule 500 m 1250 g/kg

Aflatoxine
Cereale, produse cerealiere B1 2 g/kg; B1+B2+G1+G2 4 g/kg Porumb dup tratamente fizice B1 5 g/kg; B1+B2+G1+G2 10 g/kg Cereale procesate pentru copii B1 0,1 g/kg

Fumonisine Porumb neprocesat, cu excepia celui destinat procesrii umede 4000 g/kg Porumb destinat direct consumului uman 1000 g/kg Produse pe baz de porumb pentru copii 200 g/kg Mlai, germeni 1000 g/kg Produse de la mciniul porumbului cu particule > 500 m 1400 g/kg Produse de la mciniul porumbului cu particule 500 m 2000 g/kg Zearalenon Cereale neprocesate, altele porumb 100 g/kg Porumb neprocesat 200 g/kg Cereale destinate direct consumului uman 75 g/kg Pine, biscuii, snacks 50 g/kg Cereale procesate pentru copii 20 g/kg Porumb neprocesat, cu excepia celui destinat procesrii umede 350 g/kg Porumb destinat direct consumului uman, mlai 100 g/kg

Relaia dintre pesticide i micotoxine

n linii generale, relaia este una invers, adic exist o corelaie pozitiv ntre calitatea i mai ales modalitile de aplicare a pesticidelor specifice i cantitatea de micotoxine n infeciile la culturile de cmp. Aceste corelaii sunt n curs de elaborare pe diferite meridiane ale globului, inclusiv n Romnia, unde un grup inimos de cercettori abordeaz cu aplomb problema, n ciuda unor autoriti care persist n a spune c micotoxinele nu reprezint un pericol. Produsele chimice care combat fusariozele i alte ciuperci care produc micotoxine, ar trebui aplicate la acel moment la ciupercile parazite nu au nceput s produc toxicul. Fungicidul specific devine favorizant al acumulrii acesteia n bob, deoarece blocheaz extinderea ciupercii, dar favorizeaz migrarea micotoxinei spre bob prin meninerea verde a furajului. Este foarte interesant de reinut c acest lucru difer de la un produs la altul. - Stimulatorii de cretere pot favoriza crearea n plus de micotoxine, mai ales pentru acelea dintre ele care reduc mrimea paiului. - Necombaterea buruienilor favorizeaz formarea i diversificarea micotoxinelor n boabe, prin slbirea rezistenei naturale a soiurilor de cereale. - ngrmintele cu azot aplicate unilateral favorizeaz o cantitate mai mare de micotoxine n boabe.

Modaliti de reducere a coninutului de micotoxine n produsele alimentare

s distrug, s inactiveze sau s ndeprteze micotoxinele; s nu produc sau s nu conduc la apariia unor reziduuri toxice, mutagene sau carcinogene n produsele supuse tratamentului decontaminant; s nu modifice proprietile senzoriale ale alimentului; s asigure distrugerea sporilor fungici i a miceliilor care, n condiii favorabile ar putea biosintetiza micotoxine; s fie accesibile tehnic i economic. Reducerea aportului de micotoxine pentru organismul uman i animal, prin ingerare de alimente contaminate se poate realiza prin:

limitarea coninutului de micotoxine n furaje i produse alimentare; inactivarea (reducerea toxicitii) acestora n organismul uman sau animal. Diminuarea prezenei micotoxinelor n produsele alimentare se poate realiza prim

Metode fizice - Separarea boabelor afectate - Splarea boabelor - Mcinarea - Extracia cu solveni - Adsorbia pe substraturi solide - Inactivare termic - Iradierea alimentelor Metode chimice - Utilizarea acizilor sau bazelor - Utilizarea agenilor oxidani - Utilizarea agenilor reductori - Utilizarea agenilor de clorinare Metode biologice - Utilizarea Saccharomyces - Anumite specii de Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium Metode microbiologice

Aflatoxin e Aflatoxinele sunt produse n anumite condiii, numai de unele tulpini, astzi

sunt cunoscute 10

aflatoxine Nontoxigenic tulpini de de Aspergillus flavus utilizat pentru a pregti alimente fermentate n Orient, un saprob comune care apare pe cereale i leguminoase n depozit Aflatoxina B1, B2, G1, G2 - albastru sau verde nflorire sub lumin UV Aflatoxina B1 cel mai important - foarte cancerigen i apariia pe scar larg n produsele alimentare

Efecte ale aflatoxinelor

Chiar i atunci cnd nivelele nu sunt toxice, expunerea prelungit cauzeaza cancer de ficat la fiecare specie de animale testate in laborator. Responsabile pentru rate ridicate de cancer la ficat a grupelor de populaie din Asia i Africa, unde alimentele contaminate sunt adesea consumate. Efectele toxice se arat n India, in 1974, cand sute de oameni au fost otrvii prin consumul de porumb care coninea aflatoxine. Limitele admisibile sunt n general, destul de reduse (15-20 pri pe miliard) Unii oameni de tiin consider c nu nivelele detectabile de aflatoxine ar trebui s fie permise din cauza efectelor cancerigene ci frecventa cu care consumam alimentele . Cancerul hepatocelular (HCC) este o cauza majora de mortalitate n anumite zone ale lumii aproximativ 50% din cazuri HCC n unele pri ale lumii n care produsele alimentare este contaminat cu AFB1 arata o mutaie n codoni 249 din gena supresoare tumorale p53. Mutaia este formata din transversia T G-> n poziia a treia codoni care rezult n serina loc de arginin - studii de laborator confirma

Fig.3. Claviceps purpure-Cornul de secar

Aspergillus

Penicillium

Fig.4. Ciuperci comune Toxigenic

Stachybotrys

Fusarium

Factorii care favorizeaza contaminarea porumbului cu aflatoxine din ciupercile toxicogene din grupul Aspergillus flavi
1. Infectia Are loc prin matasea galben bruna germinare si colonizare Favorizata de temperaturile ridicate si de umiditatea redusa a solului, (copetitiv pentru ciupercile toxigene din grupul Aspergillus flavi) 2. Colonizarea Favorizarea atacului cu insecte Distrugerea barierelor fizice faciliteaza raspandirea infectiei pe stiulete Distrugerea pericarpului favorizeaza infectia in interiorul boabelor Scaderea umiditatii boabelor sub 35% Aspergillus Flavius comparativ cu alte ciuperci microscopice 3. Producerea de aflatoxine Temperaturi ridicate Precipitatii reduse-stres hidric al apelor Alti factori limitativi ai plantelor cu boabe in curs de formare Prolina factor semnalat de stres la plante de porumb induce sinteza aflatoxinelor in tulpinile toxigene 4. Identificare

1. Infectia

2. Colonizarea

3. Producerea de aflatoxine

4. Identificare

Produsele contaminate trebuie folosite pt producere de bioetanol

Influenta aflatoxinelor asupra hidrolizei enizmatice a amidonului din porumb

Solubilizarea amidonului (alfa-amilaza termostabila) Zaharificarea amidonului solubilizat (glucoamilaza)

Fabricarea concomitenta de bioetanol si biopreparate din porumb contaminat cu aflatoxine

Reacii chimice produse de aflatoxine

Reaciile produse de aflatoxine la diferite condiii fizice i reactivi au fost studiat extensiv din cauza posibila aplicare a astfel de reacii la detoxifiere de aflatoxine materialul contaminat.

Cldur:
Aflatoxine n stare uscat sunt foarte stabile.Cu toate acestea, n prezena umiditatii i temperaturii ridicate nu este distrugerea de aflatoxin. O astfel de distrugere poate avea loc cu mese de aflatoxin din semine oleaginoase, de aflatoxin din arahide prjite sau aflatoxin n soluie apoas la pH 7. Dei produsii de reacie nu au fost examinati n detaliu, se pare probabil ca un astfel de tratament duce la deschiderea inelului lacton cu posibilitatea de decarboxilare la temperaturi ridicate.

Alcali:
n hidroliza soluiei alcaline apare la fraciunea lacton. Aceast hidroliz pare s fie reversibila, deoarece s-a demonstrat c reciclarea apare n urma acidificrii cu o soluie de baz care conine aflatoxin. La temperaturi mai ridicate (100C) apare un inel de deschidere, urmat de decarboxilare i reacia poate proceda n continuare, ceea ce duce la pierderea grupului metoxi de la inelul de aromatice. Pot de asemenea s apar serie de reacii similare, cu amoniac i amine diferit.

Acizi:
n prezena acizi minerali, aflatoxina B1 i G1 sunt convertite in aflatoxin B2a i din cauza adugari de acid catalizat de ap n ntreaga legtur dubl furanului G2A. n prezena anhidrid acetic i acid clorhidric reationeaza suplimentar pentru a da derivat acetoxil. Similare aflatoxinei B1 i G1 sunt formate cu clorur de acid formic-fenil, clorur de acid acetic-fenil i acid trifluoroacetic.

Ageni de oxidare:
Multi agenti de oxidare, cum ar fi hipoclorit de sodiu, permanganat de potasiu, clor, peroxidul de hidrogen, ozon i perborat de sodiu reacioneaz cu aflatoxin i schimba molecula de aflatoxin ntr-un fel cum este indicat de pierderea de fluorescen. Mecanismele acestor reacii sunt incerte i produselor de reacie rmn neidentificate n cele mai multe cazuri.

De reducere:
Hidrogenarea de aflatoxin B1 i B2, G1, respectiv randamentele aflatoxin i G2. Reducerea suplimentar de aflatoxin B1 de 3 moli de hidrogen tetrahidroxiaflatoxin. Reducerea de aflatoxin B1 i B2 cu borohidride de sodiu a dat aflatoxin RB1 i, respectiv, RB2. Acestea apar ca urmare a deschiderii inelului lacton urmat de reducere a grupului de acid i de reducere a grupului keto n ciclopentena.

Productia de spori

culoarea gri nchis spre negru (verde inchis, maro) conidia produsa de grup de spori cilindrice Conidia ovoid aproximativ 10-12 mm n lungime, vizualizate la 1000x. Conidia produs individual i succesiv ntr-o pictura care acoper sporii. dispersat de insecte in mediul natural n cele din urm se usuc i poate deveni aeropurtata.

Fig.7. Stachybotrys conidiofore

Fig.8. Stachybotrys atra

Imagini de culturi de miceli din probe (fungi dominanti: Aspergillus niger, Penicillin sp., Fusarium sp.)

Fig.9. Aspergillus niger, Penicillin sp., Fusarium sp

Fig. 10. Aspergillus niger.

Cromatografie lichid de nalt performan (HPLC) este o tehnica de separare a componentelor ntr-o prob, pe baza de interaciuni ntre componente, faz lichid mobil i o faz staionar solid.
Calitativ: separarea, determinarea componentilor pe baza timpului de retentie; Cantitativ: curba de etalonare - pe domeniul de valabilitate al legii Lambert Beer (variatie liniara a raspunsului DAD cu concentratia)

G2 Aflatoxina
Este o micotoxin, care poate fi produs de specii de mucegai din genul Aspergillus n zonele de lume, cu un climat cald i umed. Aspect: pudr alb spre galben lein Formula molecular: C17H1407 Mas molecular: 330.3 g / mol Punct de topire: 237-240 C Coeficientul de extincie lng 350 nm n solveni diferite [1]: acetonitril: = 18900 metanol: = 19200 toluolul / acetonitril (9 +1): = 18300 benzen / acetonitril (98 +2): = 18200 Numeroase produse agricole sunt vulnerabile la atacuri de ciuperci care produc micotoxine. Aceste substane toxice poate persista mult timp dupa ce ciupercile au fost ucise i contamina alimente. Cele mai multe micotoxine sunt stabile compui care nu sunt distruse n timpul procesrii produselor alimentare sau de gtit. Din moment ce acestea pot intra cu uurin pe pia i de a fi un pericol pentru sntatea public, este important s se dezvolte eficient analitice metode pentru identificarea i cuantificarea micotoxine. Dintre micotoxine, patru principale aflatoxine B1, B2, G1, G2 i sunt extrem de puternici ageni cancerigeni i poate avea un impact economic semnificativ, fcndu-le importante obiective de detectare i cuantificare. n vederea pentru a detecta urmele de aceste toxine care sunt frecvent prezente n produsele agricole, este critic pentru a dezvoltarea de metode foarte sensibile.

Pregtirea eantionului Fiecare aflatoxinelor a fost diluat n metanol de 1 mg / ml de G2, 1 mg / ml de B2, 10 mg / ml de G1, i 10 mg / ml de B1. Poriune de 100 L fiecare soluie de aflatoxin a fost dect combinate ntr-o sticl de 2 ml flacon i se amestec bine. Acest amestec a fost diluat n serie la 100.000 de falduri n ap: metanol (7:3 v / v) i utilizat ca soluie etalon. Instrumentaie Autosampler, pompe LC, i Inspector Detector Condiii de cromatografie Coloana: Gold Hypersil, 3 m, 100 x 2.1 mm Debit: 800 L / min ex: 365 nm em: 455 nm Faza mobil: Apa: metanol (7:3, v / v) (eluare isocratic) Coloana Temperatura: 40 C Volum de injectare: 10 L de soluie standard

Exemplu de cromatograma la porumb G2 Aflatoxina

Exemple de cromatograma

Rezultate i discuii Analizele pot fi efectuate n mai puin de cinci minute. fluorescen Aflatoxinele puternic pe iluminare cu 365 nm ultraviolete lumin. Cromatograma fluorescen din cele patru comune cu aflatoxine prezinta o excitaie la lungimea de und de 365 nm i o lungime de und de emisie de 455 de nm. Aflatoxina G2 produce cel mai puternic semnal cu un S/N din 1902, la o concentraie de 2,5 ppb. Chiar dac fluorescen intensitile de aflatoxine B1, G1 i sunt diminuate datorit inversrii fazei amestecului de solveni din ap i metanol, lor S / N raporturile sunt nc excelente i sunt 251 i 380.