Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar ClujNapoca FACULTATEA: Horticultur MASTER:tiine horticole

Metabolii secundari

Masterand

Lung Mihai Lucian 2010

1

Introducere
Metabolii secundari sunt compui organici care nu sunt direct implicai n creterea normal, n dezvoltarea sau reproducerea organismelor. Spre deosebire de metaboliii primari, absena metaboliilor secundari nu duce la o moarte imediat, ci mai degrab duce la deprecierea pe termen lung a supravieuirii organismului, fecunditatea sau estetica, sau poate n nici o schimbare semnificativ, la toate cele menionate. Metaboliii secundari sunt adesea limitai la un spectru restrns de specii n cadrul unui grup filogenetice. Metaboliii secundari sunt o surs important de produse farmaceutice, coloranti, arome etc, fiind obinui din culturi de celule in boreactoare. Iniial culturile de acte gen au fost iniiate pentru o mai bun cunoatere a metabolismului plantelor, a fiziologiei lor ct i a dezvoltrii celulare. Totui cultura de celule s-a dovedit a fi o important surs de produse naturale prin intermediul biotehnologiei.

1. Bazele biologice ale producerii metaboliilor secundari

Metabolismul const din serii strns coordonate de reacii chimice mediate de enzime care se desfoar n cadrul organismului vegetal, avnd ca rezultat sinteza i utilizarea unei mari varieti de molecule din categoria glucidelor, aminoacizilor, acizilor grai, nucleotidelor i a polimerilor derivai de la acestea (polizaharide, proteine, lipide, ADN, ARN, etc.). Totalitatea acestor procese este definit ca metabolism primar iar compuii respectivi, care sunt eseniali pentru supravieuirea plantei, sunt descrii ca metabolii primari. Pe lng metaboliii primari, cu rol major n meninerea viabilitii plantei (proteine, hidrai de carbon i grsimi), sunt sintetizai i o serie de compui care includ terpene, steroizi, antociani, antrachinone, fenoli i polifenoli, care aparin aa numitului metabolism secundar. Metaboliii secundari sunt prezeni numai la anumite specii, adesea manifestnd specificitate de organ sau de esut, pot fi identificai numai ntr-un anumit stadiu al creterii i dezvoltrii n cadrul unei specii, sau pot fi activai numai pe parcursul perioadelor de stres, cauzate de pild de atacul unor microorganisme sau de srcirea nutrienilor. Sinteza lor pare fr semnificaie direct pentru celula sintetizatoare, dar poate fi decisiv pentru dezvoltarea i funcionarea organismului ca ntreg. Cu toate c sinteza lor nu constituie o parte indispensabil a programului expresiei genice i dezvoltrii, aceti metabolii nu reprezint simpli produi catabolici, deoarece au o structur foarte diversificat i pot fi adesea reinclui n procesele metabolice. De fapt delimitarea ntre metabolismul primar i secundar este incert, ntruct muli 2

dintre intermediarii metabolismului primar ndeplinesc roluri similare i n cadrul metabolismului secundar. Astfel, unii aminoacizi obscuri sunt n mod cert metabolii secundari, n timp ce sterolii sunt compui structurali eseniali ai multor organisme i n consecin trebuie considerai metabolii primari. Ca urmare, dat fiind conservarea lor pe parcursul evoluiei regnului vegetal, este foarte plauzibil interpretarea c metaboliii secundari ofer un avantaj selectiv speciilor. De exemplu la speciile la care polenizarea este realizat de ctre insecte, acestea sunt atrase de culoare, parfum sau de prezena nectarului, caracteristici datorate metaboliilor secundari. Rolul pigmenilor este evident i n rspndirea fructelor i a seminelor de ctre psri i alte animale atrase de culorile vii ale structurilor vegetale. Stigmatele foarte colorate de la Crocus sativus, utilizate drept colorant alimentar, ca i culoarea rou intens a ardeilor iui (Capsicum frutescens) i iueala capsaicinei, au efect atractiv sau repelent asupra animalelor. Iat deci c metaboliii secundari vegetali pot servi ca atractani pentru polenizatori, pot reprezenta adaptri chimice la stresul factorilor de mediu sau pot constitui mijloace chimice ofensive, defensive sau protectoare mpotriva microorganismelor, insectelor , animalelor ierbivore i chiar mpotriva altor plante superioare (cum este cazul compuilor alelochimici, numii i ierbicide naturale), fiind evident rolul lor de compui activi n plan biologic, fiziologic i ecologic. Sunt numeroase exemplele de compui bioactivi din categoria metaboliilor secundari, dintre care trebuie s amintim n primul rnd nicotina, piretrinele i rotenona care sunt utilizate ca pesticide i anumii steroizi i alcaloizi utilizai in industria medicamentelor.

2. Interdependena dintre plante i mediul nconjurtor

Plantele n procesul dezvoltrii lor filogenetice s-au adaptat la anumite condiii de via. Rspndirea geografic a plantelor este determinat de cerinele acestora fa de factorii externi i de gradul lor de adaptare la condiiile mediului nconjurtor. Plantele nu cresc n mod hazardant, la ntmplare; ele sunt aranjate n asociaii i comuniti ecologice bine definite. n timp ce gruprile sau asociaiile ecologice mai mari (pduri, stepe, mlatini etc.) sunt determinate n mare msur de factorii climatici i edafici, asociaiile mai intime i mai restrnse au vegetaia diferit n acelai cadru geografic, sub influena acelorai factori climatici i edafici. n acest ultim caz, pe lng factorii menionai acioneaz i ali factori externi i interni, fapt ce determin o grupare mai restrns a plantelor.

Pentru ca plantele s supravieuiasc i s dea producii sporite la hectar ele trebuie s se adapteze condiiilor mereu schimbate ale mediului nconjurtor. Dac plantele nu se adapteaz mediului lor de via, creterea i dezvoltarea este redus foarte mult i, ntr-un timp relativ scurt, plantele vor dispare. Pe msur ce unul sau mai muli factori de cretere nu sunt asigurai la un nivel corespunztor, omogenitatea condiiilor de via este schimbat i determin limitarea productivitii plantelor. Dac n cursul creterii i dezvoltrii plantelor apar anumite condiii nefavorabile, plantele vor suferi anumite dereglri, n funcie de potenialul de rezisten biochimic i fiziologic de care dispun speciile sau soiurile respective fa de factorii duntori. Prezena unor compui secundari n plante se explic prin faptul c plantele fiind fixate prin rdcini n sol, nu se pot deplasa i deci nu pot rspunde deschis ca animalele la aciunea factorilor de mediu. Compuii secundari de metabolism ajut plantele la o mai bun i uoar adaptare la mediu, la stabilirea unor interelaii ct mai complexe ntre plante i animale. Peste 45 din compuii secundari de metabolism prezeni n animale sunt de origine vegetal. O parte din compuii secundari mresc rezistena plantelor la atacul microorganismelor. Unii compui sun toxici i constituie arme de aprare ale plantelor mpotriva ierbivorelor, insectelor i a altor duntori. Unii compui secundari ndeplinesc rolul de inhibitori i stimulatori de cretere a plantelor, alii, cum sunt carotenoidele i flavonoidele, absorb energia luminoas i iau parte n procesul de fotosintez, att prin cedarea energiei absorbite clorofilei a, ct i prin aprarea clorofilelor i a altor substane biologic active de degradri fotooxidative. Unele substane secundare determin gustul i aroma fructelor i legumelor, iar eterii, esterii, substanele terpenice etc., prin mirosul lor plcut, au un rol important n polenizarea plantelor. Pigmenii, care, de asemenea, sunt produi secundari de metabolism, au un rol important n reaciile de oxidoreducere. Ei determin culoarea florilor, fructelor, legumelor, a tuturor organelor plantelor. Au un rol nsemnat n procesul de polenizare. Industria alimentar, industria farmaceutic, industria cosmetic i cea textil se bazeaz, n mare parte, pe utilizarea compuilor metabolici secundari din organismele vegetale.

3. Producerea de metabolii n culturi de celule i esuturi vegetale i potenialul lor aplicativ

n ultimii ani, interesul pentru metaboliii secundari de origine vegetal a crescut, dat fiind, pe de o parte efectul lor terapeutic, iar pe de alt parte, caracterul lor natural, n prezent aproximativ 60% dintre medicamentele utilizate pentru oameni fiind de natur vegetal. Dar utilizarea plantelor nu se rezum numai la domeniul farmaceutic sau agroalimentar, ci ea se poate extinde la cosmetic i parfumerie. Se apreciaz c un numr mare de compui noi sunt identificai anual n diferite specii de plante, dar este totodat semnalat i rapiditatea procesului de extincie a speciilor i de ngustare a bazei genetice a resurselor vegetale n lume. De exemplu, planta Pilocarpus pabonadi utilizat pentru producerea medicamentului pilocarpin, datorit colectrii neraionale este n prezent declarat specie ameninat cu dispariia n Himalaia i a fost nlocuit cu Pilocarpus microphyllus ca surs de principii farmacologic active. Acest fenomen a stimulat att reconsiderarea importanei vitale a resurselor genetice ct i interesul pentru obinerea metaboliilor secundari prin metode neconvenionale. n ultimii ani numeroase cercetri au fost dedicate producerii de compui utili prin culturi de esuturi vegetale. Ca urmare s-au nregistrat progrese tehnologice remarcabile, astfel c n prezent studiile bazate pe culturi de celule i esuturi se desfoar att la nivel fundamental ct i sub forma cercetrilor aplicative care utilizeaz culturi la scar larg, industrial, pentru producerea comercial a metaboliilor secundari. Deoarece sinteza lor nu constituie o parte indispensabil a programului expresiei genice i dezvoltrii, aceasta poate fi modelat att prin modificri ale materialului genetic ct i prin modificri ale mediului sau prin utilizarea unor substane cu rol de semnal pentru declanarea cii biosintetice respective. Tehnicile "in vitro" i propun stimularea exprimrii complete a unor secvene metabolice care au ca rezultat sinteza unui metabolit dorit, fapt ce ofer importante avantaje economice prin posibilitatea realizrii sintezei la scar industrial, n bioreactoare, ca i prin dirijarea selectiv a unor anumite secvene biosintetice, n funcie de scopul urmrit. De regul speciile vegetale productoare de compui secundari cresc numai n anumite zone climatice, iar sinteza acestor metabolii cu structur complex pe cale artificial este neeconomic, dificulti care conduc la fluctuaii considerabile ale materiei prime i implicit ale preului de cost. n plus o serie de

reglementri elaborate n multe ri limiteaz utilizarea produselor sintetice n special ca aditivi alimentari sau medicamente. Intensa concentrare a cercetrilor efectuate n diferite laboratoare din lume n scopul utilizrii culturilor de esuturi i celule vegetale ca surse poteniale de metabolii utili poate fi explicat prin avantajele importante oferite de acestea, ca de pild: metaboliii utili pot fi obinui n condiii controlate de mediu, n flux continuu, indiferent de factorii climatici sau de nsuirile solului; avnd urmtoarele caracteristici: - culturile celulare sunt necontaminate cu microbi i insecte; - celulele oricrei plante, tropicale sau alpine, pot fi uor multiplicate n scopul producerii metaboliilor specifici; - controlul automat al creterii celulare i reglarea proceselor metabolice contribuie la reducerea costului forei de munc i la mbuntirea productivitii; - ciclurile biosintetice ale culturilor celulare n bioreactoare sunt mult mai rapide dect cele ale plantei n condiii naturale. De exemplu n cazul sikoninului un ciclu de producie n bioreactoare dureaz cteva sptmni, n timp ce numai plantele n vrst de 5 ani sunt recomandate pentru extracia produsului farmaceutic ; - prin selecie clonal i mutagenez se pot izola linii celulare care sintetizeaz metaboliii secundari n cantiti chiar mai mari dect cele prezente n organele specializate ale plantei intacte; - culturile celulare n suspensie pot fi utilizate i pentru biotransformarea unor substraturi pentru obinerea unor noi compui neidentificai n natur sau pentru producerea unor enzime utilizabile n sinteza chimic a compuilor naturali.

4. Bioreactoarele
Culturile de celule pot fi facute la scar larg sau la scar mic pentru a produce o serie de mebtaboliti secundari sau diferite produse cum ar fi : -antibiotice; -enzime; -aditivi alimentari -etc. Bioreactoarele sunt vase mari folosite pentru cretera celulelor i microorganismelor n mediu lichid. Dimensiunea lor variaz de la cele de laborator care pot avea in jur de 250 cmc pn la fermentatoare industriale cu o capacitate de 500.000 dmc 6

Fig.1 Biorector industrial i bioreactor de laborator Diferitele feluri de culturi utilizate n bioreactoare se datoreaz mai multor factori: - mrimea agregatelor; - sensibilitatea celulelor la agitare -densitatea celulelor n bioreactor; - rata de cretere a celulelor -vscozitatea la densiti ridicate. n bioreactoare se folosesc dou tipuri de culturi: -culturi fixe care sunt cultivate pe un mediu cu volum fix la care nu se mai adaug substane n timpul procesului. La acest tip de cultur celulele cresc n mediu trecns prin fazele tipice de cretere i dezvoltare dup modelul curbei din graficul de mai jos. Acestea pot fi imobilizate cu ajutorul diferitelor procedee sau substane: - culturi ncapsulate n alginat; - culturi imobilizate n poliuretan; - culturi imobilizate pe membrane.

N r d e c e l u l e

Faza staionar

Creterea intens

mbatrnire i moarte

Faza de adaptare

Timp Grafic.1. Curba de cretere a culturii de celule - culturi continue n care se adaug constant mediu proaspt i steril, iar produsul metabolic este extras din mediu n aceiai rat. Culturile continue pot fi folosite, teoretic, la infinit.(Adds i colab., 1998). 7

Ali autori(Scragg, 2000) amintesc i alte tipuri de culturi: culturi fixe aprovizionate cu substane nutritive; culturi semi-continue culturi prin perfuzare.

Datorit particularitilor de producere a fiecrui tip de culturi de celule, designul bioreactoarelor este diferit de la o plant la alta. Astfel se folosesc dou tipuri de bioreactoare: cu amestecare mecanic; cu amestecare prin curent de aer.

5. Importana economic
Importana economic a acestei clase de produse este relevat n tabelul de mai jos, unde se poate observa valoarea unui kg din substana obinut: Tabelul 1

Produse comerciale obinute din metaboliti secundari

Nr. Produsul Beneficiul Antihipertensiv Planta/Sursa Catharanthus roseus Preul $/kg 3000 Nespecif. Nespecif. 2500 6000 Crt 1. Ajmalicin 2. 3. 4. 5.

(serpentine) Artemisinin Antimalaric Arthemisia annua Castanospermin Inhibitor a glucozidazei Castanospermum australe Codein Digoxin (anti viral) Sedativ Stimulator cardiac 8 Papaver somiferum Digitalis lanata

6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

Diosigenin Guigkolide Jasmin Quinin Siconin

Steroid Antiinflamator Parfum Antimalaric Antibacterial

Dioscorea deltoidea Gingko biloba Jasminum sp. Chinchona ledgeriana Lithospermum crythrorhizon Taxus brevifolia Vanilla planifolia Catharanthus roseus Murraya paniculata

1500 Nespecif. 10.000 300 4500 1.200.000 2000 40.000.000 Nespecif.

Taxol Anticancer Vanilin Arom Vincristin Antileucemic Vinblastin Contraceptiv Sursa : Scragg i colab., 2000,

Valoarea metaboliilor secundari utilizai in industria farmaceutic poate ajunge la mii de dolari per kg. De exemplu alcaloizii de tip opium purificai (codeina i morfina) au valori de 650 1250 USD/kg iar uleiurile volatile eseniale ca cel de trandafir sunt evaluate la peste 2000 3000 USD/kg. Alcaloizii extrai din Catharanthus roseus ating valori de pn la 20.000 USD/g. Aceste preuri ridicate se datoreaz att metodelor costisitoare de izolare ct i cantitilor extrem de reduse ce pot fi obinute din sursele vegetale. Astfel, cantitatea de vincristin izolat din plante de Catharanthus roseus este de aproximativ 0,0003 0,0005 %, fiind necesare 500 kg de frunze pentru a produce numai 1 g de vincristin purificat, proces care dureaz mai multe sptmni. Cu toate acestea, plantele rmn singurele surse metaboliii secundari de interes farmaceutic de extracie, ntruct muli dintre nu pot fi sintetizai pe cale chimic, fiind

stereostructuri complexe cu muli centri chirali care pot fi eseniali pentru activitatea biologic. Metaboliii vegetali primari i secundari de interes economic au cteva caracteristici comune: majoritatea sunt compui chimici non-proteici, pot fi extrai din materialul vegetal prin distilare cu aburi, cu solveni organici sau apoi, iar cu excepia biopolimerilor cauciucului natural, a taninurilor condensate i a unor polizaharide precum gumele, pectinele i amidonul, sunt compui cu greutate molecular mic. n secolul urmtor, caracterizat drept era biotehnologiilor, strategiile biotehnologice vor determina schimbri ample, prin noi dimensiuni ale eficienei i productivitii n numeroase domenii economice. n cadrul noilor biotehnologii, tehnicile moderne de culturi de celule i esuturi vegetale ofer poteniale relevante de aplicabilitate n unele domenii biotehnologice competitive, viznd obinerea unor medicamente, produse alimentare, pigmeni naturali alimentari sau industriali, arome alimentare sau cosmetice etc. Interesul pentru obinerea metaboliilor secundari prin metode neconvenionale este stimulat de pronunata descretere a resurselor vegetale consacrate, ca urmare a perturbrii

echilibrului mediului natural, a exploatrii nelimitate a acestor resurse, a creterii costului forei de munc i dificultilor tehnice i economice n cultivarea plantelor din flora spontan. Ca impact socio-economic, nmulirea prin culturi in vitro permite adaptarea rapid la cerinele pieii, aplicarea biotehnologiei respective oferind posibilitatea nceperii unei activiti profitabile prin obinerea unor venituri substaniale n urma aclimatizrii i certificrii materialului sditor propus n condiii aseptice, n timp scurt, pe suprafee de teren restrnse. Obinerea unor rezultate pozitive reprezint primul pas n elaborarea unor metode aplicabile la scar industrial, necesare n industria alimentar, farmaceutic, textil sau cosmetic.

Bibliografie
1.Adss J., Erica Larkcom, Miller Ruth, 1998, Microorganisms and Biotechnology, Ed.Thomas Nelson&sons, London, Uk 2. Scragg A.H., 2000, Secondary products from cultured cells and organs n Plant cell culture, Oxford University Press, N.Y., USA 2. http://www.asm.md/?go=laboratoare&n=87&new_language=0 2. http://en.wikipedia.org/wiki/Secondary_metabolite 3. http:// ebooks.unibuc.ro/biologie/.../Articolul9a.doc

10