Dr.

Viorel Alexandrescu
Medic Primar Doctor n tiine medicale Cercetator stiintific I
Institutul Cantacuzino Director Centrul Naional de Grip din reeaua OMS

VIRUSOLOGIE
CURS PARTEA I GENERALA

Istoricul descoperirilor in virusologie:

1798 - Jenner E.: initiaza vaccinarea antivariolica. 1879 - Galtier I.: prima tentativa de preparare a vaccinului antirabic. 1885 - Pasteur L.: prepara vaccinul antirabic. 1886 - Mayer A.: transmite experimental v. mozaicului tutunului la plante. 1887 - Babes V.: descrie incluziile ale v. rabic in celula nervoasa. 1889 - Babes V.: aplica prima data sero-terapia in rabie. 1892 - 1899: Ivanovski D., Beijerink M: demonstreaza proprietatea virusurilor de a trece prin filtre. 1897 - Loeffler R, Frosch P.: izoleaza primul virus animal (v. aftos). 1901 - Reed W., Caroll J.: izoleaza primul virus patogen pentru om (v. amaril). 1903 - Borrel A.: elaboreaza prima teorie privind etiologia virala a cancerului. 1903 - Negri A.: descrie incluziile virale in rabie. 1903 - Remlinger P., Riffat-Bay: descopera v. rabic. 1905 - Guerin M.C.: prima cuantificare a unui virus (v. vaccinia prin scarificarea tegumentului la iepure). 1908 - Ellerman V, Bang O.: descopera v. leucemiei aviare. 1909 - Landsteiner K., Levaditi C.: reproduc experimental poliomielita la maimute. 1911 - Rous P.: demonstreaza etiologia virala a sarcomului aviar

1912 - Carrel A.: cultiva explanturi tisulare de embrion de pasare. 1913 - Levaditi C.: cultiva v. polio in cul-turi de tesut nervos de maimuta. 1915-1917-TwortF.W.,dHerelleR: descopera bacteriofagii. 1920 - Bordet J., Ciuca M.: descopera fenomenul de lizogenie. 1920-1921 - Creutzfeld H.G., Jacob A.: descriu encefalopatia spongiforma umana (sindromul Creutzfeld-Jacob). 1927 - Nicolau S. Dimancescu, Nicolau O.: evidentiaza septinevrita la virusurile neurotrope. 1928 - Maitland H.B., Maitland M.C.: cultiva virusuri in culturi de fragmente de tesut. 1929 - Elford W.J.: masoara dimensiunile virusurilor cu filtre de colodiu avand pori de marime cunoscuta. 1931 - Furth J.: utilizeaza soarecele ca animal de experienta. 1931 - Shope R.: descopera v. gripal porcin. 1931 - Woodruff A., Goodpasture F.: cultiva v. variolei aviare pe m.c.a. si descriu ,,pocksurile. 1950 - Morgan I.F. si colab.: prepara primele medii sintetice pentru culturi celulare. 1951 - Brownlee K.A., Hamre D.: prepara primul compus chimioterapic. 1951 - Gey G.O. si colab.: obtin linia celulara continua HeLa. 1952 - Hershey A.D., Chase M.: demonstreaza rolul ADN in infectia cu bacteriofagi. 1952 - Dulbecco R.: descrie formarea plajelor in culturi celulare (v. polio). 1953 - Rowe W.P. si colab.: izoleaza adenovirusuri. 1953 -Watson J.D., CrickF.H.C.: propun modelul structurii moleculei ADN.

1953 - Brakke M.L.: purifica virusurile prin centrifugare in gradient de densitate. 1953 - Salk D.: prepara vaccinul antipolio inactivat. 1954 - Sigurdsson B.: descrie boala maedi. 1954 - WellerT.H., Coons A.M. :aplicaI.F. in diagnosticul virusurilor (v. herpes-zoster). 1955 - Schaffer F.L., Schwerdt C.E.: cristalizeaza v. polio. 1955 - Eagle H.: prepara mediul sintetic optim pentru culturi celulare. 1956 - Crick F.H.C., Watson J.D.: descopera organizarea capsidelor virale din subu-nitati proteice identice. 1956 - Sabin A.B.: prepara vaccinul anti-polio viu atenuat. 1956 - Eagle H.: obtine linia celulara continua KB. 1956 - Gierer A., Schramm G., Fraenkel-ConratH.: demonstreaza infectivitatea acidu-lui nucleic purificat la v. mozaicul tutunului. 1956 - Bodian D.: utilizeaza tripsina ca agent dispersant pentru culturi celulare. 1957 - Lwoff A.: elaboreaza conceptulde virus. 1957 - Gajdusek D.C., Zigos V: descriu boala kuru. 1957 - Isaacs A., Lindenmann J.: descopera interferonii. 1960 - Enders F. si colab.: prepara vaccin antirujeolos viu atenuat (tulpina Edmonston). 1961 - Jacob R, MonodY; sugereazaexistenta ARN mesager. 1961 - Chanock R.M. si colab.: descriu hemoadsorbtia la v. paragripale. 1961 - Hayflick L., Moorhead P. S.: prepara primele culturi diploide. 1962 - Campbell A.M.: observa integrarea ADN al fagului lambda in cromozomul bacterian. 1962 - Caspar D.L.D., KlugA.: elaboreaza principiile geometriei capsidei virale.

 1962 - Lwoff A., Home R, Tournier P.: elaboreaza criteriile unui sistem de clasificare a virusurilor. 1962 - Burkitt D.: descrie limfomul Burkitt. 1962 - Parkman P.D. si colab.: izoleaza v. rubeolos. 1963 - Dulbecco R., Vogt M., Weil R. M., Vinograd J.: demonstreaza structura circulara a ADN la v. polyoma 1964 - Epstein M.A., Achong B.C., Barr Y.M.: demonstreaza etiologia virala a limfomului Burkitt. 1966 - Meyer H.M. si colab.: prepara vaccinul antirubeolos viu atenuat (HPV-77). 1966 - Nirenberg M.V., Ochoa Khorana H.G.: descifreaza codul genetic. 1967 - Blumberg B.S. si colab.: detecteaza antigenul Australia 1968 - Bunyak E. si colab.: prepara vaccinul antiurlian viu atenuat. 1968 - Martini G.A., SchmidtH.: izoleaza v. Marburg. 1970 - Temin H.M., Mizutani S., Baltimore D.: descopera reverstranscriptaza. 1970 - Kates J. Beeson J.: evidentiaza poliadenilarea ARNm la Poxviridae. 1972 - Morrow J.F., Berg P., Mulder C, Delius H.: demonstreaza specificitatea enzimelor de restrictie. 1973 - Danna K.J. si colab.: construiesc prima harta genomica (SV40), cu ajutorul enzimelor de restrictie. 1973 - Feinstone S.M. si colab.: evidentiaza v. hepatitei A.

1974 - Takahashi K. si colab.: prepara vaccinul viu atenuat varicelos (tulpina Oka). 1975 - Kohler G. si Milstein C.: prepara Ac monoclonal 1975 - Furuichi Y. si colab.: descopera structurile ,,cap ale ARNm la Reoviridae. 1976 - Steelin D. si colab.: evidentiaza pentru prima data oncogenele (v. Rous). 1977 - Chow L.T. si colab.: observa fenomenul de splicing al transcriptelor ARN la adenovirusuri. 1977 - Eradicarea globala a variolei (s-a inregistrat ultimul caz de variola). 1978 - Lee H.W. si colab.: izoleaza v. Hantaan. 1979 - Liane D.P., Crawford L.V., LinzerD., Levine A.J.: descopera proteina antioncogena p 53 si interrelatiile cu Ag tumorale (SV40). 1980 - Poiesz B. J. si colab.: izoleaza particule retrovirale C din limfoame de tip T, cuta-nate, umane. 1980 - Fowlkes D.M., Schenk T.: evidentiaza mecanismele de reglare asociate, ale polimerazei III (adenovirusuri). 1981 - Jackson D.A., Symons R.H., Berg P.: construiesc primul vector de expresie al unui virus animal (ADN SV40). 1981 - Wilson J., Wiley D., Skehel J.: descriu structura atomica la HA v. gripal. 1981 - Grass P., Dhar R., Khouri G,: evidentiaza structurile de tip promotor in transcriere (SV40). 1982 - Takatsuki K. si colab.: demonstreaza etiologia virala a leucemiei T a adultului. 1982 - Prusiner S .B.: descopera prionii (PrP).

 1982 - Yoshida M., Myoshi J., Hinuma Y: izoleaza HTLV. 1983 - Varghese J.N.,Laver W.G.: definesc stractura neuraminidazei. 1984 - Scolnick E.M. si colab.: aplica si fac evaluarea clinica a vaccinului recombinantanti hepatita B. 1985 - Laboratoarele Burows-Wellcome: obtin preparatul chimioterapic antiviral Zido-vudina. 1985 - Prin EPI si (PAHO) este initial in America programul de eradicare a poliomielitei. 1986 - Kitajewski J.si colab.: evidentiaza mecanismele apararii antivirale proprii IFN. 1987 - Lee W. si colab.: descopera factori de activare a transcrierii (SV40). 1988 - De Caprio J. A. si colab.; White P. si colab: descopera antioncogena Rb (studii cu SV40 si adenovirusuri). 1989 - Guatelli J.C. si colab.: utilizeaza PCR in diagnosticul HIV. 1989 - Jan S.K. si colab.: descopera mecanismele reglarii translatiei si structurile IRES la v. polio si v. mozaicului tutunului. 1990 - Andre F.E.: prepara vaccinul inactivat antihepatita A. 1993 - Hilleman M.R. si colab.: prepara vaccinul antihepatita B derivat din plasma.

VIRUSURI

DEFINITIE:

agenti care infecteaza bacterii, plante, animale, oameni

Caractere:
dimensiuni foarte mici (nm) structura simpla parazitism dezvoltat (multiplicare doar in celule vii) unitatea morfofunctionala infectioasa = virion (corpuscul elementar)

IMPORTANTA:
determina boli aparente (sindroame definite) si/sau inaparente la om si animale

ORIGINEA VIRUSURILOR
gene

celulare cu evolutie independenta celule degenerate sau involuate evolutie directa din celulele vii primordiale cu proprietati autoreplicative

EVOLUTIA VIRUSURILOR

Virusuri ARN
prima molecula vie a fost un ARN auto catalitic cu dubla actiune: codificare si enzimatica formele existente provin din ARN-ul primordial sau din interactiuni genetice intre virusurile ARN

Mecanisme:

mutatii: defecte de transcriere cu rata mare si cu evolutie genetica rapida; pot fi punctiforme (virusul gripal = drift antigenic) sau mari (blocuri de gene) care determina genotipuri noi recombinarea (reorganizarea genetica): copiere alternativa cu rata mare intre virusuri omologe (virusul polio intre serotipuri) si neomologe (virusul hepatitei soarecelui/sens pozitiv si virusul gripal/sens negativ) reasortarea: doar la virusurile cu genom segmentat prin schimburi de gene intre tulpini circulante animale si umane. Ex. virusurile gripale printr-o infectie mixta a virusurilor animale (aviare, porcine) cu vrusurile umane detetrmina aparitia de tulpini noi cu potential pandemic.

Virusuri ADN

evolutiv sunt superioare fata de v. ARN: transcriptia se face cu sisteme celulare, sinteza ADN viral este concomitenta cu replicarea celulei parazitate, au enzime care stimuleaza sinteza de dezoxinucleotide, fac schimb de gene cu structuri celulare provin din repliconi mobili: plasmide, transpozoni, retrotranspozoni

Mecanisme:
- mutatii: rata mai mica, unele apar la presori de selectie (antivirale) - recombinarea: acapararea de gene noi de la alte virusuri sau gene celulare ( inclusiv de la plasmide sau epizomi)

EFECTELE EVOLUTIEI

Emergenta = aparitia de specii noi Reemergenta = reaparitia unor specii cunoscute cu circulatie discontinua
Mecanisme: mutatii cu acumulare lenta (drift antigenic) recombinarile/reasortarile (shift antigenic)

FACTORI FAVORIZANTI:
depasirea barierei de specie (HIV) modificarea comportamentului gazdei umane (prostitutie/libertinaj HIV, VHB, virusuri herpetice si cresterea consumului droguri) demografici: crestere populatii, deplasari rural-urban cresterea circulatiei mondiale de persoane si marfuri modificari ecologice: defrisari, irigatii, baraje, urbanizare industrializare si tehnologie moderna: producere hrana la nivel industrial, transplant de organe, transfuzii, tratamente imunosupresoare, antivirale si antobiotice

CLASIFICAREA VIRUSURILOR
(Comitetul International de Taxonomie Virala)

CRITERII:
1. caracteristici virion: dimensiuni, forma, structura, +/- invelis, forma, simetrie 2. genom: tip (AND sau ARN), nr. catene, forma catene (liniara sau circulara), sens catene (+ sau -), nr. segmente, dimensiune 3. mod multiplicare: transcriere, translatie, loc ansamblare/maturare 4. proteinele virale: nr., structura (secvente a.a), functii (transcriptaze, reverstranscriptaze, hemaglutinine, neuraminidaze, factori de fuziune) 5. comportament la agentii fizici (temperaturi, radiatii) si chimici (ioni, solventi, detergenti) 6. proprietati biologice: spectru de gazda (bacterii, plante, animale), mod transmitere 7. patogenitate/tropism tisular: neurotropism (virusul rabic, virusuri encefalitice); v.dermatotrope (poxvirusuri); respiratorii (virusul gripal, virusuri paragripale); limfotrope (HTLV I si II); hepatitice (HVB, HCV); enterotrope (enterovirusurile) 8. distributie geografica (virusul encefalitei japoneze, virusul encefalitei West-Nile)

ORDINE :
Caracter definitoriu:
inrudire

filogenetica intre familii

MONONEGAVIRALES cu FAMILIILE:
Bornaviridae Paramyxoviridae Filoviridae
Caractere: infecteaza animale (vertebrate si nevertrebate) si plante genom: ARN (liniar, monocatenar, sens -, secventa similara a genelor) polimeraza ARN dependenta de ARN maturare prin inmugurire

NIDOVIRALES cu FAMILIILE:
Coronaviridae Arteriviridae
Caractere: infecteaza mamiferele genom: ARN (liniar, monocatenar, sens +) cu functie de ARNm

CAUDOVIRALES cu FAMILIILE:
Myoviridae Siphaviridae Podaviridae
Caractere: infecteaza Bacteria (bacteriofagi) si Archea

FAMILIA
Caractere definitorii: cuprind virusuri cu caractere comune (morfologie virion, organizare genomica) origine comuna a virusurilor pot exista si subfamilii, denumire + virinae (Alphherpesvirinae)

GENUL
Caractere:

grup de specii dintr-o familie cu proprietati comune distincte denumire = virus (Morbillivirus)

SPECIE
Caractere:
grup

de tulpini care poseda anumite gene

virus Ebola

denumire:

NUMAR VIRUSURI CUNOSCUTE/CLASIFICATE

4.000 specii cu 30.000 tipuri si subtipuri

VIRION

MORFOLOGIE
1. 2. 3.

4. 5. 6.

vizualizarea se doar la microscopul electronic (transmisie, baleiaj scanare) modul de studiu: direct din produse patologice: pustule (v. vaccinia, v. variolic); vezicule (v. varicela/zoster, v. herpetic); fecale (rotavirusuri) din tesuturi si celule infectate (bolnav, culturi celulare, oua embrionate, animal) suspensii virale obtinute prin: cultivarea pe substrat sensibil (culturi celulare, oua embrionate, animale), eliberare virus (inghet-dezghet, ultrasonare, mecanic, detergenti), suspensionare (solutii saline), centrifugare (3000 g) purificare virus: ultracentrifugare (150.000 g), cromatografie, ultrafiltrare concentrare: deshidratare, precipitare, ultrafiltrare (moleculara) examinarea propriu-zisa: coloratie negativa, imunoelectromicroscopie criomicroscopie, difractia cu raze x, sectiuni celulare ultrafine

MARIMEA VIRUSURILOR
Sunt mai mici decat bacteriile (100-1000 ori), cu dimensiuni care variaza intre 18-30 nm (parvoviridae, picornaviridae), 450 nm (poxviridae), 900 nm (forme filamentoase,

dar cu diametru mic 80 nm - filoviridae).

FORMA
sferica: virus cu invelis (virusuri gripale, virusuri paragripale, virusuri herpetice), virusuri fara invelis (virusul polio, adenovirus) cilindrica (rigida/flexibila): virusul mozaicului tutunului, fagi paralelipidica: virusul variolic, virusul vaccinia cartus: virusul rabic filamentoasa: virusul Ebola sferica cu prelungire (coada): b. fagi

STRUCTURA VIRION

genom capsida +/- nveli viral

Genom
1. 2. tip acid nucleic: ADN sau ARN (majoritar) marime: dependenta de masa mol (daltoni ) si nr. nucleotide (kilobaza) g. mol = 1,5 x10 6 daltoni (parvovirusuri); 150x106 (poxvirusuri) nr. nucleotide: 5-7kb (papovavirusuri); 231 kbp (herpesvirusuri) nr. gene: virusul gripal = 12, HIV = 9, v. vaccinia = 240 nr. proteine codificate: v. vaccinia = 250, virusul herpetic = 200, picornavirusul = 4 structura: v. ADN: monocatenare liniare (parvov.); monocatenar circular (fagX174); dublucatenare liniare (adenovirusuri, virusuri herpetice); dublucatenare inchise extremitati (v.vaccinia); dublucat. circulare cu extremit monocat. (hepadnav.); dublucatenare circulare (v. polyoma) v. ARN: monocatenar liniar (picornav, v.hepatitei A); monocatenar diploid /2 mol legate (retrov.). Unele v. ARN pot avea genom fragmentat care permite reasortarea: monocatenar liniar cu 8 segmente (orthomyxov.), monocatenar cu 2 segmente (arenav.), monocatenar cu 3 structuri circulare (bunyav.), dublucat cu 10-20 segmente (reovirusuri) functii: depozitar al informatiei genetice determina infectivitatea virala (scade la izolarea acidului nucleic) autoreplicarea cu exceptia ARN viral moncat. cu sens negativ (orthomyxov.)

3.

4.

Capsida virala
complexe proteice cu arhitectura si structura specifica care invelesc acidul nucleic unitatile morfologice = capsomere asezate ordonat pe axe de simetrie Tipuri de simetrie: cubica icosaedrica (virioni sferici): v. ADN (parvov. = 32 capsomere; herpesv. = 162 capsomere; adenov. = 252 capsomere), v. ARN (picornav., calciv. = 32 capsomere) helicoidala (tubulara): v. ARN cu sens negativ (proteinele formeaza un complex nucleocapsida/ribonucleoprot.; disocierea = pierderea infectivitatii la orthomyxov. si paramyxov.) binara (icosaedrica, helicoidala): bacteriofagi (cap = icosaedru; coada = helicoidala) Functii: protectie ac.nucleic atasare celula (virus fara invelis)

INVELISUL VIRAL

unele virusuri (ADN, ARN) prezinta un invelis (anvelopa sau peplos) invelisul provine din: membrana celulara (ortomyxovirusuri, paramyxovirusuri, filovirusuri, retrovirusuri) sau m. nucleara (herpesvirusuri)

Structura:
1.

derivata de la celula infectata: port. membrana celulara = strat bilipidic (fosfolipide, colesterol, glicolipide) in care sunt inserate proteinele virale

2.

codificata de virus:
a. spiculi (peplomere):

glicoproteine (ancorate in invelis) cu trei portiuni: externa (glicozilata), medie (polipeptide), interna (peptide) hemaglutinine (glicoproteine trimerice): se gasesc la majoritatea virusurilor cu invelis (orthomyxov., paramyxov., togav., coronav., rhabdov., flavir., bunyav.); au aspect de bastonas (microscopie eelectronica); functii = hemaglutinare/hemadsorbtie , atasare virus la receptori, induc raspuns imun. neuraminidaze (glicoproteine tetramerice): la paramyxov. si orthomyxov.; functie = scindeaza acidul sialic din membrana celulara permitind penetrarea si eliberarea virusului factori de fuziune: prezenti la paramyxov. in forma inactiva (FO) care prin proteoliza (proteaze cel.) se desfac in F1si F2 (forme active); functii = favorizeaza penetrarea virusului (fuzioneaza cu membrana celulara), fuziunea membranelor celulare cu formare de sincitii, hemoliza, difuziunea infectiei.

b. proteina M (matrix):

prezenta la majoritatea virusurilor cu anvelopa captuseste fata interna a stratului bilipidic are doua forme in celule: M1 si M2 functii: mentine integritatea anvelopei, intervine in ansamblare - inmugurire prin legare de glicoproteine si nucleocapsida, favorizeaza transportul ionilor de H.

Functii invelis:
protectia

nucleocapsidei atasare la receptori celulari ansamblare virion prin proteina M determina activitati ca: hemaglutinare, hemadsortie, hemoliza, fuziune

ENZIME VIRALE
1. ale invelisului 2. nestructurale, legate de nucleocapsida cu rol in replicarea genomului si sinteza de proteine virale: transcriptaze: ARN polimeraze dependente de ARN (v. monocat. cu sens -: paramyxov., rhabdov., orthomyxov.; v.dublucat.; reov.) ARN polimeraze dependente de ADN (poxv., herpesv.) reverstranscriptaze (retrov. si hepdnav.) cu functii de: ADN polimeraza dependenta de ARN, ADN polimeraza dependenta de ADN, integreaza (retrovirusuri integreaza ADN viral in ADN celular) endonucleaze: cliveaza catenele acidul nucleic (v. gripal, pox. v.); integreaza genom viral oncogen in ADN celular (SV40, adenovirus)

AGENTI SUBVIRALI INFECTIOSI

virusuri incomplete, virusuri nefunctionale, acizi nucleici = formatiuni independente neviabile inafara celulei replicarea depinde de celula gazda cu exceptia prionilor (autoreplicare) pot determina boli la om si animale

Virusuri defective

virusuri cu genom incomplet care se replica prin coinfectie cu alt virus (helper) pot determina infectii persistente (panencefalita scerozantasubacuta) apar prin:
o defecte de transcriere care duc la mutatii (v. ARN) o multiplicare in celule nepermisive: infectii persistente mai ales la SNC (v. rujeolos, rubeolos, urlian)

Virusuri satelite

virusuri ADN cu genom mic, monocatenar (sens +/-): replicare in prezenta adenovirusurilor si herpesvirusurilor

Viroizi
ARN

monocatenar circular cu aspect de bastonas; replicare dependenta de celula gazda determina boli la plante de cultura, dar au asemanari cu infectia data de VHD la om (difera prin rolul de helper a VHB)

Prioni
agentii

infectiosi de natura proteica care determina la om si animale boli ale SNC (om: Kuru, boala Creutzfeld Jacob; animal: encefalita spongiforma bovina, etc.)

ACTIUNEA AGENTILOR FIZICI, CHIMICI si BIOLOGICI asupra VIRUSURILOR

Mod de actiune:
distrugere/inactivare: atenuare, sterilizare conservare: transport produse patologice, pastrare laborator, mentinere vaccinuri cu virusuri vii modificare: atenuarea patogenitatii Efectele depind de: natura agentului, concentratie, timp de actiune tipul de virus: cele fara anvelopa mai rezistente mediul cu virus: produse patologice (sange, plasma, excretii, secretii) au rol protector Sensibilitatea diferitelor structuri: acidul nucleic: radiatii UV, substante chimice (formaldehida, hipocloritul de Na), agenti mutageni (ac. nitros, hidroxilamina), substante radioactive cu P, H proteine virale: radiatii UV, enzime proteolitice, substante chimice (fenol, formaldehida) invelisul: solventi (eter, cloroform), detergentii anionici

Agenti fizici:
Temperatura:

caldura uscata: - mediu ambiant : + 180C - +250C (viabilitate: 2-3 ore = v. gripal, v. rujeolos; 7 ore = v. Ebola, v. Marburg; 24 ore = v. Epstein-Barr; 3 luni = v. coxsackie; >1 an = v. variolic - temperaturi intre +560C si + 1000C pe durata de 30 min. inactiveaza majoritatea virusurilor - la +560C sunt inactivate: v. gripale (5 min.), v. urlian (20 min.), adenov/ herpesv/poliov (30 min) - sensibilitatea depinde de : tipul de virus (v. rujeolos = 3 minute la +600C, v. Ebola = 1 ora la 600C, v. hepatitei = 1ora la +1600C), substante protectoare (organice sau saruri ca Cl2Ca si Cl2Mg )

caldura umeda :

are eficienta mai mare in distrugerea virusurilor a. fierbere (+1000C): v. hepatitei A, v. rabic: 10 min. v. hepatitei B: 30 min.
b. autoclavare (+ 1210C, 15 psi): toate virusurile: 20 min.

Mod de actiune a caldurii:

alterarea proteinelor virale

FRIGUL
Conserva virusurile si mentine infectivitatea.

la +40C: majoritatea virusurilor se mentin perioade lungi congelarea (-200C) poate scadea seminficativ infectivitatea (v. gripale) la 700C si azotul lichid (-1900C) se mentin ani de zile toate virusurile inghetul si dezghetul repetat afecteaza virusurile cu anvelopa (paramyxov., v. herpetice)

DESICATIA

Deshidratarea unui preparat prin modificarea temperaturii (<, >) in prezenta unor substante (CaCl2, KOH) a. desicare lenta: scade patogenitatea (atenuare tulpini: v. rabic, v. polio)
b. desicare rapida (liofilizare): conserva virusurile inclusiv cele vaccinale pe durata a mai multor ani

pH-ul

<5 si >9 afecteaza infectiozitatea cu exceptia enterovirusurilor, virusul gripal B si arbovirusurile care se mentin la pH 3 si respectiv pH 9

RADIATIILE
Efectele depind de: tipul de radiatie (ionizanta, neionizanta) si durata de expunere radiatii neionizante: - lumina poate scadea viabilitatea si difuziunea virusurilor (v. aerogene determina epidemii in sezoanele cu insolatie scazuta) - radiatiile UV au actiune virulicida asupra unor virusuri prin alterarea bazelor ac nucleici (v. polio, v. rabic, v. urlian = distruse instantaneu; v. hepatitei A si v. rujeolos = distruse in 1-2 min.), exceptie fac v. hepatitei B si HIV care sunt rezistente. radiatii ionizante: au efect virulicid prin alterarea ac. nucleici si a proteinelor virale - radiatiile X, gamma, alfa si beta inactiveaza virusurile in functie de doza si tip de virus (v. gripal rezista pina la 2400 R/RX, iar v. polio pina la 50.000 R timp de 40 min.) - radiatiile ionizante nu afecteaza antigenitatea - se folosesc la sterilizarea materialelor si a instrumentarului de unica folosinta - pot avea efect mutagen in doze mici

ULTRASUNETELE
Efecte posibile la >20kHz/sec.: 1. pierderea infectivitatii prin disruperea virionului 2. cresterea unor activitati prin desfacerea invelisului (v. gripal cresterea titru HA) 3. fara afectare: v. rujeolos, v. aftos

AGENTI CHIMICI

Efectele depind de: - natura substantei, intensitatea, durata de actiune si tipul de virus - nivelul actiunii: virion intreg, proteine, acid nucleic, invelis Mod de actiune: - virulicida cu aplicare in decontaminare si sterilizare - diminuarea patogenitatii - conservare - stabilizare

Substante virulicide:
agentii oxidanti (1%) inactiveaza virusurile : apa oxigenata (3-6%, v.polio =1%); ozonul (dezinfectia apei) permanganatul de K (1%); aldehidele (formaldehida = 1-8% pentru decontaminare si sterilizare aer); glutaraldehida (2% distruge v. hepatitei B si HIV in 2 min.; se foloseste la sterilizarea instrumentar) clorul: actioneaza intens pe v polio, v. hepatitei A; hipocloritul Ca/Na (10%): afecteaza acizii nucleici; cloramina (2-5% uzual si 20% pentru v. hepatitei B) fenolii (1-5%) altereaza proteinele la virusurile cu invelis (v.gripal) solventii organici (eter, cloroform) inactiveaza virusul cu anvelopa prin dizolvarea lipidelor; active pe: v. gripal, v. rujeolos, v. urlian, v. herpetic (18 ore la +40C), dar nu actioneaza pe v. fara invelis (enterov., adenov.) detergentii sintetici (dezoxicolatul de Na; Tween 80) inactiveaza virusurile cu invelis (arbov., myxov.) nu si cele fara invelis (enterov.). Unii cresc activitatea HA (Tween80) detergentii cationici (saruri cuaternare de amoniu) au si efect de curatire in concentratie de 20% alcoolii: etanolul (75%) inactiveaza toate virusurile, dar libere de mat. organic; metanolul nu este folosit curent (70% inactiveaza HIV in 15 min) Lactone (beta propiolactona): in concentratie de 0,2- 0,4% actioneaza rapid pe v. gripale, v. rujeolos, v. urlian, adenovirusuri

Agenti care diminueaza patogenitatea

formaldehida (0,2%) mentin imunogenitatea (vaccinuri inactivate) la v.rujeolos, v. urlian, v. encefalitice fenolul (1%) folosit la vaccin antirabic beta propiolactona la vaccinul antirabic

AGENTI CONSERVANTI
glicerol (50%) mentine infectivitatea timp indelungat: v. polio (6 ani); v. herpetic (5 ani); v. febrei galbene (2 luni) sarurile de Mg. si Na mentin infectivitatea la temperaturi ridicate (Cl2Mg v. polio la +500C)

AGENTI BIOLOGICI

secretiile umane si animale au substante cu actiune virulicida: - lizozimul (saliva, lacrimi, secretii nazale): activ pe v.gripale si v. polio - sucul gastric activ prin pH acid si pepsina - bila activa pe v. cu invelis (v. gripal, v. herpetic) enzimele proteolitice (tripsina, papaina, pepsina, pronaza) lizeaza invelisul viral si proteinele virale; se folosesc pentru separarea acizilor nucleici de proteinele virale.

CULTIVAREA VIRUSURILOR
Virusurile se replica numai in celule vii (eucariote sau procariote). Cultivarea virusurilor se poate face in urmatoarele sisteme: I. substraturi celulare II. oua embrionate III. animale de laborator

I. Substraturi celulare:

culturi de tesut: fragmente de tesuturi suspendate in mediu nutritiv fara multiplicare: nu se mai folosesc organoculturi: fragmente de organe (esofag, stomac, intestin, colon, cord, pancreas), mentinute in mediu, permit dezvoltarea a v. gripale A si B, v. echo, v. polio, v. rujeolos, etc. Celulele nu se multiplica si au o supravietuire scurta. culturile celulare: suspensii monocelulare obtinute enzimatic sau chimic care se multiplica si au o durata de supravietuire variabila dependenta de cariotip si modul de obtinere. - componente: a) celulele b) mediul nutritiv

a) Celulele
- sursa : tesuturi embrionare: embrion uman (trim. I), plaman de embrion uman, embrion de gaina. Au potential inalt de multiplicare. tesuturi adulte: rinichi (maimuta, caine, cobai, etc.) tesuturi tumorale (de la diverse biopsii) tesuturi de insecte: tantari (folosite la cultivarea arbovirusuri) - mod obtinere: tripsinizarea fragmentelor de organ, suspendare in mediu nutritiv, incubare la 370C

Clasificare :
a. mod de cultivare: cultura in monostrat = strat celular continuu obtinut prin aderare si multiplicare pe sticla sau plastic (flacon, tub, placi cu godeuri). Ele pot fi: stationare (plan orizontal), rotate (flacoane cilindrice cu o viteza de 14 - 16 rotatii/min.) cultura in suspensie (fermentoare cu agitatie continua). Randament foarte mare. cultura pe microsfere (sticla, colagen, polistiren cu dim. de 5 mm ) b. mod de obtinere si caractere cariotip: culturi primare: se obtin prin trisinizare, cariotipul este similar cu cel de origine (diploid), supravietuiesc 7-21zile, se mentine tipul de celule (epitelial sau fibroblastic) culturi secundare: se obtin prin tripsinizarea culturilor primare sau cu EDTA/versen (chelatori), au caractere asemanatoare cu cele primare culturi diploide: se obtin din tesuturi embrionare, se pot face 20-50 de subcultivari, celule de tip fibroblastic, se folosesc la vaccinuri (MRC5) culturi heteroploide (linii celulare continue): subcultivare nelimitata, se obtin din tesuturi tumorale sau transformate (virusuri, radiatii, substante chimice). Cresc rapid (2-3 zile), se folosesc in diagnosticul de laborator.

b) Medii nutritive
Asigura multiplicarea si viabilitatea celulara. 1. Medii biologice: plasma, extracte embrionare, lichid amniotic. Se folosesc limitat. 2. Medii sintetice : - compozitie: solutie salina tamponata (Hanks, Earle) + stabilizator de pH (Hepes) + indicator pH (rosu fenol) ser animal (ser fetal de vitel) si aminoacizi pentru aderare pe suport si multiplicare antibiotice (penicilina + streptomicina) si antifungice (fungizon) +/- hidrolizat de lactalbumina - tipuri: mediu de crestere (10% ser fetal de vitel) mediu de intretinere (2-5 % ser fetal de vitel)

MODIFICARILE CULTURII CELULARE INDUSE DE VIRUSURI

1. Efect citopatic (perturbari celulare structurale si functionale): - tip: litic: celulele se rotunjesc, devin mai refringente si se desprind (enterov.) sau se maresc si se grupeaza (ciorchine) urmate de o desprindere rapida (adenov.) formare de sincitii: fuziunea membranelor celulare cu aparitia de forme gigante cu mai multi nuclei (v. sincitial repirator, HIV, v. rujeolos) citotoxic: distrugeri masive cu desprindere rapida - timp de aparitie si intensitate: 24-48 ore cu distrugere in 3-4 zile: v. polio 3-4 zile cu desprindere totala in 7-10 zile: v. Rujeolos 2. Formarea de plaje: reprezinta un efect citopatic limitat produs de o singura particula virala; se foloseste la clonarea virusurilor

3. Incluzii virale: formatiuni rotunde sau ovalare (componente virale) intranucleare (v. herpetice, adenov.) sau citoplasmatice (v.rabic ) puse in evidenta prin coloratii (M-G-G ) 4. Hemadsorbtia: se observa la virusuri cu hemaglutinine exprimate pe membrana celulara (gripale, paragripale) si se evidentiaza prin fixarea hematiilor la suprafata culturii 5. Inhibitia metabolica: celulele infectate nu vireaza indicatorul de pH 6. Interferenta: poate evidentia multiplicarea unui virus fara efect citopatogen (v. rubeolos) prin inocularea la 10 zile cu un virus cunoscut citopatogen (v. echo 11) 7. Transformarea celulara: apare la infectii cu v. oncogene (polyoma, SV40) si se manifesta prin malignizare si multiplicare aberanta a celulelor (aglomerari de celule pluristratificate la nivelul monostratului)

Culturi celulare folosite curent in virusologie

UTILIZAREA CULTURILOR DE CELULE

diagnostic

(izolare si identificare) obtinerea unor reactivi de diagnostic prepararea de vaccinuri virale

II. Oua embrionate

Sunt folosite pentru cultivarea anumitor virusuri: gripale, oncogene, poxvirusuri.
1. Tipuri dupa sursa: conventionale: folosite in diagnosticul gripei si la prepararea vaccinului gripal LF (leukosis-free): obtinute in incubatoare speciale; nu sunt infectate cu v. leucozei aviare SPF (specific-pathogen-free): nu contin contaminanti de orice fel; se folosesc la seed-uri vaccinale (gripal, rujeolos)

2. Structura:

cochilie camera de aer membrana proprie membrana chorio

1. Ou embrionat: a) cochilie; b) membrana proprie; c) membrana corioalantoidiana; d) lichid alantoidian; e) sac vitelin; f) sac amniotic continand lichid amniotic; g) camera de aer; h) sac albumen; i) embrion

3. Selectie: oua embrionate de gaina de 10-11 zile cu coaja alba; incubare la 390C, umiditate 75-80% 4 . Inocularea: pe membrana chorioalantoidiana: pentru virusuri care produc leziuni de tip pocks (v. vaccinia, v. herpetic, v. oncogene, v. Rous) in cavitatea alantoidiana : v.gripale A si B in cavitatea amniotica : v. gripal C si v. urlian in sacul vitelin : v.herpetic 5. Modificari determinate de virusuri: leziuni ale mca: nodulare (pocks) date de poxvirusuri, v. herpetice, v. Rous activitate hemaglutinanta a lichidelor amniotice si alantoice: v. gripale A, B,C si v. urlian moarte embrion: v. urlian, v. herpetic 6. Utilizare: diagnostic (izolare, caracterizare): v. gripale preparare reagenti de diagnostic: gripa preparare de vaccinuri: gripal

III. Animale de laborator

Se folosesc limitat: - virusul nu se cultiva pe cultura celulara sau ou (HIV, v. coxsackie A) sau in cercetare (patogeneza, oncogeneza virala, imunitate, substante antivirale)

1. Surse:
mamifere mici: soarece, hamster, sobolan, cobai maimuta, dihor mamifere mari: oaie, capra, cal, vitel pasari: gaina, rata, curcanul

2. Selectia:
a. susceptibilitatea la infectia virala:

specia: soarecele (v. coriomeningitei limfocitare), maimuta (v. rujeolos si VHB), cimpanzeul (HIV), hamsterul la v. oncogene caractere genetice: soareci BALB (v. leucemiei murine) b. varsta: izolarea v. coxsackie la soareci de 72 ore c. starea de sanatate: carantinarea animalelor din zone necunoscute (maimute) d. animale speciale: SPF = animale fara flora patogena Germ - free = animale fara flora asociata (patogena, saprofita) inbred (izogene) = animale homozigote obtinute prin inmultiri consanguine transgenice = animale obtinute dupa injectarea unei gene de la parinti izogeni in oul fecundat soareci nuzi = nu au pr si timus congenital

3. Utilizarea animalelor:

diagnosticul unor boli virale (virusul se dezvolta doar pe animale) preparare de reagenti de diagnostic (seruri imune, antigene, complemente) sursa de organe (rinichi: maimuta, caine) si ser (fetal vitel) pentru culturi celulare

Substrate celulare in vitro utilizate mai frecvent in laboratoarele de culturi celulare si diagnostic virusologic

continuare