Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Culturi Starter de Microorganisme
Culturi Starter de Microorganisme
Figura 1.
Biotehnologia este aplicat in diverse domenii, cum ar fi: agricultur, industria
alimentar, producie industrial, mediu i medicin.
Biotehnologia alimentar se refer la prelucrarea industrial a diferitelor
materii prime cu ajutorul microorganismelor i enzimelor proprii sau a unor ageni
biologici (microorganime, enzime) adugai n scopul realizrii unor produse sau a
ameliorrii unor procese tehnologice.
Rolul biotehnologiei este covritor n industria alimentar. n fapt, industria
alimentar este o biotehnologie, deoarece materiile prime agroalimentare sunt
produse biologice i prin urmare conservarea lor pn la consum, n stare proaspt
(cazul fructelor i legumelor) sau pn la industrializare (cazul tuturor produselor
agroalimentare) implic controlul activitii enzimatice proprii esuturilor vegetale i
animale sau a celor elaborate de microflora de contaminare.
Enzimele proprii esuturilor vegetale i animale sunt eseniale n
transformrile pe care le ofer produsele agroalimentare: maturarea fructelor i
legumelor, cerealelor i finurilor sau diferitelor produse alimentare pe baz de
cereale germinate, maturarea brnzeturilor, maturarea crnii.
Enzimele pot avea ns i rol deteriorativ cu implicaii n modificarea
caracteristicilor senzoriale i a valorii nutritive a materiilor prime agroalimentare pn
la prelucrarea termic a acestora.
2. PREPARATE ENZIMATICE
2.1. Aspecte generale
Enzimele sunt din punct de vedere structural proteine constituite din
aminoacizi, iar din punct de vedere funcional acioneaz ca nite biocatalizatori
biologici care au rolul de a permite realizarea unor reacii cu o vitez mrit.
Enzimele sunt utilizate drept catalizatori n condiiile n care exist i
catalizatori chimici, deoarece prezint urmtoarele avantaje:
1. Au capacitatea de a cataliza reaciile chimice n condiii blnde de
temperatur, pH, presiune. Aceasta permite un consum mai redus de energie i nu
necesit echipamente scumpe rezistente la coroziune.
2. Enzimele sunt catalizatori specifici, deseori stereoselective, care nu conduc
la obinerea de produi de reacie secundari nedorii. n aceste condiii nu sunt
necesare cheltuieli mari privind rafinarea i purificarea produsului ce urmeaz a fi
fabricat.
3. Comparativ cu procesele chimice, enzimele sunt din punctul de vedere al
mediului compui biodegradabili care nu necesit costuri semnificative de epurare.
4. Anumite enzime nu sunt limitate numai la aciunea n mediul apos, putnd
aciona i la interfaa dintre dou faze, ap: solvent organic sau ap:ulei etc.
Totui exist i o serie de dezavantaje:
au stabilitate limitat;
de cele mai multe ori sunt utilizate industrial o singur dat.
2.2.Clasificarea enzimelor.
Enzimele se clasific conform sistemului stabilit de Comisia de Enzime a
Uniunii Internaionale de Biochimie (1979). Conform acestei clasificri exist 6 clase
principale grupate conform cu reaciile pe care le catalizeaz astfel:
1.
Oxidoreductaze care catalizeaz reacii de oxidoreducere, transfer de atomi
de hidrogen, oxigen sau electroni;
2.
Transferaze care catalizeaz transferul unei grupri de pe o molecul pe alta;
3.
Hidrolaze ce catalizeaz scindarea hidrolitic (implic apa) a legturilor
chimice covalente;
4.
Liaze, care catalizeaz scindarea legrutilor chimice altfel dect prin hidroliz
sau oxidare;
5.
Izomeraze ce catalizeaz rearanjarea structural a moleculelor;
6.
Ligaze sau sintetaze care catalizeaz formarea de noi legturi te tip C-N, CO, C-C, C-S, cu consumare de ATP.
Aa cum se observ din datele de mai sus, cea mai mare pondere o are
utilizarea n industria alimentar, urmat de industria detergenilor.
n figura 3. sunt prezentate principalele tipuri de preparate enzimatice produse
pe plan mondial. Cea mai mare pondere o au preparatele de proteaze urmate de
amilaze.
B. Etapa biologic.
Obinerea culturilor starter de producie
Pentru producerea enzimelor, fermentaiile industriale se desfoar n
volume de 150 250 de mc de mediu, motiv pentru care trebuie pregtit o cantitate
suficient de inocul. Cultura folosit drept inocul trebuie s fie n faza exponenial
de cretere. La microorganismele care au vitez de cretere redus, se recomand
s se foloseasc o cantitate mai mare de inocul, pentru a se reduce durata iniieirii
fermentaiei. Cultura starter de producie trebuie s conin celule active, adaptate la
mediul industrial pentru ca fermentaia s se declaneze rapid. n cazul fermentaiilor
desfurate pe mediul solid, pentru care se utilizeaz inocule sporifere se
recomand s se asigure prin inoculare concentraii de 10 5-106 spori pe g mediu, iar
n cazul celor submerse cultura starter de producie s fie de circa 10% din mediul
de cultur.
Tehnici de fermentaie
Pentru producia de preparate enzimatice de origine microbian se
poate aplica dou tehnici de baz :
Fermentaia de suprafa n care se utilizeaz un mediu solid pe care
se cultiv microorganismul (de regul un mucegai filamentos). Aceast tehnic
are avantajul c mediul de cultur va deveni un mediu bogat n activitate
enzimatic ;
Fermentaia de submers, n care mediul este lichid ce se afl ntr-un
reactor unde toi parametrii fermentaiei sunt perfect controlai. Aceast ultim
tehnic este superioar primei metode din punct de vedere tehnologic i
biochimic.
Dintre speciile de microorganisme ce se folosesc menionm
urmtoarele : Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor miehei, Saccharomyces
cerevisiae, Endothia parasitica, Penicillium emersonii, Kluyveromyces lactis,
Bacillus amylolichefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus,
Actinoplanes missouriens, Klebsiella planicola.
La sfritul fermentaiei microorganismul trebuie distrus cu condiia
pstrrii intacte a activitii enzimatice.
Microorganismele cultivate pot produce enzime extracelular sau intracelular.
n funcie de tipul acestora variaz i procedeul de extracie. n ceea ce privete
tipurile de culturi submerse, ne putem situa n unul din urmtoarele cazuri:
Procedeul nealimentat, n care caz toate ingredientele mediului de
fermentare sunt pregtite n fermentator la pH-ul i temperatura dorit nainte
de a introduce inoculum.
Dup
introducerea
inoculum, fermentaia
principal ncepe i finalizarea ei se urmrete prin prelevarea de probe, n
mod steril, care arat :
- creterea microorganismelor (biomas, vscozitatea mediului) ;
- concentraia n enzim (activitatea enzimatic a mediului) ;
- consumul de glucide ;
- nivelul de proteine.
La procedeul nealimentat se pot monta diferii senzori care arat :
- pH-ul care se poate regla prin adaus de baze sau acid ;
- temperatura care se poate regla prin debitul de circulaie al apei reci n
mantaua fermentatorului sau n serpentina din interiorul fermentatorului ;
- nivelul de spum care se poate combate cu un antispumant aflat ntr-un
rezervor ataat fermentatorului;
- presiunea care se regleaz prin supape care se deschid la presiuni de 1
pn la 3 bar ;
- coeficientul respirator QR care se msoar prin cantitatea de CO 2 produs
fa de cantitatea de oxigen consumat ;
- nivelul de oxigen consumat, pornind de la analiza efluenilor.
100
enzim utilizat
100
Activitatea (E0) nainte de fixare
activitatea
rezidual a
enzimei
Stabilizare slab.
Riscul de desorbie a enzimei de ctre : fluxul de substrat, variaie lejer
de pH, fora ionic, temperatur
Avantaje
Reaciile de polimerizare sau gelificare sunt bine cunoscute
Reaciile chimice dintre suport i enzim sunt limitate (enzima este inclus
n geluri naturale)
Se poate aplica la toate enzimele (chiar i la amestec de enzime)
Se pot folosi suporturi cu forme diferite : filme, fibre, bile.
Riscul de evadare a enzimei este redus prin reticularea suportului dup
imobilizare
Dezavantaje
Anumite polimerizri necesit ageni denaturani sau radicalici
Se pun probleme de transfer de mas (inaccesibilitatea unor substraturi la
enzim)
Riscul de evadare al enzimei prin micropori
Proprietile mecanice ale gelurilor sunt nesatisfctoare
Avantajele i dezavantajele imobilizrii enzimelor prin incluziune
b) Metode chimice de imobilizare, n care caz imobilizarea se face
prin intermediul legturilor covalente de suporturi insolubile, care posed
grupri reactive sau care pot fi activate prin diferite reacii chimice. Se poate
realiza imobilizarea i prin copolimerizarea enzimelor cu un monomer reactiv
i legarea ncruciat (Cross-linking) sau reticular intra i intermolecular a
enzimelor de un suport prin intermediul unui reactiv multifuncional.
Avantaje
Stabilitate mrit datorit faptului c legturile covalente sunt cele mai
puternice dintre toate legturile menionate anterior
Varietatea mare a suporturilor : sticl, silice, ceramic, celuloz, polimeri sintetici
etc.
Posibilitatea de a efectua imobilizarea n prezena unui substrat pentru a se
evita inactivarea (protecia situsului activ).
Dezavantaje
Trebuie realizate reacii chimice, adesea complexe
Etapa de activare a suportului este lung
Randamentul de fixare este 100%
Exist riscul modificrii chimice a enzimei (pierdere de activitate)
Este necesar ca enzima s fie purificat n prealabil
Investiia (costul) este important
Suporturi de imobilizare comerciale
Suporturile comerciale cele mai des utilizate pentru imobilizarea
enzimelor sunt:
- polizaharide : agaroz, celuloz i derivai, alginai, carageenani, dextrani ;
- poliacrilamide utilizate sub form de bile ;
- polistiren (bile i tuburi) ;
- silicea i sticla poroas.
2.8. Condiiile de inocuitate pe care trebuie s le ndeplineasc
preparatele enzimatice
Numr total de germeni (NTG), maximum 5.10 4/g ;
Coliformi, maximum 30/g ;
Escherichia coli absent/ 25 g ;
Salmonella absent/ 25 g ;
Activitate antibiotic de origine microbian absent ;
26,7
26,7
29,4
29,4
20
38
13
28
5,00
5,65
5,00
5,40
Din tabelul de mai sus rezult c P. pentosaceus este mai eficace n ceea ce
privete producia de acid lactic att la 26,7C ct i 29,4C n comparaie cu P.
acidilactici.
Avnd n vedere c pediococii produc acid lactic i bacteriocine, ei exercit o
aciune inhibitoare fa de microorganismele patogene i cele de alterare (stafilocici,
salmonele, Cl. botulinum, bacili, enterobacterii gram negative, drojdii).
n produsele de carne fermentate, pediococii pot scade pH-ul de la 5,6 la 4,5-5,2
ceea ce face ca proteinele s fie aduse aproape de punctul izoelectric fapt ce
favorizeaz sinereza i deci uscarea produsului.
Acidul lactic produs contribuie la denaturarea proteinelor din carne ceea ce
contribuie la realizarea unei texturi ferme a produsului finit.
Genul Lactobacillus. Acest gen aparine familiei Lactobacillaceae. Aceast
familie cuprinde bacterii sub form de bastonae de lungimi i grosimi variabile,
precum i cocobacili scuri, aezai obinuit n lanuri n faza de nmulire logaritmic.
Sunt asporogene, imobile, Gram pozitive, anaerobe sau facultativ anaerobe.
n general sunt catalaz negative citocrom-oxidaz negative, nu reduc azotaii, nu
lichefiaz gelatina. Au activitate proteolitic i lipolitic redus. Glucidele cele mai
bine fermentate sunt: lactoza, maltoza, zaharoza (mai ales n faza de dezvoltare),
apoi hexozele (glucoza, fructoza, galactoza).
Pentru dezvoltare necesit substane minerale i toate vitaminele din grupul
B. Se dezvolt bine n mediu cu pH 5,5-5,8, dar i la pH 5 . Se pot dezvolta n
limite largi de temperatur (5-53C), dar temperatura optim este cuprins ntre 30 i
45C.
n funcie de temperatura optim de dezvoltare lactobacilii pot fi:
- termofili: L. lactis, L. helveticus, L. bulgaricus, L. acidophilus, temperatura optim
fiind 37-45C;
- mezofili: L. casei, L. plantarum, L. brevis etc.; temperatura optim de dezvoltare
fiind 26-30C.
Orla Jensen a mprit genul Lactobacillus n urmtoarele grupe:
1. grupa Thermobacterium care cuprinde lactobacili homofermentativi termofili: L.
lactis, L. helveticus, L. bulgaricus, L. acidophilus, L. delbrueckii; L. leichmanii;
2. grupa Streptobacterium care cuprinde lactobacilii homofermentativi mezofili: L.
casei, L, plantarum;
Lactobacilii
heterofermentativi
fermenteaz
hexozele
pe
calea
hexozomonofosfatului, aceti lactobacili neavnd aldolaz i triozofosfat izomeraz
care sunt enzime cheie n calea Embden Meyerhof. Aceasta este de fapt i
diferena dintre cele dou grupe de microorganisme, adic lactobacilii
homofermentativi posed att aldolaz ct i triozofosfatizomeraz, n timp ce
lactobacilii heterofermentativi nu posed aceste enzime.
Galactoza, rezultat din lactoz, pentru a fi fermentat trebuie mai nti s fie
transformat ntr-un derivat fosforilat al glucozei (glucozo-6P), care apoi sufer
transformri pe calea Embden Meyerhof (fig. 12.).
acidifiante/aromatizante care la rndul lor pot fi constituite din unul sau mai multe
specii de lactobacili i dintr-o specie de streptococi. n aceast direcie amintim:
- cultura starter termofil pentru iaurt: Lactobacillus bulgaricus i Str. therrmophilus;
- cultura starter termofil pentru brnzeturi: Lactobacillus bulgaricus + Lactobacillus
lactis + Lactobacillus helveticus + Str. thermophilus. Aceast cultur starter se
folosete la fabricarea brnzeturilor cu past tare i semitare, deci la care se practic
nclzirea a doua a bobului de coagul.
Utilizarea culturilor starter termofile este benefic deoarece:
produc acid lactic deci scad pH-ul laptelui i determin coagularea acestuia (cazul
iaurtului); la brnzeturi acidifierea favorizeaz eliminarea zerului din coagul;
au activitate proteolitic i prin urmare contribuie la ameliorarea proprietilor
reologice i la aroma produselor fermentate; ca urmare a activitii proteolitice
rezult i aminoacizi din proteine care stimuleaz dezvoltarea celorlalte bacterii din
culturile starter termofile;
produc i compui de arom, dar n principal aldehid acetic, aceton, precum i
urme de acetoin;
produc i substane cu caracter filant care influeneaz vscozitatea produsului
(Str. thermophilus n cultura pentru iaurt);
produc o serie de bacteriocine (Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus casei etc.);
produc H2O2 (Lactobacillus bulgaricus).
Avnd n vedere cantitile mari de iaurt ce se fabric pe plan mondial, este
necesar s cunoatem factorii care influeneaz performana optim a culturilor
pentru iaurt. Aceti factori se refer la:
temperatura de incubare care este de 41-42C (apropiat de temperatura optim
de dezvoltare a lui Lactobacillus bulgaricus ). Dup 3 ore de incubare se ajunge la ~
500 mil bacterii/g, raportul dintre L. bulgaricus i Str. thermophilus fiind 1/1;
tratamentul laptelui pasteurizarea influeneaz pozitiv dezvoltarea lui L.
bulgaricus prin:
- modificarea structurii proteinelor;
- eliminarea parial a oxigenului i realizarea unei microaerofilii propice;
- distrugerea inhibitorilor din lapte;
- formarea de acid formic care favorizeaz dezvoltarea culturii;
disponibilitatea substratului Laptele este un bun substrat dar trebuie artat c
Lactobacillus bulgaricus are preferin fa de glucoz i deci ar trebui ca lactoza
s fie prehidrolizat la -galactozidaza;
metabolii produi n mediu. Lactobacillus bulgaricus produce H2O2 n mediul de
cultur i deci adausul de catalaz va stimula producia de acid lactic de ctre Str.
thermophilus care este mai sensibil la H2O2 dect Lactobacillus bulgaricus. Laptele
destinat iaurtului nu trebuie s fie agitat prea mult ca s nu includ aer (oxigen) care
ar strica condiiile de microaerofilie pentru L. bulgaricus i ar deveni toxic pentru Str.
recoltare spori din vase Roux cu ser fiziologic 0,8% astfel ca s se asigure n
suspensie 108-1010 spori/ml;
pstrare suspensie la 0-4C.
Cultura cu spori de mucegai concentrat poate fi livrat i sub form de
emulsie liofilizat, emulgatorul fiind polietilsorbitanul .
Se pot realiza culturi starter concentrate de spori cu mucegaiurile utilizate n
industria laptelui i crnii, utilizarea lor fiind n funcie de produsul alimentar n care
se folosete cultura respectiv de spori de mucegai.
Pentru industria crnii, la utilizare suspensia de spori de mucegai concentrat
se dilueaz cu ap fiart i rcit n raport de 1/3.