CROMATOGRAFIA

Metodele cromatografice reprezint sisteme experimentale nrudite, utile n analizarea

unei mari varieti de substane chimice. Cromatografia reprezint o metod analitic
important. Dintre domeniile de aplicare citm: controlul de calitate, purificarea
produselor, cercetarea fundamental.
Definiie
Termenul de cromatografie a fost utilizat iniial de Tsvet (1872-1919), un botanist rus,
ca rezultat al combinrii a doi termeni din limba greac (khromatos culoare i graphos
scris). El a folosit termenul pentru a descrie studiile de migrare a unui pigment vegetal
separat pe o coloan de cret. Tsvet a descris astfel cromatografia ca o metod prin care
componentele unui amestec sunt separate pe o coloan de absorbie ntr-un mediu fluid.
IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) definete cromatografia ca :
o metod utilizat n principal pentru separarea componentelor unei probe, prob n
care componentele sunt distribuite ntre dou faze din care una este staionar iar
cealalt este mobil. Faza staionar poate fi solid sau un lichid dispus pe un suport
solid sau un gel. Faza staionar poate fi compactat ntr-o coloan, pulverizat ntr-un
strat sau dispus ca un film; n aceste definiii, patul cromatografic este un termen
generic denominnd diferitele forme de utilizare a fazei staionare. Faza mobil poate fi
gazoas sau lichid.
Istoric
1941 Martin i Synge inventeaz cromatografia de partiie (lichid-lichid) pe coloan i
planar (pe hrtie). Primesc Premiul Nobel n 1952.
1950 depunerea silicagelului n strat subire duce la apariia TLC (thin-layer
cromatography) cromatografia n strat subire
1959 James i Martin introduc GLC (gas-liquid chromatography) cromatografia gazlichid
1959 Porah i Flodin cromatografia cu excludere dimensional permite separarea
uoar a macromoleculelor dup dimensiuni
1970 HPLC high precision liquid chromatography metod de mare finee.
Clasificare
Exist 3 moduri de clasificare a metodelor cromatografice. Prima i cea mai folosit este
bazat pe mecanismele de retenie modul n care substana de analizat interacioneaz
cu faza staionar. n acest mod de clasificare, cromatografia poate fi de 5 tipuri:
1. Cromatografia de absorbie
Aceast tehnic este bazat pe competiia pentru substane de analizat neutre dintre faza
mobil (lichid sau gaz) i faza staionar. Substanele cu grupri polare sunt reinute mai
mult de ctre un adsorbent polar n timp ce substanele cu grupri nepolare
interacioneaz optim cu faza staionar nepolar. n acest tip de cromatografie,
substanele de analizat sunt simultan n contact att cu faza staionar ct i cu faza
mobil.

2. Cromatografia de partiie
Tehnica este bazat pe competiia pentru substanele neutre ntre faza mobil (lichid sau
gaz) i un lichid neutru sau o faz staionar de tip lichid (numit i faz legat deoarece
este reprezentat de lanuri lungi alkilice cuplate la o matrice astfel nct s se comporte
ca un fluid). n cromatografia de partiie, substana de analizat (analizatul) este transferat
din masa unei faze n masa celeilalte faze astfel nct moleculele analizatului sunt
nconjurate de moleculele unei faze. Separarea n cromatografia de partiie este obinut
prin diferenele dintre coeficienii de partiie ai analizatului ntre faza mobil i staionar.
3. Cromatografia pe schimbtori de ioni
Tehnica este bazat pe interaciunea electrostatic dintre un solvit ncrcat i o faz
staionar ncrcat opus. Separarea n cromatografia pe schimbtori de ioni este obinut
prin afinitatea diferit a ionilor din soluie pentru gruprile ionice de sens opus din faza
staionar. Acest tip de cromatografie se aplic pentru orice solvit care capt ncrcare
electric n soluie. Astfel, chiar i carbohidraii (glucidele) care sunt nepolare sub pH 12
pot fi separate prin aceast metod, n soluie la un pH peste 12.
4. Cromatografia de excludere dimensional
Tehnica este bazat pe principiul sitei i mai este cunoscut sub denumirea de gelcromatografie, gel-filtrare sau cromatografie de gel-permeaie. n aceast tehnic,
particulele fazei staionare posed pori de diferite dimensiuni astfel nct moleculele mari
sunt excluse. Solviii sunt astfel separai pe baza greutii moleculare i a dimensiunilor;
moleculele mari sunt primele eluate (extrase) din sistem.
5. Cromatografia de afinitate
Tehnica este bazat pe specificitatea biologic unic a interaciunilor ligand-receptor
(mecanismul cheie-yal). Ligandul este cuplat covalent cu matricea care formeaz
materialul de tapetare a coloanei. Separarea are loc dup ce macromoleculele devin
specific dar nu ireversibil cuplate ligandul. Eluarea are loc prin modificarea compoziiei
sau pHului solventului de extracie (eluent) n scopul diminurii interaciunilor cu
ligandul, facilitnd disocierea i facilitarea extraciei.
Aa cum se observ n imaginea de mai jos, scopul cromatografiei de afinitate este de a
separa moleculele cu o specificitate aparte dintr-un amestec molecular cum este serul
sanguin. De exemplu, anticorpii serici specifici pentru un determinant antigenic pot fi
izolai prin aceast metod (vezi i pricepe figura)
Etapa 1 este cea de pregtire a imunosorbentului. Acesta const dintr-o matrice solid la
care antigenul (marcat cu albastru n figur) a fost cuplat (de obicei covalent). Matricea
const de obicei din agaroz, sefadex, derivai de celuloz sau alte tipuri de polimeri.
Etapa 2. Serul este trecut peste imunosorbent. Att timp ct capacitatea de tranzitare a
coloanei nu este depit, anticorpii din amestec (culoare roie) specifici pentru antigenul
cuplat la matricea fix se vor cupla necovalent i vor fi reinui. Anticorpii nespecifici
(verde) sau alte proteine serice (galben) vor trece nestingherite prin coloan.
Etapa 3. Extracia. Un reactiv este trecut prin coloan pentru a elibera anticorpii de pe
imunoadsorbent. Soluiile tampon care conin o concentraie crescut de sruri i/sau pH
sczut sunt utilizate frecvent pentru a disloca interaciunile necovalente dintre anticorp i
antigen. Un agent de denaturare cum ar fi ureea 8M va determina de asemenea desfacerea

legturii antigen-anticorp prin modificarea situsului de cuplare a antigenului cu molecula

de anticorp.
O metod de extracie mai delicat este splarea coloanei cu o soluie care conine
antigen specific. Acesta va intra n competiie cu imunoadsorbentul pentru situsurile de
cuplare pentru antigen ale anticorpului i va prelua anticorpii n faza fluid.
Etapa 4. Soluia extras va fi dializat pe soluie tampon salin pentru a nltura reactivul
utilizat la extracie.

DE REINUT
Dializa reprezint procedeul de separare a solviilor cu molecul mic sau ionilor (ex.
glucoz sau Na, Cl) de macromolecule (ex. amidon) datorit ratei diferite de difuziune
printr-o membran cu permeabilitate diferenial.
Exemplu: celofanul este o membran perforat de pori mici care permit ionilor i
moleculelor mici s o traverseze dar care exclude moleculele cu greutate molecular
peste 12.000 Da. Dac umplem un rezervor de celofan cu un amestec de amidon i
glucoz i l imersm ntr-un rezervor cu ap pur, moleculele glucidice vor difuza n apa
din mediul nconjurtor pn la stabilirea unui echilibru adic pn cnd concentraiile

sunt egale de ambele pri ale membranei. Datorit dimensiunilor mai mari, moleculele
de amidon nu pot trece prin membrana de celofan.
! Greutatea molecular este suma greutilor atomilor din care este compus molecula.
Unitatea de msur este Da daltonul 1/12 din greutatea unui atom de 12C. Astfel,
greutatea molecular GM sau MW n englez - a apei este de 18 Da.
De ce este att de important a cunoate greutatea molecular a unui compus ?
S apreciem un exemplu simplu i americnesc de concret !
S spunem c suntem responsabili pentru un studiu care se ocup de rspunsul albinelor
de miere la diferite tipuri de zahr. Una din modalitile de rezolvare a acestei probleme
este crearea unor soluii cu diferite concentraii de zaharuri pentru a vedea care sunt
preferate de albine. Ai putea oferi albinelor s aleag ntre o soluie de sucroz 35%
(zahrul de mas) i o soluie 35% glucoz (component natural al mierii). Pentru a realiza
aceste amestecuri ar trebui deci 350 pri pe greutate (ex. grame) de zahar n 650 pri (g)
ap, producnd 1000 g din fiecare soluie. Este ns o problem! Modul de rspuns al
albinelor la prezena zaharului dizolvat n ap este dependent de numrul de molecule
dintr-un volum dat de soluie.
Molecula de sucroz (GM=342) este de aproximativ 2 ori mai grea dect molecula de
glucoz (GM=180). Astfel, o soluie de glucoz 35% va conine aproape de 2 ori mai
multe molecule dect o soluie 35% de sucroz. Pentru a corecta aceast situaie trebuie
compus o soluie cu greutile de sucroz i glucoz n raport de 342:180. n acest caz ar
trebui s avem aceeai concentraie de molecule n fiecare soluie, astfel, pictur cu
pictur, fiecare soluie trebuie s conin acelai numr de molecule.
Dac vom cntri exact 342 g sucroz vom fi cntrit 1 mol de sucroz. Astfel, un mol
reprezint cantitatea de substan a crei greutate n grame este egal cu greutatea
molecular a substanei. Astfel, 1 mol de glucoz cntrete 180 g. dac se dizolv 1
mol de substan n suficient ap pentru a crea 1 litru de soluie, avem o soluie 1 M (1
molar). O soluie 1M ar fi prea concentrat pentru albine. O soluie mai potrivit ar fi cu
34,2g sucroz i 18 g glucoz. Astfel de soluii ar fi deci soluii 0,1M. Considerate
pictur cu pictur, aceste dou soluii conin acelai numr de molecule avnd aceeai
molaritate.
Dar cte molecule sunt ntr-un mol? Aproximativ 6x1023. Acesta este numrul lui
Avogadro. Numrul lui Avogadro se aplic pentru molii oricrei substane sau ion. 1 mol
de H2 are 1g.