Universitatea Bucureşti

Facultatea de Biologie

Studiul interrelaţiilor dintre agenţii infectioşi,

celula eucariotã şi dispozitive protetice în patologia
infecţiilor cardiovasculare

Coordonator ştiinţific: Prof. Dr. Tatiana Şesan

Drd. Biolog Otilia Banu

 PARTEA TEORETICÃ

Lucrarea a urmărit abordarea bacteriilor dintr-un unghi diferit, faţă de cel obişnuit care
studiază bacteriile în stare liberă, în suspensie, şi anume, creşterea şi dezvoltarea acestora în stare
aderată la diferite substraturi celulare şi inerte, cu relevanţă în patologia şi managementul infecţiilor
asociate chirurgiei cardiovasculare.
Fenomenul formãrii biofilmelor este mai puţin cunoscut şi abordat la noi în ţară şi este cu atât
mai important de semnalat atenţiei microbiologilor, mai ales datorită uneia dintre cele mai importante
consecinţe directe ale acestuia, rezistenţa fenotipicã sau comportamentalã la substanţe antimicrobiene
care face biofilmul complet insensibil la dozele uzuale de antibiotice şi bioacizi.
În chirurgia cardiovascularã, eşecurile frecvente în depistarea şi tratamentul infecţiilor se
datoreazã în cea mai mare parte mijloacelor şi metodelor necorespunzatoare de laborator menite sã
permitã identificarea şi testarea sensibilitãţii bacteriilor cu creştere sesilã, implicate atât în etiologia
endocarditelor, cât şi a infecţiilor asociate dispozitivelor protetice.
Infecţiile cardiace implică formarea de biofilme atât pe ţesuturi (endocadita valvulară) cãt şi
dezvoltarea de biofilme pe dispozitive medicale (valve cardiace naturale şi artificiale, catetere centrale
venoase, catetere urinare). Prin urmare, studiul relaţiilor dintre agenţii infectioşi şi celulã eucariotã, pe
de o parte, şi agenţii infectioşi şi dispozitivele protetice, pe de alta parte, reprezintă un deziderat
important, cu rol atât în patologia, cât şi în managementul infecţiilor cardiovasculare.
Capitolul 1 prezintã principalele afecţiuni în patologia infecţioasã cardiovascularã şi
manifestãrile clinice ale acestora: endocardita infecţioasã (EI) şi complicaţiile cardiace şi
extracardiace ale endocarditei infecţioase, precum şi infecţiile asociate dispozitivelor protetice non-
valvulare.
Capitolul 2 descrie agenţii etiologici microbieni ai infecţiilor cardiovasculare şi factorii de
virulenţã implicaţi în procesul infecţios. Microorganismele implicate în apariţia EI la adult sunt
reprezentate de specii de streptococi, stafilococi, enterococi, bacili Gram negativi şi bacterii din
grupul HACEK, în schimb etiologia microbianã a infecţiilor asociate dispozitivelor protetice non-
valvulare este dominată de Streptococcus aureus, S. epidermidis, bacili Gram negativi şi Candida spp.
Factorii de virulenţă ai acestor agenţi bacterieni sunt prezentaţi corelat cu etapele obligatorii ale unui
proces infecţios, reprezentate de aderenţa la ţesuturi şi dispozitive protetice, în care sunt implicate
molecule bacteriene denumite adezine şi receptorii de adezine, urmate de agresivitaea sau
invazivitatea microorganismelor patogene, care rezidã în capacitatea acestora de a se localiza,
multiplica şi de a coloniza organismul gazdã pe diferite cãi. Sunt prezentate, mecanismele formării
biofilmelor pe diferite suprafaţe – ţesuturi şi dispozitive protetice utilizate în chirurgia cardiovascularã

2
şi consecinţele acestora: rezistenţa la mecanismele de apărare ale gazdei şi la dozele convenţionale de
antibiotice.
Inducerea apoptozei celulei gazdã de către agenţii infecţioşi bacterieni reprezintă, de
asemenea, o condiţie esenţialã a existenţei patogenilor, pentru depăşirea mecanismelor de apãrare şi
instalarea infecţei la nivelul organismului gazdã. Pentru înţelegerea în profunzime a procesului
infecţios, este necesarã atât identificarea şi cunoaşterea factorilor de virulenţã care favorizeazã
supravieţuirea patogenului, cât şi investigarea mecanismelor de rãspuns ale organismului gazdã.
Bacteriile pot declanşa apoptoza printr-o varietate de mecanisme care includ secreţia de
proteine inhibitorii ale sintezei, proteine formatoare de pori, molecule responsabile de activare a
mecanismelor endogene declanşatoare de superantigene.
Utilizarea pe scarã largã a antibioticelor în domeniul medical, dar şi în alte domenii legate de
activitatea umanã (agriculturã, zootehnie, medicinã veterinarã) a dus la creşterea fãrã precedent a
rezistenţei la antibiotice a bacteriilor, ce se manifestã la unul sau mai multe antibiotice, astfel încât,
constituie adevãraţi markeri de rezistenţã ai bacteriilor cu mare valoare clinicã şi epidemiologicã.
Utilizarea din ce în ce mai frecventă a antibioticelor în tratamentul infecţiilor a avut ca efect apariţia
unui număr tot mai mare de tulpini bacteriene rezistente la un număr tot mai mare de antibiotice.
Odată apărută rezistenţa la antibiotice, gena codificatoare a acestui caracter se poate răspândi la alte
celule prin transferul plasmidelor sau a genelor cromosomale. O bacterie poate purta simultan mai
multe gene de rezistenţă la antibiotice, manifestând fenomenul de multirezistenţă (Acinetobacter spp,
Ps, aeruginosa, K. pneumoniae, S. aureus) aşa cum sunt bacteriile implicate în etiologia infectioasã
cardiovasculatã , care face dificil de realizat procesul terapeutic.
Urmãrind prezenţa markerilor de rezistenţã la diferite tipuri de microorganisme s-au constatat
variaţii semnificative care conduc spre identificãri de tipuri epidemiologice ale tulpinilor bacteriene
mai ales în cazul celor nosocomiale.
Capitolul 3 evidenţiazã principiile actualizate aplicate în diagnosticul şi tratamentul infecţiilor
asociate cardiologiei şi chirurgiei cardiovasculare. In scopul diagnosticãrii corecte a diverselor
afecţiuni cardiovasculare se utilizeazã diferite scheme grupând criterii clinice, microbiologice şi
ecocardiografice (criteriile von Reyn, crieriile Duke, criteriile Duke modificate) având drept scop
facilitarea diagnosticului şi utilizarea acestuia în studii clinice şi epidemiologice. Aceste indicaţii sunt
cuprinse în diverse ghiduri cele mai utilizate fiind ESC - European Society of Cardiology, ACC -
American College of Cardiology şi AHA - American Heart Association.
Diagnosticul presupune demonstrarea implicãrii endocardului, respectiv a dispozitivelor
protetice în cursul unei infecţii sistemice. Spectrul clinic al afecţiunilor cardiovasculare este extrem de
variabil, de la forme fulminante, cu insuficienţã cardiacã acutã, manifestãri embolice, distrugere
rapidã a valvelor cardiace, la forme fruste, cu evoluţie îndelungatã, cu prezenţa sau nu a febrei, cu

3
apariţia sau absenţa manifestãrilor imunologice sau embolice. Având în vedere complexitatea acestei
patologii şi morbi-mortalitatea ridicatã, diagnosticul presupune un indice ridicat de suspiciune clinicã

Scopul şi obiectivele lucrãrii:

Scopul lucrãrii de doctorat este studiul relaţiilor dintre unii agenţi infectioşi cu celula
eucariotã, şi cu dispozitive protetice în prezenţa unor componente serice, în vederea optimizãrii
acţiunii profilactice şi terapeutice a infecţiilor asociate patologiei cardiovasculare.

Obiective:

1. Izolarea, identificarea, studiul antibiorezistenţei şi caracterizarea gradului de virulenţã a

tulpinilor microbiene izolate din infecţii asociate chirurgiei cardiovasculare.
2. Studiul antibiorezistenţei tulpinilor bacteriene şi influenţa unor parametri fizico - chimici
asupra acesteia: compoziţia mediului de culturã, temperatura de incubare, tipul de creştere - în
suspensie sau aderatã la substrat.
3. Studiul formãrii şi dinamicii biofilmelor pe substraturi inerte, sub influenţa concentraţiilor
diferite de antibiotice
4. Sensibilitatea la antibiotice în prezenţa unor componente serice ale gazdei, a tulpinilor
aderate la substrat celular şi inert, izolate din infecţii specifice chirurgiei cardiovsculare.
5. Studiul interacţiunilor celulelor bacteriene cu celulele HeLa.

MATERIALE ŞI METODE

1 Metode de izolare, identificare biochimicã şi evidenţiere a spectrului de factori de

virulenţã la agenţii etiologici ai infecţiilor specifice afecţiunilor cardiovasculare
- Recoltarea produselor patologice specifice chirurgiei cardiovasculare (tehnici cuprinse in
manualul laboratorului);
- Examinarea directã a probelor recoltate (frotiu colorat Gram);
- Determinarea încãrcãturii microbiene a probelor recoltate;

4
 - Izolarea tulpinilor microbiene din biofilmele dezvoltate pe dispozitivele protetice utilizate în
chirurgia cardiovascularã (tehnici cuprinse în manualul laboratorului);
- Identificarea tulpinilor izolate (Sistem Api- Biomerieux; Vitek 2 C);
- Evidenţierea factorilor de virulenţa la tulpinilor izolate din clinicã (1) Demonstrarea
capacitãţii de aderenţa şi invazie a bacteriilor la substratul celular prin Metoda Cravioto adaptatã dupã
Lazãr şi colab., 2003; 2) Teste enzimatice de evidenţiere a prezenţei/absenţei enzimelor .
2. Testarea sensibilitãţii la antibiotice şi a influenţei unor parametri fizico-chimici asupra
acesteia
- Evaluarea in vitro a eficienţei unui antibiotic (Metode calitative (Disc- difuzimetricã, discului
dublu şi E-test) şi cantitative (Diluţii în mediu lichid sau agar, CMI- Vitek) de determinare a
spectrului de sensibilitate la antibiotice.
3. Testarea acţiunii diferitelor concentraţii de antibiotice asupra bacteriilor aderate la un
substrat
- Testarea capacitãţii de aderenţã la substratul inert - testul producerii de slime;
- Determinarea rezistenţei la antibiotice a biofilmului aderat la o suprafaţã inertã;
- Studiul rezistenţei la antibiotice a biofilmului microbian în matricea de agar (Model
experimental - Lazar, 2003).
4. Evaluarea sensibilitãţii la antibiotice a unor tulpini de E.coli în prezenţa unor
componente serice cu rol protector
Substrat celular: linia celulară HeLa;
Antibiotice (pulberi) Oxoid pentru testarea sensibilităţii prin metoda microdiluţiilor în mediu
lichid şi testarea influenţei antibioticelor în asociere cu diferite componente serice specifice sau
nespecifice, asupra capacitãţii tulpinilor de E. coli de a adera la substratul celular şi inert;
Fracţii serice: lizozim, complement C4, IgG, IgA, IgM, ser imun.
Capacitatea de aderenţǎ la substratul celular, reprezentat de celule HeLa, s-a realizat prin
metoda Cravioto, adaptată (Lazãr şi colab., 2003).

5. Studiul in vitro al interacţiunii celulelor bacteriene cu celulele HeLa

- Investigarea calitativã a biofilmelor microbiene prin microscopie (TEM, CSLM, microscopia
cu fluorescenţã);
- Investigarea efectului diferitelor fracţii bacteriene asupra viabilitãţii celulelor eucariote;
- Studiul influenţei diferitelor fracţii bacteriene asupra celulelor HeLa;
- Studiul expresiei citokinelor în celule tratate cu diferite fracţii microbiene, în diferite condiţii
experimentale prin Real Time PCR (RT-PCR).

5
REZULTATE ŞI DISCUŢII

Rezultatele prezentate au derivat în urma unui studiu amplu asupra patologiei infecţioase şi
manifestãrii rezistenţei la antibiotice, la tulpini izolate din probe recoltate de la pacienţii Institutului de
Urgenţã pentru Boli Cardiovasculare „Prof. Dr. C C Iliescu” (IUBCV), în perioada mai 2005-
decembrie 2008. Au fost utilizate date privind testarea sensibilitãţii la 374 tulpini izolate din infecţii
invazive şi localizate, din secţiile de chirurgie cardiovascularã şi terapie intensivã (ATI) cu importantã
clinicã şi epidemiologicã, dintr-un total de 2462 probe pozitive.
Prelevarea de probe biologice s-a realizat, respectându-se principiile de igienă, asepsie,
antisepsie existente în sãlile de operaţie, dar şi în secţiile de terapie intensivã, ţinându-se cont de
legislaţia sanitară în vigoare.
Izolarea tulpinilor microbiene s-a realizat din produse patologice foarte diverse In
urmãtoarea ordine a frecvenţei izolãrii: secreţia trahealã (28,88 %), secreţiile de plagã (14,44%), urina
(12,50%), sânge (11,76%), dispozitive protetice (catetere, tuburi de dren, fragmente de valve,
fragmente din proteze cardiace şi vasculare)(8,40%) , alte produse (lichide pericardic, pleural, sputã,
exsudat faringian/nazal). Diversitatea probelor analizate, reflectă gama largă de infecţii localizate şi
generalizate în care sunt implicate tulpini aparţinând unei mari diversitãţi de genuri şi specii
bacteriene.
Identificarea tulpinilor bacteriene izolate, realizată cu ajutorul galeriilor microtest API 20E,
API 20NE, API STAPH, API NH şi cu sistemul automat Vitek, a permis determinarea apartenenţei la
gen şi specie a acestora).
Patologia infecţioasã cardiovascularã este variatã în ceea ce priveşte etiologia
infecţioasã. Ponderea cea mai ridicatã au avut-o bacilii Gram negativi aparţinând grupului
Enterobacteriaceae şi bacililor Gram negativi non-fermentativi. Se observã însã incidenţa în creştere
a infecţiilor cu stafilococi, S. aureus aflându-se în topul etiologiei infecţiilor de plagã, hemoculturilor
şi dispozitivelor protetice. Stafilococii coagulazo-negativi sunt frecvent izolaţi din hemoculturi şi
dispozitive protetice având ca sursã principalã de contaminare şi infecţie consecutivã, tegumentul.
S-a constatat o incidenţã foarte crescutã a infecţiilor cu Ps. aeruginosa şi Klebsiella
pneumoniae în departamentele de terapie intensivã. Atenţia la detalii, anamneza atentã, un examen
fizic minuţios şi cunoaşterea microorganismelor responsabile de apariţia celor mai frecvente infecţii
nosocomiale, conduc la un diagnostic corect. Se remarcã asocierea evidentã dintre microorganismele
oportuniste, statusul imunologic al pacientului şi factorii de risc reprezenetaţi de portaj şi prezenţa
dispozitivelor protetice, care în urma unei perioade de spitalizare prelungite, duc la iniţierea şi
propagarea infecţiilor nosocomiale.

6
 Evidenţierea şi caracterizarea factorilor de virulenţa implicaţi în aderenţa şi progresia
infecţiei la tulpinile izolate din clinicã a relevat spectre diferite ale factorilor de virulenţã, în funcţie de
apartenenţa taxonomicã a acestor tulpini, şi un grad înalt de patogenitate.
Prezenţa de enzime implicate în invazivitate prin distrugerea integritãţii tisulare precum
gelatinaze, toxine formatoare de pori (hemolizine, lecitinaze, lipaze) la toate tulpinile analizate poate
explica abilitatea acestora de a invada celulele eucariote, de a evada din fagosomi dupã endocitare şi
de a se externaliza din celulele infectate, producând astfel infecţii cu atingere sistemicã.
Rezultatele testãrilor pentru determinarea sensibilitãţii la antibiotice au relevat cã nu existã
antibiotic utilizat în tratamentul clinic cu sensibilitate in vitro de 100%. Cefalosporinele de generaţia a
IV-a (FEP, CPO), beta-lactaminele cu inhibitor de betalactamaze (TTC, TZP, CES), carbapenemii
(ERT, IMI, MEM), glicopeptidele (VA, TEC), lincosaminele (LZD) şi colimicinele (CO, PB) au
pãstrat cea mai bunã eficacitate asupra tulpinilor testate, atât in vitro, cât şi in vivo.
În ceea ce priveşte prezenţa markerilor de rezistenţã pe tipuri de microorganisme s-au constatat
variaţii semnificative care conduc spre identificãri epidemiologice ale tulpinilor bacteriene, mai ales a
celor nosocomiale. Pentru fiecare patogen, mecanismele de rezistenţã şi tendintele rezistenţei
antimicrobiene sunt prezentate mai jos:
La Enterobacteriaceae s-a observat o creştere semnificativã a rezistenţei la aminopeniciline,
cefalosporine de generaţia I, II, III, fluoroquinolone şi aminoglicozide (Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Proteus mirabilis). Creşterea alarmantã a numãrului tulpinilor producãtoare de β-
lactamazã (ESBL) se regãseşte în apariţia rezistenţei la cefalosporine de generaţia a IV-a şi la
inhibitori β-lactaminici. Rãmân încã eficienţi în tratament carbapenemii, care sunt dificil de utilizat,
datoritã costului ridicat. Utilizarea frecventã a penicilinelor şi cefalosporinelor de generaţia I şi a II-a,
în tratamentele infecţiilor cu E. coli a dus la rezistenţa covârşitoare la aceste antibiotice, recomandând
excluderea lor ca opţiune de tratament empiric de lungã duratã. În ultimii ani este evidentã tendinţa
creşterii rezistenţei combinate la cefalosporinele de generaţia a III a, fluoroquinolone şi
aminoglicozide, cu un procent de peste 20%.
La tulpinile de bacili non-fermentativi (Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii-
complex) se constatã o creştere intensã a rezistenţei la peniciline şi cefalosporine, precum şi la
quinolone (10-50%). Folosind întregul arsenal antimicrobian, tot mai multe tulpini de Pseudomonas
aeruginosa şi aproape 90 % din tulpinile de Acinetobacter baumannii-complex au reuşit sã anihileze
chiar şi efectul carbapenemilor (producere de carbapenemaze, pompe de eflux), singurele antibiotice
rãmase eficiente fiind colimicinele. Rezistenţa dobânditã este realizatã prin mai multe mecanisme,
care atunci când funcţioneazã simultan, conferã caracterul de multirezistenţã acestor tulpini.
Infecţiile cu MRSA sunt frecvent asociate cu prelungirea duratei spitalizãrii, S. aureus, fiind cel
mai comun agent infecţios, atât în clinicile IUBCV, cât şi la nivel mondial. Tulpinile de stafilococi

7
(în special S. aureus), izolate în clinicile de cardiologie, prezintã în proporţie de peste 50% meticilino-
rezistenţã (producere de beta-lactamazã, mediatã mec-A). Tot mai des se remarcã prezenţa fenotipului
MLSb (rezistenţã inductibilã la macrolide, lincosamine, streptogramine) şi rezistenţã de nivel înalt la
mupirocin. Glicopeptidele (Vancomicinã şi Teicoplaninã) sunt utilizate pe scarã largã în ultimii ani în
tratamentul infecţiilor nosocomiale ceea ce a dus, la selecţia a douã tulpini de stafilococ -VISA şi douã
tulpini de Enterococcus faecium -VRE (rezistenţã dobanditã VanB). Controlul epidemiologic al
tulpinilor MRSA se poate obţine prin identificarea promptã şi testarea sensibilitãţii la antibiotice a
izolatului bacterian, asociatã cu eliminarea stãrii de purtãtor atât a pacienţilor cât şi a personalului
medical. Astfel se înlãturã substanţial riscul apariţiei complicaţiilor infecţioase şi se previne
rãspândirea agentului infecţios, cunoscut fiind cã profilaxia este mult mai ieftinã şi mai uşor de aplicat
decât terapia.
Pentru S. pneumoniae ponderea tulpinilor rezistente la penicilinã este de peste 50%, iar a celor
rezistente la MLS (macrolide, lincosamide, streptogramine) de 30%. S-a constatat cã rezistenţa
combinatã la cele douã clase de antibiotice atinge un nivel cuprins între 10 şi 20 %.
Diversitatea originii şi etiologiei infecţiilor nosocomiale şi asocierea acestora cu o gamã
foarte largã de localizãri, necesitã realizarea unui diagnostic microbiologic amãnunţit care sã includã
screening-ul mecanismelor de rezistenţã la antibiotice (naturalã şi dobânditã) şi utilitatea folosirii
antibiotipului ca marker epidemiologic.
Influenţa compoziţiei mediului de culturǎ asuprã rezultatelor testãrilor sensibilitãţii la
antibiotice a fost observatã nu numai în cazul bacteriilor planctonice, ci şi al celor aderate, aşa cum
demonstreazã rezultatele obţinute cu ajutorul modelului experimental de devoltare a biofilmelor în
matrice de agar (Lazãr 2003). Mediul de cultivare lichid influenţeazã semnificativ sensibilitatea la
cefalosporinele de generatia a III-a (CTX), valorile CMI obţinute variind foarte mult în cadrul
aceleiaşi tulpini, fapt ce subliniazã necesitatea standardizãrii şi armonizãrii la nivel naţional a
tehnicilor de realizare a antibiogramei cantitative, pentru obţinerea de rezultate reproductibile.
Temperatura de incubare a influenţat variabil sensibilitatea la cefotaxim (CTX) a tulpinilor
testate. Este de remarcat faptul cã la temperatura de +4o C valorile CMI au fost în general mai mici
decât cele obţinute prin incubare la temperatura de 28o C şi, respectiv, 37oC, ceea ce demonstreazã
faptul cã scãderea temperaturii conduce la creşterea sensibilitãţii tulpinilor microbiene la antibiotice,
probabil datoritã modificãrii expresiei anumitor gene în condiţiile limitative de stres termic, mimate în
aceste condiţii experimentale.
Datele experimentale, obţinute prin intermediul model experimental de creştere în matricea de
agar, au arãtat faptul cã dezvoltarea bacteriilor în biofilm conduce la o creştere a rezistenţei la anumite
antibiotice, demonstratã prin reducerea diametrului zonelor de inhibiţie a creşterii, aşa cum se poate
observa în cazul cefotaximului cefalosporine de generaţia a III-a (CTX, CRO) şi imipenem. Deşi

8
creşterea bacteriilor în biofilm determinã scãderea sensibilitãţii la unele antibiotice, aratã creşterea
sensibilitãţii faţã de altele cum ar fi cefoxitinul (FOX -cefalosporina de generaţia a II-a). Acidul
nalidixic (NA), nu difuzeazã în biofilm, ceea ce explicǎ scãderea sensibilitãţii bacteriilor sesile,
comparativ cu a celor planctonice.
Modalitatea colonizãrii in vitro a diferitelor materiale protetice este determinatã de structura
suprafeţelor şi de compoziţia chimicã a materialelor, dar şi de speciile colonizatoare; grosimea
biofilmelor a relevat o colonizare neuniformã, influenţatã de gradul de rugozitate al suprafetelor, ceea
ce semnaleazã importanţa selectarii compoziţiei chimice a dispozitivelor protetice în vederea
prevenirii colonizãrii bacteriene Modelul experimental utilizat a relevat cã bacteriile incluse în
biofilme îşi pǎstreazǎ viabilitatea în prezenţa concentraţiilor de antibiotic chiar superioare CMB şi
aderǎ mai eficient la cateterul venos faţǎ de cel urinar. Cel mai eficient antibiotic, care a inhibat
dezvoltarea biofilmelor atât la concetraţii mari, cât şi la concentraţii subinhibitorii a fost
ciprofloxacinul, quinolona care probabil determinã inhibarea biofilmelor datoritã interferenţei cu
sistemele de semnalizare intercelularã, esenţiale în iniţierea şi mai ales, maturarea biofilmului
microbian. În cazul biofilmelor de Ps. aeruginosa, pe lângã ciprofloxacin, cel mai eficient antibiotic
faţã de celulele crescute în biofilme a fost gentamicina. Efectul inhibitor al acestor antibiotice asupra
capacitaţii de aderenţã a tulpinilor a fost demonstrat şi de imaginile de microscopie electronicã, ce au
arãtat reducerea numarului de celule bacteriene în prezenţa antibioticului.
Antibioticul exercitã o presiune selectivã asupra celulelor incluse în biofilm, împiedicând
atingerea unor densitãţi celulare crescute care sã grãbeascã maturarea şi respectiv dezintegrarea
parţialã a biofilmului, cu diseminare la distanţã a agentului patogen.
Aprecierea cantitativã şi evaluarea dinamicii temporale a gradului de formare a biofilmelor
bacteriene pe suprafaţã de plastic sub influenţa concentraţiei diferite a unor antibiotice, a relevat o
evoluţie linearã o biofilmelor de Ps. aeruginosa (numãr conatant de celule, relativ stabile în timp).
Biofilmele dezvoltate în absenţa antibioticului prezintã un numar maxim de celule la 48h, dupã care
acesta scade brusc, fapt ce demonstreazã maturarea biofilmului cu desprinderea (diseminarea)
celulelor.
Biofilmele de S. aureus au o dinamicã temporalã variabilã, cu intervale diferite de maturare
în funcţie de tulpina testatã (48, 72 sau 96 de ore) cu excepţia creşterii în prezenţa gentamicinei, unde
apare o evoluţie relativ constantã în timp, indiferent de concentraţia antibioticului.
Administrarea antibioticelor, indiferent de concentraţie, nu este eficientã faţã de celulele
bacteriene aderate şi incluse în biofilme. Infecţia devine persistentã şi necesitã prelungirea perioadei
de tratament, cu riscul dobândirii rezistenţei, a toxicitãtii, a disconfortului clinic şi creşterea costurilor
spitalizãrii.

9
 Comportamentul bacteriilor sesile fiind diferit de cel al celulelor planctonice, antibiograma
clasicã nu reprezintã un model de predicţie a spectrului de antibiorezistenţã a biofilmelor. De aceea se
impune necesitatea introducerii unei metode standardizate de testare a sensibilitãţii tulpinilor
bacteriene izolate din infecţii produse de bacterii sesile. Creşterea dozelor de antibiotice (mult
superioare CMB) ramâne ineficientã pentru tratamentul infecţiilor datorate creşterii bacteriilor în
biofilme, o posibilã alternativã fiind utilizarea asocierii optime a douã sau mai multe antibiotice.
Studiile comparative, privind sensibilitatea la antibiotice a celulelor bacteriene incluse în
biofilme experimentale monospecifice, au evidenţiat cã uneori, tulpinile microbiene şi-au modificat
profilul de rezistenţã la antibiotice, modificãrile variind foarte mult, în funcţie de sursa de izolare a
tulpini.
Tulpinile de S. aureus izolate din secreţii de plagã crescute în biofilm suferã conversia de la S
la R la toate antibioticele β-lactamice mai puţin la rifampicinã, şi tetraciclinã, in vitro, s-au dovedit
eficiente faţã de tulpinile crescute în biofilme.
Rezultatele obţinute sugereazã faptul cã administrarea antibioticelor, indiferent de concentraţie, nu
sunt eficiente pe celulele bacteriene aderate şi incluse în biofilme, infecţia este persistentã şi necesitã
prelungirea tratamentului, cu riscul dobândirii rezistenţei la antibiotice, a toxicitãtii, disconfortului
clinic, creşterea costurilor spitalizãrii.
S-a încercat în acest sens găsirea unui model experimental in vitro de evidenţiere a unor
posibile corelaţii între aspectele de antibiosensibilitate bacterianã şi componente serice ale
gazdei (nespecifice tip lizozim, C4 şi specifice tip IgG, IgA, IgM), ser uman, la tulpini izolate din
infecţii specifice chirurgiei cardiovsculare, aderate la substrat celular şi inert. În acest context s-a
studiat influenţa antibioticelor, în concentraţii subinihibitorii (CsI), pe de o parte, şi a diferitelor
componente serice ale gazdei (tip lizozim, C4, IgG, IgA, IgM, ser imun obţinut de la animale
imunizate cu tulpini de E. coli), pe de altã parte, asupra capacitãţii tulpinilor de E. coli de a adera la
substratul celular şi inert. Utilizãrarea modelului experimental a evidenţiat aspecte care ar putea
contribui la intelegerea mai buna a modului cum cresteriea bacterianã în biofilm se opune
mecanismelor de apãrare ale gazdei.
Concentraţiile subinhibitorii (CsI) de antibiotic acţioneazã asupra tulpinilor sensibile,
determinãn trecerea fenotipului de la categoria S la R.
Serul imun, ca şi asocierile dintre componentele serice nespecifice (lizozim, Complement) şi
specifice (imunoglobuline) au inhibiat capacitatea de aderenţã a tulpinii de E. coli sensibilã la
antibiotice (ATCC 25922).
Ceftazidimul în concentraţie subinhibitorie (CsI) a stimulat sinteza adezinelor şi consecutiv
aderenţa la substratul celular, a tulpinii de E. coli, producãtoare de β-lactamaze de spectru larg.

10
 Asocierea CTX în CsI cu unele componente serice, a inhibat capacitatea de aderenţã la
substratul celular, în timp ce Acidul nalidixic (NA) a avut efect de stimulare a aderenţei în şi fǎrǎ
prezenţa opsoninelor.
Asocierea antibioticelor cu componente serice (lizozim, imunoglobuline, Complement, ser
total) a determinat o scãdere severã a capacitãţii de aderenţã la substratul celular, datoratǎ probabil
acţiunii lizozimului asupra peretelui celular, care modificǎ expresia moleculelor de suprafaţǎ, inclusiv
a epitopilor recunoscuţi de moleculele de Ig şi de complement cu rol de opsonine.
Atât antibioticele în CsI, cât şi asocierile de componente serice nu au crescut capacitatea
celulelor bacteriene de a secreta polizaharide extraparietale (slime test), aspect care sugereazã cã
secreţia polizaharidului este unul dintre mecanismele de adaptare comportamentalǎ la diferiţi factori
de stres (antibiotice, molecule antibacteriene).
În prezenţa componentelor serice, a fost observată creşterea capacitãţii de aderenţã, ceea ce
demonstreazã faptul cã rezultatele testelor de sensibilitate la antibiotice obţinute in vitro, pe celule în
suspensie, nu pot fi extrapolate in vivo, datoritã apariţiei fenomenului de aderenţã bacterianã la
substratul celular, aderenţa fiind urmatã de modificarea comportamentului celulelor bacteriene în ce
priveşte sensibilitatea la substanţele antimicrobiene.
Celulele bacteriene, consecutiv aderenţei, induc efecte multiple în celulele HeLa. Efectele
metabolice constau în sinteza citokinelor, modificarea citoscheletului şi apoptozã. În acest context s-a
urmarit evidenţierea localizãrii intracelulare a unor tulpini de S. aureus şi Ps. aeruginosa în celule
HeLa şi investigarea efectului diferitelor fracţii de culturã ale S. aureus asupra proliferǎrii celulare,
ciclului celular (analiza prin citometrie în flux) şi inducerea apoptozei celulei gazdã (kitul Anexin V-
FITC-PI) precum şi inducerea expresiei citokinelor (real-time PCR).
A fost demonstrat faptul că bacterii considerate până nu de mult „prototipuri” ale infecţiilor
extracelulare, cum ar fi Staphylococcus aureus şi Pseudomonas aeruginosa sunt capabile să se
internalizeze şi să se multiplice în celule nefagocitare, producând reorganizarea scheletului
citoplasmatic care favorizeaza internalizarea asemãnãtor fagocitelor (macrofage, celule dendritice).
Flosind metode cantitative şi calitative de evidenţiere a capacitãţii de aderenţã şi invazie s-a
observat valori foarte ridicate ale aderenţei pentru tulpinile ambelor specii bacteriene.Valorile
invaziei sunt diferite în funcţie de tulpinã, însã, semnificative, demonstrând capacitatea acestor
bacterii de a invada, consecutiv aderenţei, celulele organismului gazdã. Examinarea nivelului de
fluorescenţã a celulelor HeLa infectate cu S. aureus, evidenţiazã schimbãri la nivelul membranei
celulare cu expunerea unor regiuni mascate sau criptice, aspect care demonstreazã posibila existenţa a
unui proces de endocitozã. Rezultatele obţinute sunt, în concordanţã cu date din literatura de
specialitate, care au demonstrat supravieţuirea intracelularã a stafilococilor în celulele mamaliene
nefagocitare, demonstrând necesitatea creãrii unor noi modele pentru studiul stadiilor infecţiei,

11
inclusiv cel intracelular. S. aureus, contribuie fãrã dubiu, la menţinerea rezervorului de infecţie în
organismul gazdã, mai ales în prezenţa unei presiuni selective exercitate de componentele serice ale
gazdei şi amplificate de administrarea excesivă de antibiotice, în special a celor active faţã de
bacteriile extracelulare. În acest mod se urmãreşte gãsiriea, de strategii eficiente de prevenire a
infecţiilor persistente cu S. aureus.
Evaluarea cineticii celulare prin citometrie de flux a arǎtat cǎ în prezenţa corpilor bacterieni
are loc creşterea fazei S în celulele HeLa şi scǎderea pronunţatǎ a fazelor G2/M.
Cu referire la inducerea expresiei citokinelor (cuantificatã prin real-time PCR), rezultatele au
arãtat cã expresia TNF, IL-1b, IL-6 şi IL-8) în celulele HeLa este crescutã de fracţiile bacteriene, în
principal în prezenţa fracţiilor bacteriene solubile, care au manifestat şi un efect pro-apoptotic. Aceste
date sugereazã cã moleculele bacteriene solubile, induc schimbãri în celula eucariotã, care fac posibilã
cronicizarea infecţiei cu S. aureus şi localizarea în compartimentul intracelular.
Aceste ultime rezultate deschid noi perspective de studiu pentru elucidarea mecanismelor de
semnalizare intracelulară şi a rãspunsului celulei gazdã implicat în aceste mecanisme, precum şi al
rolului componentelor bacteriene specifice în activarea celulelor eucariote.

12