CITOMETRIA DE FLUX

CE ESTE CITOMETRIA DE FLUX?

Metod de msurare a caracteristicilor fizice i/sau biochimice ale particulelor (celule, nuclei, organite celulare):

Mrimea Granularitatea Cantitatea de ADN Antigene de suprafa

Metod de sortare a celulelor

ETAPE
1.

Prepararea suspensiei de celule Marcarea celulelor Achiziia datelor Stocarea datelor Interpretarea datelor

2.

3.

4.

5.

PRODUCEREA ANTICORPILOR MONOCLONALI

Antigen Fuzionarea celulelor HIBRIDOM

Mielom

Plasmocite producatoare de Ac Cultivarea hibridoamelor

Testarea clonelor

Hibridoamele se separa si se cultiva Mentinerea hibridoamelor in soareci

Clonele dorite se cultiva sau se congeleaza Anticorpii monoclonali sunt purificati

FLUOROCROMII

AcM sunt conjugai cu fluorocromi Spectru de absorbie (excitaie) Spectru de emisie Pentru 2 parametri 2 AcM cuplai cu 2 fluorocromi cu spectre de emisie diferite:

Izotiocianat de fluorescein (FITC) Phycoeritrin (PE)

IMUNOFLUORESCENA

Numar de evenimente

FITC FITC

FI TC

FITC
FI TC

FITC

TC FI

101

102

103

Intensitatea fluorescenei

FITC

FITC

FIT C

104

COMPONENTELE CITOMETRULUI DE FLUX

Sistem fluidic Sistem optic Sistem electronic

SISTEMUL FLUIDIC

Celule aflate n suspensie:

Lichid de nveli Curent intern unicelular ir indian Intersectare cu un fascicul de lumin

Snge Lichid sinovial LCR Ganglioni limfatici Tumori solide

SISTEMUL FLUIDIC
Ac de injecie
Camer de scurgere Lichid de nveli

Flux laminar

SISTEMUL OPTIC DE EXCITAIE

Sursa laser (Ar =488 nm) Fascicul luminos dispersie i stimularea fluorocromilor Dispersia luminii:

=0 Forward Scatter (FS) dimensiunea =90 Side Scatter (SS) granularitatea ~ cantitatea de fluorocromi info calitative i cantitative

Emisia luminii fluorescente:

Elemente optice de focalizare (lentile)

FS I SS
Forward Scatter LASER

LASER

Side Scatter

SISTEMUL OPTIC DE COLECTARE

Conversie semnal optic semnal electronic Detectori pentru:

Lumina dispersat: n fa, lateral Emisia de fluorescen Filtre optice

CITOMETRUL DE FLUX

SISTEMUL ELECTRONIC

Recepionarea impulsurilor detectorilor Prelucrarea semnalului Prezentarea rezultatelor:

Histograme 1 parametru Grafice 2 parametri: 1 punct = 1 particul (dotplot)

ELEMENTE FIGURATE

GRAFIC DOT-PLOT PENTRU FITC I PE

PE+ FITC+ / PE+

PE FL

FITC- / PE-

FITC FL

FITC+

FITC / PE

SORTAREA CELULELOR

Separarea unei (sub)populaii celulare dintrun amestec:

Mrime Granularitate Antigene de suprafa

SORTAREA CELULELOR ETAPE

1. 2. 3. 4. 5.

6.

Identificarea criteriului Marcarea cu AcM+fluorocromi Identificarea celulei e de interes? ncrcare cu sarcini pozitive/negative/fr Cmp magnetic deflectare spre tuburi colectoare Centrifugare

SORTAREA CELULELOR

LASER 488 nm

Senzor FS Detector de fluorescen

Plci ncrcate magnetic

Tuburi de colectare

APLICAII

Analiza subpopulaiilor limfocitare Diagnosticul hemopatiilor maligne Biologie celular Identificarea unor molecule HLA Determinarea unor autoanticorpi Studiul ciclului i al funciilor celulare Diagnosticul, evoluia, prognosticul tumorilor maligne solide Microbiologie

ANALIZA ADN
G2 M
G1
E v e n i m e n t e
0 200

G0 G0G1

s
400 600

G2 M
800 1000

4N 2N Cantitatea de ADN

ANALIZA ADN
E v e n i m e n t e
300 0 75 150 225

200

400

600

800

1000

2N

4N

Fluorescen PE

ANALIZA ADN
300

E v e n i m e n t e

Index ADN 1,21

225

Peak aneuploid
150 0 0 75

200

400

600

800

1000

Fluorescen PE