Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

CAP. 3. INGINERIE GENETIC BACTERIAN Ingineria genetic cuprinde tehnici efectuate n vitro cu gene, cromozomi sau celule ntregi n scopul construirii unor structuri reprogramate genetic. Cuprinde o inginerie genetic celular reprezentat de fuziunea de protoplati i o inginerie genetic molecular reprezentat de tehnologia ADN recombinant. Tehnologia ADN recombinant reprezint un ansamblu de metode prin care se realizeaz n vitro, molecule de ADN recombinante, permitnd, clonarea unor gene de origini diferite, att n celula procariot ct i n celula eucariot. Realizarea acestei tehnologii presupune construirea unor vectori de clonare, izolarea unor gene de interes (denumite iniial ADN pasager, n prezent, ADN heterolog) i utilizarea unui echipament enzimatic corespunztor: endonucleaze de restricie, ADN ligaze, polimeraze, exonucleaze, fosfataze alcaline, revertranscriptaze, terminaltransferaze, etc. 3.1. Vectori utilizai n clonarea genetic la Escherichia coli Vectorii reprezint molecule de ADN n interiorul crora se introduc fragmentele de ADN de studiat (ADN pasager, heterolog), ce poate fi de origine pro- sau eucariot. Vectorii pot fi clasificai n funcie de diferite criterii: a) posibilitatea studierii exprimrii fragmentelor de ADN pasager, vectorii se mpart n: vectori de clonare - nu au n structur secvene de tip promotor i, ca atare, permit doar clonarea unor fragmente de ADN pasager, dar nu i analiza exprimrii acestora, i vectori de exprimare (implicit i de clonare) - au n structur secvene de tip promotor, permind att clonarea, ct i analiza exprimarii fragmentului clonat. b) tehnica de clonare folosit, vectorii pot fi: vectori de clonare inserional - ADN pasager este clonat prin inserie la un situs unic de restricie din vector i vectori de clonare prin inlocuire (substituie) - ADN clonat inlocuiete un fragment din vector, n urma digestiei cu 2 endonucleaze de restricie. c) structura i modul de funcionare, vectorii se mpart n: vectori plasmidiali (sunt derivai din, i au structur de plasmide); vectori virali (sunt derivai din, i au structura de genom viral ); vectori hibrizi - fagimide (au structur hibrid, de genom de fag filamentos i de plasmid) i cosmide (au structur hibrid, de genom de fag i de plasmid). d) spectrul de gazde, exist vectori: vectori congenerici (pot fi folosii doar la tulpini ale aceluiai gen taxonomic) i vectori shuttle (navet, suveic) - se replic stabil n, i pot fi folosii n tulpini aparinnd la dou genuri microbiene, de exemplu: Escherichia/Pseudomonas, Escherichia/Saccharomyces etc. 3.1.1. VECTORI DE CLONARE PLASMIDIALI Proprietile plasmidelor ca vectori de clonare Pentru a putea fi folosite ca vectori de clonare, plasmidele necesit o serie de caracteristici: a) S nu conin gene tra, deci s nu genereze proces de conjugare bacterian i, ca atare, s nu fie autotransmisibile. Aceast caracteristic este esenial att, pentru diversele etape de cercetare, ct i pentru securitatea cercettorului (foarte muli vectori de clonare plasmidiali prezint ca markeri de selectie gene de rezistent la antibiotice, iar dac vectorii ar fi autotransferabili ar exista/crete riscul ca gene de antibiorezistent s ajung n diverse microorganisme patogene). b) S conin situsuri unice pentru un numr ct mai mare de endonucleaze de restricie (la acest nivel se efectueaz insertia ADN pasager). c) Situsul de inserie s nu fie localizat n genele implicate n replicarea i partiia plasmidului. d) S prezinte markeri genetici abseni n celula receptoare. e) S aiba o greutate molecular mic, pentru a fi uor de izolat i de manipulat. f) S prezinte ct mai multe copii per celul. Primul plasmid natural care a fost folosit n experimente de clonare genetic este plasmidul Col E1 de la Escherichia coli (Fig.3.1.) Acest plasmid are o greutate molecular de 4.6 x 106 Da, este neconjugativ, produce colicina E1 i confer gazdei imunitate la aceast colicin. Selecia celulelor transformate (care au primit plasmidul) pe baza acestui marker (imunitatea la colicina) este o tehnic dificil i, n final, reprezint un dezavantaj al folosirii acestui plasmid n experimentele de clonare genetic. Pe de alt parte, plasmidul Col E1 poart i gene mob care i confer capacitatea de transfer n trans, n prezena unui alt conjugon. Ca urmare, exist riscul diseminarii necontrolate a plasmidului Col E1 recombinat.

Cap. 3-1 Vectori de clonare

Ulterior, au fost folosite alte plasmide naturale pSC101 i pRS2124 - care, datorit genei de rezisten la tetraciclin i, respectiv, rezisten la ampicilin, permit o selecie mai uoar a transformanilor. n urma unor asemenea testri a plasmidelor naturale, s-a concluzionat c este necesar construcia unor plasmide artificiale, destinate exclusiv experimentelor de clonare. n cele ce urmeaz vom prezenta cteva asemenea plasmide artificiale utilizate ca vectori de clonare.

Fig.3.1. Plasmidul Col E1.

Vectorul pBR322
Fig.3.2. Vectorul pBR322.

Vectorul pBR322 (Fig.3.2.) este un vector plasmidial cu o lungime de 4361 bp (2.6 x 106 D). n construcia lui s-au folosit genele de replicare plasmidial din ColE1, fapt pentru care acest vector desfoar o replicare pe acelai model cu ColE1: replicare realizat de ADN polimeraza I (i nu ADN polimeraza III, ca n cazul replicrii cromosomului bacterian), n control relaxat, cu reglaj realizat de molecule de ARN antisens stabilizate de proteina Rop. Acest sistem prezint avantajul c, atunci cnd tulpin gazd este cultivat n prezen unei concentraii mari de cloramfenicol (170 g/ml) - antibiotic ce inhib ntreaga proteosintez din celula respectiv replicarea cromosomului bacterian este blocat (ntruct necesit biosinteza continu de ADN polimeraza III), dar se poate desfaura replicarea vectorului, proces realizat de ADN pol I (aceast enzim este prezent n mod continuu n celula n cantitate foarte mare). n acest mod, are loc de fapt o amplificare genetic prin creterea numrului de copii plasmidiale per echivalent molar cromosomial. Vectorul are 2 markeri genetici - 2 gene de rezisten la ampicilin i, respectiv, la tetraciclin, ce sunt transcrise n direcie invers una de cealalt. Situsurile de restricie importante pentru experimentele de clonare sunt: Pst I - n gena Apr Hind III, BamH I, Sal I - n gena Tcr Strategia de clonare n vectorul pBR322 i derivaii si (Fig.3.3.) 1 - Insertia ADN pasager construcia vectorului recombinat ADN pasager va fi inserat ntr-unul din situsurile de restricie din cele 2 gene de antibiorezistent (Apr, Tcr) : (1) ambele molecule (vector i ADN pasager) se supun digestiei cu o aceeai enzima de restricie, ceea ce va conduce la obinerea de capete complementare; (2) se amestec cele 2 tipuri de molecule (n anumite proporii molare) astfel digerate (n prealabil, vectorul linearizat este tratat cu fosfataz alcalin pentru a evita recircularizarea lui); (3) se adaug i o ADN ligaza (de E.coli sau de T4, funcie de tipul de capete obinute - netede sau coezive) ce va reface legturile fosfodiesterice rezultnd vectorul recombinat . n funcie de endonucleaza de restricie folosit la digestie, vectorul pBR322 recombinat va avea una din cele 2 gene de rezisten (Tcr sau Apr) inactiv. Prin aceast inactivare inserional pot fi deosebite moleculele de vector nerecombinat, fr ADN pasager (Apr Tcr) de moleculele de vector recombinat, cu ADN pasager inserat (Apr Tcs sau Aps Tcr). 2 - Propagarea vectorului recombinat n tulpini de E.coli i selecia celulelor transformate Vectorul recombinat se introduce (prin tehnici de transformare genetic n vitro) ntr-o tulpin bacterian ce trebuie s prezinte sensibilitate la ambele antibiotice (Aps Tcs). Celulele transformate vor prezenta fenotip Apr Tcs sau Aps Tcr. 2

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

Fig.3.3. Schema clonarii moleculare n vectorul pBR322.

n ultimii ani, principalele tendine n construcia vectorilor plasmidiali sunt: (I) reducerea la maximum a dimensiunii vectorilor i mrirea capacitii lor de a accept ADN heterolog; (II) creterea numrului de situsuri de restricie i distribuirea lor ntr-un cluster = PolyCloning Site (PCS); (III) ncorporarea n vectori a unor secvene ce permit identificarea celulelor cu vectori reconbinani prin teste ct mai simple i mai rapide : selecie direct (sisteme ce permit numai creterea clonelor recombinate) sau selecie prin teste histochimice; (IV) introducerea n vectori a unor secvene ce permit generarea de molecule monocatenare necesare tehnicilor de secveniere sau de construcie de sonde ADN; (V) introducerea n vectori a unor secvene de tip promotori, terminatori, enhanceri,ce permit transcrierea n vitro a ADN clonat (pasager).

Vectorii pUC 18/19 pUC 18/19 (Fig.3.4.) sunt vectori doar de clonare, nepermind i exprimarea ADN clonat. Au o dimensiune de 2.69 kb.
Fig.3.4. Vectorul pUC 18/19.

Aceti vectori au regiunea ori din Col E1, cu diferena ca a fost scoas gena rop. Ca atare, aceti vectori sunt prezeni n mod obinuit ntr-un numr foarte mare de copii per celul i prezint un potenial crescut de amplificare prin tratament cu cloramfenicol. Aceti vectori au 2 tipuri de markeri genetici: gena Apr - caracter pe care se bazeaz selecia iniial (screeningul) a celulelor ce poart vector; gena lacZ- este o gen defectiv ce al exprim doar captul NH2-terminal galactozidazei; Aceast gen incomplet este capabil de complementaie intra-alelic cu o alt form defectiv a genei lacZ (ce codific captul COOH-terminal al -galactozidazei) dintr-o gazd bacterian adecvat. n urma procesului de complementaie, tulpina bacterian defectiv dar purttoare a vectorului nerecombinat este capabil s refac integral galactozidaza. Sub inducia IPTG (isopropil-tio-D-galactosid, care este un inductor al genei lacZ), o asemenea tulpin formeaz colonii albastre pe un mediu ce contine X-gal (5-Br-4-Cl-3-indolil-D-galactosid). 3

Cap. 3-1 Vectori de clonare

Inseria unui ADN heterolog n situsul de policlonare (PCS, MCS) - care este inclus n promotorul lui lacZ - determin imposibilitatea exprimrii genei lacZ i, ca atare, gena lacZ defectiv din cromosomul gazdei nu mai este complementat de cea din vectorul recombinat i, ca urmare, nu se mai formeaz galactozidaza activ care s scindeze complexul X-gal cu formarea compusului indolic albastru. Coloniile ce poarta vectorul recombinat au culoarea alb. Este cea mai folosit variant histochimic de selectie a clonelor recombinate. Vectorii pUC18/19 reprezint prima familie de vectori de clonare la care situsurile pentru endonucleazele de restricie au fost grupate ntr-o singura zon a vectorului, denumita situs de policlonare (PCS = PolyCloning Site ; MCS = MultiCloning Site). n pUC18/19, PCS contine situsuri pentru 10 endonucleaze de restricie i pentru 3 enzime izoschizomere. PCS este n orientare invers n pUC19 fa de pUC18. Clonarea n acest situs determin tot o inactivare insertional (o gen din vector nu se mai exprim), diferen ns fa de vectorii de clonare anteriori (pBR322, pBR325, pUB110) constnd n posibilitatea identificrii rapide, directe, a clonelor recombinate, pe baza diferenei de culoare dintre colonii (colonii albastre = celule ce poart vector nerecombinat ; colonii albe = celule ce poart vector recombinat). Vectorii a cror derivai recombinai se bazeaz pe acest sistem de identificare histochimic (complementaia intra-alelica ntre 2 gene defective lacZ, una cromosomial i cealalt pe vector), necesit a fi introdui n gazde bacteriene adecvate, care s aibe pe cromosom o gen lacZ defectiv ce codific capul COO - terminal al galactozidazei. Strategia de clonare n vectorii pUC18/19 i derivaii si a Inseria ADN heterolog n situsul de policlonare se realizeaz prin aceleai etape ca i n cazul vectorilor anteriori: digestia vectorului i a ADN heterolog cu aceeai endonucleaz de restricie (sau cu enzime izoschizomere), amestecarea fragmentelor i, respectiv, adugarea unei ADN-ligaze; b - Introducerea vectorului recombinat n tulpini bacteriene adecvate (au pe cromosom o gena lacZ defectiv ce complementeaz gena lacZ . Selectarea clonelor celulare cu vector recombinat se realizeaza n 2 etape: 1 - cultivare pe mediu cu Ap i screeningul clonelor ce poart vector (Apr) 2 - cultivarea acestor clone celulare pe mediu cu IPTG i X-gal i selecia coloniilor ce poart vector recombinat (= colonii albe)

VECTORII pGEM
Fig.3.5. Vectorul pGEM 3/4.

Vectorii pGEM (Fig.3.5., Fig.3.6.) sunt vectori plasmidiali de exprimare care confer, deci, i posibilitatea analizei exprimrii ADN heterolog. n structura lor intr urmtoarele regiuni: (1) regiunea ori din plasmidul Col E1, ce controleaz replicarea vectorului; (2) Apr = gena de rezistena la ampicilin, pe baza creia sunt selecionai transformanii; (3) regiunea PCS care conine situsuri pentru 10 endonucleaze de restricie + 3 enzime izoschizomere; (4) doi promotori, din fagii SP6 i T7, care flancheaz regiunea PCS i care sunt n orientare invers unul fat de celllt, permind transcrierea ambelor catene ale ADN heterolog. Vectorii pGEM 3/4 (Fig.3.5.) au o dimensiune de 2.87 kb i difer intre ei prin orientarea situsurilor de restricie n cadrul regiunii PCS. Vectorii pGEM 3Z/4Z (Fig.3.6.) conin n plus fa de variantele 3/4 i o gen defectiv lac Z identic cu cea din vectorii pUC 18/19, permind deci selecia histochimic a clonelor recombinate.

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

Fig.3.6. Vectorul pGEM 3Z/4Z.

3.1.2. VECTORI DERIVAI DIN FAGI FILAMENTOI Fagii filamentoi (M13, f1, fd, Pf1) au genomul format dintr-o molecul ADN m.c. circular nchis, cu greutate molecular medie de 2 x 106 D. Dup ptrunderea n celula bacterian, ADN fagic iniiaz ciclul de replicare cu ajutorul unei forme intermediare de replicare dublu catenare. Replicarea se face dupa modelul cercului rotativ i are ca rezultat formarea unui mare numar de catene ADN, notate prin conventie - catene (catena infectant este notat cu +). Aceste catene vor servi ca matria n transcrierea genelor fagice. M13 este un fag filamentos specific pentru Escherichia coli. Are genom ADN m.c. (6.4 kb) cu omologie mare cu genomul fagilor f1 i fd. 90% din genom este reprezentat de gene ce codific proteine. Aceste gene sunt separate ntre ele doar prin cteva nucleotide, singurele regiuni intergenice mai extinse sunt ntre genele VIII i III (IG 2), i respectiv, ntre II i IV (IG 1). Replicarea fagului M13 are loc pe modelul descris mai sus i este realizat de ADN polimeraza I a gazdei bacteriene. Dup sinteza catenei (i, deci, formarea intermediarului dublu catenar de replicare), catena + este nickat i, n continuare, este sintetizat catena + pe matri . Ceea ce rezult este o caten + foarte mare, un concatemer format dintr-un mare numr de genomuri fagice. Ulterior, aceast molecul va fi scindat n genomuri individuale. Toate genele din fagii filamentosi sunt eseniale i, ca atare, vectorii derivai din acesti fagi trebuie s prezinte toate genele fagilor slbatici. Exista totui o regiune de 500 nucleotide, situat intre genele II i IV, n care poate fi inserat ADN heterolog. Vectorii din seria mp (dintre care cei mai folositi sunt M13 mp 18/19 - 7.5 kb, Fig.3.7.) sunt derivai dintr-un fag M13 recombinant (M13 mp1), care are un mic fragment de ADN din vectorul pUC 18/19 inserat n principala regiune intergenica (IG 1). Acest fragment de ADN de E.coli cuprinde : 1. gena lac I = gen ce codific represorul operonului Lac 2. gena lac Z = gena lac Z defectiv, ce codific captul NH4-terminal al galactozidazei 3. situsul PCS = situs de policlonare Aceste secvene permit identificarea clonelor celulare infectate cu vector recombinat folosind acelai sistem histochimic, bazat pe complementaia intra-alelica a celor 2 gene lac Z defective (una pe cromosom, cealalt pe vector) i, respectiv, pe blocarea transcrierii de la promotorul lac prin inseria ADN heterolog. Diferena ntre M13 mp 18 i varianta 19 const n orientarea situsurilor de restricie n cadrul PCS. n procesul de infectare a unei celule bacteriene de catre un fag M13 este esenial etapa de interaciune dintre fag i pilii de sex ai celulei bacteriene. Ca atare, n experimentele de introducere a unui vector M13 - derivat recombinat ntr-o tulpin bacterian este necesar folosirea tulpinilor bacteriene F +, iar de regul se folosesc tulpini F . n afar de acest caracter, tulpinile bacteriene folosite trebuie s mai aib urmatoarele caractere : (I) lacZM15 = o gen lac Z mutant n care a fost deletat regiunea ce codific capul NH4terminal al galactozidazei. Astfel, secvena lacZM15 codific pentru capul COO 5

Cap. 3-1 Vectori de clonare

terminal al galactozidazei i este capabil s desfoare complementaie cu gena lac Z de pe vector, restaurnd activitatea normal a acestei enzime. (II) (lac-proAB) = deleia unui segment cromosomal ce include celelalte gene ale operonului Lac, precum i genele proAB implicate n biosinteza prolinei. Genele proAB exist ns pe episomul F, complementnd deleia cromosomal i asigurnd meninerea episomului F n celula respectiv. (III) (III) lac I q = o gen lac I mutant ce sintetizeaz de aproximativ 10 ori mai mult represor Lac I dect forma salbatic, represnd astfel i mai mult exprimarea operonului Lac, care este oricum la un nivel sczut de transcriere n absena inductorilor. }i aceast gen este de regul localizat pe episomul F . (IV) (IV) hsdR17 i hsdR4 = mutaii ce conduc la pierderea activitaii de restricie a ADN strin de celula respectiv, dar nu i a activitaii de modificaie desfaurat de sistemele enzimatice de restricie/modificaie de tip I. Astfel, ADN heterolog nemodificat (nemetilat) clonat direct n vectori derivai din fagul M13 i propagat n tulpini bacteriene ce poart asemenea mutaii va fi modificat (metilat) de ctre enzimele gazdei i, deci, protejat mpotriva proceselor de restricie n cazul clonrilor ulterioare n alte tulpini hsd +. Cteva exemple de asemenea tulpini bacteriene sunt: E.coli JM 105, 107, 109, 110, XL1-Blue. Strategia de clonare n vectorii M13 mp 18/19 n experimentele de clonare n aceti vectori, de regul, un fragment de ADN heterolog este clonat n ambele variante: i M13 mp 18, i M13 mp 19. 1- Inseria ADN heterolog n vector - forma replicativ (RF), dublu-catenara, a vectorilor M13, mp 18 i 19, se supune digestiei cu 2 endonucleaze de restricie; vectorii astfel linearizai nu se pot recirculariza dect cu capete compatibile cu cele aleADN heterolog. - ADN heterolog se supune i el digestiei succesive cu aceleai 2 enzime de restricie; - ADN heterolog se amesteca separat cu fiecare din cei 2 vectori linearizai i se adaug o ADN-ligaza; Rezult 2 tipuri de vectori recombinani, care au ADN heterolog inserat n orientari opuse.
Fig.3.7. Vectorul M13 mp 18/19.

3.1.3. VECTORI DE CLONARE HIBRIZI DE TIP FAGIMIDE Fagimidele sunt vectori hibrizi ce combin caractere de plasmide cu caractere de fagi filamentoi. Caracterele de plasmide: au o origine a replicrii din ColE1, segment ce asigur replicarea de tip cerc rotativ i meninerea vectorului n forma plasmidial; au o gen de rezisten la antibiotic, caracter selectabil n tulpinile bacteriene ce poart acest vector. Caractere de fag filamentos: au regiunea intergenica majora (IG 1) dintr-un fag filamentos. Aceast regiune conine toate secvenele necesare n cis pentru ntreaga replicare a vectorului pe modelul replicrii fagilor filamentosi i pentru morfogeneza particulelor virale. Datorit acestor caractere duale, fagimidele pot fi propagate i meninute n forma plasmidial n tulpin bacterian gazd atunci cnd aceasta este cultivat n condiii obinuite, standard. Cnd celulele gazd sunt infectate cu un fag filamentos helper, atunci modul de replicare a vectorului se schimb sub aciunea produsului genei II (endonucleaza II) codificat de virusul helper. Acest produs interactioneaz cu regiunea intergenic din vector, iniiind replicarea pe modelul fagilor filamentoi i genernd astfel monocatene ADN ce vor fi apoi clivate, circularizate i mpachetate n particule fagice. ADN m.c. purificat din aceste particule n experimente de secveniere sau pentru obinerea de sonde ADN m.c. Actualmente se folosesc ca virusuri helper n asemenea experimente, virusuri cu genom modificat prin manipulri genetice (de exemplu, M13 K07), astfel nct nu pot genera propriile particule fagice i au gena II mutant ce acioneaz mai bine pe IG din fagimid dect pe IG propriu. Cei mai reprezentativi vectori de clonare de tip fagimide sunt pUC 118/119 i pBluescript.

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

Vectorii pUC 118/119

Fig.3.8. Vectorul pUC 118/119.

Aceti vectori (Fig.3.8.) au o dimensiune de 3.2 kb i sunt, de fapt, vectori hibrizi din categoria fagimidelor. Fagimidele sunt vectori hibrizi ce au 2 origini de replicare: una (ori-Col E1) care genereaz replicare de tip plasmidial (de regul, mecanismul rolling circle) i una (dintr-un fag filamentos, oriM13 sau f1) care genereaz replicare de tip fag filamentos, adic genereaz monocatene. Monocatenele sunt ulterior folosite n experimentele de secveniere ADN, sau ca sonde ADN m.c. ADN clonat n fagii filamentoi s-a dovedit a fi instabil n timp (cu ct este mai mare fragmentul, cu att mai instabil), suferind deleii i rearanjamente. Astfel, avantajul major al fagimidelor l reprezint posibilitatea pstrrii ADN heterolog inclus ntr-un ADN circular i, ca atare, ADN clonat este mult mai stabil (nu apar deletii, rearanjamente). Pe de alt parte, pUC 118/119 pot accepta ADN heterolog mult mai mare dect pUC 18/19. Ca i pUC 18/19, varianta 118/119 au ori-Col E1 fr gena rop. Poart gena Apr pentru screeningul clonelor transformate i gena lacZ pentru selecia histochimic a clonelor recombinate. Situsul PCS este inclus n promotorul genei lacZ (Plac) i, ca urmare, clonarea va bloca transcrierea genei lacZ. Strategia de clonare n vectorii pUC 118/119 a - Insertia ADN heterolog n vector se realizeaz dup aceleai etape ca i la vectorii anterior prezentai. c - Introducerea vectorului recombinat n celule bacteriene se efectueaza tot prin tehnici de transformare genetic microbian. Screeningul i selecia clonelor recombinate se efectueaza n acelai mod ca i n cazul vectorilor pUC 18/19.

Fig.3.9. Vectorul pBluescript.

Vectorul pBluescript Vectorii din seria pBluescript (Fig.3.9.) sunt vectori de tip fagimide, multifuncionali, construii pentru a simpifica clonarea molecular i analiza genetic. Asemenea vectori ofera urmtoarele avantaje n experimentele de clonare : clonare multipla n PCS (Tab.3.1); selectie histochimic a clonelor recombinate (colonii albe); transcriere n vitro a ADN heterolog, mediat de promotorii T3 i T7; obinere de monocatene ADN; exprimarea de proteine de fuziune (cu galactozidaz) 1. Replicarea vectorului pBluescript (Fig.3.9.) are 2 origini de replicare: una din plasmidul Col E1 (de la Escherichia coli) i cealalt din fagul filamentos f1. Originea din Col E1 controleaza replicarea vectorului prin mecanismul cercului rotativ i, deci, permite meninerea vectorului sub forma de molecule ADN d.c. circular covalent inchis (CCC). Originea din fagul f1 este activat n trans de proteine codificate de genomul unui alt fag (M13), introdus ca fag helper, cu genom modificat, astfel inct acesta nu se poate replica.

Cap. 3-1 Vectori de clonare

2. Situsul PCS Regiunea de policlonare din pBluescript conine situsuri pentru 20 de endonucleaze de restricie: Sac I, Bst XI, Sac II, Not I, Eag I, Xba I, Spe I, BamH I, Sma I, Pst I, EcoR I, EcoR V, Hind III, Cla I, Sal I, Acc I, Hinc II, Xho I, Apa I, Dra II, Kpn I, oferind astfel un set foarte bogat de enzime pentru clonare. Exist diverse variante de vectori pBluescript - SK, KS funcie de orientarea situsurilor de restricie (Sac I Kpn I sau Kpn I Sac I). Regiunea este ncadrata de promotorii T3 i T7 i ntreg acest complex este flancat de cte un situs pentru endonucleaza de restricie BssH II (situs extrem de rar n genomuri), cu ajutorul creia poate fi, deci, excizat. 3. Transcriere n vitro (Fig.3.10.) Situsul de policlonare este ncadrat de promotorii T3 i T7 care permit desfurarea unui proces de transcriere n vitro. Din multitudinea de promotori disponibili la bacterii i bacteriofagi au fost alei aceti 2 promotori din fagii T3 i, respectiv, T7, datorit faptului c ei sunt recunoscui foarte specific de ARN polimeraz cognat, astfel nct se elimin riscul ca aceasta enzim s desfaoare proces de transcriere de la alt promotor. Acesti 2 promotori se gsesc n orientare invers unul fa de cellalt i, ca atare, ADN heterolog clonat poate fi transcris pe oricare din cele 2 catene, funcie de orientarea pe care o are n molecula de vector recombinat. Procesul de transcriere n vitro permite obinerea de molecule ARN ce pot fi apoi folosite ca sonde moleculare n experimente de hibridizare molecular. Pe de alt parte, dupa transcriere n vitro poate fi realizat i un proces de traducere n vitro, ceea ce conduce la obtinerea de proteine care pot fi ulterior analizate. 4. Obtinerea de monocatene ADN (Fig.3.11.) Dupa clonarea n PCS, vectorul recombinat (care se afl n form CCC) se introduce, prin transformare genetic, n celule bacteriene. Pentru a obtine monocatene, tulpin bacterian n care se afl deja vectorul recombinat, se infecteaz cu un fag M13 defectiv (M13 K07) care are gena II mutant, astfel inct produsul ei va aciona preferenial asupra secvenei ori-f1 din fagimid, declannd replicarea ADN pe modelul fagilor filamentoi i, deci, obinerea de monocatene. n funcie de orientarea regiunii ori-f1 n fagimid (f1+ sau f1-) monocatena va conine catena sens sau cea antisens a genei lac Z. Pentru a putea infecta gazd bacterian cu un fag M13 este necesar ca tulpin bacterian folosit s aib un plasmid F integrat n cromosom, astfel inct s prezinte pe suprafaa celular pili de sex. Procesul de infectare a unei gazde bacteriene de ctre un fag filamentos presupune ca etapa iniiala ataarea fagului la pilii de sex ai celulei.
pBluescript II KS
BssH II T7 Sac I Bst XI / Sac II Not I / Eag I Xba I Spe I BamH I Sma I Pst I EcoR I EcoR V Hind III Cla I Sal I / Acc I / Hinc III Xho I Apa I Dra II Kpn I T3 BssH II

pBluescript II SK
BssH II T7 Kpn I Dra II Apa I Xho I Sal I / Acc I / Hinc II Cla I Hind III EcoR V EcoR I Pst I Sma I BamH I Spe I Xba I Not I / Eag I Bst XI / Sac II Sac I T3 BssH II

pBluescript I SK
T7 Kpn I Dra II Apa I Xho I Sal I / Acc I / Hinc II Cla I Hind III EcoR V EcoR I Pst I Sma I BamH I Spe I Xba I Not I / Eag I Bst XI / Sac II Sac I T3

Tab.3.1. Componena n situsuri de restricie a regiunii PCS n 3 variante ale fagimidului pBluescript.

5. Obinerea de proteine de fuziune Pentru obinerea unei cantiti suficiente din proteina heterolog, sub o forma molecular neatacabil de ctre proteazele celulare, se poate realiza un proces de transcriere i traducere n vitro pornind de la promotorul lac. ADN heterolog fiind clonat n PCS, deci, n interiorul lui LacP, n urma traducerii se va obine o protein de fuziune - proteina heterolog plus -galactozidaza.

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

Fig.3.10. Obinerea de molecule ARN prin proces de transcriere n vitro a unui fragment de ADN heterolog clonat n fagimidul pBluescript.

Fig.3.11. Obinerea de monocatene ale ADN heterolog clonat n fagimidul pBluescript.

Cap. 3-1 Vectori de clonare

3.1.4. VECTORI DERIVAI DIN GENOMUL BACTERIOFAGULUI

De cnd a fost folosit pentru prima dat ca vector de clonare (Murray i Murray 1974), bacteriofagul (se citete lambda) a ocupat un rol central n experimentele de clonare. Pe baza analizelor de genetic i fiziologie a acestui virus, n prezent, au fost construii i sunt comercializai o serie de vectori suficient de sofisticai. Genomul fagului , prezentnd dimensiuni mari, nu poate fi utilizat ca atare ca vector de clonare. Cu att mai mult cu ct ADN-ul su conine multe situsuri pentru enzime de restricie n gene eseniale pentru ciclul litic al fagului. Pe de alta parte, particulele fagice nu pot prelua o cantitate mult mai mare de ADN dect propriul genom. Totui, toate aceste impedimente au fost depite : 1. regiunea central a genomului viral (ce reprezint aproximativ 1/3 din genom) nu este esenial pentru creterea litic i, ca atare, poate fi nlocuit de ADN heterolog; aceast regiune a fost denumit stuffer 2. prin manipulare genetic situsurile de restricie au fost eliminate din regiunile eseniale 3. mai mult dect att, folosind oligonucleotide sintetice, situsurile de restricie au fost plasate exact n poziiile cele mai favorabile Toate aceste metode au condus la dezvoltarea unui mare numr de vectori ce pot accepta i propaga fragmente de ADN heterolog, folosind un set foarte larg de enzime de restricie. n funcie de tehnica de inserare a ADN heterolog, vectorii derivai dinfagul se clasific n : a) vectori inserionali - se caracterizeaz prin faptul c prezint un unic situs pentru o anumita endonucleaz de restricie, situs la nivelul cruia se insera ADN heterolog, fr a nlocui vreo regiune din vector; b) vectori de substituie (nlocuire) prezint 2 situsuri pentru o aceeasi endonucleaza de restricie, cele 2 situsuri flancnd o regiune neeseniala a vectorului (regiunea stuffer); aceasta regiune va fi inlocuit cu ADN heterolog, genernd vectorul recombinat. Alegerea vectorului adecvat Nici unul din vectorii derivai din fagul nu sunt adecvai pentru toate experimentele de clonare moleculara. Ca urmare, este necesar alegerea vectorului cel mai adecvat scopului urmrit i, n consecin trebuie luai n considerare 3 factori: 2. enzima (sau enzimele de restricie) ce vor fi folosite; 3. dimensiunea fragmentului de ADN heterolog ce urmeaz a fi clonat; 4. dac vectorul va fi folosit i pentru exprimarea ADN heterolog n E.coli. Construcia de vectori ce conin situsuri multiple de clonare a simplificat foarte mult mecanismele de clonare molecular n vectori derivai din fagul Totui, dimensiunea insertului ramne nca un factor important de luat n considerare. Aproape 60% din genomul viral (braul stng - 20 kb incluznd genele capsidei i genele cozii - de la A pna la J i braul drept - 8-10 kb - de la PR pna la cos) este necesar pentru ciclul litic al fagului Deci, treimea central a genomului viral poate fi nlocuit de ADN heterolog. Cu toate acestea, viabilitatea bacteriofagului descrete simitor atunci cnd dimensiunea total a genomului este n afara limitelor de 78-105% fa de fagul slbatic. Sisteme de selecie a vectorilor -derivai recombinanti 1) folosirea unor sisteme genetice ce se gsesc n regiunea de nlocuit (stuffer). De exemplu, exist vectori derivai din i care poart n regiunea stuffer o gena lac Z (ce codific pentru galactozidaz). Atunci cnd sunt introdui n gazde bacteriene lac , iar acestea cultivate n prezena substratului cromogen X-gal, formeaz plaje de liza de culoare albastru inchis. Introducerea n acesti vectori de substituie a unui fragment de ADN heterolog, conduce la eliminarea genei lac Z i, ca urmare, vectorii recombinati vor forma plaje de liza incolore. 2) n cazul vectorilor de inserie - de exemplu, gt10 - care conine un unic situs pentru EcoRI localizat n gena cI, se recomand folosirea unei tulpini de Escherichia coli mutant - care are o mutaie hfl (high frequency of lysogenisation). n asemenea mutante, produsul genei fagice cII se acumuleaz n cantiti foarte mari, acest produs fiind de fapt un reglator pozitiv al genei cI, care, la rndul ei, determin represia ciclului litic i intrarea n ciclul lizogen. Ca urmare, vectorii nerecombinai vor intra automat n ciclul lizogen i, deci, nu vor produce plaje de liz. Introducerea ADN heterolog prin inserie la situsul Eco RI din gena cI va inactiva aceast gen i, ca urmare, toate genomurile fagice recombinate vor intra n ciclul litic. Aceast metod este extrem de folositoare pentru screningul unor banci de gene clonate n vectorul gt10.

10

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

3) un alt tip de selecie se bazeaz pe faptul ca multiplicarea fagului slbatic este restrictat n gazde ce poart profagul P2. Acest fenotip este denumit Spi+ (sensibil la interferena cu P2). Totui, tulpinile de fag ce nu au genele implicate n recombinare (red i gam) pot crete bine n gazde lizogene pentru P2 i prezint, deci, fenotip Spi . Pe baza acestor constatri au fost construii o serie de vectori derivai din ( DASH, EMBL) care au genele red i/sau gam n regiunea stuffer. Inlocuirea acestei regiuni cu un ADN heterolog conduce la obtinerea de vectori recombinati ce prezint fenotip Spi i care, deci, cresc eficient n tulpini de E.coli lizogene pentru P2. 4) n anumite condiii, meninerea genelor red i/sau gam n vectorii fagici recombinati prezint o serie de avantaje. Produsul genei red este implicat n evenimentele de recombinare timpurii din timpul ciclului litic, evenimente ce resolva ADN viral replicativ (de forma theta) n molecule CCC. Ulterior, aceste molecule devin matrie pentru replicarea de tip cerc rotativ, formndu-se oligomeri lineari ai ADN viral ce vor fi mpachetai n particulele fagice mature. Produsul genei gam inactiveaz exonucleaza V a gazdei codificat de genele recB i recC ale gazdei bacteriene. n absena produsului genei gam, exonucleaza V (RecBC) degradeaz moleculele lineare concatenate ale ADN viral produse prin replicare de tip cerc rotativ. Astfel, ntr-o bacterie infectat cu un fag gam , exist foarte puine molecule virale disponibile pentru mpachetare. Ca urmare, fagii red i gam trebuie propagai n gazde recA+ (RecA este protein major a recombinrii n Escherichia coli). 5) Un ultim factor genetic ce trebuie luat n considerare n alegerea unui vector derivat din fagul este prezena situsului chi. Bacteriofagul slbatic nu conine nici un situs chi. Situsurile chi sunt situsurile preferate pentru recombinarea mediat de enzima RecBC a gazdei. Mutantele ce poart o secvena chi octanucleotidic supreseaza fenotipul Spi ce apare n mod normal la fagii red gam n tulpini slbatice de E.coli. Aceast supresie poate fi explicat prin faptul c, n prezena situsurilor chi, procesul de recombinare ce d nastere la molecule virale mpachetabile este crescut, astfel inct plajele de liz formate sunt aproape la fel de mari ca i n cazul fagilor red+ gam+. Majoritatea vectorilor au aceste 2 gene (red i gam) n regiunea stuffer, astfel inct atunci cnd n vector este introdus ADN heterolog, vectorii recombinai prezint fenotip red gam. Totui, ADN heterolog eucariot conine foarte frecvent secvene ce mimeaz situsuri chi i, ca urmare, vectorii recombinati vor avea fenotip Spi+ i, deci, nu vor putea fi selectati pe baza acestui sistem genetic. Astfel de vectori se recomand a fi propagati n gazde recBC pentru a putea fi selectai prin sistemul Spi/Spi+. Mai recent au fost construii i vectori care permit nu numai clonare i propagarea ADN heterolog, dar i exprimarea acestuia n gazde bacteriene (de exemplu, gt11). Vectorii CHARON Vectorii Charon sunt vectori de clonare (nu i de exprimare). Ei sunt n general folosii ca vectori de nlocuire, dar prezint i situsuri unice pentru endonucleaze de restricie, fapt ce permite i clonarea unui ADN heterolog prin mecanisme de inserie. n seria vectorilor Charon, de la Charon 3A pna la Charon 40, crete dimensiunea ADN heterolog ce poate fi clonat. Aceti vectori sunt folosii cu precdere ca vectori suport pentru bncile de gene. Vectorul CHARON 4A Vectorul Charon 4A permite clonare att prin substituie, ct i prin inserie, dar de regul este folosit ca vector de substituie pentru bnci genomice ale ADN eucariot. Dimensiunea acestui vector este de 45.4 kb i accept ADN heterolog de 0-6 kb (n clonarea prin inserie) sau de 7-20 kb (n clonarea prin substitutie). n regiunea central, neesential, acest vector poart o gena lac Z, ceea ce permite identificarea recombinantilor de inserie prin fenotip Lac+, i o gena bio, ceea ce permite cresterea gazdelor bio. Caracteristici genetice
Substituie Inserie Statusul red/gam al vectorului Statusul red/gam al recombinanilor Situs chi n recombinani Propagare n gazde recA Selecie Spi lac5, bio256, QSR80 Da red gam red gam probabil Nu Nu

Situsuri de clonare
Situs EcoRI XbaI Inserie/ Substituie Substituie inserie Dimensiune (kb) Braul stng 19.5 24.8 insertul 7-20 0-6 bratul drept 11.0 20.5 Fenotipul recombinantilor Lac Bio + + Lac Bio

11

Cap. 3-1 Vectori de clonare

Vectorul CHARON 40

Fig.3.12. Vectorul Charon 40.

Acest vector (Fig.3.12.) este numai vector de nlocuire, ntru-ct nici unul din situsurile de restricie nu este unic. Prezinta 2 situsuri de policlonare (PCS) ce conin cte 16 situsuri de restricie. Cei 2 PCS se afl n orientare invers. Regiunea stuffer (POLYSTUFFER) are o secven unic pentru Charon 40 i conine o secven repetat de aproximativ 80 de ori. Aceast secven cuprinde operatorul lac i un fragment de ADN de adenovirus. Fiecare unitate de repetare are un situs pentru endonucleaz de restricie Nae I. Prin digestie cu aceast enzim, regiunea polystuffer este digerat n multe fragmente mici ce pot fi ndepartate prin precipitare cu PEG (polietilenglicol). Aceast structur a stuffer-ului permite o foarte bun ndepartare a regiunii de nlocuit. Vectorul Charon 40 poate accepta fragmente de ADN heterolog cu dimensiuni cuprinse ntre 9.2 i 24.2 kb. Acest vector are gena gam+ n braul stng i nu n regiunea de nlocuit, astfel inct att vectorul nerecombinat, ct i cel recombinat se pot propaga n tulpini de E.coli recA. Caracteristici genetice
Substituie Inserie Statusul red/gam al vectorului Statusul red/gam al recombinailor Situs chi n recombinai Propagare n gazde recA Selecie Spi regiunea polystuffer Nu + red gam + red gam Absent Da nu Dimensiunea (kb) Braul insert stng

Situsuri de clonare
Situs EcoRI, ApaI, XbaI, SfiI, SacI, AvrII, SalI, SpeI, HindIII, XhoI, BamHI, NaeI, KpnI, NotI, SmaI, XmaIII Inserie/ Substituie Braul drept Fentipul recombinantilor

substitutie

19.2

9.2-24.2

9.6

Majoritatea plajelor sunt recombinante. Regiunea stuufer este indepartata eficient

Strategia de clonare n Charon 40 1) Inserarea ADN heterolog n vector - att vectorul ct i ADN heterolog se supun digestiei cu o aceeai endonucleaz de restricie - vectorul digerat se supune n continuare unei digestii cu endonucleaza de restricie Nae I ce va cliva regiunea polystuffer n fragmente mici; aceste fragmente sunt apoi ndepartate prin precipitare cu PEG - vectorul astfel tratat se amestec cu ADN heterolog i se adaug o ADN-ligaz vector recombinat 2) Introducerea vectorului recombinat ntr-o tulpin bacterian - se recomand o tulpin recA de Escherichia coli F+ - pentru infectare se amestec suspensia bacterian cu vectorul recombinat i se incubeaz timp variabil la 37oC (de fapt, este vorba de un amestec ce conine att molecule recombinate, ct i molecule nerecombinate) 3) Selecia moleculelor de vector recombinat - dupa infectare, suspensia bacteriana se amestec cu agar moale i se toarn ca strat n placi Petri cu mediu adecvat - dup incubare, se aspir cu o micropipet stratul de agar moale corespunztor unei plaje de liz mari (de altfel, majoritatea plajelor formate sunt determinate de fagi recombinai); ulterior, particulele fagice se purific din acest agar moale.

12

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

VECTORII EMBL Sunt vectori de clonare, de nlocuire, ce pot integra ADN heterolog de pna la 20 kb. Regiunea stuffer este ncadrat de 2 situsuri de policlonare (PCS) ce conin cte 3 situsuri de restricie i sunt n orientare invers. De exemplu, la EMBL 4 aceast zona are urmtoare structur : EcoRI , BamHI , SalI - STUFFER - SalI , BamHI , EcoRI Vectorii din seria EMBL sunt foarte utili pentru clonarea fragmentelor de digestie parial cu endonucleaza de restricie Sau3AI, datorit faptului c n vector situsul BamHI este flancat de EcoRI i SalI i, ca urmare, fragmentele clonate pot fi excizate din recombinani prin digestie cu EcoRI sau cu SalI. In regiunea stuffer, vectorii EMBL au genele red i gam i, deci, prezint fenotip Spi+ atunci cnd infecteaz tulpini bacteriene lizogene pentru bacteriofagul P2. Recombinaii au fenotip Spi i astfel pot fi selectai pe gazde lizogene cu profag P2. Vectorul EMBL 4 (Fig.3.13.) Caracteristici genetice
Substituie Inserie Statusul red/gam al vectorului Statusul red/gam al recombinanilor Situs chi prezent n recombinani Selecie Spi red, gam trpE Nu + + red gam red gam Probabil Da Dimensiune (kb) Braul stng 19.9

Situsuri de clonare
Situs SalI BamHI EcoRI Inserie/ Substituie substitutie insert 7-20 Braul drept 8.8 Fenotipul recombinanilor Spi

Fig.3.13. Vectorul EMBL 4

VECTORII gt Vectorii din seria gt sunt vectori de clonare i/sau exprimare folosii pentru clonarea unor fragmente mici de ADN (6 kb) ntr-un situs unic pentru endonucleaza de restricie EcoRI, situs localizat n regiunea de imunitate (imm). Ca atare, acesti vectori sunt vectori inserionali. Datorit localizrii situsului de inserie n regiunea de imunitate, vectorii nerecombinanti au fenotip cI+ i, deci, lizogenizeaz n tulpini bacteriene hfl. Vectorii recombinani au fenotip cI i, ca urmare, n bacterii hfl intr n ciclul litic i formeaz plaje de liz, putnd astfel s fie selectai prin acest sistem. Vectorul gt10 (Fig.3.14.) Caracteristici genetice
Substituie Inserie Statusul red/gam al vectorului Statusul red/gam al recombinanilor Situs chi prezent n recombinani Propagare n gazde recA Selectie Spi da (regiunea imm) nu + + red gam + + red gam nu da nu

13

Cap. 3-1 Vectori de clonare

Situsuri de clonare
Situs EcoRI Inserie/ Substituie inserie Dimensiunea (kb) Braul stng 32.7 insert 0-6 Braul drept 10.6 Fenotipul recombinanilor cI

Fig.3.14. Vectorul gt 10.

Fig.3.15. Vectorul gt 11.

Vectorul gt 11 Vectorii din seria gt11 i gt18-23 sunt tot vectori de inserie, dar nu sunt numai pentru clonare molecular, ci permit i exprimarea ADN heterolog inserat, sub forma unei proteine de fuziune cu -galactozidaza i, ca urmare, recombinanii sunt Lac (atunci cnd fragmentul de -galactozidaza este complexat cu proteina heterolog el nu mai poate complementa cu fragmentul de galactozidaza codificat de cromosomul gazdei). Deseori, aceti vectori sunt folosii n experimente de screening imunologic, fie al plajelor, fie al coloniilor bacteriene. Vectorul gt 11 (Fig.3.15.) este folosit de regul pentru screening imunologic. Fragmentele de ADN ( de pna la 7.2 kb) sunt clonate n unicul situs pentru EcoRI localizat n gena lacZ, permitnd astfel exprimarea unei proteine de fuziune dac secvena clonat este n-frame cu gena lacZ. Caracteristici genetice
Substituie Inserie Statusul red/gam al vectorului Statusul red/gam al recombinanilor Situs chi prezent n recombinani Propagare n gazde recA Selecie Spi nu da (gena lacZ) + + red gam + + red gam nu da nu

Situsuri de clonare
Situs EcoRI Inserie/ Substituie inserie Dimensiunea (kb) Braul insert stng 19.5 0-7.2 Braul drept 24.2 Fenotipul Recombinanilor Lac

14

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

Vectorul DASH

Fig.3.16. Vectorul DASH.

Vectorul DASH (Fig.3.16.) este un vector de substituie la care regiunea stuffer conine genele red, gam i bio. Aceast regiune este flancat de 2 situsuri de policlonare (PCS) constituite din cte 7 situsuri de restricie (XbaI, SalI, EcoRI, BamHI, SacI, XhoI). n interiorul celor 2 situsuri de policlonare se gsesc i promotorii T3 i T7 care permit sinteza de sonde ARN sau chiar de proteine heterologe fr o prealabil subclonare a ADN heterolog. Prezena genelor red i gam n regiunea inlocuit de ADN heterolog face ca vectorii nerecombinani s aib fenotip red+gam+(Spi+), iar cei recombinani, fenotip red gam (Spi ). Caracteristici genetice
Substituie Inserie Statusul red/gam al vectorului Statusul red/gam al recombinanilor Situs chi prezent n recombinani Propagare n gazde recA Selecie Spi da (genele red, gam i bio) nu + + red gam red gam probabil nu da Dimensiunea (kb) Braul insert stng 20 9-22

Situsuri de clonare
Situs XbaI, SalI, EcoRI, BamHI, HindIII, SacI, XhoI Inserie/ Substituie substitutie Braul drept 9 Fenotipul Recombinanilor Spi

VECTORII ZAP Fig.3.17. Vectorul ZAP II Vectorul ZAP (Fig.3.17.) este un vector de inserie complex. n regiunea central, neesential, n locul genelor fagice, conine vectorul fagimid pBluescript SK (M13). n regiunea amino-terminal a genei lac Z din acest fagimid se gsete un situs de policlonare (PCS) n interiorul cruia se inser de fapt ADN heterolog. Vectorul plasmid din interiorul lui ZAP are rolul de a facilita experimentele de secveniere ADN i ARN, precum i obinerea de sonde ARN cu ajutorul promotorilor T3 i T7 ce flacheaz ADN heterolog clonat. Totodat, un asemenea sistem genetic permite obinerea de proteine de fuziune cu galactozidaza. ADN corespunztor vectorului pBluescript SK (M13) poate fi excizat (Fig.3.18. i Fig.3.19.) n prezena fagilor helper f1 sau M13. ZAP conine 2 secvene semnal necesare pentru iniierea exciziei (I) i pentru terminarea acesteia (T). Caracterisiticile genetice
Substituie Inserie Statusul red/gam al vectorului Statusul red/gam al recombinanilor Situs chi prezent n recombinani Propagare n gazde recA Selecie Spi da (de la T pna la I) nu + + red gam + + red gam probabil da nu

15

Cap. 3-1 Vectori de clonare

Situsuri de clonare
Situs SacI, NotI, XbaI, SpeI, EcoRi, XhoI Inserie/ Substituie inserie Dimensiunea (kb) Braul insert stng 21.8 0-10 Braul drept 8.1 Fenotipul Recombinanilor Lac

Fig.3.18. Schema clonrii n ZAP II.

Fig.3.19. Tranziia vectorului ZAP II recombinat prin diverse forme moleculare.

3.1.5. VECTORI DE CLONARE HIBRIZI DE TIP COSMIDE Cosmidele sunt vectori hibrizi ce conin ADN plasmidial i situsul cos din genomul fagului Prezentnd secvena ori din plasmidul Col E1 i gena de rezisten la ampicilin (Apr), cosmidele se pot replica i menine n celula bacterian n forma pasmidial (CCC) i permit selecia transformanilor pe mediu cu ampicilin. Situsul cos permite mpachetarea n vitro a vectorului recombinat (obtinere de particule fagice mature) i, implicit, propagarea sa prin transducie sau transfecie. Dintre cele 2 forme moleculare, plasmid i genom fagic, cea de-a doua form este cea care permite meninerea si propagarea stabil a unui ADN heterolog de dimensiuni mari. Aceti vectori permit clonarea unor fragmente mari de ADN genomic, de aproximativ 45 kb, permind astfel propagarea unor gene eucariote n intregime ntr-o singur molecul de ADN recombinant. Insertul acceptat de cosmide este mult mai mare dect n cazul vectorilor derivai din fagul (aproximativ 24 kb), ceea ce reprezint un avantaj n realizarea bncilor genomice la eucariote. O alt utilizare a cosmidelor este clonarea i analiza unei regiune de ADN genomic ce face parte dintr-o familie de gene. De exemplu, genele mamaliene pentru globine, care sunt cuprinse ntr-o regiune de 75 kb, pot fi clonate n doar 2 specii moleculare de cosmide. COSMIDE pentru PROPAGAREA ADN heterolog eucariot n E.coli Asemenea cosmide au o singur secvena de control al replicrii, ori din Col E1, permind astfel replicarea doar n celul bacterian.

16

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

Cosmidul pJB8 (Fig.3.20.) Acest vector are 5.4 kb i conine urmtoarele secvene: 5. ori din plasmidul Col E1, care i permite replicarea de tip plasmidial n celule de E.coli 6. gena de rezisten la ampicilin (Apr) ce reprezint markerul de selecie a transformanilor pe mediu cu acest antibiotic 7. situsul cos (derivat din vectorul Charon 4A) care permite mpachetarea vectorului recombinat n particule fagice mature 8. regiunea PCS care conine situsuri pentru 4 endonucleaze de restricie (BamH I, EcoR I, Cla I, Hind III)

Fig.3.20. Cosmidul pJB8.

Strategia de clonare n pJB8 (Fig.3.21.) 1) Se realizeaz 2 experimente separate de digestie enzimatic a moleculelor de cosmid cu Hind III i, respectiv, Sal I. Se obin molecule lineare de vector cu capete coezive Hind III i, respectiv, Sal I. 2) Ambele tipuri de molecule lineare se supun apoi (tot separat) unei digestii cu BamH I, rezultnd, deci, molecule lineare cu capete coezive de BamH I; din moleculele digerate anterior cu Sal I, rezult n urma digestiei cu BamH I, 2 tipuri de fragmente: unele ce conin ori i Apr i, altele ce conin cos; pentru etapele urmtoare ale clonrii se aleg fragmentele ce conin situsul cos. 3) ADN genomic eucariot se diger cu endonucleaz de restricie Mbo I, aceasta enzim fiind izoschizomer cu BamH I. 4) fragmentele lineare de vector obinute n urma digestiei cu BamH I se amestec cu fragmentele lineare de ADN genomic obinute prin digestia cu Mbo I i se adaug T4-ADN-ligaz. Rezult molecule lineare, recombinate, ce contin: cos-ori-Apr-ADN heterolog-cos. 5) Aceste fragmente sunt supuse unui proces de mpachetare n vitro, proces n care etapa iniial este realizat de enzima terminaza A - o endonucleaz ce recunoate specific situsurile cos, rupnd legturile fosfodiesterice n ambele catene de la acest nivel. Rezultatul mpachetarii l reprezint particule fagice mature, capabile de transducie sau transfecie, particule ce nu conin nsa genom, ci cosmidul recombinat. 6) Poate fi efectuat o infecie a unei tulpini bacteriene cu aceste particule fagice, n interiorul celulelor infectate realizndu-se circularizarea vectorului recombinat i reformarea structurii plasmidiale. Pstrarea ns intact i stabil n timp a ADN heterolog clonat este obinut doar n particulele fagice.

Fig.3.21. Schema clonrii moleculare n cosmidul pJB8.

17

Cap. 3-1 Vectori de clonare

Cosmidul c2RB (Fig.3.22.) Acest cosmid are o dimensiune de 6.8 kb i conine urmtoarele secvene: - gena de rezistena la ampicilin (Apr) - gena de rezistena la kanamicin (Kmr) - secvena ori din plasmidul Col E1 - regiunea PCS ce conine 4 situsuri de restricie: BamH I, EcoR I, Cla I, Hind III - 2 situsuri cos ce flancheaza gena Kmr n timpul mpachetrii se pierde un fragment de 1.7 kb, ce conine un situs cos i gena Kmr, ca atare, recombinanii vor fi Kms. Strategia de clonare n c2RB (Fig.3.23.) 1) Se realizeaz o digestie dubl a cosmidului c2RB, cu 2 endonucleaze de restricie, BamH I i Sma I, ceea ce sparge vectorul n 2 tipuri de fragmente: S - parte din gena Kmr - cos - parte din PCS - B B - parte din PCS - gena Apr - ori - cos - parte din gena Kmr - S fiecare fragment avnd un cap coeziv creat de enzima Fig.3.22. Cosmidul c2RB. Sma I (S) i un cap coeziv creat de enzima BamH I (B) 2) ADN genomic eucariot se diger cu endonucleaza de restricie Mbo I, aceast enzim fiind izoschizomer cu BamH I. 3) Fragmentele de ADN genomic se adaug la fragmentele de vector i, n prezena ADN-ligazei de fag T4, are loc refacerea legturilor fosfodiesterice la situsurile specifice pentru BamH I/Mbo I, rezultnd o molecul linear (vector recombinat) ce are inserat n PCS un fragment de ADN eucariot. 4) Moleculele lineare de vector recombinat se supun unui proces de mpachetare n vitro n particule mature cu care apoi, 5) Se infecteaz celule de Escherichia coli i se selecteaz clonele recombinate ce au fenotip AprKms. Din aceste celule se pot recupera molecule circulare ale vectorului recombinat, constatndu-se c n timpul mpachetrii s-a pierdut un fragment de 1.7 kb ce coninea gena Kmr i unul din cele 2 situsuri cos.

Fig.3.23. Schema clonrii moleculare n cosmidul c2RB.

18

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

COSMIDE pentru transfecia CELULELOR MAMALIENE Au fost construite o serie de cosmide pentru clonare de gene n celule mamaliene. Aceti vectori difer unul de cellalt prin 2 tipuri de regiuni: 9. markerii selectabili n celule pro- i eucariote 10. situsurile de restricie ce pot fi folosite n clonare Cosmidele pWE 15 i pWE 16 (Fig.3.24 i 3.25) Aceste 2 cosmide au fost construite pentru a simplifica procesul de cutare (walking = scanare) de la o clona cosmidial la alta. Regiunea PCS este organizat astfel: EcoR I - Not I - T3 - BamH I - T7 - Not I - EcoR I Fragmentele de ADN eucariot se cloneaz n situsul BamH I. Replicarea vectorului n celule procariote este asigurat de secvena sori-Col E1t, iar bacteriile transformate sunt selectate pe baza markerului Apr. Replicarea vectorului n celule mamaliene este asigurat de sori-SV 40t, iar celulele transformate sunt selectate pe baza markerului: gena de rezisten la neomicina (Neor) prezent n pWE 15 ntr-o forma (SV2-neo) ce poate fi exprimat n celule mamaliene gena murin dihidrofolat-reductaza (DHFR) prezent n pWE 16 Cei 2 promotori T3 i T7 sunt folosii pentru procese de transcriere n vitro, ceea ce conduce la obinerea de sonde ARN, sau i de traducere n vitro, ceea ce conduce la obtinerea de proteine heterologe. Sondele ARN astfel obinute sunt, de regul, folosite pentru identificarea clonelor suprapuse din cadrul unei biblioteci de cosmide, proces ce poarta numele de scanare (walking) a unei biblioteci de cosmide.

Fig.3.24. Cosmidul pWE 15.

Fig.3.25. Cosmidul pWE 16.

19