CAPITOLUL II

2.1. Clasificarea i caracteristicile markerilor molecular. Markerii genetici reprezint forme diferite ale aceleiai gene care controleaz expresii fenotipice mutante i permit identificarea prezenei unei gene la nivel individual. Markerii genetici se bazeaz pe polimorfismul genei la nivelul expresiei fenotipice n relaie cu condiiile de mediu. Exist trei tipuri de markeri genetici: morfologici , biochimici i moleculari .Markerii moleculari sunt cei mai utilizai datorit numrului lor nelimitat, acetia provenind din diferite ,tipuri de mutaii ale ADN-ului: substituii (mutaii punctiforme), rearanjamente (inserii sau deleii) sau erori n replicarea ADN ului n tandem. Aceti markeri sunt neutrii deoarece sunt localizai n regiuni necodate a ADN-ului, de asemenea, markerii moleculari sunt practic n numr nelimitat i nu sunt influenai de condiiile de mediu sau de stadiul de dezvoltare al plantelor (Winter & Kahl, 1995). Avantajele i dezavantajele principalelor tipuri de marker moleculari sunt prezentate n tabelul 1.

Tabelul 1. Avantajelei dezavantajele celor mai utilizai markeri moleculari pentru analiza QTL(dup Collard et all ., 2005)

Marker molecular

RFLP (Restriction fragment Length Polymorphism) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) SSR (Simple Sequences Repeat)

Codomina nt- C Dominant -D C

Avantaje

Dezavantaje

Reproductibilitate

Metod rapid si simpl Ieftin Necesit cantitati mici de ADN Metod simpl Repetabilitate

Necesit mult timp Metod complex Necesit cantiti mari de ADN Metod nereproductibil

AFLP (Amplified D fragment Length Polymorphism) ISSR (Inter Simple D Sequence Repeats)

Polimorfism ridicat

Necesit mult timp Metod complex Necesit folosirea gelurilor de poliacrilamid Necesit cantiti mari de ADN Metod complex ca

metoda poate fi se comport automatizat, markeri dominani furniznd un numr mare de markeri reproductibili

Markerii ISSR

Tehnica ISSR permite evaluarea polimorfismului existent ntre regiunile microsatelit, alctuite din secvene simple, repetate. A fost astfel dezvoltat o metod alternativ de investigare, eficient care nu necesit studii prealabile de secvenializare la fel ca n cazul markerilor SSR. n literatura de specialitate de limb englez metoda este cunoscut sub denumirea de (Inter Simple Sequence Repeats-amplificarea regiunilor dintre secvenele simple repetate, notat abreviat prin acronimul ISSR. Tehnica ISSR se bazeaz pe reacia PCR , care implic amplificarea unui segment de ADN, prezent la o distan amplificabil ntre dou regiuni microsatelit, orientate n direcii opuse. Principii metodologice Primerii utilizai n aceast tehnic au n general lungimi de 16-25 de nucleotide, avnd ca regiuni int loci multipli din genom, n special amplasai n secvenele inter SSR. Repetiiile de tip microsatelit utilizate ca primeri pot fi di, tri, tetra sau pentanucleotide, neancorai, sau de cele mai multe ori sunt ancorai la capatul 3 sau 5 cu 1 -4 baze degenerate extinse n regiunile care flancheaz regiunea microsatelit. n cazul n care primerul utilizat este neancorat (CA)n se poate ataa oriunde n regiunea repetitiv (GT)n, conducnd la formarea unui numr mai mare de fragmente. Un primer ancorat cu dou nucleotide (NN) la captul 3 se ataeaz la regiuni specifice din molecula ADN matri i produce un singur fragment de amplificare. Dac primerul este ancorat la captul 5 cu dou nucleotide (NN) se ataeaz la regiuni specifice din genom i amplific o parte a secvenei repetate , conducnd la formarea unui fragment de dimensiuni mai mari. Tehnica ISSR combin beneficiile analizelor AFLP i SSR , cu universalitatea RAPD, avnd i o reproductibilitate ridicat dat de lungimea mare a primerilor (15 -25 nucleotide), comparativ cu 10 nucleotide la RAPD.

Markerii ISSR segreg mai ales dominant, dup legile mendeliene, dar n unele situaii pot segrega i co-dominant, permind diferenierea dintre homozigoi i heterozigoi 2.2 Aplicaiile markerilor moleculari n ameliorarea plantelor n ameliorarea convenional, rezultatele i viteza de rspuns obinute prin aplicarea seleciei fenotipice au depins, pe lng ali factori, de posibilitatea de a distinge i capitalize variaiile genetice innd cont de faptul c cele mai importante caractere sunt poligenice i deci puternic influenate de mediu. ntre modalitile folosite, de mare interes s-a dovedit posibilitatea de a identifica caractere fenotipice evidente, cu determinism genetic simplu i puin influenate de mediu, care s fie asociate cu caractere importante urmrite de ameliorator. Aceste caractere, numite gene marcatoare sau markeri genetici, au fost folosite de ameliorarea convenional acolo unde a fost posibil, pentru a mbuntii eficiena programelor de ameliorare. Identificarea unei noi clase de markeri genetici, respectiv a markerilor moleculari, reprezint un adevrat eveniment revoluionar n metodologia de ameliorare a plantelor.Strategia utilizrii markerilor moleculari se bazeaz pe evidenierea polimorfismului molecular, polimorfism care la genomurile plantelor este datorat, n mare parte, variaiei cantitii de AND repetitiv. Cele mai importante aplicaii ale markerilor moleculari n ameliorarea plantelor sunt reprezentate de selecia asistat de markeri, accelerarea backcrossului, detectarea diversitii i diferenelor genetice dintre diferite populaii.

CAPITOLUL III 3.1. Selecia asistat de markeri Markerii moleculari care sunt strns linkai cu gene importante n sens agronomic sunt folosii ca instrumente moleculare pentru selecia asistat de markeri n ameliorarea plantelor

(Ribaut & Hoisington, 1998). Cu ajutorul markerilor moleculari se urmrete efectuarea unei selecii indirecte a caracterelor de interes folosind strnsa legatur (linkage -ul) dintre gena sau genele care controleaz caracterul i un marker molecular, metod ce poart numele de selecie asistat de markeri (MAS - Marker Assisted Selection). Selecia asistat de markeri const n identificarea unei legaturi strnse ntre genele care controleaz caractere agronomice i markeri moleculari, precum i utilizarea acestor marker pentru a mbuntai linii sau cultivare (Dudley, 1993). Genele sunt motenite mpreun, iar prin prezena uneia (gena marker, la care este cunoscut secvena de nucleotide) se confirm c i cealalt gen ce determin caracterul dorit este prezent n acel individ.

3.2. Atribuirea markerilor genelor de interes Pentru a putea fi folositi n munca de selecie, markerii trebuie s fie atribuii genelor deinteres, acest lucru se face prin trei metode: Cosegregare - prin analiza relaiei de linkage dintre marker i gena de interes, mai inti markerul trebuie asociat genei de inters, iar apoi se face analiza de linkage: dac distana dintre marker i gen este mic, markerul se atribuie genei respective. Utilizarea liniilor- NIL (Near Izogenic Lines) - obtinute prin metoda backross care const n ncruciarea unui soi recurent cu un soi donor. n continuare se face selecia formelor care poart gena de la donor i care se retroncrucieaz n continuare cu recurentul. Se obine o linie NIL asemntoare cu recurentul, dar care poart gena de la donor. Urmeaz a se face o caracterizare molecular att a soiului recurent, ct i a liniei NIL. Dac prin analiza fingerprint- urilor de la soiul recurent i linia NIL se evideniaz un polimorfism se poate presupune c markerul molecular ce definete acest polimorfism poate fi atribut genei provenite de la donor. Prin utilizarea metodei BSA (Bulk Segregant Analysis)- metod ce presupune alegerea a dou forme parentale extreme: una rezistent i una sensibil la care s -au

dovedit a fi polimorfe la nivel molecular (Michelmore et al., 1991). Acestea se hibrideaz, i n gen F2 segregant se face o grupare a indivizilor sensibili i rezisteni. Se face extracia ADN-ului i n cadrul fiecrei grupe se amestec. Urmeaz amplificarea ADN-ului i analiza polimorfismului molecular: dac ntre cele dou grupe apare un polimorfism molecular (o band n plus) la forma rezistent nseamn c markerul molecular respectiv poate fi atribuit genei pentru care s-a fcut selecia. Acest sistem funcioneaz numai dac gena pentru care se face selecia este n faza de cuplare cu markerul molecular.